Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego RIP-Tag; Model mysi RIP-tva

Podsumowanie

Prezentujemy protokół demonstrujący nowatorski somatyczny system transferu genów wykorzystujący RIP-Tag; Mysi model RIP-tva do badania funkcji genów w przerzutach. Ptasie retrowirusy są dostarczane dosercowo, aby zapewnić transfer genów do przedzłośliwych, nieinwazyjnych zmian komórek β trzustki u dorosłych myszy.

Streszczenie

Rak z przerzutami odpowiada za 90% zgonów u pacjentów z guzami litymi. Istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia czynników powodujących przerzuty nowotworowe i zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych. Aby zbadać zdarzenia molekularne, które napędzają progresję od pierwotnego raka do przerzutów, opracowaliśmy bitransgeniczny model myszy, RIP-Tag; RIP-tva. W tym modelu mysim promotor insuliny szczura (RIP) napędza ekspresję antygenu T SV40 (Tag) i receptora dla wirusa ptasiej białaczki podgrupy A (tva) w komórkach β trzustki. U myszy rozwijają się guzy neuroendokrynne trzustki ze 100% penetracją przez dobrze zdefiniowane etapy, które są podobne do ludzkiej nowotworzenia, z etapami obejmującymi hiperplazję, angiogenezę, gruczolaka i raka inwazyjnego. Ponieważ RIP-Tag; Myszy RIP-tva nie rozwijają choroby przerzutowej, można łatwo zidentyfikować zmiany genetyczne sprzyjające przerzutom. Transfer genów somatycznych do proliferujących β przednowotworowych zmian trzustkowych z ekspresją twa osiąga się poprzez wstrzyknięcie do serca ptasich retrowirusów zawierających pożądaną zmianę genetyczną. Miano >1 x 10,8 jednostek zakaźnych na ml uważa się za właściwe dla zakażenia in vivo. Ponadto ptasie retrowirusy mogą infekować linie komórkowe pochodzące z nowotworów w RIP-Tag; Myszy RIP-tva o wysokiej wydajności. Linie komórkowe można również wykorzystać do scharakteryzowania czynników przerzutowych. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać ten mysi model i linie komórkowe do oceny funkcji genów kandydujących w przerzutach nowotworowych.

Wprowadzenie

Większość nowotworów powstaje w wyniku mutacji somatycznych ¹. Konwencjonalne genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) dostarczyły istotnych informacji na temat udziału określonych zmian genetycznych w nowotworzeniu ². Mają jednak kilka ograniczeń. Główną wadą tych modeli jest to, że nie odtwarzają one sporadycznej natury powstawania nowotworów u ludzi, w których tylko niektóre komórki w tkance uzyskują zmiany genetyczne. Mutacje u myszy transgenicznych i nokautowych są również linią zarodkową, która może wpływać na rozwój. Co więcej, generowanie tych modeli myszy jest kosztowne i czasochłonne.

Przerzuty to poważny problem w dziedzinie raka. Modelowanie przerzutów w GEMM było trudne. Spontaniczne przerzuty są rzadkie u myszy. Penetracja jest zmienna, a opóźnienie jest duże w GEMM przerzutów ³. Eksperymentalne modele przerzutów wykorzystują bezpośrednie wstrzykiwanie komórek do krążenia myszy, dzięki czemu wczesne etapy kaskady przerzutowej są eliminowane.

Aby przezwyciężyć niektóre z powyższych ograniczeń w badaniu czynników przerzutowych w modelach mysich, opracowaliśmy dwutransgeniczny model myszy, RIP-Tag; RIP-tva⁴. Strategia opiera się na połączeniu wysoce zsynchronizowanego mysiego modelu progresji nowotworu, RIP-Tag ⁵, oraz receptora dla wirusa ptasiej białaczki podgrupy A, tva ^6,7. Ten znacznik RIP; Mysi model RIP-tvapozwala na somatyczne wprowadzenie genów do pojedynczego bitransgenicznego szczepu myszy. Z antygenem SV40 T hamującym funkcje supresyjne nowotworu Rb i p53, myszy rozwijają guzy neuroendokrynne trzustki w podobny sposób jak ludzka noworoczyna, z etapami obejmującymi hiperplazję, angiogenezę, gruczolaka i raka inwazyjnego. Ten model RIP-Tag był bardzo pouczający dla naszego zrozumienia cech charakterystycznych raka, nie ograniczając się do guzów neuroendokrynnych trzustki. Był również używany w badaniach przedklinicznych ⁸.

Przedstawiamy protokół transferu genów somatycznych poprzez wstrzyknięcie ptasich retrowirusów dosercowo do RIP-Tag; Myszy RIP-tva. Skuteczne zakażenie retrowirusami ptaków pochodzącymi z RCASBP wymaga aktywnej proliferacji komórek docelowych. Dlatego wybraliśmy RIP-Tag; Myszy RIP-tva w wieku 7 tygodni, kiedy przerost rozwija się w około 50% wysp trzustkowych. Wstrzyknięcie dosercowe do lewej komory serca wirusów o wysokim mianie jest wymagane do osiągnięcia skuteczności infekcji na poziomie 10-20% ⁴. Ta metoda dostarczania zmniejsza znaczne rozcieńczenie cząstek wirusa w krążeniu, zanim wirusy dotrą do wysp trzustkowych.

Korzystając z tego podejścia, wykazaliśmy wcześniej, że Bcl-xL sprzyja przerzutom raka niezależnie od swojej funkcji antyapoptotycznej ^4,9. Ta niezależna od apoptozy funkcja przerzutowa nie była obserwowana, gdy Bcl-xL był wyrażany przez transgen we wszystkich komórkach β trzustki podczas ontogenezy nowotworowej w RIP-Tag; Model myszy RIP-Bcl-xL ¹⁰. Dlatego nasz mysi model oferuje wyjątkową możliwość identyfikacji i scharakteryzowania funkcji genów, gdy ulegają ekspresji na późniejszym etapie nowotworzenia. Ponieważ 2-4% wysepek przekształca się w guzy w RIP-Tag; Myszy bitransgeniczne RIP-tva bez infekcji wirusowej i nie wszystkie zmiany przednowotworowe są zakażone retrowirusami ptaków pochodzącymi z RCASBP, można zidentyfikować tylko czynniki, które dają selektywną przewagę nad naturalnym przebiegiem nowotworzenia. W szczególności czynniki przerzutowe będą najłatwiej rozpoznane tą metodą, ponieważ przerzuty do węzłów chłonnych trzustki lub innych narządów zwykle nie występują w RIP-Tag; Myszy RIP-tva.

Protokół

Oświadczenie etyczne:Eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Komitet Instytutu Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Weill Cornell Medicine.

1. Wybór ptasich wektorów retrowirusowych (opartych na RCASBP(A) lub opartych na RCANBP(A))

• Wektory pochodzą z wirusa mięsaka Rous¹¹. Ptasie wektory retrowirusowe mogą dostarczać cDNA (≤2,5 kb), krótkie RNA spinki do włosów (shRNA), mikroRNA (miRNA) i inne niekodujące RNA. Dostępne na rynku wektory są wymienione w Materiałach, a inne należy zamówić bezpośrednio u autorów.
• Aby uzyskać nadekspresję interesujących genów, użyj jednego z następujących wektorów: RCASBP(A)¹² (Rysunek 1A), RCAS-X (Rysunek 1B), RCAS-Y¹³ (Rysunek 1C), RCASBP-Y DV¹⁴, lub inne wektory ALV-A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
• Aby wybić interesujące geny za pomocą shRNA, użyj jednego z następujących wektorów: RCAN-X DV¹⁵ lub RCAS-RNAi¹⁶.
• Aby uzyskać nadekspresję miRNA, wygeneruj wektor RCAS-miR zgodnie z opisem w¹⁷.
• Transformacja w E. coli i wymóg DNA.
• Najlepiej przekształcić DNA w kompetentne komórki Stbl2 lub Stbl3, które mają unikalny genotyp do stabilizacji bezpośrednich powtórzeń i sekwencji retrowirusowych. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą metody, która pozwoli uzyskać czyste DNA klasy transfekcyjnej. Potrzeba 5 μg DNA przy minimalnym stężeniu 0,1 μg/μl.

2. Rozprzestrzenianie się wirusa w linii komórkowej DF1 fibroblastu kurczaka

1. Stosowanie filtrowanych końcówek pipet do hodowli komórkowych jest wymagane, aby zapobiec zakażeniu krzyżowemu zapasów wirusów¹⁸.
2. Utrzymuj komórki DF1 w 6 cm naczyniu z pożywką wzrostową (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 6 mM (końcowe stężenie) L-glutaminy, 10 jednostek/ml penicyliny, 10 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 ^oC i 5% CO₂ . Jeśli komórki DF1 są świeżo rozmrożone z zamrożonych szczepów, hoduj je przez co najmniej 3 dni przed transfekcją.
3. Na dzień przed transfekcją należy przekazać komórki DF1 do 6-centymetrowej płytki do hodowli tkankowej, tak aby w momencie transfekcji były w 30-50% zlewne.
4. Rozcieńczyć 5 μg czystego wirusowego DNA za pomocą DMEM (bez surowicy, penicyliny lub streptomycyny) do całkowitej objętości 150 μl w probówce do mikrowirówek wewnątrz okapu do hodowli tkankowej.
5. Dodać 30 μl Superfect bezpośrednio do rozcieńczonej probówki DNA; wirować tę mieszaninę przez 10 s; pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5-10 minut w kapturze do hodowli tkankowej, aby umożliwić tworzenie się kompleksu transfekcji.
6. Podczas tworzenia kompleksu delikatnie odessać pożywkę wzrostową z naczynia do hodowli komórkowych DF1 i ostrożnie umyć komórki 4 ml PBS-^/-.
7. Odmierzyć pipetą 5 ml pożywki wzrostowej (zawierającej surowicę i antybiotyki); zachować 4 ml do probówki Falcon na następny krok; i dodać resztę 1 ml pożywki wzrostowej do kompleksów transfekcyjnych. Wymieszać przez dwukrotne pipetowanie w górę i w dół i natychmiast przenieść całe kompleksy transfekcyjne do komórek DF1. Wirować, aby upewnić się, że warstwa komórek jest pokryta; inkubować przez 2-3 godziny w temperaturze 37^oC.
8. Odessać mieszaninę transfekcji, przemyć komórki 4 ml PBS-^/-; dodać 4 ml świeżej pożywki wzrostowej (zawierającej surowicę i antybiotyki); umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37^oC.
9. Kiedy komórki osiągną zbieg, komórki pasażujące (ekspresję przejściową można oznaczyć 48 do 72 godzin po transfekcji).
10. Kontynuuj przepuszczanie komórek przez około 7 dni, aż wszystkie komórki zostaną prawdopodobnie zainfekowane; przetestuj integrację wirusowego DNA za pomocą PCR i określ ekspresję białka za pomocą Western blot; i zamroź komórki w pożywce DMEM z 10% DMSO i 20% płodową surowicą bydlęcą.

3. Zakażenie in vivo RIP-Tag; Myszy RIP-tva

1. Zbieranie i stężenie wirusa
   Do infekcji in vivo należy używać świeżo skoncentrowanych wirusów. Miano wirusów utrzymywanych w temperaturze 4 ^oC w ciągu tygodnia nie ulega znacznemu zmniejszeniu. Jednak zamrożone podwielokrotności zapasów wirusa wykazują 10-krotnie zmniejszone miano po rozmrożeniu.
   1. Rozwiń komórki DF1 produkujące wirusa do 15-centymetrowych szalek w zależności od potrzebnej ilości wirusa. W przypadku zakażenia myszy in vivo należy przygotować średnio jedną płytkę na mysz.
   2. Wstępnie schłodzić wirnik (na przykład SW28), łyżkę obrotową i ultrawirówkę do temperatury 4^oC.
   3. Zebrać supernatant z zlewających się 15-centymetrowych szalek. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie na niskiej prędkości przy 1 650 x g przez 10 minut w temperaturze 4^oC.
   4. Przenieś supernatant wirusa do probówek ultrawirówek (probówki wirówkowe z poliallomeru). Wirować w ultrawirówce przez 1,5 godziny w temperaturze 95 400 x g 4 ^oC. W przypadku ultrawirówki Beckman XL-100 użyj Accel: 1; Decel: 1 ustawienia.
   5. Usunąć supernatant z probówek ultrawirówek w jak największym stopniu. Dodać PBS bez wapnia i magnezu (PBS-^/-) do probówki ultrawirówki, aby uzyskać ostateczną zawiesinę wirusa 100 μl z jednego naczynia o średnicy 15 cm. Przykryj tuby Parafilmem. Ponownie zawiesić niewidoczne osady wirusowe, wirując probówki ultrawirówki przez 2 minuty ze średnią prędkością.
   6. Probówki ultrawirówkowe należy wstrząsać w temperaturze 4 ^oC przez godzinę lub noc.
   7. Przenieś zawiesinę wirusa do probówki mikrowirówkowej. Rozgrzej zawiesinę wirusa do temperatury pokojowej przed wstrzyknięciem myszom.
2. Oznaczanie miana wirusa.
   Dla każdego nowego konstruktu wirusa należy określić miano wirusa przed zakażeniem in vivo.
   1. Umieść komórki DF1 we wszystkich studzienkach 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (sugestia: 2 x 10⁴ komórki / dołek, 1 ml / dołek), tak aby w momencie infekcji były w 30% zlewne. Do jednego oznaczenia miana wirusa potrzebna jest jedna 12-dołkowa płytka.
   2. Wykonać serię 10-krotnych rozcieńczeń supernatantu wirusa w pożywce wzrostowej w następujący sposób:
      1. Zmieszać 5 μl supernatantu wirusa z 495 μl pożywki wzrostowej w celu rozcieńczenia 10:² w probówce do mikrowirówki. Wiruj krótko przez kilka sekund.
      2. Pobrać 40 μl z rozcieńczenia 10:² na 360 μl pożywki wzrostowej w probówce do mikrowirówki do rozcieńczenia 10:³. Wiruj krótko przez kilka sekund.
      3. Postępować zgodnie z krokiem 3.2.2.2 dla rozcieńczenia 10⁴ i 10⁵.
      4. Ustaw 5 probówek polistyrenowych o pojemności 6 ml. Podwielokrotność 2,25 ml pożywki wzrostowej na probówkę i oznaczyć je odpowiednio 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰.
      5. Zmieszać 0,25 ml z rozcieńczenia 10:⁵ z 2,25 ml pożywki wzrostowej w probówce z polistyrenu o pojemności 6 ml w celu uzyskania rozcieńczenia 10:⁶. Wiruj krótko przez kilka sekund.
      6. Wykonaj krok 3.2.2.5 dla rozcieńczenia 10⁷, 10⁸, 10⁹ i 10¹⁰.
      7. Usunąć oryginalną pożywkę hodowlaną z komórek DF1 na 12-dołkowej płytce. Umieścić 1 ml rozcieńczonych wirusów w każdym dołku w dwóch (niezakażonych, 10¹⁰ do 10⁶ j.m./ml).
   3. Pozwól komórkom rosnąć przez co najmniej 7 dni (w razie potrzeby wykonaj trypsynizację). Zbierz komórki w celu wyizolowania DNA i sprawdź obecność wirusowego DNA metodą PCR, jak opisano w "6. Protokoły PCR". Jeśli to miano wirusa wynosi 10⁸ jednostek zakaźnych na ml (j.m./ml), dodatnie wyniki 398 bp PCR produktów RCASBP będzie obserwowane przy użyciu DNA z komórek zawierających 10⁸ do 10⁶ IU / ml wirusów, ale nie z komórek niezakażonych lub komórek zawierających 10¹⁰ do 10⁹ IU / ml wirusów. W przypadku zakażenia in vivo należy stosować miano >1 x 10⁸ jednostek zakaźnych na ml.
3. Iniekcja dosercowa
   W tym badaniu wykorzystano hemizygotyczne myszy RIP-Tag, a nie myszy homozygotyczne. Hemizygotyczne myszy RIP-Tag rozwijają guzy neuroendokrynne trzustki w wieku około 10 ~ 12 tygodni, podczas gdy myszy homozygotyczne mają krótszą latencję guza. Ponieważ proliferacja komórek jest wymagana do włączenia wirusowego cDNA do genomu gospodarza, 7-tygodniowy RIP-Tag; Wykorzystuje się myszy RIP-tva z hiperplastycznymi komórkami β trzustki. Należy pamiętać, że większość normalnych komórek β nie namnaża się u dorosłych myszy.
   1. Użyj 7-tygodniowego RIP-Tag; Myszy RIP-tva w czystym tle C57BL/C do eksperymentów.
   2. Znieczulić mysz za pomocą kombinacji ketaminy i ksylazyny (150 mg/kg; 15 mg/kg). Użyj wsparcia cieplnego, aby utrzymać temperaturę ciała myszy przez cały okres znieczulenia.
   3. Nałóż smar do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
   4. Ogolić włosy z klatki piersiowej RIP-Tag; Myszy RIP-tva. Ułóż mysz na plecach klatką piersiową skierowaną do góry. Wykonuje się szczypanie palca u nogi w celu obserwacji zwierzęcia pod kątem braku reakcji, aby potwierdzić pełny efekt znieczulenia.
   5. Wysuń przednią kończynę i zabezpiecz je taśmami. Oznacz klatkę piersiową myszy do wstrzyknięcia. Zaznacz miejsce w połowie odległości między wcięciem mostka a szczytem wyrostka ksyloidalnego i nieco na lewo (anatomicznie) od mostka (Ryc. 2).
   6. Wyszoruj przednią ścianę klatki piersiowej peelingiem jodowo-powidonowym lub peelingiem chlorheksydyny, a następnie gąbką z gazy nasączoną 70% alkoholem izopropylowym lub 70% etanolem.
   7. Pobrać 50 μl powietrza do sterylnej strzykawki insulinowej o gramaturze 28 g 1/2, aby zrobić przestrzeń między tłokiem a łąkotką strzykawki o pojemności 500 μl, a następnie pobrać 100 μl wirusów. Przestrzeń powietrzna bez płynu na ścianie ma kluczowe znaczenie dla zobaczenia tętna serca.
   8. Trzymaj igłę w pozycji pionowej. Jedną ręką trzymaj napiętą skórę myszy i włóż igłę w zaznaczone miejsce. Gdy w strzykawce pojawi się jaskrawoczerwony puls krwi, przestań przesuwać igłę i jedną ręką ustal głębokość igły w myszy.
   9. Drugą ręką ostrożnie i powoli popychaj tłok, aby dostarczyć zawiesinę wirusa (objętość ~100 μl) w ciągu ~60 sekund. Dostarczyć 10-20 μl za każdym razem, gdy w strzykawce pojawi się jaskrawoczerwony puls krwi. Ciągłe wnikanie czerwonej natlenionej krwi do przezroczystej piasty igły świadczy o prawidłowym ułożeniu igły do lewej komory.
   10. Po ostatnim naciśnięciu tłoka w celu dostarczenia zawiesiny wirusa i przed zobaczeniem kolejnego czerwonego impulsu krwi, szybko wycofaj igłę z jamy klatki piersiowej.
   11. Delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zmniejszyć krwawienie przez co najmniej 1 minutę.
   12. Ostrożnie przesuń mysz na poduszkę grzewczą lub pod lampę grzewczą, aż do uzyskania pełnej przytomności. Myszy będą obserwowane, dopóki znieczulenie nie ustąpi, aby mogły odejść od bodźców, okres trwający zwykle około godziny. Myszy będą codziennie monitorowane pod kątem równej i nienaruszonej sierści oraz wszelkich zmian w zachowaniu.

4. Analiza histopatologiczna nowotworów

1. Dziewięć tygodni po wstrzyknięciu poddać eutanazji 16-tygodniowego RIP-Taga; Myszy RIP-tva. Rejestruj rozmiary i liczbę pierwotnych guzów trzustki i wszelkich dużych przerzutów.
2. Umocuj trzustkę, wątrobę i/lub inne narządy w 10% buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej na bujanej platformie.
3. Następnego dnia przenieś utrwalone tkanki do 70% etanolu. Przetwarzaj tkanki na skrawki zatopione w parafinie.
4. Wykonaj barwienie immunohistochemiczne dla synaptofizyny (markera neuroendokrynnego) lub insuliny (marker specyficzny dla komórek β) zgodnie z instrukcjami producenta w celu identyfikacji przerzutów komórek β trzustki w węzłach chłonnych trzustki lub wątrobie. Jednak niezróżnicowane komórki nowotworowe lub słabo zróżnicowane komórki nowotworowe mogą utracić ekspresję insuliny i można je wykryć tylko za pomocą barwienia immunologicznego synaptofizyny.

5. Zakażenie in vitro komórek wykazujących ekspresję tva

Nie jest konieczne używanie skoncentrowanych wirusów do infekcji in vitro. Opisany poniżej protokół dotyczy dwóch rund infekcji. Kolejne rundy infekcji można przeprowadzić, powtarzając następujący protokół.

1. Zbierz wirusowy supernatant z konfluentnych komórek DF1. Przechowywać supernatant wirusa w temperaturze 4 ^oC w celu zakażenia w ciągu tygodnia. Przed zakażeniem przepuść supernatant wirusa przez filtr 0,45 μm, aby uzyskać wirusy bezkomórkowe.
2. Krótko przepłukać komórki docelowe wykazujące ekspresję tva (tj. linię komórkową nowotworu trzustki z komórek β N134 z RIP-Tag; Mysz RIP-tva) z PBS-^/- w celu usunięcia wszelkich śladów surowicy, które zawierają inhibitor trypsyny. Krótko przepłukać komórki docelowe wykazujące ekspresję twa roztworem trypsyny-EDTA (takim jak 0,25% Trypsyna-2,21 mM EDTA). Dodaj roztwór trypsyny-EDTA i inkubuj przez 2 minuty. Delikatnie postukaj w talerz. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem. Komórki zwykle odłączają się w ciągu 2 do 3 minut. Wysiewaj komórki docelowe na 6 cm płytce. Użyj 3 ~ 4 ml przefiltrowanego supernatantu wirusowego jako pożywki wzrostowej.
   UWAGA: Składniki odżywcze w supernatancie wirusa są zużywane przez komórki DF1, więc zmień pożywkę następnego dnia.
3. Następnego dnia rozgrzej wystarczającą ilość supernatantu wirusowego do temperatury pokojowej. Usuń pożywkę z komórek docelowych i zastąp ją 3-4 ml supernatantu wirusowego.
4. Trzeciego dnia przejdź komórki w razie potrzeby. Jeśli komórki nie są wystarczająco gęste, aby mogły zostać pasażowane, podgrzej ~ 4 ml zwykłej pożywki wzrostowej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 6 mM (końcowe stężenie) L-glutaminy, 10 jednostek/ml penicyliny, 10 μg/ml streptomycyny) w celu zastąpienia supernatantu wirusa.
5. Rozwiń zainfekowane komórki i zbadaj ekspresję białka kandydującego za pomocą Western blotting ¹⁹. Wpływ genów kandydujących na migrację i inwazję można analizować w testach transwell. Te linie komórkowe można również przetestować pod kątem ich potencjału przerzutowego do wątroby w teście żyły ogonowej pod kątem przerzutów.

6. Protokoły PCR

Roztwory powinny być montowane jak najszybciej na lodzie. Mastermix bez szablonu może być wykonany dla dużej liczby próbek i podzielony na porcje do probówek PCR. Pomnóż ilość każdego potrzebnego odczynnika przez liczbę próbek. Wymieszaj odczynniki, przesuwając je wcześniej i zamieszaj końcówką pipety, a następnie weź trochę i dodaj do mieszanki głównej. Po dodaniu każdego odczynnika do probówki mastermix, pipetuj w górę iw dół, aby dostarczyć wszelkie pozostałości do końcówek.

1. Wykrywanie obecności RCASBP w zakażonych lub transfekowanych komórkach.
   Poniższy protokół wymaga 11,5 μl mastermix i 1 μl genomowego DNA dla każdej próbki. Pamiętaj, aby zawirować przed dodaniem każdego odczynnika.
   1. Przygotuj mastermix składający się z 7,68 μl wody wolnej od nukleaz, 0,75 μl DMSO, 1,25 μl 10x buforu II dla polimerazy DNA AmpliTaq, 1,375 μl 25 mM MgCl₂ i 0,125 μl 25 mM dNTP.
   2. Dodać 0,125 μl 100 μM startera wstępnego RCAS5626F: (5'-ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA-3') i 0,125 μl 100 μM startera wstecznego RCAS6023R: (5'-CCGCAACACCCACTGGCATTACC-3') do mastermixu.
   3. Dodać 0,075 μl polimerazy DNA AmpliTaq do mastermixu.
   4. Wymieszaj mastermix, przesuwając tubkę palcami. Odwiruj matermix w wirówce krótko przez 3 ~ 5 sekund.
   5. Podwielokrotność 11,5 μl z mastermixu do każdej pojedynczej probówki PCR. Mieszaj za każdym razem przed podaniem do nowej probówki.
   6. Zawiruj i dodaj 1 μl matrycy genomowego DNA do każdej probówki PCR. Aby przygotować genomowe DNA:
      1. Osad komórek lizy w 200 μl 0,05 M NaOH. Pipetować w górę iw dół, aby rozpuścić osad.
      2. Podgrzej lizat komórkowy do 98 °C przez 20 minut w maszynie do PCR, a następnie schładzaj do 25 °C.
      3. Dodać 20 μl 1,0 M Tris-HCl (pH 7,5) do probówek i przechowywać próbki DNA w temperaturze 4°C.
   7. Wymieszać próbki, trzepocząc i krótko odwirować przez 3-5 sekund. Włóż probówki do maszyny do PCR.
   8. Warunek PCR ustawia się na 2 minuty w temperaturze 92 °C dla początkowej denaturacji, a następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C dla denaturacji, 30 s w temperaturze 67 °C dla wyżarzania, 30 s w temperaturze 72 °C dla przedłużenia i 10 m w temperaturze 72 °C dla końcowego przedłużenia.
   9. Po zakończeniu PCR dodaj 3 μl 6x barwnika ładującego DNA do każdej próbki. Wymieszaj przez strzepnięcie i krótko odwiruj przez 3 ~ 5 sekund.
   10. Produkty PCR są badane za pomocą elektroforezy w 2% (w/v) żelu agarozowym w 1x buforze TAE. Wielkość produktu PCR wynosi 398 pz.
2. Genotypowanie tagów.
   Poniższy protokół wymaga 10,5 μl mastermix i 2 μl genomowego DNA dla każdej próbki. Pamiętaj, aby zawirować przed dodaniem każdego odczynnika.
   1. Przygotuj mastermix składający się z 4,5 μl wody wolnej od nukleaz i 4,00 μl 5x buforu reakcyjnego MyTaq dla polimerazy DNA MyTaq.
   2. Dodać 0,4 μl 100 μM startera do przodu TagF2: (5'-GGACAAACCACACAACTAGAATGCAGTG-3') i 0,4 μl 100 μM startera wstecznego TagR2: (5'-CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG-3') do mieszanki głównej.
   3. Dodać 0,8 μl 10 μM mieszaniny starterów prekursorów beta-2-mikroglobulin (B2m) do kontroli wewnętrznej. Startery PCR dla B2m kontroli wewnętrznej, prekursora beta-2-mikroglobuliny (B2m), to B2F (5'-CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA-3') i B2R (5'-TCCACACAGATGGAGCGTCCAG-3').
   4. Dodaj 0,4 μl polimerazy DNA MyTaq do mastermixu.
   5. Wymieszaj mastermix, przesuwając tubkę palcami. Odwiruj mastermix w wirówce przez 3 ~ 5 sekund.
   6. Podwielokrotność 10,5 μl z mastermixu do każdej pojedynczej probówki PCR. Mieszaj za każdym razem przed podaniem do nowej probówki.
   7. Zawiruj i dodaj 2 μl matrycy genomowego DNA do każdej probówki PCR. Genomowe DNA przygotowuje się w sposób opisany powyżej.
   8. Wymieszaj roztwór, strzepując i krótko odwirowując przez 3-5 sekund. Włóż probówki do maszyny do PCR.
   9. Warunek PCR ustawia się na 3 minuty w temperaturze 95°C dla początkowej denaturacji, a następnie 35 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C dla denaturacji, 15 s w temperaturze 65 °C dla wyżarzania, 30 s w temperaturze 72 °C dla przedłużenia i 10 minut w temperaturze 72 °C dla końcowego przedłużenia.
   10. Po zakończeniu PCR dodaj 3 μl 6-krotnego barwnika ładującego do każdej próbki. Wymieszaj przez strzepnięcie i krótko odwiruj przez 3 ~ 5 sekund.
   11. Produkty PCR są badane za pomocą elektroforezy w 2% (w/v) żelu agarozowym w 1x buforze TAE. Rozmiary produktów Tag i B2m PCR to odpowiednio ~450 pz i 300 pz.
3. Genotypowanie TVA.
   Poniższy protokół wymaga 10,5 μl mieszaniny odczynników dla każdej próbki. Pamiętaj, aby zawirować przed dodaniem każdego odczynnika.
   1. Przygotuj mieszankę główną składającą się z 5,6 μl wody wolnej od nukleaz, 0,5 μl DMSO, 1,25 μl 10x buforu II dla polimerazy DNA AmpliTaq i 1,375 μl 25 mM MgCl₂ i 0,125 μl 25 mM dNTP.
   2. Dodaj 0,125 μL 100 μM tva-3 (5'-GCCCTGGAAGGTCCTGCCC-3') i 0,125 μL 100 μM tva-5 (5'-CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG-3') do mastermixu.
   3. Dodać 1,275 μl 10 μM mieszanki podkładowej B2m do kontroli wewnętrznej do mastermixu.
   4. Dodać 0,125 μl polimerazy DNA AmpliTaq do mastermixu.
   5. Wymieszaj mastermix, przesuwając tubkę palcami. Odwiruj mastermix w wirówce krótko przez 3-5 sekund.
   6. Podwielokrotność 10,5 μl z mastermixu do każdej pojedynczej probówki PCR. Mieszaj za każdym razem przed podaniem do nowej probówki.
   7. Zawiruj i dodaj 2 μl matrycy genomowego DNA do każdej probówki PCR. Genomowe DNA przygotowuje się w sposób opisany powyżej.
   8. Wymieszaj roztwór, strzepując i krótko odwirowując przez 3-5 s. Włóż probówki do maszyny PCR.
   9. Warunek PCR ustawia się na 2 minuty w temperaturze 92 °C dla początkowej denaturacji, a następnie 35 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C dla denaturacji, 30 s w temperaturze 60 °C dla wyżarzania, 30 sekund w temperaturze 72 °C dla przedłużenia i 10 minut w temperaturze 72 °C dla końcowego przedłużenia.
   10. Po zakończeniu PCR dodaj 3 μl 6-krotnego barwnika ładującego do każdej próbki. Wymieszaj przez strzepnięcie i krótko odwiruj przez 3-5 sekund.
   11. Produkty PCR są badane za pomocą elektroforezy w 2% (w/v) żelu agarozowym w 1x buforze TAE. Rozmiary produktów tva i B2m PCR wynoszą odpowiednio 500 pz i 300 pz.

Wyniki

Wskaźnik infekcji in vivo i in vitro za pomocą RIP-Tag; Komórki nowotworowe RIP-tva wirusów opartych na RCASBP wynoszą odpowiednio ~20% i ~80% ²⁰. w znaczniku RIP; model myszy RIP-tva, około 4% z 400 wysp trzustkowych u każdej myszy naturalnie przekształci się w guzy ²⁰; W związku z tym w każdej myszy znajduje się wystarczająca ilość komórek nowotworowych do analizy histologicznej i fenotypowej potencjalne...

Dyskusja

W tym badaniu opisaliśmy potężny model myszy, RIP-Tag; RIP-tva, w celu osiągnięcia dostarczania genów somatycznych za pośrednictwem ptasich retrowirusów w celu identyfikacji i charakterystyki czynników przerzutowych. Chociaż RIP-Tag; U myszy RIP-tva rozwijają się guzy neuroendokrynne trzustki, czynniki przerzutowe zidentyfikowane w tym modelu mysim mogą również sprzyjać przerzutom innych typów raka.

Nasze podejście ma tę zaletę, że wprowadza somatyczne zmiany genetyczne specy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plazmid RCASBP-Y DV	Addgene	11478
Plazmid RCAS-RNAi	Addgene	15182
DMEM	Corning	10-013-CV
płodowa surowica bydlęca	Atlanta Biologicals	25-005-CI
L-glutamina, 100x	Corning	25-005-CI
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100x	Corning	30-002-CI
PBS-/-, 1x	Corning	21-040-CV
Superfect	Qiagen	301305
Probówka wirówkowa z poliallomeru	Beckman Coulter	326823
0,45 mm Nalgene Filtry strzykawkowe z membraną PES	Thermo Scientific	194-2545
Strzykawki do insuliny	BD
synaptofizyna	Vector Laboratories	VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (peroksydaza, królicza IgG)	Vector Laboratories	PK-6101
Polimeraza DNA AmpliTaq z technologiami Buffer II	Life N8080153
Polimeraza DNA MyTaq	Bioline	BIO-21106