Method Article

Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

DOI:

10.3791/55893

⸱

June 5th, 2017

 ,  , 
1Laboratory of Chemical Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Center for Information and Neural Networks, National Institute of Information and Communications Technology, 3PRESTO, Japan Science and Technology Agency (JST)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węchowe neurony czuciowe wyrażają szeroką gamę cząsteczek sortujących aksony, aby ustanowić prawidłowe obwody neuronowe. Protokół ten opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego w celu wizualizacji kombinatorycznych ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi system węchowy jest często używany do badania mechanizmów tworzenia obwodów nerwowych ze względu na swoją prostą budowę anatomiczną. Węchowy neuron czuciowy (OSN) to dwubiegunowa komórka z pojedynczym dendrytem i pojedynczym nierozgałęzionym aksonem. OSN wyraża tylko jeden gen receptora węchowego (OR), OSN wyrażające dany typ OR zbiegają swoje aksony do kilku zestawów niezmiennych kłębuszków nerkowych w opuszki węchowej (OB). Niezwykłą cechą projekcji OSN jest to, że wyrażone OR odgrywają pouczającą rolę w projekcji aksonalnej. Sale operacyjne regulują ekspresję wielu cząsteczek sortujących aksony i generują kombinatoryczny kod molekularny cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów OSN. Tak więc, aby zrozumieć mechanizmy molekularne specyficznych dla OR mechanizmów kierowania aksonami, konieczne jest scharakteryzowanie ich profili ekspresji na końcach aksonów OSN w obrębie tego samego kłębuszka nerkowego. Celem artykułu było przedstawienie metod pobierania jak największej liczby kłębuszków nerkowych na pojedynczym skrawku OB oraz wykonywania barwienia immunologicznego przy użyciu wielu przeciwciał. Pozwoliłoby to na porównanie i analizę wzorców ekspresji cząsteczek sortujących aksony bez różnic w barwieniu między sekcjami OB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju, neurony są precyzyjnie połączone ze sobą, tworząc prawidłowe obwody neuronowe, co jest kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania mózgu. Ponieważ uważa się, że nieprawidłowe obwody neuronalne w mózgu są przyczyną zaburzeń psychicznych, takich jak autyzm i schizofrenia, zrozumienie mechanizmów powstawania obwodów nerwowych jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie neuronauki.

W układzie węchowym myszy, każdy węchowy neuron czuciowy (OSN) w nabłonku węchowym (OE) wyraża tylko jeden funkcjonalny gen receptora węchowego (OR), a OSN wyrażające ten sam OR zbiegają swoje aksony do określonej pary kłębuszków w stereotypowych miejscach w opuszce węchowej (OB)1,2. Układ węchowy myszy jest doskonałym systemem modelowym do badania molekularnych mechanizmów tworzenia obwodów nerwowych, ponieważ naukowcy mogą wykorzystać wyrażenie OR do identyfikacji określonego podtypu OSN i wizualizacji miejsc projekcji aksonów OSN jako przezroczystych struktur kłębuszkowych. Niezwykłą cechą projekcji OSN jest to, że OR odgrywają pouczającą rolę w rzutowaniu aksonów OSN na OB3,4,5,6. Mówiąc dokładniej, po tym, jak aksony OSN są kierowane w celu przybliżenia regionów docelowych, są one segregowane w celu utworzenia kłębuszków nerkowych w sposób zależny od OR. Wcześniejsze badania wykazały, że cząsteczki OR kontrolują ekspresję cząsteczek sortujących aksony, które regulują segregację kłębuszków nerkowych7,8. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że cząsteczki OR generują neuronalny kod tożsamości poprzez unikalną kombinację cząsteczek sortujących aksony9. Dlatego, aby zrozumieć mechanizm zależnej od OR segregacji kłębuszków nerkowych, konieczne jest scharakteryzowanie profili ekspresji cząsteczek sortujących aksony w OSN.

Barwienie immunologiczne metodą fluorescencyjną jest powszechną metodą wizualizacji ekspresji określonych genów. Ponieważ białka cząsteczek sortujących aksony są głównie zlokalizowane w aksonach OSN, naukowcy muszą użyć sekcji OB, aby scharakteryzować ich wzorce ekspresji w OSN. Przekrój koronalny OB jest rutynowo stosowany do barwienia immunologicznego. Jednak ten preparat traci informacje topograficzne wzdłuż osi przednio-tylnej w tym samym przekroju OB. W związku z tym opracowaliśmy preparat przystrzałkowy przyśrodkowej strony OB, który może zamontować jak najwięcej otaczających kłębuszków nerkowych na tym samym odcinku OB. W połączeniu z barwieniem immunologicznym przy użyciu wielu przeciwciał, preparat ten umożliwia porównanie i analizę wzorców ekspresji cząsteczek sortujących aksony bez różnic barwiących między sekcjami OB.

Ponadto, przedstawiono metodę barwienia immunohistochemicznego bez utrwalenia za pomocą PFA i sacharozy. Metoda ta pozwala naukowcom uzyskać wystarczającą ilość wysokiej jakości danych barwiących do analizy danych wielowymiarowych. Przedstawione tutaj protokoły dostarczą szczegółowych informacji na temat skutecznych metod dla badaczy, którzy badają powstawanie węchowych obwodów nerwowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą komisji etyki eksperymentów na zwierzętach na Uniwersytecie Tokijskim i zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Tokijskiego dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS): dodać tabletkę PBS (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO43-, pH 7,4) do 1 l wody destylowanej i mieszać w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS: dodaj 4 g PFA do 100 ml PBS. Mieszać roztwór w temperaturze 60 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
    1. Po rozpuszczeniu PFA w PBS dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu (NaOH). Następnie ostudzić na lodzie i przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną, aby usunąć wszelkie cząstki stałe. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Zachowaj odpowiednią ostrożność podczas korzystania z tych odczynników. Z okularami ochronnymi należy obchodzić się ostrożnie i używać rękawic, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego pod kapturem chemicznym.
      UWAGA: Użyj świeżego 4% roztworu PFA przygotowanego w ciągu 2 dni.
  3. Przygotować 0,01 M PBS uzupełnionego 0,3% Triton X-100 (PBST): dodać 3 ml Triton X-100 do 997 ml PBS. Mieszać roztwór w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia.
  4. Przygotować 1% i 5% roztwór blokujący: dodać 10 g odtłuszczonego mleka do 200 ml PBST, aby przygotować 5% roztwór blokujący. Mieszać w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia. Rozcieńczyć 5% roztwór blokujący pięciokrotnie PBST, aby przygotować 1% roztwór blokujący.

2. Przygotowanie parastrzałkowych sekcji położniczych

  1. Używaj zwierząt w wieku od 1 do 2 tygodni. Te grupy wiekowe są odpowiednie do następujących eksperymentów, ponieważ kłębuszki nerkowe są wyraźnie widoczne, a mózg można przeciąć czaszką.
  2. Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu (50 mg/kg masy ciała). Perfuzję zwierzęcia przezsercowo z lodowatym 4% PFA w PBS. Z okularami należy obchodzić się ostrożnie i używać rękawic, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego pod kapturem chemicznym.
  3. Po perfuzji odetnij głowę nożyczkami i ostrożnie usuń skórę. Następnie włóż ostrze nożyczek w przestrzeń między górnymi i dolnymi zębami i tnij poziomo, aby usunąć dolną kość szczęki. Odetnij nadmiar tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek, aby pozostawić tkankę węchową, w tym OB i OE.
    UWAGA: Nie usuwaj czaszki otaczającej OB, ponieważ dzięki temu kłębuszki przyśrodkowe są ustawione pionowo prosto.
  4. Zanurz tkankę węchową w PBS, aby usunąć powietrze z jamy nosowej. Odetnij tylną część mózgu pionowo i umieść tkankę węchową na dnie formy osadzającej nacięciem skierowaną w dół. Napełnij formę związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.), a następnie zanurz formę w ciekłym azocie.
    1. Po całkowitym zamrożeniu tkanki w związku inkubować ją w kriostacie w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę.
  5. Wykonać szeregowe przekroje przystrzałkowe (10 μm) OB za pomocą kriostatu i zebrać je, przyklejając do szkiełek pokrytych MAS. Po przyklejeniu należy natychmiast wysuszyć szkiełka suszarką.

3. Dzień 1: Poczwórne barwienie immunologiczne plastrów OB

  1. Myj szkiełka przez 5 minut za pomocą PBS w temperaturze RT. Powtórz 3 razy.
  2. Zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, inkubując szkiełka przez 1 godzinę z 5% roztworem blokującym w temperaturze pokojowej.
  3. Inkubować szkiełka O/N z koktajlem pierwszorzędowych przeciwciał (400 μl każda szkiełka) w 1% roztworze blokującym w temperaturze pokojowej. Należy użyć następujących przeciwciał pierwszorzędowych: przeciwciało anty-Kirrel2 świnki morskiej (1:1000), przeciwciało anty-Semaforyna-7A (Sema7A) (1:500), szczurze przeciwciało anty-OL-protokadheryny (OLPC) (1:500) i mysie przeciwciało przeciwpęcherzykowe transporter glutaminianu2 (VGLUT2) (1:500).

4. Dzień 2: Poczwórne barwienie immunologiczne plastrów OB

  1. Odrzucić roztwór przeciwciała pierwotnego i myć szkiełka przez 5 minut PBST w temperaturze RT. Powtórzyć 3 razy.
  2. Inkubować szkiełka przez 1 godzinę z koktajlem przeciwciał drugorzędowych (400 μl każda szkiełko) w PBS w temperaturze pokojowej. Użyj następujących przeciwciał drugorzędowych: przeciwko osłemu Alexa Fluor 405 (1:400), anty-kozie osła Alexa Fluor 488 (1:400), anty-śwince morskiej osła Alexa Fluor 555 (1:400) i anty-szczurowi osła Alexa Fluor 647 (1:400).
    UWAGA: Wszystkie przeciwciała drugorzędowe powinny pochodzić od tego samego gatunku gospodarza. Wybierz inną długość fali fluorescencji przeciwciał drugorzędowych dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego, aby zapewnić brak nakładania się długości fal
    3. .
  3. Wyrzuć roztwór i myj szkiełka przez 5 minut PBS w temperaturze RT. Powtórz 3 razy.
  4. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą medium montażowego. W tym celu nałóż 2 krople podłoża montażowego na każde szkiełko, a następnie nałóż szkiełko nakrywkowe, usuwając pęcherzyki powietrza.

5. Pomiary intensywności

  1. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj następujących kostek filtrujących: kostka filtra DAPI (wzbudzenie 360/40 nm, emisja 460/50 nm i lustro dichroiczne 400 nm) dla sygnałów Alexa Fluor 405, kostka filtra GFP (wzbudzenie 470/40 nm, emisja 525/50 nm i lustro dichroiczne 495 nm) dla Alexa Fluor 488, kostka filtra TRITC (wzbudzenie 545/25 nm, emisja 605/70 nm i lustro dichroiczne 565 nm) dla Alexa Fluor 555, oraz kostka filtra Cy5 (wzbudzenie 620/60 nm, emisja 700/75 nm i lustro dichroiczne 600 nm) dla Alexa Fluor 647.
    Uwaga: Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać sygnały fluorescencyjne obrazu bez nasycenia.
  2. Zdefiniuj strukturę kłębuszkową za pomocą sygnałów immunofluorescencyjnych VGLUT2. Zmierz intensywność barwienia cząsteczek sortujących aksony w kłębuszkach nerkowych za pomocą ImageJ.

6. Analiza danych

  1. Odejmij sygnały tła od intensywności barwienia cząsteczek sortujących aksony.
  2. Przygotuj macierz danych wyrażeń, która zawiera kolumny złożone z cząsteczek sortujących aksony i rzędy złożone z kłębuszków nerkowych.
  3. Wykonaj analizę składowych głównych (PCA) przy użyciu przygotowanego zestawu danych wyrażeń. Następnie uzyskaj wyniki PCA, współczynniki udziału i ładunki czynników każdego głównego składnika.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mapa kłębuszków węchowych jest tworzona przez początkowe globalne ukierunkowanie i późniejszą centralizację kłębuszków nerkowych aksonów OSN1,2. Segregacja kłębuszków nerkowych jest regulowana przez adhezyjne/odpychające oddziaływania aksonów, w których pośredniczą cząsteczki sortujące aksony, których poziomy ekspresji są określane przez wyrażone cząsteczki OR7. Cząsteczki sortujące aksony biorące udział w ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poczwórne barwienie immunologiczne przystrzałkowych odcinków OB umożliwiło wizualizację i kwantyfikację poziomów ekspresji aż czterech cząsteczek sortujących aksony jednocześnie w większej liczbie kłębuszków nerkowych. Analizując te dane wielowymiarowe za pomocą PCA, można spekulować na temat charakterystyki ekspresji tych cząsteczek.

Dla skutecznego barwienia niezwykle ważne jest przygotowanie próbki tkanki. Niektóre protokoły sugerują, że tkanki powinny być utrwalone 4% PFA i potraktowane 30...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Mitsubishi Foundation, Takeda Science Foundation, JST PRESTO i JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4TAKARA BIOT9181
Mleko odtłuszczoneNacalai tesque31149-75
kozie przeciwciało anty-Sema7AR& D SystemsAF2068
szczurze przeciwciało anty-OLPCMerck MilliporeMABT20
mysie przeciwciało anty-VGLUT2Merck MilliporeMAB5504
kozie przeciwciało anty-BIG-2R& D SystemsAF2205
gunea świnia przeciwciało anty-Kirrel2Operon BiotechnologiesPrzeciwciała anty-Kirrel2 zostały wytworzone przez uodparnienie świnek morskich syntetycznymi peptydami sprzężonymi z KLH (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
osioł anty-mysz Alexa Fluor 405Abcamab175658
osioł anty-koza Alexa Fluor 488 Jackson ImmunoResearch705-545-003
świnka morska przeciwko osłowi Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA21432
osł anty-szczur Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153
Paraformaldehyd (PFA)Wako162-16065
Okulary ślizgowe powlekane MASKleszcze MATSUNAMIMAS-01
Fine Science Tools11253-27
Nożyczki sprężynowe VannasFine Science Tools15000-00
Nożyczki preparacyjneFine Science Tools14090-09
fluorescencyjnyKEYENCEBZ-X700
Kostka filtra DAPIKEYENCEOP-87762
Kostka filtra GFPKEYENCEOP-87763
Kostka filtracyjna TRITCKEYENCEOP-87764
Kostka filtracyjna Cy5KEYENCEOP-87766
ADVANTEC00011185
Związek OCTSakura FinetekM71484
mikroskop Bibuła filtracyjna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
  2. Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
  3. Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
  4. Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
  5. Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
  6. Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
  7. Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
  8. Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
  9. Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
  10. Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9(2011).
  11. Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Olfactory BulbOlfactory Sensory NeuronsImmunostaining MethodAxon Sorting MoleculesFluorescence MicroscopyImage J AnalysisPrimary AntibodiesSecondary AntibodiesGlomerular StructureVGLUT2 Marker

Related Articles