Method Article

Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

DOI:

10.3791/55893

⸱

June 5th, 2017

 ,  , 
1Laboratory of Chemical Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Center for Information and Neural Networks, National Institute of Information and Communications Technology, 3PRESTO, Japan Science and Technology Agency (JST)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węchowe neurony czuciowe wyrażają szeroką gamę cząsteczek sortujących aksony, aby ustanowić prawidłowe obwody neuronowe. Protokół ten opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego w celu wizualizacji kombinatorycznych ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi system węchowy jest często używany do badania mechanizmów tworzenia obwodów nerwowych ze względu na swoją prostą budowę anatomiczną. Węchowy neuron czuciowy (OSN) to dwubiegunowa komórka z pojedynczym dendrytem i pojedynczym nierozgałęzionym aksonem. OSN wyraża tylko jeden gen receptora węchowego (OR), OSN wyrażające dany typ OR zbiegają swoje aksony do kilku zestawów niezmiennych kłębuszków nerkowych w opuszki węchowej (OB). Niezwykłą cechą projekcji OSN jest to, że wyrażone OR odgrywają pouczającą rolę w projekcji aksonalnej. Sale operacyjne regulują ekspresję wielu cząsteczek sortujących aksony i generują kombinatoryczny kod molekularny cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów OSN. Tak więc, aby zrozumieć mechanizmy molekularne specyficznych dla OR mechanizmów kierowania aksonami, konieczne jest scharakteryzowanie ich profili ekspresji na końcach aksonów OSN w obrębie tego samego kłębuszka nerkowego. Celem artykułu było przedstawienie metod pobierania jak największej liczby kłębuszków nerkowych na pojedynczym skrawku OB oraz wykonywania barwienia immunologicznego przy użyciu wielu przeciwciał. Pozwoliłoby to na porównanie i analizę wzorców ekspresji cząsteczek sortujących aksony bez różnic w barwieniu między sekcjami OB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju, neurony są precyzyjnie połączone ze sobą, tworząc prawidłowe obwody neuronowe, co jest kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania mózgu. Ponieważ uważa się, że nieprawidłowe obwody neuronalne w mózgu są przyczyną zaburzeń psychicznych, takich jak autyzm i schizofrenia, zrozumienie mechanizmów powstawania obwodów nerwowych jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie neuronauki.

W układzie węchowym myszy, każdy węchowy neuron czuciowy (OSN) w nabłonku węchowym (OE) wyraża tylko jeden funkcjonalny gen receptora węchowego (OR), a OSN wyrażające ten sam OR zbiegają swoje aksony do określonej pary kłębuszków w stereotypowych miejsca....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą komisji etyki eksperymentów na zwierzętach na Uniwersytecie Tokijskim i zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Tokijskiego dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS): dodać tabletkę PBS (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO43-, pH 7,4) do 1 l wody destylowanej i mieszać w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS: dodaj 4 g PFA do 100 ml PBS. Mieszać roztwór w t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mapa kłębuszków węchowych jest tworzona przez początkowe globalne ukierunkowanie i późniejszą centralizację kłębuszków nerkowych aksonów OSN1,2. Segregacja kłębuszków nerkowych jest regulowana przez adhezyjne/odpychające oddziaływania aksonów, w których pośredniczą cząsteczki sortujące aksony, których poziomy ekspresji są określane przez wyrażone cząsteczki OR7. Cząsteczki sortujące aksony biorące udział w .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poczwórne barwienie immunologiczne przystrzałkowych odcinków OB umożliwiło wizualizację i kwantyfikację poziomów ekspresji aż czterech cząsteczek sortujących aksony jednocześnie w większej liczbie kłębuszków nerkowych. Analizując te dane wielowymiarowe za pomocą PCA, można spekulować na temat charakterystyki ekspresji tych cząsteczek.

Dla skutecznego barwienia niezwykle ważne jest przygotowanie próbki tkanki. Niektóre protokoły sugerują, że tkanki powinny być utrwalone 4% PFA i potraktowane 30.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Mitsubishi Foundation, Takeda Science Foundation, JST PRESTO i JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4TAKARA BIOT9181
Mleko odtłuszczoneNacalai tesque31149-75
kozie przeciwciało anty-Sema7AR& D SystemsAF2068
szczurze przeciwciało anty-OLPCMerck MilliporeMABT20
mysie przeciwciało anty-VGLUT2Merck MilliporeMAB5504
kozie przeciwciało anty-BIG-2R& D SystemsAF2205
gunea świnia przeciwciało anty-Kirrel2Operon BiotechnologiesPrzeciwciała anty-Kirrel2 zostały wytworzone przez uodparnienie świnek morskich syntetycznymi peptydami sprzężonymi z KLH (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
osioł anty-mysz Alexa Fluor 405Abcamab175658
osioł anty-koza Alexa Fluor 488 Jackson ImmunoResearch705-545-003
świnka morska przeciwko osłowi Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA21432
osł anty-szczur Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153
Paraformaldehyd (PFA)Wako162-16065
Okulary ślizgowe powlekane MASKleszcze MATSUNAMIMAS-01
Fine Science Tools11253-27
Nożyczki sprężynowe VannasFine Science Tools15000-00
Nożyczki preparacyjneFine Science Tools14090-09
fluorescencyjnyKEYENCEBZ-X700
Kostka filtra DAPIKEYENCEOP-87762
Kostka filtra GFPKEYENCEOP-87763
Kostka filtracyjna TRITCKEYENCEOP-87764
Kostka filtracyjna Cy5KEYENCEOP-87766
ADVANTEC00011185
Związek OCTSakura FinetekM71484
mikroskop Bibuła filtracyjna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
  2. Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Olfactory BulbOlfactory Sensory NeuronsImmunostaining MethodAxon Sorting MoleculesFluorescence MicroscopyImage J AnalysisPrimary AntibodiesSecondary AntibodiesGlomerular StructureVGLUT2 Marker

Related Articles