Artykuł metodologiczny

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

DOI:

10.3791/55894

⸱

2 listopada 2018

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HR-SD-OCT jest używany do monitorowania postępu degeneracji fotoreceptorów w żywych modelach mysich, oceny dostarczania środków terapeutycznych do przestrzeni podsiatkówkowej oraz do oceny toksyczności i skuteczności in vivo. HR-SD-OCT wykorzystuje światło bliskiej podczerwieni (800-880 nm) i ma optykę specjalnie zaprojektowaną dla unikalnej optyki oka myszy o rozdzielczości osiowej poniżej 2 mikronów. Transgeniczne mysie modele zwyrodnienia zewnętrznej siatkówki (fotoreceptorów) i grupy kontrolnej zostały zobrazowane w celu oceny postępu choroby. Wyciągnięte szklane mikroigły użyto do podania podsiatkówkowych iniekcji wirusa związanego z adenowirusem (AAV) lub nanocząstkami (NP) za pomocą podejścia przeztwardówkowego i przeznaczyniówkowego. Ostrożne umieszczenie igły w przestrzeni podsiatkówkowej było wymagane przed skalibrowanym wstrzyknięciem ciśnieniowym, które dostarcza płyn do przestrzeni podsiatkówkowej. Przeprowadzono operację podsiatkówkową w czasie rzeczywistym na naszym systemie obrazowania siatkówki (RIS). HR-SD-OCT wykazał postępujące jednolite zwyrodnienie siatkówki spowodowane ekspresją toksycznego zmutowanego ludzkiego zmutowanego transgenu rodopsyny (P347S) (RHOP347S) u myszy. HR-SD-OCT umożliwia rygorystyczną ocenę ilościową wszystkich warstw siatkówki. Pomiary grubości zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL) i długości zewnętrznego segmentu fotoreceptora (OSL) korelują z żywotnością fotoreceptora, degeneracją lub ratunkiem. System dostarczania RIS umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wstrzyknięć podsiatkówkowych u noworodków (~P10-14) lub dorosłych myszy, a HR-SD-OCT natychmiast określa powodzenie porodu i mapuje zasięg powierzchniowy. HR-SD-OCT to potężne narzędzie, które może ocenić powodzenie operacji podsiatkówkowej u myszy, a także mierzyć żywotność fotoreceptorów in vivo. HR-SD-OCT może być również stosowany do identyfikacji jednolitych kohort zwierząt w celu oceny zakresu zwyrodnienia siatkówki, toksyczności i ratowania terapeutycznego w przedklinicznych badaniach naukowych nad terapią genową.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naukowcy opracowują terapie genowe dla różnych chorób zwyrodnieniowych siatkówki i siatkówki z nadzieją na przełożenie nowych metod leczenia chorób u ludzi1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Optyczna koherentna tomografia koherentna w dziedzinie czasu lub w domenie spektralnej (SD-OCT) została wykorzystana do zbadania aspektów zwyrodnienia zewnętrznej siatkówki w określonych mysich modelach choroby12,13,14. HR-SD-OCT nie był jednak szeroko stosowany w kontekście optymalizacji oceny modeli mysich w celu określenia szybkości i jednorodności przestrzennej zwyrodnienia siatkówki, ani w kontekście przedklinicznej oceny terapii opartej na genach, na przykład do oceny ratunku, toksyczności lub przestrzennego zasięgu dostarczania wektorów8,15,16. Gdy model mysi zostanie w pełni scharakteryzowany, dane HR-SD-OCT mogą służyć jako informacyjne i wiarygodne źródło do pomiaru wpływu środków terapeutycznych w celu wywarcia ratunku lub toksyczności w mysich modelach zwyrodnienia siatkówki17. Wiele grup stosuje iniekcję podsiatkówkową jako metodę dostarczania wektora ze względu na jej skuteczność w transdukcji fotoreceptorów i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Jednak pozostaje to trudną do opanowania metodą, biorąc pod uwagę, że zwykle wykonuje się ją za pomocą operacji z wolnej ręki z powierzchni rogówki i często jest obarczona zaćmą, krwawieniem i niezamierzonymi odwarstwieniami siatkówki występującymi po prostu w wyniku manipulacji tylnego ciała szklistego. Wiele grup nadal próbuje wstrzykiwać podsiatkówkowo na ślepo i dostarcza wirusa za pomocą ręcznych zastrzyków za pomocą igieł ze stali nierdzewnej o stosunkowo dużej średnicy (34G)8,17,18,19,20,21,22, a kilka z nich wykorzystuje obrazowanie optycznej tomografii koherentnej (OCT) w celu potwierdzenia prawidłowego dostarczenia wektora do siatkówki8,17,20,22. Pewne ulepszenia w metodzie zostały ostatnio opisane przy użyciu igieł w mikroskali napędzanych przez mikromanipulator22.

Prezentujemy zintegrowane podejście, które pomaga w pozycjonowaniu igły, a zastrzyki są ułatwione przez specjalnie ukierunkowany stereoskopowy oftalmoskop zaprojektowany w laboratorium specjalnie do wizualizacji wnętrza małego oka myszy17,23. Użycie mikroigieł z wyciąganego szkła w połączeniu z mikromanipulatorem stereotaktycznym zapewnia lepszą kontrolę umieszczania igły bez konieczności chirurgicznego cięcia (tj. przez spojówki i tkankę łączną) przed wstrzyknięciem. Zastosowanie mikroiniektora o regulowanym ciśnieniu pomaga zapewnić stałą objętość wstrzyknięcia, a wstrzyknięcie może być wykonane ze znacznie większą stabilnością, precyzją i znacznie wolniej niż wstrzyknięcia ręczne wykonywane za pomocą ręcznej strzykawki, zmniejszając w ten sposób występowanie wstrzykiwania pęcherzyków do oka. Mniejsza igła pomaga zapobiegać wyciekom po wyjęciu igły, ponieważ ścieżka jest samouszczelniająca. Aby ocenić zakres wstrzyknięcia/dostarczenia, wiele grup badawczych polega na znalezieniu i ocenie powierzchniowego zakresu zwiększonej ekspresji białka zielonej fluorescencji (EGFP) w siatkówce (konstrukt ekspresji dostarczony przez wektor) w eksperymentalnym punkcie końcowym (eutanazja), aby potwierdzić udane wstrzyknięcia11,19,20,24. Takie podejście (bez wykorzystania OCT) do weryfikacji sukcesu chirurgicznego marnuje ogromną ilość zasobów w czasie zabiegów chirurgicznych i zwierzętach, ponieważ wszystkie zwierzęta z (nieznanymi) niepowodzeniami chirurgicznymi muszą być utrzymywane, a następnie poddawane powtarzalnym środkom aż do eutanazji i pobrania oczu (kiedy mierzy się EGFP). Potwierdzenie lokalizacji wstrzyknięcia w siatkówce można poprawić za pomocą HR-SD-OCT, aby wykazać, że wstrzyknięcie znajduje się między właściwymi warstwami siatkówki (tj. przestrzenią podsiatkówkową). HR-SD-OCT może być również używany do natychmiastowego określania nieudanych prób (niepowodzeń chirurgicznych) w celu zidentyfikowania odpowiednich zmiennych w rzeczywistym czasie chirurgicznym w celu ulepszenia podejścia. Stwierdziliśmy, że HR-SD-OCT zapewnia liczne korzyści w przedklinicznych badaniach terapii genowej, umożliwiając szybką ilościową ocenę zewnętrznego zwyrodnienia siatkówki, umożliwiając identyfikację/ubój badanych zwierząt, które nie spełniają kryteriów eksperymentalnych (np. nieprawidłowe wstrzyknięcie podsiatkówkowe) oraz kierując obrazowanie kontrolne do obszaru oka, w którym dostarczono wektor (gdzie efekt przedkliniczny jest najbardziej prawdopodobny), a także regionów kontrolnych, w których wektor nie został dostarczony. Od czasu jego opracowania, stosowanie SD-OCT jest nadal akceptowane i stosowane przez badaczy okulistyki i jest obecnie uważane za standard obrazowania siatkówki w badaniach naukowych siatkówki na modelach myszy lub gryzoni13,25. HR-SD-OCT i jego możliwości oprogramowania zostały wykorzystane w unikalny, zintegrowany sposób, aby osiągnąć cel, jakim jest skuteczna ilościowa terapia genowa w modelach mysich na każdym etapie procesu, w tym selekcji modelu zwierzęcego, charakterystyki zwyrodnienia w wybranych modelach choroby, dostarczania terapeutycznego, mapowania dostarczania wektorów oraz oceny toksyczności/skuteczności. Zastosowanie HR-SD-OCT pozwala na skuteczniejsze odkrywanie leków na każdym poziomie procesu. Tutaj opisujemy te podejścia, które są stosowane w naszym programie odkrywania leków RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły dla zwierząt zostały przejrzane i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania VA WNY HCS oraz Uniwersytetu w Buffalo-SUNY. Zwierzęta zostały wykorzystane zgodnie z postanowieniami Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) oraz Deklaracją Helsińską.

1. Modele myszy

  1. Zidentyfikuj modele myszy do oceny, w tym kontrole.
    nuta: Obrazowanie przeprowadzono dla C57BL/6(J), hC1/hC1//mWT/mWT, częściowo humanizowanego modelu zwyrodnienia siatkówki myszy homozygotycznego dla ludzkich zmutowanych alleli RHOP347S hC1 na genotypie RHO+/+ myszy typu dzikiego (WT)26,27, hC1 x BL/6(J), częściowo humanizowany model z pojedynczą kopią zmutowanego ludzkiego allelu RHOP347S hC1 na myszy WT RHO+/+ genotyp (hC1/-//mWT/mWT) (uzyskany przez skrzyżowanie hC1/hC1//mWT/mWT z myszami C57BL/6(J)). Powyższe modele autosomalnego dominującego barwnikowego zwyrodnienia siatkówki (adRP) znajdują się na tle C57BL/6(J). Użyto również modelu mysiego, który jest homozygotyczny pod względem dwóch kopii ludzkiego genu WT RHO na tle nokautu RHO myszy28,29. Ta linia znajduje się na tle 129Sv. Kiedy ta linia została przekroczona z nokautem RHO myszy na tle 129Sv, pojedyncza dawka ludzkiego RHO występuje na tle RHO myszy.
  2. Utrzymywać zwierzęta zgodnie z warunkami odnoszącymi się do projektu doświadczalnego.
    nuta: Zwierzęta były przetrzymywane w Weterynaryjnym Zakładzie Medycznym (VMU) w VA WNY HCS. Myszy były karmione standardową karmą laboratoryjną i hodowane w temperaturze 12 godzin: 12 godzin światła: ciemne cykle z miękkimi fluorescencyjnymi białymi światłami górnymi o natężeniu około 300 luksów na poziomie klatki w temperaturze około 72 °F.

2. Żel do oczu myszy

  1. Przygotuj żel optyczny używany do obrazowania siatkówki30 i zabiegów chirurgicznych.
  2. Połączyć 2 mg / ml w/v o wysokiej masie cząsteczkowej (4 x 106 g / mol karbomeru w sterylnym 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS).
  3. Mieszaj w temperaturze pokojowej, aż żel utworzy lepki optycznie przezroczysty żel.
  4. Przenieś żel do małych sterylnych butelek i odwiruj w wirówce stołowej z wahadłowym wiadrem o sile 350 x g, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
  5. Nałóż żel bezpośrednio na rogówkę, aby stworzyć interfejs między rogówką myszy a wysokiej jakości szkłem nakrywkowym (18 mm x 18 mm).

3. Obrazowanie HR-SD-OCT

  1. Zobacz urządzenie HR-SD-OCT (Rysunek 1).
  2. Zważ zwierzę, aby określić właściwą dawkę środka znieczulającego. Następnie znieczulić mysz za pomocą 25 μl/g masy ciała 2,5% roztworu buforowanego roztworu alkoholu 2,2,2-tribromoetylowego (Avertin) we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP) i dodać krople do oczu, aby rozszerzyć źrenice po unieruchomieniu zwierzęcia.
  3. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone przez uszczypnięcie palca u nogi i upewnij się, że zwierzę nie reaguje.
  4. Przytnij wąsy i umieść mysz na sankach HR-SD-OCT.
  5. Umieść oko myszy bezpośrednio przed soczewką głowicy i manipuluj elementami sterującymi stage, aż rogówka i tęczówka zostaną zlokalizowane. Utrzymuj nawilżenie rogówki, stosując sztuczne łzy.
    nuta: Mikromanipulatory do precyzyjnej regulacji na sankach HR-SD-OCT służą do ustawiania myszy w taki sposób, aby otwór źrenicy był wyśrodkowany i zorientowany. Optyczne nakrycie głowy jest następnie przesuwane, aż siatkówka stanie się widoczna, a zwierzę jest dalej dostosowywane w celu uzyskania jak najlepszego obrazu.
  6. Najpierw otwórz program "Mysz" i kliknij "pacjent/badanie". Po drugie, kliknij "dodaj pacjenta" i wprowadź odpowiednie informacje, aby zidentyfikować zwierzę w oknie nowego pacjenta i "zapisz i wyjdź". Po trzecie, kliknij "dodaj egzamin", a następnie "rozpocznij egzamin". Po czwarte, kliknij "dodaj skan niestandardowy" i wybierz "wolumin prostokątny", wybierz OD lub OS dla obrazowanego oka, a następnie kliknij "dodaj badanie". Na koniec zacznij celować instrumentem i ustawiać zwierzę, aby uzyskać interesujący Cię obszar. Po znalezieniu właściwego obszaru usuń nadmiar płynu z powierzchni oka za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką tuż przed akwizycją obrazu, aby jeszcze bardziej poprawić jakość obrazu, a następnie kliknij "rozpocznij migawkę", a jeśli uzyskasz dobry obraz, kliknij "zapisz skan".
    nuta: Typowe parametry dla prostokątnych obrazów HR-SD-OCT to 900 a-skanów/b-skan i 90 b-skanów/obraz. Pozyskane obrazy mają wymiary 1,4 mm x 1,4 mm. Obrazowany obszar siatkówki zależy od konkretnego eksperymentu, ale większość obrazów jest wyśrodkowana na głowie nerwu wzrokowego (ONH).

4. Ocena obecności, częstości i jednorodności modelowych zewnętrznych zwyrodnień siatkówki

  1. Ocena modelu zwyrodnienia siatkówki zewnętrznej metodą HR-SD-OCT
    1. Uzyskaj zwierzęta o szerokim spektrum wieku zarówno dla osób kontrolnych, jak i eksperymentalnych, aby ocenić obecność, częstość i jednorodność zewnętrznego zwyrodnienia siatkówki.
    2. Wykonaj obrazowanie HR-SD-OCT na wielu zwierzętach w każdym wieku z obu kohort (chorobowych i normalnych). Użyj metody opisanej w 3.1.6, aby uzyskać obrazy OCT.
      nuta: Dane można zebrać z dużej kohorty zwierząt jednocześnie, które mają rozłożone urodziny obejmujące szeroki okres czasu (1 rok), lub małą kohortę zwierząt można wykorzystać do zebrania wielu obrazów w długim okresie czasu (1 rok) w celu uzyskania podobnych wyników.
    3. Otwórz nagrany obraz o objętości prostokątnej HR-SD-OCT i zidentyfikuj pierwszy skan b, który ma zostać zmierzony (najlepiej będzie zawierał ONH lub inny możliwy do zidentyfikowania punkt orientacyjny) z zestawu obrazów. Powiększ obraz, aby wypełnić ekran, korzystając z funkcji powiększania w oprogramowaniu.
    4. Otwórz żądaną liczbę suwmiarek, klikając prawym przyciskiem myszy obraz b-scan, a następnie klikając "Suwmiarki" i na koniec klikając tyle suwmiarek, ile chcesz (są ponumerowane od 1 do 10). Upewnij się, że suwmiarki znajdują się w prawym dolnym rogu obrazu. Korzystając z funkcji "Konfiguruj suwmiarkę", przypisz je wszystkie jako "pionowe" w kolumnie bloku kąta i włącz "Wyświetl lokalizację suwmiarki", aby ułatwić równomierne rozmieszczenie w siatkówce, a na koniec kliknij zastosuj.
      nuta: 1. suwmiarka powinna być umieszczona po lewej stronie obrazu podczas przetwarzania prawego oka oculus dexter (OD), a 1. suwmiarka powinna być umieszczona po prawej stronie obrazu podczas przetwarzania obrazów oculus sinister (OS) lewego oka. Powoduje to orientację nosową do czasowej wszystkich danych zarówno dla lewego, jak i prawego oka podczas kreślenia.
    5. Za pomocą myszy komputerowej przesuń każdą suwmiarkę w żądane miejsce (w odległości 2.0 mm od siebie) w poprzek b-scan, pamiętając, aby umieścić jedną suwmiarkę na środku głowy nerwu wzrokowego, na obrazach b-scan, które ją zawierają (ustaw tę suwmiarkę na zero). Następnie użyj myszy, aby kliknąć i przeciągnąć suwmiarkę na długość, aby objąć obszar zainteresowania. Dowolnie ustaw suwmiarki, które nie nakładają mierzalnych obszarów b-scan na maksymalną długość i ignorują je podczas analizy danych.
    6. Zmierz grubość ONL za pomocą narzędzi suwmiarki, umieszczając górną część suwmiarki na zewnętrznej membranie ograniczającej (ELM), a dolną część suwmiarki na dole zewnętrznej warstwy splotowatej (OPL). Powtórz tę czynność dla każdej suwmiarki w poprzek siatkówki w odstępach co 0,2 mm. Zapisz pomiary.
    7. Po umieszczeniu wszystkich suwmiarki i dopasowaniu ich do rozmiaru, kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie i kliknij "Zapisz dane suwmiarki".
    8. Powtórz pomiary na kolejnych skanach b (co 10skan działa dobrze) z tego samego prostokątnego obrazu OCT o objętości obejmującego całą siatkówkę od dolnych do górnych obszarów. Zaciski powinny pozostać otwarte i znajdować się w tym samym miejscu w osi X. Dostosuj długość zacisków bez przesuwania ich w kierunku X.
    9. Otwórz pliki z danymi zapisu, klikając małą ikonę pliku obok przetworzonego obrazu b-scan i kliknij "Przejdź do danych". Kliknij "Data modyfikacji", aby ułożyć pliki w kolejności na podstawie zaoszczędzonego czasu i otworzyć wszystkie pliki dla każdego zmierzonego b-scan.
    10. Skompiluj surowe dane z każdego skanowania b-scan w jednym pliku w kolejności od najniższej do najwyższej na podstawie numeru klatki. Wybierz kolumny danych, w tym "Nazwa suwmiarki", "Długość" i "Środek X".
    11. Upewnij się, że środek X jest taki sam dla wszystkich skanów b mierzonych dla każdego przetworzonego obrazu OCT o objętości prostokątnej. Usuń wszystkie dane z suwmiarki, które nie były używane do rejestrowania pomiarów, i ustaw suwmiarkę znajdującą się w środku głowy nerwu wzrokowego na zero.
    12. Wykreśl dane dla X i wielu zestawów danych Y, aby uzyskać funkcję wykresu 3D do wykreślenia całkowitej grubości ONL lub innej zmierzonej warstwy siatkówki.
    13. Porównaj pomiary ONL między zwierzętami kontrolnymi i doświadczalnymi w odpowiednim wieku, aby określić szybkość i jednorodność potencjalnego zwyrodnienia siatkówki.
    14. Powtórz ten proces dla pomiarów OSL przy użyciu tych samych obrazów b-scan. Postępuj zgodnie z tą samą metodologią, która jest używana do pomiaru ONL, z wyjątkiem umieszczenia suwmiarki między ELM a membraną Brucha (BM).
      nuta: Przykładowy sposób umieszczenia suwmiarki znajduje się w sekcji Reprezentatywne wyniki (Rysunek 3B). Należy to zrobić na powiększonym obrazie, aby zmniejszyć błąd.
    15. Powtórz analizę danych dla wielu zwierząt dla każdych urodzin zarówno dla kohort eksperymentalnych, jak i kontrolnych.
  2. Kompleksowy pomiar i mapowanie 3D grubości ONL lub OSL za pomocą narzędzia do suwmiarki programowej
    1. Przejrzyj obrazy OCT po wstrzyknięciu i zanotuj wszelkie możliwe do zidentyfikowania punkty orientacyjne, takie jak ONH lub naczynia krwionośne w siatkówce. Następnie ustaw kursor myszy, aby uzyskać kolejne SD-OCT z tego samego regionu i upewnij się, że dołączyłeś te same możliwe do zidentyfikowania punkty orientacyjne.
      nuta: Upewnij się, że obszar siatkówki obrazowany i zaangażowany w odwarstwienie siatkówki jest zidentyfikowany na obrazach SD-OCT po wstrzyknięciu. Nagraj obraz SD-OCT z woluminem prostokątnym i zapisz go.
    2. Przetwarzaj zarejestrowane obrazy zgodnie z powyższym opisem w krokach od 4.1.3 do 4.1.14. Zapisz dane suwmiarki i wydrukuj zgodnie z powyższym opisem.
      nuta: Wynikowa tablica pomiarów ONL jest używana do tworzenia wykresu 3D przedstawiającego grubość ONL. Położenie suwmiarki wzdłuż osi X pozwala na ponowne wykreślenie wykresu, umieszczając nerw wzrokowy w punkcie początkowym (0) wzdłuż osi X. Oś Y jest wykreślana przy użyciu numeru b-scan, a nerw wzrokowy jest następnie używany do zdefiniowania punktu początkowego, co pozwala na prawidłowe ustawienie nerwu wzrokowego w punkcie początkowym osi Y. Identyfikacja nerwu wzrokowego w każdym zestawie danych pozwala na niezawodne wyrównanie obrazów kontrolnych.
  3. Mapowanie zasięgu miejsca iniekcji na obraz dna oka
    1. Wykonaj OCT o prostokątnej objętości po wstrzyknięciu, aby potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia. Postępować zgodnie z metodą opisaną w ppkt 3.6.
    2. Użyj funkcji Caliper w oprogramowaniu, aby zidentyfikować punkt przegięcia na granicy odłączonej siatkówki na podstawie wielu skanów b obejmujących cały obraz OCT. Do otwierania suwmiarki należy użyć metody opisanej w ppkt 4.1.4.
    3. Zapisz obrazy dna oka z odwzorowaną lokalizacją skanu OCT b i odpowiednią pozycją suwmiarki na obrazie dna oka, która odpowiada jego lokalizacji.
    4. Skompiluj wszystkie obrazy dna oka w obraz złożony, w tym pozycje suwmiarki, co daje precyzyjną mapę miejsca wstrzyknięcia na obraz dna oka (przykład w sekcji Reprezentatywne wyniki, Rysunek 5A).

5. Zastrzyki do gałki ocznej

UWAGA: Szczegóły dotyczące korzystania z RIS są bardziej szczegółowo opisane w niedawnym badaniu23.

  1. Przygotowanie szklanych igieł iniekcyjnych
    1. Autoklawuj rurki kapilarne z filamentami w małych partiach, stosując cykl suchy.
    2. Użyj ściągacza do pipet i ustaw program, który wytworzy szklaną końcówkę o najostrzejszym kącie i średnicy w zakresie 2-5 μm.
      nuta: Przykładowy 5-etapowy program, który wytworzył skuteczne igły w naszym ściągaczu do pipet, jest pokazany w Tabeli 1.
    3. Wyciągnięte szklane igły należy przechowywać w sterylnym słoiku z igłami do pipet w temperaturze pokojowej.
  2. Napełnić igłę iniekcji żądanym roztworem do wstrzykiwań
    1. Zamontuj igłę w uchwycie igły, pozostawiając około 5/8" wystające poza koniec uchwytu.
      nuta: Odległość mniejsza niż 5/8" utrudni dotarcie do roztworu do wstrzykiwań w celu napełnienia igły, ponieważ uchwyt igły nie mieści się łatwo w otworze probówki o pojemności 0,2 ml. Ponadto wystająca igła o więcej niż 5/8 cala powoduje znacznie większe oscylacje lub precesję końcówki, co utrudnia obrazowanie w czasie rzeczywistym, ponieważ końcówka opuszcza płaszczyznę ogniskowej lub pole widzenia (FOV) podczas próby przebicia oka.
    2. Roztwór do wstrzykiwań należy przygotować w jałowej probówce o pojemności 0,2 ml. Dodać rozcieńczenie 1:10 sterylnego siarczanu fluoresceiny (10 mg/ml w 1x PBS) do roztworu do wstrzykiwań, aby uzyskać końcowe stężenie fluoresceiny 1 mg/ml.
      nuta: Dokładny użyty barwnik jest specyficzny dla użytkownika i może to być wszystko, co jest nietoksyczne i widoczne gołym okiem w świetle białym, aby ułatwić precyzyjne umieszczenie końcówki igły na poziomie RPE i przestrzeni podsiatkówkowej.
    3. Wizualizuj igłę przez mikroskop stereoskopowy, używając pokręteł sterujących 3-osiowego mikromanipulatora, aby ustawić igłę tak, aby była wyrównana ze środkiem rurki zawierającej roztwór do wstrzykiwań, który ma być użyty do napełnienia igły.
    4. Ostrożnie wbić końcówkę igły do probówki o pojemności 0,2 ml, aż końcówka igły zostanie zanurzona w płynie. Pobrać żądaną objętość płynu iniekcyjnego (np. 1 μl) do igły niezbędnej do wykonania pojedynczego wstrzyknięcia. Zachowaj pozostały roztwór w probówce umieszczonej w lodzie.
  3. Przygotowanie zwierzęcia do wstrzyknięcia
    UWAGA:     Mikroskop RIS jest utrzymywany w czystości i jest systemem bezdotykowym. Płyta grzewcza jest pokryta czystą podkładką adsorpcyjną, a igły są sterylizowane w autoklawie przed wyciągnięciem. Po pociągnięciu przez samosterylizujący się podgrzewany metalowy pasek, są one przechowywane w zamkniętej sterylizowanej komorze przeznaczonej do przechowywania ciągniętych szklanych igieł. Z igłami obchodzi się wyłącznie rękami w rękawiczkach i należy uważać, aby nie dotykać końcówki igły podczas montażu jej w uchwycie. Wstrzyknięte roztwory są przygotowywane przy użyciu techniki sterylnej i poddawane testom pod kątem zanieczyszczenia poprzez rozsypywanie próbki preparatów wirusa na płytkach agarowych LB i inkubację ich przez noc w temperaturze 37 °C.
    1. Zważyć zwierzę (g) w celu określenia odpowiedniej dawki znieczulającego środka przeciwbólowego.
    2. Podawać środek znieczulający (2,5% roztwór buforowanego alkoholu 2,2,2-tribromoetylowego (Avertin)) we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP).
    3. Natychmiast zastosuj leki antycholinergiczne (np. cyklopentylan) do obu oczu, aby rozszerzyć źrenice.
    4. Przytnij wąsy zwierzęcia i ponumeruj zwierzę za pomocą dziurkacza w ucho lub innej metody.
    5. Przemyć oczy i okolice rozcieńczoną betadyną.
      nuta: Unikaj dostania się jakiegokolwiek roztworu w okolice nosa, ponieważ może to spowodować niezamierzone utonięcie.
    6. Umieść mysz na poduszce grzewczej, utrzymywanej w temperaturze 39 °C, we wstępnie uformowanym glinianym uchwycie na mysz modelarską z oczkiem, które ma być wstrzyknięte w kierunku igły.
    7. Upewnij się, że mysz nie reaguje, wykonując test szczypania tylnej stopy.
  4. Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowej
    1. Użyj pary sterylnych, kleszczyków tęczówki, aby delikatnie wywołać wytrzeszcz kuli ziemskiej, umieszczając końcówki kleszczy w pozycjach godziny 7 i 10 na powiekach, jednocześnie otwierając i dociskając w dół.
    2. Użyj kleszczyków, aby nakłonić powieki pod gałką oczną, aby nie dostała się ona do oczodołu podczas procesu wstrzykiwania.
      nuta: Zwierzęta w wieku od 10 do 14 dni często łatwiej trzymają oko poza oczodołem niż starsze zwierzęta.
    3. Skieruj końcówkę igły około 1-1,5 mm poniżej krawędzi rąbka rogówki i ostrożnie wbij ją do oka przez spojówkę, aż utworzy zagłębienie twardówkowe, gdy igła wnika w tkankę twardówki i umożliwia manipulację oka.
    4. Obróć oko w dół za pomocą mikromanipulatora, aby uwidocznić wgłębienie twardówki przez rozszerzoną źrenicę za pomocą mikroskopu stereoskopowego RIS.
    5. Nałóż kroplę sterylnego żelu do oczu lub 1x roztwór PBS i przykryj sterylnym szkiełkiem nakrywkowym.
    6. Skoncentruj się na wgłębieniu twardówki utworzonym przez końcówkę igły (2-5 μm) i przesuwaj igłę do przodu, aż w miejscu wstrzyknięcia utworzy się ostry szczyt siatkówki.
    7. Obracać igłę za pomocą uchwytu, aż końcówka przebije się przez twardówkę, a fluoresceina w igle będzie widoczna pod siatkówką w bezpośrednim sąsiedztwie monowarstwy komórek RPE.
    8. Wkręć końcówkę igły tak, aby była styczna do kuli ziemskiej, a następnie aktywuj pompę wtryskową za pomocą przełącznika nożnego.
    9. Po dostarczeniu żądanej objętości (0,5-1 μl) do przestrzeni podsiatkówkowej należy wyjąć igłę i sprawdzić, czy pęcherzyk jest stabilny i czy płyn nie wycieka z miejsca wstrzyknięcia, co jest pierwszym kryterium udanego wstrzyknięcia.
      nuta: Utrzymanie odpowiedniej średnicy końcówki (średnica 2-5 μm) ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia wycieku z miejsca wstrzyknięcia.
    10. Umieść zwierzę na platformie obrazowania instrumentu OCT. Postępuj zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi obrazowania HR-SD OCT, aby zarejestrować obraz o objętości prostokątnej.
    11. Upewnij się, że wstrzyknięty płyn znajduje się w przestrzeni podsiatkówkowej i zachowaj obrazy w celu określenia zakresu pęcherzyka.
    12. Wyjąć zwierzę z uchwytu i nałożyć dużą ilość maści z antybiotykiem na oczy, w które wstrzyknięto
      13. środek.
    13. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aż całkowicie wyzdrowieje, a następnie umieść je z powrotem w oryginalnej klatce, z której pochodzi.
      nuta: Nasze zwierzęta są zwykle wstrzykiwane przed odsadzeniem, dlatego zwierzęta muszą zostać zwrócone do klatki z matką.
  5. Mapowanie zasięgu pęcherzyka podsiatkówkowego za pomocą narzędzi programowych do instrumentów OCT.
    1. Uzyskaj prostokątny obraz OCT objętości, stosując metody opisane wcześniej, pęcherzyka i ustaw go tak, aby zawierał rozpoznawalny punkt orientacyjny w oku, taki jak ONH.
      nuta: Nagrywanie 90 skanów b dobrze sprawdza się w mapowaniu benia, ale może być używane w zależności od żądanej rozdzielczości.
    2. Dodaj pojedynczą suwmiarkę do rysunku i umieść ją w punkcie przegięcia, w którym siatkówka odłącza się od RPE i naczyniówki.
      nuta: Oprogramowanie automatycznie odwzorowuje odpowiedni punkt na linię na obrazie dna oka reprezentującym suwmiarkę i oceniany b-scan.
    3. Przechwyć ekran po umieszczeniu suwmiarki i skompiluj obrazy, aby skutecznie odwzorować granicę pęcherzyka iniekcyjnego na obrazie dna oka, który precyzyjnie odwzorowuje miejsce wstrzyknięcia. Zapisz skompilowany obraz w celach informacyjnych, aby pomóc w zlokalizowaniu obszarów zainteresowania podczas dalszego obrazowania.
      nuta: Alternatywnie, dane suwmiarki mogą być zapisywane, spełniane i wykreślane przy użyciu podobnej metody do wykreślania zestawów danych 3D o grubości ONL.
  6. Iniekcja doszklistkowa
    1. Umieść końcówkę igły, stosując podobne podejście chirurgiczne, jak wstrzyknięcie podsiatkówkowe, z tą różnicą, że igła jest wbijana całkowicie przez twardówkę w pars plana około 0,25 mm za rąbkiem rogówki i do ciała szklistego.
    2. Po umieszczeniu igły należy zastosować impuls iniekcyjny za pomocą pedału nożnego.
      nuta: Obserwuje się szybką dyfuzję barwnika fluoresceiny w ciele szklistym muszli ocznej, wypełniając rozszerzoną aperturę źrenicy fluorescencją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena obecności, częstości i jednorodności modelowego zwyrodnienia zewnętrznej siatkówki
Pomiary ONL rejestrowano od OPL do ELM, określając granice ONL za pomocą suwmiarki dostarczonej w oprogramowaniu przyrządu. Celem było zmapowanie progresji zwyrodnienia zewnętrznej siatkówki w częściowo humanizowanym modelu myszy adRP. Wykazano, że porównywalne obrazy z myszy kontrolnej C57BL/6(J) i mysiego modelu hC1/hC1//mWT/mWT, wyrażające dwie kopie zmutowanych genów ludzkiej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HR-SD-OCT zapewnia prostą metodę charakterystyki potencjalnych zwierzęcych modeli chorób u ludzi w celu określenia ich przydatności w testowaniu potencjalnych środków terapeutycznych. Zdolność do szybkiego i wiarygodnego scharakteryzowania potencjalnego zwierzęcego modelu choroby człowieka ma kluczowe znaczenie dla procesu odkrywania leków terapeutycznych (np. zastępcza terapia genowa, terapia genowa knockdown rybozymu lub shRNA, skojarzona terapia genowa). HR-SD-OCT zapewnia prostą, szybką i nieinwazyjną metodę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Relacje handlowe: MCB: brak; JMS: Żadnych. System obrazowania siatkówki (RIS)23 zastosowany w tym badaniu jest nowatorskim urządzeniem o istotnym zastosowaniu dla każdej grupy dążącej do przeprowadzenia badań nad dostarczaniem terapii genowej u myszy, gryzoni lub małych zwierząt. Chociaż autorzy nie mają obecnie żadnych konfliktów do zadeklarowania w odniesieniu do tego urządzenia, Uniwersytet w Buffalo-SUNY i Administracja Weteranów mają prawa do własności intelektualnej i mogą dążyć do komercjalizacji tego instrumentu w przyszłości.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten materiał jest oparty na pracy częściowo wspieranej przez Departament Spraw Weteranów (VA), Administrację Zdrowia Weteranów, Biuro Badań i Rozwoju (Badania i Rozwój Laboratorium Biomedycznego) (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS jest zatrudniony, częściowo, jako lekarz-naukowiec w okulistyce przez VA WNY; MCB jest częściowo zatrudniony przez VA WNY. Badanie zostało przeprowadzone i częściowo wspierane przez Veterans Administration Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Treści nie reprezentują poglądów Departamentu ds. Weteranów ani rządu Stanów Zjednoczonych. Wspierany również w dużej części przez grant NIH/NEI R01 EY013433 (PI: JMS), GRANT NIH/NEI R24 EY016662 (UB Vision Infrastructure Center, kierownik projektu: M Slaughter, dyrektor modułu biofotoniki: JMS), nieograniczony grant dla Wydziału Okulistyki/Uniwersytetu w Buffalo z Research to Prevent Blindness (Nowy Jork, NY) oraz grant z Fundacji Oishei (Buffalo, Nowy Jork). Przyjmujemy dar transgenicznej linii RHOP347S hC1 i nokaut RHO myszy eksonu 1 od dr Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) oraz dar modelu transgenu NHR-E w stanie heterozygotycznym na tle nokautu RHO eksonu myszy 2 od dr G. Jane Farrar i Petera Humphriesa (Trinity College, Dublin, IRE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Przyrząd do koherentnej koherentnej koherentności oka (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
System obrazowania siatkówki (RIS)WłasnyN/A
Stemi 2000CZeiss000000-1106-133
P-97 Ściągacz do mikropipet Flaming/BrownSutter Instrument Cop-97
MMN-33 mikromanipulator Narishige USAMMN-33
PLI-100  mikrowtryskiwaczAparat Harvard64-1736
Uchwyt na mikropipety (obrotowy)Wewnętrznymikropipet Nie dotyczy
World Precision Instruments Inc.E210
  Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego 1,5-1,8 X 100mm, Aparat Harvarda30-0053
2,2,2-tribromoetanolSIGMA AldrichT48402-25G
Alkohol tert-amylowySIGMA Aldrich240486-100ML
Siarczan atropiny Roztwór okulistyczny, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Roztwór okulistyczny chlorowodorku cyklopentolanu, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Maść siarczanowa gentamycyny USP, 0,1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Chlorowodorek tetrakainyBausch i LombNDC 24208-920-64
Roztwór okulistyczny, USP 0,5%Bausch i LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Preparaty wirusoweViGene /UNCN/A
Złote nanoprętyNANOPARTzD12M-850-1.75
Siarczan fluoresceiny AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-548-A
KleszczeMilton18-825
Igły 30 grubościBeckton Dickenson   W11604
StrzykawkiBeckton Dickenson   
Pakiet oprogramowania BioptigenBioptigenN/A
Chlorowodorek proparakainy Roztwór okulistyczny, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftNie dotyczy
Adobe IllustratorAdobe 
SkalaMettler
NożyczkiŚwiat Instrumenty
Dziurkacz do uszuNat' l opaska
CL 100 Źródło światłaWelch AllynCL100
GazJackson Zasilanie spawalniczeNie dotyczy
Podgrzewana kąpiel wodnaNeslabRTE-140
Płyta grzewczaw domuNie dotyczy
Mata grzewczaCincinnatti Sub Zero273
Gliniany uchwyt na myszPlast.i.clay Amerykańska sztuka gliniana Co.Nie dotyczy
BetadineMedLine NDC53329-938-06
Aplikatory z bawełnianą końcówkąAmerykańska służba zdrowiaCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Rękawice NitrylVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome instrumentDiagnosys Inc.D125
Soczewki kontaktoweWłasne
oprogramowanie Diagnosys DiagnosysInc.Nie dotyczy
oprogramowania Origin 6.1OriginLab Corp.Nie dotyczy
Elektrody referencyjneOcuscienceElektroda z gwintem F (DTL) 24"
mikroskop pojemnik do przechowywania 309659Precyzyjne azotowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
  3. Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
  4. Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
  5. Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
  6. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
  7. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
  8. Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).
  9. Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
  10. Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
  11. Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
  12. Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
  13. Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494(2014).
  14. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9(2015).
  15. Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
  16. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).
  17. Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).
  18. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
  19. Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
  20. Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  21. Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).
  22. Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).
  23. Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
  24. Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
  25. Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203(2014).
  26. Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
  27. Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
  28. Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
  29. Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
  30. Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
  31. Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
  32. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  33. Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
  34. Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
  35. Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

iniekcja podsiatk wkowaobrazowanie oka myszyzewn trzna warstwa j drowadegeneracja fotoreceptor wwirus towarzysz cy adenowirusomwizualizacja w czasie rzeczywistympodej cie przeztward wkowesystem obrazowania siatk wki

Powiązane artykuły