Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji

29.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55898

⸱

7 września 2017

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

W tym artykule

Podsumowanie

Wirusy grypy typu A (IAV) są ważnymi ludzkimi patogenami układu oddechowego. Aby zrozumieć patogenność wirusów IAV i przeprowadzić badania przedkliniczne nowych metod szczepień, potrzebne są modele zwierzęce naśladujące ludzką fizjologię. W tym miejscu opisujemy techniki oceny patogenezy IAV, odpowiedzi humoralnych i skuteczności szczepionki przy użyciu mysiego modelu infekcji.

Streszczenie

Wirusy grypy powodują ponad 500 000 zgonów na całym świecie1 i wiążą się z rocznym kosztem 12 - 14 miliardów USD w samych Stanach Zjednoczonych, biorąc pod uwagę bezpośrednie wydatki na leczenie i hospitalizację oraz absencję w pracy2. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie w badaniach nad wirusem grypy A (IAV) w celu oceny patogenezy wirusa, interakcji gospodarz-patogen, odpowiedzi immunologicznej oraz skuteczności obecnych i/lub nowatorskich podejść do szczepionek, a także leków przeciwwirusowych. Myszy są korzystnym modelem małych zwierząt, ponieważ ich układ odpornościowy jest ewolucyjnie podobny do tego, który występuje u ludzi, są dostępne u komercyjnych dostawców jako genetycznie identyczne podmioty, istnieje wiele szczepów, które można wykorzystać do oceny genetycznych podstaw infekcji i są stosunkowo niedrogie i łatwe do manipulowania. Aby podsumować zakażenie IAV u ludzi przez drogi oddechowe, myszy są najpierw znieczulane przed inokulacją donosową zakaźnymi wirusami IAV pod warunkiem odpowiedniego zabezpieczenia biologicznego. Po zakażeniu patogenezę IAV określa się poprzez codzienne monitorowanie zachorowalności (utraty masy ciała) i śmiertelności (przeżycia). Ponadto patogenezę wirusa można również ocenić, oceniając replikację wirusa w górnych (błona śluzowa nosa) lub dolnych (płuca) drogach oddechowych zakażonych myszy. Reakcje humoralne po zakażeniu IAV można szybko ocenić za pomocą nieinwazyjnych testów krwawienia i wtórnego wykrywania przeciwciał, mających na celu wykrycie obecności przeciwciał całkowitych lub neutralizujących. W tym miejscu opisujemy powszechne metody stosowane do donosowego (i.n) zakażenia myszy IAV i oceniamy patogenezę, humoralne odpowiedzi immunologiczne i skuteczność ochrony.

Wprowadzenie

IAV to wirusy otoczkowe sklasyfikowane w rodzinie Orthomyxoviridae3. Zawierają osiem jednoniciowych cząsteczek RNA o ujemnej polarności3. U ludzi IAV wywołują sezonowe epidemie i sporadyczne pandemie o ważnych konsekwencjach, gdy nowe wirusy są wprowadzane do populacji ludzkiej4. Co więcej, sezonowe IAV są wysoce i szybko przenoszone między ludźmi, powodując co roku zwiększone straty ekonomiczne na całym świecie2,5. Objawy IAV obejmują kaszel, przekrwienie błony śluzowej nosa, gorączkę, złe samopoczucie, ból głowy, anoreksję i bóle mięśni, ale wirus może również powodować cięższą chorobę u pacjentów z obniżoną odpornością6. W rzeczywistości Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) oblicza, że wirusy grypy sezonowej powodują 300 000 - 500 000 zgonów na całym świecie każdego roku1. Obecnie istnieją tylko dwie klasy leków zatwierdzonych przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do profilaktyki i leczenia grypy u ludzi: inhibitory neuraminidazy (NA) (np. oseltamiwir) i blokery kanału jonowego M2 (np. amantadyna); Jednak pojawienie się lekoopornych wariantów wirusa stanowi coraz większy problem. Szczepienia pozostają zatem najlepszą opcją medyczną chroniącą ludzi przed zakażeniami wirusami IAV. Do tej pory dostępne są trzy rodzaje szczepionek przeciw grypie licencjonowanych przez FDA do stosowania u ludzi: rekombinowane szczepionki białkowe hemaglutyniny wirusowej (HA), inaktywowane szczepionki przeciw grypie (IIV) i żywe atenuowane szczepionki przeciw grypie (LAIV)5,7. Trzy szczepionki mają na celu wywołanie adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowemu białku HA, głównemu celowi przeciwciał neutralizujących przeciwko IAV.

Zweryfikowany model mysi do badania infekcji IAV in vivo

Modele zwierzęce zostały wykorzystane do badania, między innymi, patogenezy IAV8,9,10,11, czynniki wirusowe, które przyczyniają się do choroby12 i/lub transmisji wirusa13,14, oraz do testowania skuteczności nowych szczepionek lub leków przeciwwirusowych9,10,15. Myszy (Mus musculus) są najszerzej wykorzystywanym modelem zwierzęcym do badań nad IAV z kilku powodów: 1) układ odpornościowy jest ewolucyjnie podobny do tego obecnego u ludzi; 2) niskie koszty, w tym zakup, trzymanie i rozmnażanie zwierząt; 3) mały rozmiar do łatwej manipulacji i przechowywania; 4) minimalna zmienność gospodarza w celu uzyskania jednorodnych odpowiedzi i wyników; 5) dużą wiedzę z zakresu biologii myszy, w tym sekwencji genomu; 6) wiele dostępnych odczynników z zakresu biologii molekularnej i/lub immunologii; 7) dostępne myszy z nokautem (KO) do badania wpływu danego białka gospodarza na infekcję wirusową; oraz 8) wiele szczepów myszy, które można wykorzystać do oceny genetycznych podstaw infekcji.

Obecnie dostępnych jest kilka szczepów myszy do badania IAV in vivo. Wiek, status immunologiczny, płeć, tło genetyczne i szczep myszy, a także drogi zakażenia, dawka i szczepy wirusa mają wpływ na wynik zakażenia IAV u myszy. Najczęstszymi szczepami myszy stosowanymi w badaniach nad IAV są myszy C57BL/6, BALB/C, a ostatnio DBA.2, ponieważ są one bardziej podatne na chorobę IAV niż dwa poprzednie szczepy16,17,18,19,20. Co ważne, odpowiedź immunologiczna może być również różna w zależności od szczepu myszy18,19,20. Dlatego bardzo ważne jest, aby odzyskać wszystkie dostępne informacje o myszy i szczepie IAV, aby wybrać najlepszą opcję dla eksperymentu, który ma zostać przeprowadzony

.

Chociaż mysz jest dobrym zwierzęcym modelem infekcji do badań in vivo z IAV, mają one kilka ograniczeń, które muszą być uwzględnione w projekcie eksperymentalnym. Na przykład głównym ograniczeniem wykorzystywania myszy do badań in vivo jest to, że IAV nie przenoszą się między myszami. W związku z tym do badań nad transmisją stosuje się bardziej akceptowane modele zwierzęce (np. fretki lub świnki morskie)16,17,21. Ponadto istnieje kilka różnic między objawami IAV u myszy i ludzi. W przeciwieństwie do ludzi, myszy nie rozwijają gorączki po zakażeniu IAV; Z drugiej strony występują u nich hipotermia16,17. U myszy replikacja IAV jest skoncentrowana w dolnych drogach oddechowych (płucach), a nie w górnych drogach oddechowych. Tak więc zjadliwość IAV u myszy nie zawsze jest skorelowana z tą obserwowaną u ludzi. Podsumowując, ponieważ zalety przeważają nad ograniczonymi wadami, mysz stanowi pierwszy model zwierzęcy używany do oceny patogenezy wirusa grypy, immunogenności i skuteczności ochronnej w badaniach nad szczepionkami i lekami przeciwwirusowymi. Co więcej, nie byłoby etycznie dopuszczalne prowadzenie badań z IAV na dużych modelach zwierzęcych bez uprzednich dowodów na zakażenie IAV na małych zwierzętach. W tym manuskrypcie opisujemy, jak zakażać myszy donosowo (i.n.) wirusem IAV, jak monitorować nasilenie i postęp infekcji wirusowej oraz jak przeprowadzać eksperymenty wymagane do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej i skuteczności ochrony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) w School of Medicine and Dentistry Uniwersytetu w Rochester i są zgodne z zaleceniami zawartymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals National Research Council 2. Placówki i programy Vivarium oraz Division of Laboratory Animal Medicine w School of Medicine and Dentistry posiadają akredytację AAALAC International i są zgodne z prawem stanowym, przepisami federalnymi oraz polityką National Institutes of Health (NIH). W każdej instytucji powinny być stosowane podobne wymagania w celu przestrzegania protokołów dotyczących zwierząt opisanych w niniejszym manuskrypcie.

1. Wykorzystanie małych zwierząt kręgowców

UWAGA: Do pracy z myszami wymagany jest odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE). Minimalne wymagania obejmują jednorazowe kombinezony, nakładki na obuwie, czepki, maseczki i rękawiczki.

  1. Zgodnie z protokołem IACUC, należy umieścić maksymalnie 5 myszy w jednej klatce. Stosując się do protokołu IACUC, należy poddać myszy eutanazji za pomocą dwóch metod (druga musi być metodą fizyczną), aby upewnić się, że zwierzę nie żyje.
    UWAGA: W eksperymentach, w których oceniano zapadalność i śmiertelność na IAV, myszy, które utraciły 20% początkowej masy ciała, uznano za osiągające punkt końcowy eksperymentu i poddano eutanazji za pomocą CO2 oraz zwichnięcia szyjnego jako fizycznej metody pomocniczej. W innych instytucjach ten procent utraty masy ciała może być inny. W procedurach, w których po infekcji IAV pobierano płuca i błonę śluzową nosa myszy, zwierzęta poddawano eutanazji za pomocą śmiertelnej dawki 2,2,2-tribromoetanolu (TBE) oraz przez przecięcie żyły wątrobowej jako fizycznej metody pomocniczej. Samice myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni zostały zakupione i utrzymywane w jednostce opieki nad zwierzętami w School of Medicine and Dentistry Uniwersytetu w Rochester w warunkach specyficznie wolnych od patogenów.

2. Bezpieczeństwo biologiczne

UWAGA: W niniejszym raporcie wirusy IAV wykorzystane do zakażania myszy to powszechnie stosowany w laboratoriach szczep grypy A/Puerto Rico/8/34 H1N1 przystosowany do myszy (PR8 WT)2,23 oraz wariant LAIV wrażliwy na temperaturę, PR8 LAIV8. Wszystkie procedury obejmujące zakażenia IAV (in vitro lub in vivo), hodowle komórkowe oraz próbki biologiczne należy przeprowadzać w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2. W przypadku użycia wysokowirulentnych szczepów IAV należy zastosować inne odpowiednie pomieszczenia BSL lub warunki izolacji.

  1. Przed i po przeprowadzeniu wszystkich procedur eksperymentalnych opisanych w niniejszym manuskrypcie należy oczyścić komorę z laminarnym przepływem powietrza środkiem dezynfekującym na bazie dwutlenku chloru. Wszystkie narzędzia do sekcji (nożyczki, skalpel i pęseta sekcyjna) oraz homogenizator Dounce należy wysterylizować przed i po użyciu, zgodnie z obowiązującymi zaleceniami IBC. Wszystkie materiały powstałe podczas procedur należy zutylizować zgodnie z wytycznymi IBC oraz IACUC.

3. Zakażenie donosowe

  1. Umieść samice myszy szczepu C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF). Zorganizuj i opisz klatki z myszami, podając użyty wirus oraz dawkę. Zidentyfikuj myszy w każdej klatce za pomocą kodu z dziurkowania uszu lub innej zatwierdzonej metody, np. poprzez malowanie ogonów. W każdej klatce umieść maksymalnie 5 myszy.
  2. Przygotować rozcieńczenie IAV (jednostek tworzących fluorescencję (FFU)/mysz) w warunkach aseptycznych w całkowitej objętości 30 µL/mousw sterylnym 1-krotnym roztworze buforu fosforanowo-solnego (PBS). Inokulum wirusa należy przechowywać w lodzie. Obliczyć ilość IAV do dodania w rozcieńczeniu wirusa, stosując wzór: ((X FFU na mysz / 30 µL) x objętość końcowa) / miano wirusa w roztworze zapasowym.
  3. Zważ myszy za pomocą wagi i zapisz masę każdego zwierzęcia (dzień 0). Przytrzymaj mysz w pozycji grzbietowej, chwytając ją za kark między palcem wskazującym a kciukiem. Ogon przyciśnij do dłoni małym palcem.
  4. Zanurzyć mysz w znieczuleniu poprzez podanie domięśniowe (i.p.) 240–250 mg/kg TBE, wprowadzając igłę w tylnej 2/3 prawej strony brzucha. Przed wyjęciem igły należy chwilę odczekać. Umieścić mysz z powrotem w klatce i odczekać 5 minut.
  5. Nanieś sterylną maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas znieczulenia myszy. Sprawdź, czy mysz jest znieczulona, badając brak odruchu wycofywania łapy (t. j., uciśnięcie palca u stopy). Jeśli myszy nie zostaną w pełni znieczulone, wykrztuszą wirusa.
  6. Gdy mysz zostanie w pełni znieczulona, ułóż ją na plecach. Umieść końcówkę pipety zawierającą 30 µL inakulum wirusa do nozdrza i powoli, lecz w sposób ciągły, wyprowadzać roztwór. Należy upewnić się, że mysz wdycha preparat, obserwując znikanie kropli inakulum.
  7. Należy sprawdzić, czy mysz oddycha, ponieważ TBE może obniżyć temperaturę ciała i częstotliwość oddechów. Umieścić zwierzę z powrotem w klatce w pozycji grzbietowej. Monitorować myszy pod kątem objawów niewydolności oddechowej; w przypadku ich wystąpienia pomóc zwierzęciu w oddychaniu, trzymając je w pozycji pionowej i indukując oddychanie poprzez wstrząsy.24Monitorować mysz do momentu odzyskania przez nią przytomności (30–45 min po znieczuleniu).

4. Charakterystyka patogenezy wirusowej (Rycina 1)

  1. Ocena zachorowalności i śmiertelności (Rysunek 1 i Rycina 2)
    1. Zainfekuj donosowo (i.n.) 3–4 grupy samic myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni (co najmniej 5 myszy na grupę, n = 5), stosując dziesięciokrotne dawki (10, 102, 103 i 104 (FFU/mysz) PR8 WT, zgodnie z opisem w sekcji 3.
    2. Monitorować i ważyć myszy za pomocą wagi przez kolejne 14 dni, mniej więcej o tej samej porze, aby zminimalizować wahania masy ciała wynikające z przyjmowania pokarmu. Poddać eutanazji myszy, które stracą 20% początkowej masy ciała, zgodnie z opisem w sekcji 1.
    3. Po 14 dniach uśmierć myszy, które przeżyły infekcję wirusową, zgodnie z opisem w sekcji 1.
    4. Obliczenie 50% dawki letalnej wirusa dla myszy (MLD50)50) na podstawie danych o przeżywalności uzyskanych metodą Reeda i Muencha25Najpierw oblicz odległość proporcjonalną (PD):
      równanie PD=50%; analiza wskaźnika śmiertelności; schemat badania dawkowania w toksykologii; koncepcja MLD50.
      1. Następnie oblicz MLD50 zgodnie z następującym wzorem:
        Równanie logarytmiczne dla obliczania dawki leku, wzór: Log(dawka poniżej MLD50) = Log(MLD50).
  2. Ocena miana wirusa w płucach i błonie śluzowej nosa (Rycina 1 i Rycina 2)
    1. Odzyskiwanie płuc i błony śluzowej nosa
      1. Zainfekuj donosowo (i.n.) samice myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni (n = 6) dawką wirusa do przetestowania 10-104 FFU szczepu PR8 WT zgodnie z opisem w sekcji 3.
      2. Pobrać płuca oraz błonę śluzową nosa myszy w 2. (n = 3) i 4. dniu (n = 3).
        1. Poddać myszy eutanazji poprzez domięśniowe (i.p.) podanie śmiertelnej dawki TBE (50 mg/kg). Umieścić zwierzę w pozycji grzbietowej i zdezynfekować sierść w obrębie klatki piersiowej 70% etanolem. Skalpelem naciąć skórę od mostka do podstawy brzucha. Nożyczkami wykonać nacięcia o długości 1 cm od podstawy cięcia w kierunku bocznych części ciała myszy.
        2. Przetnij nożyczkami żyłę wątrobową, aby doprowadzić do upuszczenia krwi u myszy jako wtórną metodę eutanazji. Umieść zwierzę w pozycji brzusznej i odczekaj 2 min, aby krew mogła wypłynąć. Ten krok jest istotny w celu zmniejszenia ilości krwi w płucach.
        3. Usunąć skórę z całej górnej części ciała myszy (w tym z głowy) aż do podstawy brzucha, w miejscu wykonania pierwszego nacięcia, przy użyciu pęsety i nożyczek anatomicznych. Odciąć głowę nożyczkami i umieścić ją w sterylnej, suchej szalce Petriego.
        4. Przeciąć nożyczkami połączenia między szczęką a żuchwą, a następnie usunąć żuchwę. Za pomocą nożyczek wykonać dwa cięcia na końcach łuków jarzmowych i usunąć je. Usunąć oczy przy użyciu pęsety anatomicznej.
        5. Przytrzymaj czaszkę pęsetą anatomiczną i przetnij ją wzdłuż szwu strzałkowego skalpelem. Podnieś obie połowy czaszki wraz z mózgiem, aby odsłonić błonę śluzową nosa. Błony śluzowe nosa są otoczone przednimi kośćmi czaszki, w tym kośćmi nosowymi, szczękową, podniebienną, jarzmową i sitową.
        6. Za pomocą skalpela odciąć część czaszki wraz z mózgiem i usunąć. Pozostałą część czaszki wraz ze śluzówką nosa umieścić w sterylnej probówce. Przechowywać probówkę w lodzie (4 °C), jeśli próbki zostaną przetworzone tego samego dnia, lub w suchej lodzie, aby je szybko zamrozić, jeżeli próbki zostaną przetworzone później.
        7. Aby uniknąć zanieczyszczenia próbek, należy czyścić i dezynfekować narzędzia sekcyjne po pobraniu każdej tkanki oraz pomiędzy sekcjami każdego zwierzęcia, używając środka dezynfekującego na bazie dwutlenku chloru.
        8. Aby pobrać płuca, należy ułożyć zwierzę na grzbiecie i przeciąć opłucną nożyczkami. Otwórz klatkę piersiową, przecinając żebra w odległości 1 cm po obu stronach mostka. Wykonaj cięcia nożyczkami od podstawy klatki piersiowej w górę.
        9. Wykonaj nożyczkami cięcie poprzeczne pomiędzy dwiema nacięciami w górnej części klatki piersiowej i usuń płytkę mostkową. Przytrzymaj płuca pęsetą, przetnij nożyczkami koniec tchawicy (bezpośrednio przed płucami) i umieść płuca w sterylnej probówce. Przechowuj probówkę w lodzie (4 °C) jeżeli próbki są przetwarzane tego samego dnia, lub w suchym lodzie w celu ich szybkiego zamrożenia, jeżeli próbki będą przetwarzane w późniejszym terminie.
          UWAGA: Próbki tkanek należy homogenizować w tym samym dniu, w którym zostały pobrane, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy mian wirusa. Ważne jest, aby próbki nie były poddawane wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania przed oznaczeniem mian wirusa. Alternatywnie, próbki tkanek należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ich przetworzenia.
    2. Homogenizacja płuc i błony śluzowej nosa
      1. Umieść płuca lub błonę śluzową nosa w sterylnym homogenizatorze Dounce'a i dodaj 1 ml zimnego podłoża do hodowli patogenów. Homogenizuj próbkę, poruszając tłokiem w górę i w dół przez około 1 min w temperaturze pokojowej (RT), aż do całkowitego rozbicia tkanki płucnej. Umieść zhomogenizowaną próbkę w sterylnym probówce i przechowuj w 4 °CDo każdej próbki należy użyć nowego homogenizatora Dounce'a.
      2. Odwiruj próbki przy 30 x g przez 5–10 min w temperaturze pokojowej. Przenieś nadfiltr do nowej sterylnej probówki. Przechowuj nadfiltr w 4 °C jeśli miareczkowanie wirusa jest wykonywane tego samego dnia, a pellet należy odrzucić. Alternatywnie można go zamrozić (-80 °C) nadpłyn z homogenizatów próbek w celu późniejszej oceny miana wirusa.
    3. Miareczkowanie wirusa metodą pośredniej immunofluorescencji
      1. Dzień przed miareczkowaniem wysiać komórki nabłonkowe nerki psa Madin-Darby (MDCK) na płytki 96-dołkowe (4 x 104komórek/dołek), aby osiągnąć ok. 80–90% konfluencji w pożywce tkankowej. Umieścić komórki w 37 °C inkubator z 5% CO22W dniu miareczkowania wirusa należy sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić obecność monowarstwy przed rozpoczęciem infekcji wirusowej.
      2. Przygotować rozcieńczenia 1:10 supernatantu z homogenizatów próbek (płuca lub śluzówka nosa) w podłożu do infekcji na płytce 96-dołkowej. Miareczkowanie wirusa przeprowadzić w trzech powtórzeniach, aby dokładnie określić miano wirusa.
        1. Dodaj 90 µL pożywki infekcyjnej do każdej z dolek płytki 96-dołkowej. Dodać 10 µL część nadosadu z jednej z homogenizowanych próbek dołków A1, A2 i A3, aby ocenić miano wirusa dla każdej próbki w trzech powtórzeniach. Dodać 10 µL do dołków A4, A5 i A6 przenieść kolejną porcję nadnadkładu z homogenizowanych próbek. Powtórzyć to samo rozcieńczenie kolejno dla pozostałych próbek.
        2. Po dodaniu supernatantu z próbki do rzędu A, należy wymieszać go za pomocą pipety wielokanałowej, wykonując kilkukrotne pobieranie i wydawanie cieczy. Przenieś 10 µL od wiersza A do wiersza B. Wymieniaj końcówki między rozcieńczeniami i dokładnie wymieszaj. Powtarzaj tę czynność aż do osiągnięcia ostatniego wiersza (H).
      3. Usuń pożywkę do hodowli tkankowych (krok 4.2.3.1), używając aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym, z komórek MDCK w płytkach 96-dołkowych, a następnie przemyj dwukrotnie za pomocą 100 µL/well z 1x PBS.
      4. Transfer 50 µL/well szeregowo rozcieńczonego supernatantu z homogenizatów próbek do płytki 96-dołkowej z komórkami MDCK. Rozpocząć przenoszenie od najwyższych rozcieńczeń (rząd H) do najniższych rozcieńczeń (rząd A). W tym przypadku nie jest konieczna wymiana końcówek między poszczególnymi rzędami.
      5. Umieść płytki 96-dołkowe na platformie kołyszącej na 1 h w temperaturze pokojowej (RT), aby umożliwić adsorpcję wirusa. Po adsorpcji wirusa usuń inokulum za pomocą wielokanałowego adaptera do aspiratora próżniowego i dodaj 100 µL/well pożywki poinfekcyjnej. Inkubować zainfekowane komórki przez 8 h w 33 °C lub 37 °C inkubator z 5% CO22Następnie należy przystąpić do utrwalania, barwienia, obrazowania oraz obliczania miana wirusa zgodnie z opisem w krokach 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Usuń pożywkę do hodowli tkankowej z płytek 96-dołkowych, używając aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym. Utrwal i permeabilizuj komórki za pomocą 100 µL/well roztworu do fiksacji i permeabilizacji przez 20 min w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Roztworu do fiksacji/permeabilizacji należy używać w dygestorium, aby zapobiec ekspozycji na formaldehyd.
      7. Usuń roztwór do fixacji/permeabilizacji za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym, przemyj 1x PBS i inkubuj ufiksowane komórki w roztworze blokującym przez 1 h w temperaturze pokojowej. Przechowuj komórki w roztworze blokującym w 4 °C lub przejść do następnego kroku.
      8. Usunąć roztwór blokujący. Dodać 50 µL/well z 1 µg/mL przeciwciało monoklonalne (mAb) anty-NP HB-65 rozcieńczone w roztworze do rozcieńczania przeciwciał. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °CMożna zastosować różne przeciwciała monoklonalne (mAb) lub poliklonalne (pAb) przeciwko PR8.
      9. W międzyczasie należy rozcieńczyć w stosunku 1:20 wtórne przeciwciało anty-mysie koniugowane z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) w roztworze do rozcieńczania przeciwciał. Roztwór należy wirować przy 170 x g przez 5–10 min w temperaturze pokojowej. Można zastosować inne przeciwciała wtórne koniugowane z innymi fluoroforami.
      10. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj 3 razy za pomocą 100 µL/well 1x PBS. Dodać 50 µL/well roztworu przeciwciała wtórnego i inkubować przez 30–45 min w temperaturze 37 °CUsuń przeciwciało wtórne i przemyj 3 razy za pomocą 100 µL/well z 1x PBS. Pozostaw ostatnią porcję płuczki w płytce.
      11. Obserwować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia liczby komórek wybarwionych pozytywnie (zielonych). Obliczyć miano wirusa, wyznaczając liczbę FFU/ml. Obliczyć miano wirusa wyrażone w FFU/ml dla rozcieńczenia zawierającego od 30 do 50 komórek wybarwionych pozytywnie, stosując wzór: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/rozcieńczenie.

5. Ocena humoralnych odpowiedzi immunologicznych (Rycina 3)

  1. Zainfekuj d.n. 3 grupy samic myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni (n = 5) różnymi dawkami (102, 103, oraz 104 (FFU/mysz) PR8 LAIV, a jedną grupę (n = 5) zainfekuj pozornie 1x sterylnym PBS jako kontrolę negatywną. Przeprowadź infekcje myszy drogą donosową zgodnie z opisem w sekcji 3.
    1. Pobieranie krwi u myszy poprzez nakłucie podżuchowe
      1. Czternaście dni po immunizacji pobierz krew z myszy poprzez nakłucie podżuchwowe za pomocą lancetu 4 mm.26lub przy użyciu innej metody zatwierdzonej przez IACUC.
        1. Uchwyć mysz, chwytając ją za kark między palcem wskazującym a kciukiem. Przyciśnij ogon do dłoni małym palcem, aby unieruchomić zwierzę.
        2. Umieść mysz w pozycji bocznej, aby odsłonić policzek. Wykonaj nakłucie w miejscu połączenia żył zakolców i podżuchwowych z żyłą szyjną. Wprowadź lancet (4 mm) i pobierz krew do sterylnej probówki (odzyskujemy około 0,2–0,4 ml na mysz). Przez kilka sekund uciskaj miejsce nakłucia sterylną gazikiem. Umieść mysz z powrotem w klatce.
      2. Pozostawić probówki na 1–2 h w 37 °C następnie odwiruj je przy 70 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej, aby oddzielić surowicę od krwi. Przenieś górną warstwę składającą się z surowicy za pomocą pipety do nowej sterylnej probówki. Odrzuć pellet erytrocytów (RBC). Przechowuj surowicę w temperaturze -20 °C.
  2. Analiza całkowitego poziomu przeciwciał przeciwko białkom wirusowym
    1. Przygotowanie ekstraktów z zakażonych komórek MDCK
      1. Dzień przed infekcją wysiewać do jednej płytki 10-mm 4–5 x 106 komórki MDCK (aby następnego dnia osiągnęły ok. 80–90% konfluencji) w pożywce do hodowli tkankowych. Umieścić komórki w 37 °C inkubator z 5% CO22W dniu infekcji wirusowej należy sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić obecność monowarstwy przed rozpoczęciem infekcji wirusowej.
      2. Przygotuj rozcieńczenie wirusa o niskiej wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 0,001 dla szczepu PR8 WT w medium do zakażania, tak aby całkowita objętość końcowa wynosiła 4 ml. Oblicz ilość PR8 WT, korzystając ze wzoru ((X MOI x n°komórki) x objętość końcową) / miano wirusa w roztworze macierzystym.
      3. Odssać pożywkę do hodowli tkanek z płytki z komórkami MDCK i dwukrotnie przemyć 4 ml 1x PBS. Dodać inokulum wirusowe (4 ml) i umieścić płytkę na platformie kołyszącej na 1 h w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję wirusa. Usunąć inokulum wirusowe za pomocą próżni i dodać 8–10 ml pożywki poinfekcyjnej zawierającej 1 µg/mL trypsyny traktowanej TPCK. Inkubować zainfekowane komórki przez 48–72 h w 33 °C lub 37 °C inkubator z 5% CO22.
      4. Odczepić komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie zebrać komórki wraz z pożywką hodowlaną pipetą do probówki o objętości 15 ml. Odwirować zawartość probówki przy 40 x g przez 5–10 min w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, a osad komórkowy resuspender w 1 ml buforu RIPA i przenieść mieszaninę do sterylnej probówki o objętości 1,5 ml. Inkubować na lodzie przez 20–30 min.
      5. Wiruj probówkę z prędkością 130 x g przez 20–30 min w temperaturze 4 °COstrożnie odzyskaj nadsącz. Przechowuj ekstrakt komórkowy w 100 µL alikwoty w temperaturze -20 °C.
      6. Należy mianować ekstrakty komórkowe zgodnie z opisem dla enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA) przed ocenie ich pod kątem obecności przeciwciał.9,10,11,27W ramach kontroli negatywnej należy uwzględnić ekstrakty komórkowe z komórek MDCK poddanych infekcji pozorowanej (przygotowane zgodnie z powyższą instrukcją).
    2. ELISA (Rysunek 4)
      1. Płytki polistyrenowe z 96 dołkami należy pokryć odpowiednim rozcieńczeniem ekstraktu zakażonych komórek MDCK w 1x PBS (zazwyczaj w zakresie od 1:20 do 1:10). Inną płytkę należy pokryć takim samym rozcieńczeniem ekstraktu z niezakażonych komórek MDCK (kontrolnych) jako kontrolę negatywną. Inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
      2. Usuń nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym i przemyj raz za pomocą 100 µL/well 1x PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Aby zablokować wiązania nieswoiste, należy dodać 100 µL/well roztworu blokującego przez 1 h w temperaturze pokojowej.
      3. W tym czasie, na płytce 96-dołkowej, należy wykonać dwukrotne rozcieńczenia seryjne (rozcieńczenie początkowe 1:50) surowic od każdej myszy zakażonej w kroku 5.1, wykorzystując do tego roztwór do rozcieńczania przeciwciał.
      4. Usuń roztwór blokujący z polistyrenowych płytek 96-dołkowych za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym. Dodaj 50 µL każdego rozcieńczenia surowicy mysiej do odpowiedniej dołki i inkubować przez 1 h w 37 °C.
      5. Usuń surowicę mysia za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym. Przemyj studzienki 3 razy wodą destylowaną, używając pipety wielokanałowej. Dodaj 50 µL/well przeciwciała wtórnego anty-mysiego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczonego 1:2 0 w roztworze do rozcieńczania przeciwciał. Inkubować przez 1 h w 37 °C.
      6. Usuń przeciwciało wtórne za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym. Przemyj studzienki 3 razy wodą destylowaną, używając pipety wielokanałowej. Przygotuj roztwór substratu tetrametylobenzedyny (TMB), mieszając roztwory A i B w stosunku 1:1. Dodaj 100 µL/well substratu i inkubować przez 5–10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
      7. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 100 µL/well z 0,2 N H2SO4Odczyt płytek należy przeprowadzić przy 450 nm za pomocą czytnika płytek ELISA.
      8. Od wartości uzyskanych dla każdego rozcieńczenia na płytce 96-dołkowej z kontrolnymi komórkami MDCK (mock-infected) odejmij wartości uzyskane na płytce 96-dołkowej z zainfekowanymi komórkami MDCK. Oblicz wartości średnie dla każdego rozcieńczenia z różnymi surowicami i przedstaw je na wykresie z zaznaczonymi odchyleniami standardowymi (SD).
  3. Analiza przeciwciał neutralizujących
    1. test inhibicji hemaglutynacji (HAI) (Rysunek 5)
      1. Przed przeprowadzeniem testu HAI należy poddać surowice mysie działaniu enzymu niszczącego receptory (RDE), aby wyeliminować wszystkie nieswoiste inhibitory obecne w surowicy. Należy dodać 1 objętość surowicy mysiej do 4 objętości roztworu roboczego RDE (rozcieńczenie surowicy wynosi teraz 1:5). Inkubować przez noc (12–18 h) w 37 °C łaźnia wodna
      2. Podgrzać próbki surowicy w temperaturze 56 °C przez 30 min w celu inaktywacji RDE.
      3. Wyznaczyć wcześniej aktywność hemaglutynacyjną (HAU) szczepu PR8 WT za pomocą standardowego testu HA28Po wyznaczeniu wartości HAU wirusa, należy rozcieńczyć zapas wirusa do poziomu 8 HAU na 50 µL w 1x PBS.
      4. Przygotować dwukrotne rozcieńczenia szeregowe (12 rozcieńczeń) surowic traktowanych RDE na płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Wykorzystać jeden rząd dla każdej próbki surowicy (np., od A1 do A12).
        1. Dodaj 25 µL 1x PBS do studni od A1 do A12. Przebadać każdą z próbek surowicy w jednym rzędzie. Dodać 25 µL osocza traktowanego RDE (1:5) do 25 µL 1x PBS w pierwszej studzience kolumny (A1). Pierwsze rozcieńczenie surowicy wynosi 1:10.
        2. Po dodaniu wszystkich surowic poddanych działaniu RDE do pierwszej kolumny, (np., A1, B1, C1), należy użyć pipety wielokanałowej, aby wymieszać surowice z 1x PBS poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przenieść 25 µL rozcieńczonychy serum z pierwszej kolumny do drugiej kolumny (np., od A1 do A2). Wymień końcówki między rozcieńczeniami i wymieszaj.
        3. Powtarzaj kroki 5.3.1.4.2. aż do osiągnięcia ostatniej kolumny (np., A12, B12, C12). Odrzuć 25 µL z ostatniej kolumny, zachowując stałą objętość we wszystkich dołkach (25 µL). Dołączyć jeden rząd dołków zawierających wyłącznie 25 µL 1x PBS bez dodatku surowic jako kontroli negatywnej.
      5. Dodać 25 µL IAV rozcieńczonego do 8 HAU/50 µL do każdej z studni z surowicami w płytce 96-dołkowej z wypukłym dnem w kształcie litery V; końcowa objętość w każdej studni wynosi 50 µLzawierające 4 HAU wirusa. Wymieszać zawartość poprzez wielokrotne pipetowanie. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
      6. Dodaj 50 µL 0,5% RBC indyka do każdej z dolek. Wymieszać zawartość poprzez wielokrotne pipetowanie. Inkubować płytkę przez 30–45 min na lodzie. Odczytać wynik testu HAI wizualnie, gdy RBC w dolkach kontrolnych (1x PBS) utworzą czerwony osad (t. j., osad) na dnie studni.
        UWAGA: Można również stosować erytrocyty innych gatunków, takich jak kurczak, świnia morska lub koń.
      7. Obliczyć miana HAI, identyfikując ostatnią studzienkę, w której erytrocy tworzą czerwony osad i nie dochodzi do hemaglutynacji.
        UWAGA: Odwrotność tej wartości rozcieńczenia stanowi miano HAI. Wartość odwrotna jest mnożona przez współczynnik 20 w celu skorygowania rozcieńczenia surowicy 1:20 w pierwszym rzędzie.
    2. Test mikroneutralizacji wirusa (VNA) (Rycina 6)
      1. Dzień przed VNA należy przygotować komórki MDCK na płytce 96-dołkowej w taki sposób, aby następnego dnia osiągnęły 80–90% konfluencji, zgodnie z opisem w kroku 5.2.1.1. Przygotować rozcieńczenie PR8 WT w pożywce do infekcji, aby uzyskać 20 FFU/25 µL.
      2. Inaktywować sera mysie w temperaturze 56 °C przez 1 h. Wykonać dwukrotne rozcieńczenia seryjne (12 rozcieńczeń) dla surowic mysich w trzech powtórzeniach, wykorzystując płytkę 96-dołkową.
        1. Dodaj 40 µL surowicy do 160 µL pożywek infekcyjnych w pierwszej studzience pierwszego rzędu, (np., A1) (rozcieńczenie serum 1:5). Wymieszać poprzez pipetowanie. Dodać 100 µL pośrodka infekcyjnego do pozostałych studzienek (A2 do H12).
        2. Transfer 100 µL z pierwszego rzędu do drugiego rzędu, aby przygotować rozcieńczenia 1:2 (np., od A1 do A2). Zmieniać końcówki między rozcieńczeniami i mieszać poprzez pipetowanie. Powtarzać tę czynność aż do ostatniego rzędu (np., A12). Odrzucić 100 µL z ostatniego rzędu, zachowując stałą objętość we wszystkich dołkach (100 µL).
      3. Dodaj 100 µL roztworu IAV do wszystkich studzienek. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej. W międzyczasie usunąć pożywkę hodowlaną z komórek MDCK na płytce 96-dołkowej za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym i dwukrotnie przemyć za pomocą 100 µL/well z 1x PBS.
      4. W każdej płytce 96-dołkowej z komórkami MDCK należy pozostawić dwa rzędy na kontrole. Jeden rząd stanowi kontrolę negatywną (komórki bez wirusa i surowic), a drugi rząd stanowi kontrolę pozytywną infekcji (komórki z wirusem przy braku surowic lub z surowicami od myszy z grup kontrolnych, nieinfekowanych).
      5. Transfer 50 µL/well z płytki z przeciwciałami przeciwwirusowymi na płytki 96-dołkowe z komórkami MDCK. Płytki należy umieścić na wstrząsarce platformowej na 1 h w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję wirusa.
      6. Usuń inokulum wirusa i przeciwciał za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym, a następnie dodaj 100 µL/well pożywki poinfekcyjnej zawierającej 1 µg/mL trypsyny traktowanej TPCK.
      7. Inkubować komórki przez około 3–4 dni w 33 °C lub 37 °C inkubator z 5% CO22 do momentu zaobserwowania efektu cytopatycznego (CPE) w kontroli pozytywnej (komórki zainfekowane bez dodatku surowic lub z surowicą kontrolną).
      8. Usuń pożywkę do hodowli tkankowych za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym, a następnie dodaj 100 µL/well 0,1% fioletu krystalicznego. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór fioletu krystalicznego za pomocą aspiratora próżniowego z adapterem wielokanałowym. Przemyć studzienki 3 razy wodą destylowaną. Wysuszyć płytki w temperaturze pokojowej.
      9. Oblicz miana VNA, identyfikując najwyższe rozcieńczenie, przy którym zachowana jest konfluencyjna warstwa komórek MDCK.
        UWAGA: Wartość odwrotna tego odpowiadającego rozcieńczenia stanowi miano przeciwciał neutralizujących. Wartość odwrotną mnoży się przez czynnik 10, aby skorygować rozcieńczenie surowic 1:10 w pierwszej studzience rzędu.

6. Ocena skuteczności ochrony szczepionek (Rysunek 3)

  1. Zaszczep drogą donosową (i.n.) grupę samic myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni (n = 1) dawką PR8 LAIV przeznaczoną do testu (FFU/mysz) oraz wykonaj szczepienie pozorowane w drugiej grupie myszy (n = 1) przy użyciu 1x sterylnego PBS. Immunizację donosową myszy przeprowadź zgodnie z opisem w sekcji 3.
  2. Czternaście dni po szczepieniu pobierz krew od myszy i uzyskaj surowice zgodnie z opisem w sekcji 3. Przeanalizuj obecność przeciwciał całkowitych i neutralizujących przeciwko PR8 WT zgodnie z opisem w sekcji 5.1.1.
  3. Piętnaście dni po szczepieniu zmierz i zapisz masę ciała myszy (Dzień 0). Poddaj myszy ekspozycji donosowej (i.n.) na letalną dawkę PR8 WT (wyzwanie homologiczne) zgodnie z opisem w sekcji 3.
  4. Przez 14 dni po ekspozycji mierz masę ciała oraz przeżywalność (n = 5 / grupa), aby ocenić zapadalność i śmiertelność wywołaną przez PR8 WT u zaszczepionych myszy (sekcja 4.1).
  5. Pobierz płuca i śluzówkę nosa myszy (n = 3/dzień) w 2. i 4. dniu po ekspozycji na PR8 WT. Homogenizuj i analizuj płuca oraz śluzówkę nosa zgodnie z opisem w sekcji 4.2, aby ocenić replikację wirusa PR8 WT u zaszczepionych myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystyka patogenezy wirusowej u myszy

Patogeneza IAV wiąże się z zapadalnością i śmiertelnością spowodowaną zakażeniem tym wirusem. Oba te parametry można łatwo ocenić u myszy: zapadalność na IAV wiąże się z utratą masy ciała u zainfekowanych myszy, a odsetek przeżywalności wskazuje na wskaźnik śmiertelności (Rysunek 1). Masę ciała i przeżywalność myszy zainfekowanych IAV monitoruje się zazwycza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mysi model IAV jest szeroko stosowany do badań in vivo patogenezy IAV, immunogenności i skuteczności ochrony. Niewielki rozmiar myszy sprawia, że są one łatwe w manipulowaniu i przechowywaniu w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, takimi jak fretki czy świnki morskie. Co więcej, łatwość w zakresie kosztów zwierząt, utrzymania i reprodukcji pozwala na ich wykorzystanie w przedklinicznych testach szczepień, w których potrzebna jest duża liczba zwierząt. Warto zauważyć, że ponieważ myszy były wykorzystywane w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania nad wirusem grypy w laboratorium LM-S są częściowo finansowane przez The New York Influenza Center of Excellence (NYICE), członka NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS). Dziękujemy Wendy Bates za wsparcie w naniesieniu poprawek do rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki nabłonkowe nerki Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)ATCCCCL-34
Sześcio- do ośmiotygodniowa samica myszy C57BL/6National Cancer Institute (NCI)01XBE
Czerwone komórki blod TurckeyBiolink IncSklep pod adresem 4 ° C
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVPrzechowywać w 4 & stopni; C
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Seradigm1500-050Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Penicylina/Streptomycyna/L-Glutamina (PSG) 100xCorning30-009-CIPrzechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Penicylina/Streptomycyna (PS) 100xCorning30-00-CIPrzechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Roztwór albuminy Bovin (BA)Sigma-AldrichA7409Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Albumina surowicy Bovin (BSA)Sigma-AldrichA9647Przechowywać w 4 & stopni; C
Trypsyna traktowana tosylsulfonylem fenyloalanylem chlorometylowym (TPCK)Sigma-AldrichT8802Przechowywać w temperaturze -20 &; C
Neutralna buforowana formalina 10%EMD65346-85Przechowywać w RT
Triton X-100J.T.BakerX198-07Przechowywać w RT
Przeciwciało monoklonalne anty-NP Wirus grypy A HB-65ATTCH16-L10-4R5Przechowywać w temperaturze -20 &; C
Poliklonalne królicze immunoglobuliny przeciw myszym/FITCDakoF0261Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
ECL Anty-mysie IgG, całe przeciwciało połączone z peroksydazą chrzanowąGE HealthcareLNA931V/AGPrzechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Zestaw podłoży TMBBioLegend421101Przechowywać w 4 stopniach; C
Vmax Czytnik płytek kinetycznychmolekularne
Młynki do tkanek z odcinkaThomas Scientific7722-7
Enzym niszczący receptory, RDE (II)Denka Seiken Co.370013Przechowywać w temperaturze -20 stopni C
Crystal VioletFisher ScienctificC581-100Przechowywać w RT
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowychGreiner Bio-one655-180
Naczynia do hodowli komórkowych 100 mmGreiner Bio-one664-160
Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytkiThermo Fisher Scienctific269620
Nunc 96-dołkowe płytki polistyrenowe MicroWell ze stożkowym dnemThermo Fisher Scienctific249570
Puralub Maść weterynaryjnaDechra9N-76855
Mikroskop fluorescencyjnyOlympus OlympusIX81
Urządzenia

Bibliografia

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857(2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. , Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Inokulacja donosowapatogeneza wirusowahumoralna odpowiedź immunologicznamiareczkowanie wirusatkanka płucnabłona śluzowa nosaobliczanie MLD50detekcja przeciwciał
Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.