Wirusy grypy typu A (IAV) są ważnymi ludzkimi patogenami układu oddechowego. Aby zrozumieć patogenność wirusów IAV i przeprowadzić badania przedkliniczne nowych metod szczepień, potrzebne są modele zwierzęce naśladujące ludzką fizjologię. W tym miejscu opisujemy techniki oceny patogenezy IAV, odpowiedzi humoralnych i skuteczności szczepionki przy użyciu mysiego modelu infekcji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wirusy grypy powodują ponad 500 000 zgonów na całym świecie1 i wiążą się z rocznym kosztem 12 - 14 miliardów USD w samych Stanach Zjednoczonych, biorąc pod uwagę bezpośrednie wydatki na leczenie i hospitalizację oraz absencję w pracy2. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie w badaniach nad wirusem grypy A (IAV) w celu oceny patogenezy wirusa, interakcji gospodarz-patogen, odpowiedzi immunologicznej oraz skuteczności obecnych i/lub nowatorskich podejść do szczepionek, a także leków przeciwwirusowych. Myszy są korzystnym modelem małych zwierząt, ponieważ ich układ odpornościowy jest ewolucyjnie podobny do tego, który występuje u ludzi, są dostępne u komercyjnych dostawców jako genetycznie identyczne podmioty, istnieje wiele szczepów, które można wykorzystać do oceny genetycznych podstaw infekcji i są stosunkowo niedrogie i łatwe do manipulowania. Aby podsumować zakażenie IAV u ludzi przez drogi oddechowe, myszy są najpierw znieczulane przed inokulacją donosową zakaźnymi wirusami IAV pod warunkiem odpowiedniego zabezpieczenia biologicznego. Po zakażeniu patogenezę IAV określa się poprzez codzienne monitorowanie zachorowalności (utraty masy ciała) i śmiertelności (przeżycia). Ponadto patogenezę wirusa można również ocenić, oceniając replikację wirusa w górnych (błona śluzowa nosa) lub dolnych (płuca) drogach oddechowych zakażonych myszy. Reakcje humoralne po zakażeniu IAV można szybko ocenić za pomocą nieinwazyjnych testów krwawienia i wtórnego wykrywania przeciwciał, mających na celu wykrycie obecności przeciwciał całkowitych lub neutralizujących. W tym miejscu opisujemy powszechne metody stosowane do donosowego (i.n) zakażenia myszy IAV i oceniamy patogenezę, humoralne odpowiedzi immunologiczne i skuteczność ochrony.
Wprowadzenie
IAV to wirusy otoczkowe sklasyfikowane w rodzinie Orthomyxoviridae3. Zawierają osiem jednoniciowych cząsteczek RNA o ujemnej polarności3. U ludzi IAV wywołują sezonowe epidemie i sporadyczne pandemie o ważnych konsekwencjach, gdy nowe wirusy są wprowadzane do populacji ludzkiej4. Co więcej, sezonowe IAV są wysoce i szybko przenoszone między ludźmi, powodując co roku zwiększone straty ekonomiczne na całym świecie2,5. Objawy IAV obejmują kaszel, przekrwienie błony śluzowej nosa, gorączkę, złe samopoczucie, ból głowy, anoreksję i ból....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) w School of Medicine and Dentistry Uniwersytetu w Rochester i są zgodne z zaleceniami zawartymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals National Research Council 2. Placówki i programy Vivarium oraz Division of Laboratory Animal Medicine w School of Medicine and Dentistry posiadają akredytację AAALAC International i są zgodne z prawem stanowym, przepisami federalnymi oraz polityką National Institutes of Health (NIH). W każdej instytucji powinny ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Charakterystyka patogenezy wirusowej u myszy
Patogeneza IAV jest powiązana z zachorowalnością i śmiertelnością spowodowaną infekcją tym wirusem. Te dwa parametry można łatwo ocenić u myszy: zachorowalność na IAV wiąże się z utratą masy ciała u zakażonych myszy, a odsetek przeżywalności wskazuje stopień śmiertelności (Rysunek 1). Masę ciała oraz przeżywalność myszy zakażonych IAV zazwyczaj monitoruje si.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mysi model IAV jest szeroko stosowany do badań in vivo patogenezy IAV, immunogenności i skuteczności ochrony. Niewielki rozmiar myszy sprawia, że są one łatwe w manipulowaniu i przechowywaniu w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi, takimi jak fretki czy świnki morskie. Co więcej, łatwość w zakresie kosztów zwierząt, utrzymania i reprodukcji pozwala na ich wykorzystanie w przedklinicznych testach szczepień, w których potrzebna jest duża liczba zwierząt. Warto zauważyć, że ponieważ myszy były wykorzystywane w .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania nad wirusem grypy w laboratorium LM-S są częściowo finansowane przez The New York Influenza Center of Excellence (NYICE), członka NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS). Dziękujemy Wendy Bates za wsparcie w naniesieniu poprawek do rękopisu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki nabłonkowe nerki Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) | ATCC | CCL-34 | |
| Sześcio- do ośmiotygodniowa samica myszy C57BL/6 | National Cancer Institute (NCI) | 01XBE | |
| Czerwone komórki blod Turckey | Biolink Inc | Sklep pod adresem 4 ° C | |
| Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Przechowywać w 4 & stopni; C |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| Penicylina/Streptomycyna/L-Glutamina (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| Penicylina/Streptomycyna (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| Roztwór albuminy Bovin (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C |
| Albumina surowicy Bovin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Przechowywać w 4 & stopni; C |
| Trypsyna traktowana tosylsulfonylem fenyloalanylem chlorometylowym (TPCK) | Sigma-Aldrich | T8802 | Przechowywać w temperaturze -20 &; C |
| Neutralna buforowana formalina 10% | EMD | 65346-85 | Przechowywać w RT |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Przechowywać w RT |
| Przeciwciało monoklonalne anty-NP Wirus grypy A HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Przechowywać w temperaturze -20 &; C |
| Poliklonalne królicze immunoglobuliny przeciw myszym/FITC | Dako | F0261 | Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C |
| ECL Anty-mysie IgG, całe przeciwciało połączone z peroksydazą chrzanową | GE Healthcare | LNA931V/AG | Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C |
| Zestaw podłoży TMB | BioLegend | 421101 | Przechowywać w 4 stopniach; C |
| Vmax Czytnik płytek kinetycznych | molekularne | ||
| Młynki do tkanek z odcinka | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Enzym niszczący receptory, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Przechowywać w temperaturze -20 stopni C |
| Crystal Violet | Fisher Scienctific | C581-100 | Przechowywać w RT |
| 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Naczynia do hodowli komórkowych 100 mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytki | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
| Nunc 96-dołkowe płytki polistyrenowe MicroWell ze stożkowym dnem | Thermo Fisher Scienctific | 249570 | |
| Puralub Maść weterynaryjna | Dechra | 9N-76855 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Olympus Olympus | IX81 |
Bibliografia
- Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
- Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
