Artykuł metodologiczny

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

19.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55907

⸱

17 czerwca 2017

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, University of Giessen

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przy użyciu dojrzałej linii mysich komórek T. Protokół ten jest odpowiedni do badania rozkładu określonych znaczników histonowych w określonych miejscach promotora lub w całym genomie.

Streszczenie

Szlaki sygnałowe regulują programy ekspresji genów poprzez modulację struktury chromatyny na różnych poziomach, takich jak posttranslacyjne modyfikacje (PTM) ogonów histonów, wymiana histonów kanonicznych na warianty histonów i emisja nukleosomów. Taka regulacja wymaga wiązania wrażliwych na sygnał czynników transkrypcyjnych (TF), które rekrutują enzymy modyfikujące chromatynę do elementów regulatorowych zdefiniowanych jako wzmacniacze. Zrozumienie, w jaki sposób kaskady sygnałowe regulują aktywność wzmacniacza, wymaga kompleksowej analizy wiązania TF, enzymów modyfikujących chromatynę oraz zajmowania określonych znaczników histonów i wariantów histonów. Testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) wykorzystują wysoce specyficzne przeciwciała do immunoprecypitacji określonych kompleksów białkowo-DNA. Późniejsza analiza oczyszczonego DNA pozwala na identyfikację regionu zajmowanego przez białko rozpoznawane przez przeciwciało. W pracy tej opisano protokół skutecznego wykonywania ChIP białek histonowych w dojrzałej linii mysich komórek T. Przedstawiony protokół pozwala na wykonywanie testów ChIP w rozsądnych ramach czasowych i z wysoką odtwarzalnością.

Wprowadzenie

Rozwój, różnicowanie i homeostaza zależą od określonych programów ekspresji genów, które są ustanawiane przez zdarzenia sygnalizacyjne, które modulują strukturę chromatyny, a zatem określają, czy dany gen jest aktywowany, czy represjonowany w sposób specyficzny dla komórki i czasu. Podczas rozwoju limfocytów T należy ustanowić specyficzne programy ekspresji genów, aby prawidłowo określić dojrzewanie prekursorów limfocytów T ze stanu podwójnie ujemnego (DN) do pojedynczego dodatniego (SP), przechodząc przez kilka etapów pośrednich1. To, w jaki sposób program ekspresji genów jest dynamicznie regulowany podczas rozwoju limfocytów T, zostało szeroko zbadane w poprzednich latach przez kilka laboratoriów2,3,4,5,6.

Poprzez posttranslacyjne modyfikacje (PTM) histonów, wymiana histonów kanonicznych na warianty histonów, emisja nukleosomów i metylacja DNA regulują przełącznik ON/OFF genów. Kilka grup zbadało rozkład PTM i wariantów histonów w całym genomie, aby określić znaczniki, które są związane z różnymi stanami chromatyny zarówno w proksymalnych, jak i dystalnych regionach regulatorowych7,8,9,10. Kaskady sygnałowe koordynują dynamiczną regulację chromatyny poprzez wymianę dodatnich i ujemnych enzymów modyfikujących chromatynę (znanych również jako modyfikatory chromatyny) na określonych elementach wzmacniających. Te modyfikatory chromatyny regulują strukturę chromatyny, a tym samym produkcję transkrypcyjną, na przykład poprzez dynamiczną metylację i acetylację histonów. Tak jest w przypadku ścieżki sygnalizacyjnej Notch11,12,13,14.

Dynamiczne PTM histonów; wymiana z wariantami histonów; oraz dynamiczne zajmowanie histonów, czynników transkrypcyjnych i kofaktorów mogą być badane za pomocą testów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP). Wysoce specyficzne przeciwciała są używane do oczyszczania specyficznych kompleksów DNA-białko, a oczyszczone DNA jest analizowane za pomocą ilościowego PCR (qPCR); głębokie sekwencjonowanie (ChIP-Seq); lub, rzadziej w dzisiejszych czasach, hybrydyzacja do mikromacierzy (ChIP-ChIP).

Testy ChIP są czasami trudne ze względu na komplikacje związane z lizą komórek, ścinaniem chromatyny i/lub niską swoistością przeciwciał. Przyjęto kilka strategii w celu ulepszenia protokołu, tak jak ma to miejsce w przypadku NEXSON15. Zastosowanie sonikatorów w kąpieli wodnej pozwala uniknąć podgrzewania próbki, które mogłoby uszkodzić epitopy obecne na badanym białku, ale energia potrzebna do ścinania próbek ulega rozproszeniu w wodzie. Kolejnym ulepszeniem było opracowanie skoncentrowanych urządzeń ultradźwiękowych, które zapobiegają rozpraszaniu energii. Dlatego skoncentrowane urządzenia ultradźwiękowe pozwalają na poprawę lizy komórek i ścinania chromatyny, eliminując zmiany wywołane przez operatora i znacznie zwiększając odtwarzalność.

Ta praca opisuje protokół (schemat na rysunku 1) do efektywnego wykonywania ChIP białek histonowych w dojrzałej linii mysich komórek T o nazwie E2-10HA16,17. Limfocyty T są zwykle trudne do lizy, a ścinanie ich chromatyny okazało się nieefektywne. W tym protokole, który wykorzystuje ultradźwiękowy układ skoncentrowany na chłodzeniu, liczba komórek, bufor do lizy i ustawienie ścinania zostały zoptymalizowane dla linii mysich komórek T E2-10HA. Protokół ten pozwala na wykonanie ChIP z wysoką powtarzalnością i w rozsądnym czasie. W rzeczywistości potrzeba około dwóch dni, aby ścinać chromatynę i ocenić jakość ścinania, oraz trzech dni do przeprowadzenia immunoprecypitacji, odwrócenia wiązania krzyżowego i oczyszczenia DNA.

Protokół

UWAGA: Wszystkie i nośniki używane w tym protokole są wymienione w Tabeli 1.

Dzień 1 i 2

1. Sieciowanie komórek

  1. Przenieść mysie limfocyty T z płytki 6-dołkowej do probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ~271 x g. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 30 ml pożywki do hodowli komórkowych IMDM i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.
  2. Zbierz porcje 20 x 106 komórek do nowych probówek o pojemności 50 ml.
  3. Dodać formaldehyd (FMA) do 1% stężenia końcowego bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    Ostrzeżenie: FMA jest toksyczny w przypadku wdychania, dlatego należy pracować pod wyciągiem i nosić odpowiedni sprzęt ochronny. Prosimy również o postępowanie z odpadami FMA zgodnie z zasadami obowiązującymi w instytucji przyjmującej.
  4. Dodać 1/8 objętości 1 M glicyny o pH 7,0 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Granulować komórki przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ~271 x g i przemyć 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  6. Przemyć osad komórkowy 1 ml PBS i przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml.

2. Liza komórek i ścinanie chromatyny

  1. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy SDS i inkubować na lodzie przez 10 minut.
  2. Przenieść każdą próbkę do probówki sonikacyjnej i wykonać ścinanie za pomocą zogniskowanego ultrasonografu zgodnie z ustawieniami wskazanymi w Tabeli 2.
  3. Po ścinaniu przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ~18 000 x g.
  4. Przenieść supernatant do nowych probówek.
  5. Zebrać 50 μl, aby określić wydajność ścinania zgodnie z krokiem 3 i zamrozić ścięty lizat w ciekłym azocie. Przechowywać lizat w jednorazowych porcjach w temperaturze -80 °C.

3. Określanie wydajności ścinania

  1. Dodać 50 μl buforu elucyjnego do 50 μl każdego ściętego lizatu i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc, wytrząsając.
  2. Dodać 100 μl buforu TE i 4 μl 10 mg/ml RNazy A (stężenie końcowe 0,2 μg/μl). Mieszać i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, wytrząsając.
  3. Dodać 2 μl 20 mg/ml proteinazy K (stężenie końcowe 0,2 μg/μl) do każdej próbki i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 55 °C, wytrząsając.
  4. Przenieść każdą próbkę do probówki żelowej odpowiedniej do ekstrakcji fenolem/chloroformem/alkoholem izoamylowym; postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Dodać 200 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) i wstrząsnąć probówkami. Wirować przez 5 minut w temperaturze 24 °C i ~16 000 x g i przenieść górną fazę do nowych probówek.
    Uwaga: Fenol, chloroform i alkohol izoamylowy są toksyczne w przypadku wdychania i działają żrąco; Pracować pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Z odpadami fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego należy również postępować zgodnie z zasadami instytucji przyjmującej.
    1. Powtórz raz.
  6. Oczyścić DNA za pomocą kolumn oczyszczających zgodnie z instrukcją producenta, z następującymi modyfikacjami:
    1. Umyj membranę dwukrotnie. Po ostatnim praniu pozostaw probówkę otwartą na 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby odparować resztki etanolu.
    2. Do elucji dodać 50 μlH2O, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, obracać probówkę przez 1 s, aby odpowiednio zwilżyć błonę, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przed elucją, przez wirowanie przez 1 minutę w temperaturze 24 °C i ~17,900 x g.
  7. Określ ilościowo oczyszczone DNA na fluorometrze za pomocą zestawu o wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Przeanalizuj około 500 ng oczyszczonego DNA na 1,8% żelu agarozowym i około 1 ng na systemie do elektroforezy przy użyciu zestawu o wysokiej czułości.
    UWAGA: Oczekiwany rozmiar fragmentów DNA wynosi od 200 do 500 pz.

Dni 3 i 4

4. Immunoprecypitacja

  1. Rozcieńczyć 1 objętość ściętego lizatu 5 objętościami buforu rozcieńczającego.
  2. Preclear z 30 μl/ml białka A w kulkach agarozy (przygotowanych zgodnie z dodatkiem A) przez 30 minut, obracając się w chłodni.
  3. Wirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy ~750 x g.
  4. Zebrać 10% wsadu i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
  5. Podać żądaną ilość lizatu do nowych probówek (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 3). Dodać pożądane przeciwciała do każdej probówki (szczegóły patrz Tabela 3) i obracać przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Dodać 40 μl kulek białka A i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, obracając się.
  7. Przemyć kulki 1 ml buforu o niskiej zawartości soli, buforu o wysokiej zawartości soli, buforu LiCl i buforu TE (przy każdym płukaniu inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C podczas obracania i wirować przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ~950 x g). Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 3.
  8. Dodać 110 μl buforu elucyjnego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, wirując co 2 minuty.
  9. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ~950 x g i przenieść 100 μl supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  10. Powtórzyć kroki 4.7-4.8 ze 100 μl buforu elucyjnego i połączyć eluaty. Dodać bufor elucyjny do 200 μl, aby wprowadzić próbki.
  11. Wszystkie próbki inkubować przez noc w temperaturze 65 °C, wytrząsając.

Dzień 5

5. Oczyszczanie DNA

  1. Dodać 200 μl buforu TE do każdego eluatu i 8 μl 10 mg/ml RNazy A (końcowe stężenie 0,2 μg/μl). Mieszać i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, wytrząsając.
  2. Dodać 4 μl 20 mg/ml proteinazy K (0,2 μg/μl stężenia końcowego) do każdej eluacji i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 55 °C, wytrząsając.
  3. Przenieść każdą próbkę do probówki żelowej odpowiedniej do ekstrakcji fenolem/chloroformem/alkoholem izoamylowym; postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Dodać 400 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) i wstrząsnąć probówkami. Wirować przez 5 minut w temperaturze 24 °C i ~16 000 x g. Przenieś górną fazę do nowych probówek.
    Uwaga: Fenol, chloroform i alkohol izoamylowy są toksyczne w przypadku wdychania i działają żrąco; Pracować pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Z odpadami fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego należy również postępować zgodnie z zasadami instytucji przyjmującej.
    1. Powtórz raz.
  5. Oczyścić DNA za pomocą kolumn oczyszczających zgodnie z instrukcjami producenta, z następującymi modyfikacjami:
  6. Umyj membranę dwukrotnie. Po ostatnim praniu pozostaw probówki otwarte na 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby odparować resztki etanolu.
  7. Do elucji dodać 50 μlH2O, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min, wirować probówki przez 1 s, aby odpowiednio zwilżyć membranę, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przed elucjącją, przez wirowanie przez 1 minutę w temperaturze 24 °C i ~17,900 x g.

Wyniki

Dojrzałe limfocyty T myszy poddano analizie ChIP w celu zbadania wzbogacenia modyfikacji histonowych: monometylacji lizyny 4 histonu 3 (H3K4me1), trimetylacji lizyny 4 histonu 3 (H3K4me3) oraz acetylacji lizyny 27 histonu 3 (H3K27ac), a także zajętości nukleosomów, co wykazano za pomocą ChIP panH3. Jakość fragmentacji DNA oceniono za pomocą analizy na żelu agarozowym 1,8% (Rycina 2A) oraz w systemie elektroforetycznym (Rycina 2B). H3K4me1 i H3K4me3 są zazwyczaj stosowane odpowiednio do identyfikacji miejsc enhancerów i promotorów (Rycina 3A). W rzeczywistości H3K4me3 jest wyraźnie, choć nie wyłącznie, wzbogacone w obrębie promotorów5,8,14. Charakterystyczną cechą aktywnych enhancerów jest wysoki poziom wzbogacenia w H3K4me1 i H3K27ac oraz niski poziom wzbogacenia w H3K4me3 (Rycina 3A, górny panel), natomiast enhancery nieaktywne wykazują niskie poziomy H3K4me3 i H3K27ac, ale wysoki poziom H3K4me1 (Rycina 3A, dolny panel). Jak pokazano na Rycynie 3B, gen Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gapdh) jest reprezentatywny dla analizy aktywnych promotorów genów (promotor Gapdh). W rzeczywistości wykazuje on wysokie poziomy H3K4me3 i H3K27ac oraz niski poziom H3K4me1. Na Rycynie 3B gen Deltex1 (Dtx1) jest reprezentatywny dla nieaktywnych enhancerów (enhancer Dtx1), ponieważ jest silnie wzbogacony w H3K4me1 i słabo wzbogacony w H3K4me3 i H3K27ac. Gene desert (pustynia genowa) jest reprezentatywny dla regionu pozbawionego genów kodujących i jest zazwyczaj stosowany jako kontrola negatywna dla aktywnych markerów chromatyny. Obserwacja, że H3K4me1, powszechnie uznawany marker enhancerów4,5,7,14,18, nie jest wzbogacony w regionie Gene desert, sugeruje, że obszar ten jest pozbawiony enhancerów.

Schemat procesu immunoprecypitacji chromatyny, oczyszczanie DNA, qPCR, analiza żelu agarozowego.
Rycina 1: Schematyczny przegląd przedstawionego protokołu ChIP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Elektroforeza żelowa i wykres intensywności; wyniki rozdziału i analizy wielkości DNA.
Rysunek 2: Kontrola jakości fragmentacji dojrzałej linii komórek T myszy. (A) Dwie różne alikwoty dojrzałej linii komórek T myszy E2-10HA zostały poddane fragmentacji, a następnie około 500 ng oczyszczonego DNA przeanalizowano na żelu agarozowym 1,8%, aby ocenić jakość fragmentacji. (B) 1 ng oczyszczonego DNA z próbki 2 przeanalizowano za pomocą elektroforezy w celu oceny jakości fragmentacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat modyfikacji chromatyny; poziomy H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac; wyniki na wykresie słupkowym.
Rysunek 3: Markery chromatyny charakteryzujące enhancery i promotory. (A) Aktywne enhancery (panel górny) charakteryzują się wysokim poziomem H3K4me1, niskim poziomem H3K4me3 i wysokim poziomem H3K27ac, podczas gdy enhancery nieaktywne (panel dolny) wykazują wysoki poziom H3K4me1, niski poziom H3K4me3 i niski poziom H3K27ac. (B) Próbki przedstawione na Rysunku 2A zostały połączone i wykorzystane do analizy ChIP w odniesieniu do markerów histonowych H3K4me1, H3K4me3 i H3K27ac oraz zajętości histonów, co wykazano za pomocą ChIP panH3. Analiza ta pokazuje, że promotor genu konstytutywnego Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (promotor Gapdh) jest silnie wzbogacony w H3K4me3 i H3K27ac oraz słabo wzbogacony w H3K4me1. Z drugiej strony, enhancer nieaktywnego genu Deltex1 (enhancer Dtx1) jest silnie wzbogacony w H3K4me1, ale słabo wzbogacony w H3K4me3 i H3K27ac. Do zbadania zajętości nukleosomów wykorzystano ChIP z użyciem przeciwciała panH3. W качестве kontroli negatywnej wykorzystano gene desert (pustynię genową). Przedstawiono jeden reprezentatywny eksperyment. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Nazwa buforuOdczynnikStężenie końcowe
Bufor do rozcieńczaniaDodcylofosforan sodu (SDS)0,01% (m/v)
Triton X-1001,1% (v/v)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,01,2 mM
Tris-HCl pH 8,116,7 mM
Chlorek sodu (NaCl)167 mM
roztwór DMAAdipimidian dimetylu (DMA)10 mM
roztwór soli fosforanowo-buforowany (PBS)1x
Bufor elucyjnyDodecylosiarczan sodu (SDS)1% (m/v)
Kwas etylendiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,010 mM
Tris-HCl pH 8,050 mM
Bufor wysokosolnyDodcylofosforan sodu (SDS)0,1% (m/v)
Triton X-1001% (v/v)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,02 mM
Tris-HCl pH 8,120 mM
Chlorek sodu (NaCl)500 mM
pożywka IMDMmodyfikowana pożywka Dulbecco opracowana przez Iscove'a (IMDM)1x
płodowa surowica bydlęca (FBS)2% (v/v)
Penicylina/Streptomycyna1x
Pepton Primatone0,3 mg/ml
Roztwór insuliny ludzkiej 4,8 mg/ml
Minimum essential medium z nieessentialnymi aminokwasami (MEM NEAA)1x
bufor solny LiClChlorek litu (LiCl)0,25 M
IGEPAL-CA6301% (v/v)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,01 mM
Tris-HCl pH 8,110 mM
Bufor o niskim stężeniu soliDodecylosiarczan sodu (SDS)0,1% (m/v)
Triton X-1001% (v/v)
Kwas etylenodiaminooctowy (EDTA) pH 8,02 mM
Tris-HCl pH 8,120 mM
Chlorek sodu (NaCl)150 mM
Bufor do płukania kulek Sepharose Protein ATris-HCl pH 8,020 mM
Chlorek sodu (NaCl)500 mM
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,02 mM
Dodcylowy siarczan sodu (SDS)0,1% (m/v)
IGEPAL-CA6301% (v/v)
Bufor lizujący z SDSDodecylosiarczan sodu (SDS)1% (m/v)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,010 mM
Tris-HCl pH 8,150 mM
bufor TETris-HCl pH 8,010 mM
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,01 mM

Tabela 1: Lista buforów i pożywki użytych w tym protokole.

WŁ.WYŁĄCZONY
Moc szczytowa150.02.5
Współczynnik wypełnienia15.015.0
Cykle/bursty500500
Liczba cykli28

Tabela 2: Ustawienia ścinania zastosowane w tym protokole. Warunki te zostały zoptymalizowane dla dojrzałej linii limfocytów T myszy.

PrzeciwciałoDostawcaIlość przeciwciała/immunoprecypitacjaLiczba komórek/immunoprecypitacjaWarunki płukania
H3Abcam (ab1791)2.5 mg5 x 106Raz w buforze niskosolnym, dwa razy w buforze wysokosolnym, dwa razy w buforze z LiCl i trzy razy w buforze TE
H3K4me1Abcam (ab8895)2.5 mg5 x 106Raz w buforze niskosolnym, dwa razy w buforze wysokosolnym, dwa razy w buforze z LiCl i trzy razy w buforze TE
H3K4me3Diagenode (pAb-003-050)2.5 mg5 x 106Raz w buforze niskosolnym, dwa razy w buforze wysokosolnym, dwa razy w buforze z LiCl i trzy razy w buforze TE
H3K27acDiagenode (pAb-174-050)2.5 mg5 x 106Raz w buforze niskosolnym, dwa razy w buforze wysokosolnym, dwa razy w buforze z LiCl i trzy razy w buforze TE
IgGDiagenode (C15410206)Zmienna*Zmienna*Zmienne*
* W przypadku kontroli IgG ilość przeciwciał i komórek, a także etapy płukania, muszą odpowiadać warunkom stosowanym w pozostałych immunoprecypitacjach.

Tabela 3: Przeciwciała i warunki płukania zastosowane w niniejszym badaniu.

Genstarter forwardstarter reversesonda
Gapdh promoter (0 kb)5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3'5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3'68
Dtx1 enhancer (+26 kb)5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3'5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3'27
Gene desert5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3'5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3'94

Tabela 4: Primery i sondy użyte do qPCR w niniejszym badaniu.

ProblemPrzyczynyRoztwór
Chromatyna jest niewystarczająco rozszczepiona, a fragmenty są zbyt duże.Użyto zbyt wielu komórek.Zmniejszyć liczbę komórek.
Siły ścinające są zbyt niskie.Zwiększ liczbę cykli ścinania.
Zwiększ szczytową moc ścinania, współczynnik wypełnienia i/lub liczbę cykli w impulsie.
Chromatyna została nadmiernie rozdrobniona i fragmenty są zbyt małe.Użyto zbyt niewielkiej liczby komórek.Zwiększyć liczbę komórek.
Siły ścinania są zbyt wysokie.Zmniejsz liczbę cykli ścinania.
Należy zmniejszyć szczytową moc ścinania, współczynnik wypełnienia i/lub liczbę cykli w impulsie.
Zbyt niska odzyskowalność względem kontroli IgG i/lub kontroli negatywnej (wysokie tło).Użyto niewystarczającej ilości chromatyny do przeprowadzenia eksperymentu.Zwiększyć ilość chromatyny.
Ilość przeciwciał jest zbyt niska.Zwiększyć ilość przeciwciała.
Ilość przeciwciał jest zbyt wysoka.Zmniejszyć ilość przeciwciał.
Przeciwciało wykazuje niską swoistość.Wymień przeciwciało.
Warunki płukania są zbyt rygorystyczne.Zmniejszyć liczbę etapów płukania.
Zmniejszyć rygorystyczność buforów płuczących.
Warunki płukania nie są wystarczająco rygorystyczne.Zwiększyć liczbę przemyć.
Zwiększyć rygorystyczność buforów płuczących.
Do reakcji qPCR przeniesiono zbyt dużą ilość DNA.Zmniejsz ilość DNA pipetowanego do reakcji qPCR.
Warunki qPCR nie są optymalne.Zoptymalizuj warunki qPCR.
Zmniejszyć liczbę cykli.
W reakcji qPCR próbki wejściowej nie stwierdzono produktu lub jego poziom jest zbyt niski.Do reakcji qPCR pipetowano zbyt małą ilość DNA.Zwiększ ilość DNA naniesionego do reakcji qPCR.
Warunki qPCR nie są optymalne.Zoptymalizuj warunki qPCR.
Zwiększ liczbę cykli.
Wykorzystano niewystarczającą ilość chromatyny do przeprowadzenia eksperymentu.Zwiększyć ilość chromatyny.
Brak sygnału w kontroli pozytywnej i/lub w ChIP panH3.Użyto zbyt małej ilości chromatyny do przeprowadzenia eksperymentu.Zwiększyć ilość chromatyny.
Ilość przeciwciał jest zbyt niska.Zwiększyć ilość przeciwciała.
Przeciwciało wykazuje niską swoistość.Wymień przeciwciało.
Elucja jest suboptymalna.Należy często wirować próbki w vortexie, aby zapobiec sedymentacji kulek.

Tabela 5: Rozwiązywanie problemów.

Dyskusja

ChIP jest dobrą techniką do badania, czy białka lub ich PTM są wzbogacone w określonych regionach genomu. Wyniki testów ChIP są często trudne do interpretacji z przyczyn biologicznych lub technicznych. Przyczyny biologiczne są wielorakie i obejmują słabe lub pośrednie wiązanie białek z DNA. Istnieją również ograniczenia techniczne, takie jak ograniczona swoistość przeciwciał i nieefektywna liza komórek lub ścinanie chromatyny. Przewodnik rozwiązywania problemów (Tabela 5) może pomóc czytelnikowi w rozwiązaniu problemów, które można napotkać podczas testów ChIP.

Protokół ten, wykorzystujący urządzenie ultradźwiękowe skoncentrowane na chłodzeniu, pozwala na skuteczne ścinanie chromatyny dojrzałej linii mysich komórek T. Głównym krytycznym etapem protokołu jest ścinanie chromatyny, które zawsze musi być zoptymalizowane dla każdego typu komórki. Sugeruje się różnicowanie liczby komórek i liczby cykli sonikacji. Ponadto na efektywność ścinania negatywny wpływ ma obecność w próbkach osadów SDS, które mogą powstawać podczas lizy komórek na lodzie z buforem do lizy SDS. W takim przypadku najlepiej jest inkubować próbkę po lizie w temperaturze pokojowej przez kilka minut, aby zmniejszyć obecność osadów SDS. Zaleca się optymalizację protokołu w celu uzyskania ściętych fragmentów o wielkości od 200 do 500 pz i zawsze ocenę jakości ścinania próbek przed przystąpieniem do immunoprecypitacji. Ponadto czas utrwalania, ilość przeciwciał i/lub komórek oraz warunki mycia muszą być zoptymalizowane dla każdego przeciwciała.

Jeszcze jednym krytycznym krokiem na drodze do udanego przeprowadzenia procedury ChIP jest wybór przeciwciała, ponieważ przeciwciała o niskiej swoistości znacznie zmniejszają skuteczność immunoprecypitacji. Wcześniej ujednolicona procedura badania jakości pozwalała na ocenę swoistości kilku przeciwciał dostępnych na rynku19. Linia przesiewowa została oparta na dot blot, Western blot i ChIP, dostarczając listę wysokiej jakości odczynników odpowiednich dla ChIP19. Niedawno oceniono swoistość kilku dostępnych na rynku przeciwciał przy użyciu platform mikromacierzy peptydów histonowych o dużej gęstości, co pozwoliło na utworzenie bazy danych na temat swoistości przeciwciał20. Czytelnik może użyć tego przydatnego narzędzia do zidentyfikowania najbardziej specyficznych przeciwciał, które można wykorzystać w eksperymentach ChIP.

Protokół ten nie został przetestowany dla pierwotnych limfocytów T i w tym przypadku czytelnik powinien zapoznać się z innymi opublikowanymi protokołami, które z powodzeniem wykonują ChIP na pierwotnych limfocytach T 3,4,21. Warto zauważyć, że protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do przeprowadzenia ChIP na linii komórek T progenitorowych myszy, a także na linii komórek śródbłonka myszy.

Do każdej immunoprecypitacji należy użyć 5 x 106 komórek do analizy znaczników histonowych. Ponieważ protokół ten może być również odpowiedni, z pewną optymalizacją, do przeprowadzania ChIP na TF lub kofaktorach, najlepiej jest zwiększyć liczbę komórek używanych do immunoprecypitacji w takich przypadkach. Aby osiągnąć wymaganą liczbę komórek dla każdego eksperymentu, więcej porcji ściętego lizatu można połączyć razem przed rozcieńczeniem chromatyny w buforze rozcieńczającym.

Protokół ten można również zmodyfikować w celu przeprowadzenia ChIP na endogennych białkach, które nie wiążą się bezpośrednio z DNA. W takim przypadku może być wymagane wstępne utrwalenie za pomocą środków sieciujących białko-białko (np. dimetyloadipimidate, DMA) (więcej informacji znajduje się w dodatku B ). Pomyślne działanie ChIP na kofaktory zostało wcześniej osiągnięte poprzez nadekspresję białek, które są połączone ze znacznikiem biotyny. W tym przypadku białko oczyszczono kulkami magnetycznymi sprzężonymi ze streptawidyną i przeprowadzono wstępne utrwalenie za pomocą DMA22.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni P. Käse i T. Schmidt-Wöllowi za doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez wspólny grant badawczy TRR81 i program Heisenberga (BO 1639/5-1) DFG (Niemiecka Fundacja Badawcza), Towarzystwo Maxa Plancka i EXC 294 we Freiburgu oraz Klaster Doskonałości dla Układu Krążeniowo-Oddechowego (ECCPS) w Giessen do T.B.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki Agilent High Sensitivity D5000Agilent Technologies5067-5593
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5592
Agilent Tapestation 4200Agilent TechnologiesG2991AA
Covaris S220 AFA SystemCovaris500217
adipimidan dimetylu (DMA)Thermo Fisher Scientific20660
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Pan-Biotech1502-P121301
Formaldehyd (FMA)Sigma-AldrichF8775
Roztwór insuliny dla ludzi Sigma-AldrichI9278-5ML
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMDM)Gibco21980-032
Minimalna niezbędna pożywka aminokwasy endogenne (MEM NEAA)Gibco11140-035
nProtein A Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare17-5280-02
Penicylina-Streptomycyna
(10,000 U/ml)		Gibco15140-122
Pepton primatoneSigma-AldrichP4963-100G
Żel do blokady fazy ciężki 2  mL5 Prime2302830
Alkohol fenolowy/chloroformowy/izoamylowy (25:24:1)RothA156.2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)GIBCO14190-094
Roztwór proteinazy K (20 mg/ml), klasa RNAThermo Fisher Scientific25530049
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR (250)Qiagen28106
Qubit 3.0 FluorometrThermo Fisher ScientificQ33216
Probówki do oznaczania kubitówThermo Fisher ScientificQ32856
Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854
Bez RNazy A, DNazy i proteazy (10  mg / ml)Thermo Fisher ScientificEN0531
Rurka AFA Błonnik & CzapkaCovaris520081

Bibliografia

  1. Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
  2. Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
  3. Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
  4. Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
  5. Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
  6. Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905(2015).
  7. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  8. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  9. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  10. Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
  11. Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
  12. Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
  13. Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
  14. Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
  15. Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67(2016).
  16. Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
  17. White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
  18. Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
  19. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  20. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  21. Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
  22. Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modyfikacje histon wfragmentacja chromatynysieciowanie formaldehydemprotok sonikacjiwi zanie przeciwciaoczyszczanie DNAekstrakcja fenolowo chloroformowaelektroforeza w elu
Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.