Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

41.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55912

⸱

1 sierpnia 2017

 ,  , 
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje metody zastosowania technologii mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających histony i ich potranslacyjne modyfikacje.

Streszczenie

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek histonowych są szeroko badane pod kątem ich roli w regulacji struktury chromatyny i ekspresji genów. Masowa produkcja i dystrybucja przeciwciał specyficznych dla histonów PTM znacznie ułatwiła badania nad tymi znakami. Ponieważ przeciwciała histonowe PTM są kluczowymi odczynnikami do wielu zastosowań biochemii chromatyny, rygorystyczna analiza swoistości przeciwciał jest niezbędna do dokładnej interpretacji danych i dalszego postępu w tej dziedzinie. Protokół ten opisuje zintegrowany proces projektowania, wytwarzania i stosowania mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał histonowych. Aspekty projektowania i analizy tej procedury są ułatwione przez ArrayNinja, interaktywny pakiet oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym, który niedawno opracowaliśmy w celu usprawnienia dostosowywania formatów drukowania mikrotablic. Rurociąg ten został wykorzystany do badań przesiewowych dużej liczby komercyjnie dostępnych i szeroko stosowanych przeciwciał histonowych PTM, a dane wygenerowane z tych eksperymentów są swobodnie dostępne za pośrednictwem internetowej i rozszerzającej się bazy danych swoistości przeciwciał histonowych. Poza histonami, ogólna metodologia opisana w niniejszym dokumencie może być szeroko stosowana do analizy przeciwciał specyficznych dla PTM.

Wprowadzenie

Kwas DNA genomowy jest w elegancki sposób upakowany w jądrze komórkowym eukariotów wraz z białkami histonowymi, tworząc chromatynę. Powtarzającą się podjednostką chromatyny jest nukleosom, który składa się ze 147 par zasad DNA owiniętych wokół rdzenia oktamerowego białek histonowych – H2A, H2B, H3 oraz H41. Chromatyna jest ogólnie zorganizowana w luźno upakowane domeny euchromatyny oraz gęsto upakowane domeny heterochromatyny. Stopień kondensacji chromatyny reguluje zakres, w jakim aparaty białkowe mogą uzyskać dostęp do leżącego u podstawy DNA, aby przeprowadzić fundamentalne procesy matrycowe DNA, takie jak replikacja, transkrypcja i naprawa.

Kluczowymi regulatorami dostępności genomu w kontekście chromatyny są PTM w obrębie nieustrukturyzowanych ogonów oraz domen rdzeniowych białek histonowych2,3. PTM histonów działają bezpośrednio, wpływając na strukturę chromatyny4, oraz pośrednio poprzez rekrutację białek czytających (reader proteins) i powiązanych z nimi kompleksów makromolekularnych o aktywnościach remodelujących chromatynę, enzymatycznych i rusztowaniowych5. Badania nad funkcją PTM histonów prowadzone w ciągu ostatnich dwóch dekad w przeważającej mierze sugerują, że modyfikacje te odgrywają kluczową rolę w regulacji losu komórek, rozwoju organizmu oraz inicjacji i progresji chorób. Dzięki postępom w technologiach proteomicznych opartych na spektrometrii mas odkryto ponad 20 unikalnych PTM histonów w ponad 80 różnych resztach histonowych6. Co istotne, modyfikacje te często występują w kombinacjach, a zgodnie z hipotezą „kodu histonowego”, liczne badania sugerują, że białka czytające są kierowane do konkretnych regionów chromatyny poprzez rozpoznawanie specyficznych kombinacji PTM histonów7,8,9. Kluczowym wyzwaniem na przyszłość będzie przypisanie funkcji rosnącej liście PTM histonów oraz określenie, w jaki sposób specyficzne kombinacje tych modyfikacji koordynują dynamiczne funkcje związane z chromatyną.

Przeciwciała są kluczowymi odczynnikami w detekcji PTM histonów. W związku z tym komercyjnie opracowano ponad 1000 przeciwciał specyficznych dla PTM histonów do zastosowań w badaniach nad biochemią chromatyny. Dzięki szybkiemu rozwojowi technologii wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA, odczynniki te są szeroko wykorzystywane przez poszczególnych badaczy oraz w ramach wielkoskalowych inicjatyw „mapowania” epigenomiki (np. ENCODE i BLUEPRINT) w potokach analiz ChIP-seq (immunoprecypitacja chromatyny połączona z sekwencjonowaniem nowej generacji) w celu generowania wysokorozdzielczych map przestrzennych rozkładu PTM histonów w całym genomie10,11. Jednakże niedawne badania wykazały, że specyficzność przeciwciał przeciwko PTM histonów może być bardzo zmienna, a odczynniki te wykazują niepożądane właściwości, takie jak rozpoznawanie epitopów pozacelowych, silny wpływ dodatni i ujemny sąsiednich PTM oraz trudność w rozróżnianiu stopnia modyfikacji konkretnego reszty (np. mono-, di- lub tri-metylolizyny)12,13,14,15,16,17,18. Dlatego konieczna jest rygorystyczna kontrola jakości przeciwciał specyficznych dla PTM histonów, aby dokładnie interpretować dane generowane za pomocą tych cennych odczynników.

Technologia mikromacierzy umożliwia jednoczesną analizę tysięcy oddziaływań makromolekularnych w formacie wysokoprzepustowym, powtarzalnym i zminiaturyzowanym. Z tego powodu stworzono różnorodne platformy mikromacierzy do analizy oddziaływań białko-DNA19,20, białko-białko 21 oraz białko-peptyd22. W szczególności mikromacierze peptydów histonowych stały się informacyjną platformą odkrywczą w badaniach nad biochemią chromatyny, umożliwiając wysokoprzepustowe profilowanie enzymów zapisujących (writers), usuwających (erasers) i odczytujących (readers) PTM histonów15,23,24, a także analizę swoistości przeciwciał antyhistonowych17,25. Poza zastosowaniem w badaniach nad chromatyną i epigenetyką, macierze peptydów histonowych wykazują potencjalną użyteczność jako test diagnostyczny/prognostyczny w toczniu układowym i innych chorobach autoimmunologicznych, w których powstają autoprzeciwciała przeciwko chromatynie26,27.

W niniejszej pracy opisujemy zintegrowany schemat postępowania, który opracowaliśmy w celu projektowania, wytwarzania i badania mikromacierzy peptydów histonowych, aby generować profile specyficzności przeciwciał rozpoznających histony oraz ich modyfikacje potranslacyjne (PTM). Proces ten jest wspierany przez ArrayNinja — opracowaną przez nas niedawno, interaktywną aplikację otwartoźródłową, która integruje etapy projektowania i analizy eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy28. ArrayNinja działa najlepiej w przeglądarce Google Chrome. W skrócie, zrobotyzowany drukarka mikromacierzy kontaktowej jest wykorzystywana do nanoszenia biblioteki biotynylowanych peptydów histonowych w określonych pozycjach na szklanych przedmiotach mikroskopowych powlekanych streptawidyną. Macierze mogą być następnie wykorzystywane w formacie testów konkurencyjnych i równoległych do badania oddziaływań przeciwciało-epitop (Rycina 1). Biblioteka peptydów składa się z setek unikalnych syntetycznych peptydów zawierających PTM (acetylację lizyny, metylację lizyny/argininy oraz fosforylację seryny/treoniny) pojedynczo oraz w odpowiednich kombinacjach, w dużej mierze pochodzących z zestawów danych proteomicznych. Metody syntezy i walidacji peptydów zostały szczegółowo opisane w innej publikacji23. Dane generowane z naszych bieżących wysiłków w zakresie przesiewania przeciwciał przeciwko PTM histonów z wykorzystaniem tej platformy macierzowej są archiwizowane w publicznym zasobie internetowym, bazie danych Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Co istotne, mikromacierze peptydów histonowych wytworzone z zastosowaniem wariantów tego protokołu były również szeroko wykorzystywane do charakterystyki aktywności domen odczytujących PTM histonów8,29,30,31,32,33,34,35,36,37, a ostatnio do profilowania aktywności enzymów zapisujących (writer) i usuwających (eraser) PTM histonów24.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie etapowej procedury przesiewania przeciwciał na mikrotablicy peptydów histonowych. Biotynilowane peptydy histonowe posiadające określone modyfikacje potranslacyjne (czerwone i niebieskie kółka) są współdrukowane z biotyna-fluoresceiną na szkle pokrytym streptawidyną. Pozytywne interakcje są wizualizowane jako czerwona fluorescencja. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Instalacja i uruchamianie programu ArrayNinja

  1. Pobierz i zainstaluj program Oracle Virtual Box ze strony www.virtualbox.org.
  2. Pobierz i rozpakuj maszynę wirtualną (VM) ArrayNinja z adresu http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. Otwórz Virtual Box i dodaj maszynę wirtualną ArrayNinja, klikając „Machine”, „Add”, a następnie wybierz plik arrayninja.vbox z folderu, w którym zapisano maszynę wirtualną ArrayNinja.
  4. Uruchom ArrayNinja, zaznaczając ją w programie Virtual Box i klikając zieloną strzałkę „start”.
  5. Virtual Box otworzy nowe okno i wyświetli komunikat informujący, że dostęp do maszyny wirtualnej można uzyskać, wpisując w przeglądarce internetowej adres localhost:2080.                                                                                                                                         UWAGA: Kontenerowa wersja ArrayNinja jest również dostępna poprzez hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. Projektowanie układu szkiełka z macierzą i płytki źródłowej

  1. W sekcji „Plan a slide layout” w interfejsie ArrayNinja kliknij łącze odpowiadające używanej drukarce do mikromacierzy.
    UWAGA: Program ArrayNinja został zaprojektowany tak, aby naśladować ruchy robotyczne dwóch powszechnie stosowanych drukarek do mikromacierzy (patrz Tabela 1). Kompatybilność z innymi urządzeniami do nanoszenia macierzy może zostać skonfigurowana na żądanie.
  2. Kliknij wewnątrz okna dialogowego „Load plate”, wpisz „empty” i naciśnij klawisz enter. Zrzut ekranu modułu projektowania ArrayNinja przedstawiono na Rysunku 2.
  3. Ustaw średnicę plamki (spot diameter) na 275 µm oraz odstępy między plamkami (spot spacing) na 375 µm. Dostosuj pozostałe ustawienia (Plate Blocks/plate row, Total plate Rows, replicates, features in y, Super Arrays, SuperA fudge; patrz Rysunek 2), aby spersonalizować rozmieszczenie elementów na szkiełku do mikromacierzy.
    UWAGA: Średnica plamki jest określona przez rozmiar pinu do mikromacierzy. Wraz ze zmianą tych ustawień, schemat szkiełka będzie aktualizowany w czasie rzeczywistym. Użyj tego schematu, aby podglądać, jak każde ustawienie modyfikuje końcowy układ szkiełka.
  4. Po sfinalizowaniu układu elementów na szkiełku, najeżdżaj kursorem na każdy unikalny element i wpisuj jego identyfikator w pojawiającym się oknie dialogowym.
    UWAGA: Identyfikatory elementów mogą składać się z cyfr, liter lub ich kombinacji. Jest to wymagane tylko dla unikalnych elementów; okno dialogowe nie pojawi się w przypadku wybrania powtórzeń (replicates).
  5. Po przypisaniu identyfikatorów do wszystkich unikalnych elementów kliknij „populate”. Wpisz nazwę układu szkiełka i kliknij „print your plate”, aby zapisać zmiany. Otworzy się nowa strona wyświetlająca liczbę potrzebnych 384-dołkowych płytek źródłowych do wykonania wybranego projektu szkiełka oraz tabelę mapującą fizyczną lokalizację każdego elementu, który ma zostać naniesiony na płytkę(i) źródłową(e).
    UWAGA: Zapamiętaj tę nazwę, ponieważ będzie ona używana do przywołania tego projektu podczas analizy danych mikromacierzy (patrz sekcja 6.2). Kliknięcie „print your plate” zapisuje układ w programie ArrayNinja.

figure-protocol-1
Rycina 2: Moduł projektowania ArrayNinja. Wewnątrz przerywanej linii pokazano zrzut ekranu modułu projektowania ArrayNinja. Panel sterowania (u góry) zawiera wszystkie parametry, które można modyfikować w drukarce do mikromacierzy. Wraz z dostosowywaniem tych parametrów, schematyczna grafika układu szkiełka (na dole po lewej) aktualizuje się w czasie rzeczywistym. Po ustawieniu układu użytkownik może najechać kursorem myszy na poszczególne plamki, aby wprowadzić unikalne identyfikatory cech. Na podstawie tych danych wejściowych ArrayNinja tworzy mapę pozycji każdej cechy w płytkach źródłowych (na dole po prawej), niezbędną do wykonania określonego układu szkiełka mikromacierzy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Fabrykowanie mikromacierzy

  1. Przygotowanie płytki źródłowej
    1. Używając mapy wygenerowanej w programie ArrayNinja w sekcji 2.5, przygotować płytkę(i) źródłową(e) z 384 dołkami.
      UWAGA: Szczegółowe opisy peptydów analizowanych na tej platformie można znaleźć w innym źródle17.
    2. Nanieść 1 - 2 µL każdej substancji (np. biotynilowanego peptydu histonowego) do odpowiedniego dołka płytki(i) źródłowej z 384 dołkami.
      UWAGA: Biotynilowane peptydy histonowe są zazwyczaj nanoszone z roztworów stokowych o stężeniu 200 - 400 µM, co odpowiada 10- do 25-krotnej nadwyżce molowej peptydu względem miejsc wiązania streptawidyny w pojedynczej plamce macierzy. Jest to obliczane według równania:
      figure-protocol-2
      gdzie V to objętość dostarczona przez pin, [P] to stężenie nanoszonej substancji, NA to liczba Avogadra, a S to powierzchnia plamki. C to pokrycie szkiełka, wyrażone jako liczba cząsteczek streptawidyny na jednostkę powierzchni pomnożona przez trzy (średnia liczba dostępnych miejsc wiązania streptawidyny). Wartości V oraz C są dostarczane przez odpowiedniego producenta. Inne substancje mogą wymagać różnych stężeń w zależności od wielkości biomolekuły, w przypadku których problemem może być zatłoczenie steryczne. Zakres stężeń nanoszenia dla każdego nowego rodzaju substancji należy przetestować empirycznie, aby określić optymalne stężenie nanoszenia.
    3. Rozcieńczyć każdą substancję 10-krotnie w 1x buforze do nanoszenia uzupełnionym o 1% albuminy surowicy wołowej (BSA). Wirirmek płytkę(i) źródłową(e) z prędkością 500 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zaleca się dodanie do buforu do nanoszenia biotyny znakowanej fluoresceiną (5 µg/µL) jako kontroli nanoszenia oraz pomocniczego wskaźnika wizualnego ułatwiającego prawidłowe wyrównanie macierzy podczas analizy (patrz Rysunek 4).
  2. Protokół nanoszenia (Rysunek 3A – B).
    1. Przygotować urządzenie do nanoszenia (arrayer), opróżniając pojemnik na odpady i napełniając pojemnik z roztworem myjącym oraz pojemnik nawilżacza sterylną wodą destylowaną.
    2. Wprowadzić do programu sterującego drukarką mikromacierzy parametry użyte do zaprojektowania szkiełka w programie ArrayNinja (sekcja 2 i Rysunek 2).
    3. W programie sterującym drukarką mikromacierzy ustawić procedurę mycia jako 1 s mycia z jednym zanurzeniem. Ustawić parametry po myciu na 5-krotne ponowne zanurzenie pinów po każdym cyklu mycia. Ustawić wilgotność na 60%.
      UWAGA: Optymalna konfiguracja mycia może się różnić w zależności od używanej drukarki mikromacierzy. Optymalna konfiguracja zanurzeń pinów po myciu może się różnić w zależności od używanej drukarki mikromacierzy.
    4. Włożyć funkcjonalizowane szkiełka (np. szkło powlekane streptawidyną) do uchwytów podłoży i umieścić wszystkie uchwyty w windzie podłoży. Włożyć płytkę(i) źródłową(e) do uchwytu(ów) na płytki i umieścić w windzie płytek źródłowych.
    5. Kliknąć „print”. Monitorować proces nanoszenia przez kilka rund osadzania substancji, aby upewnić się, że wszystkie ustawienia mycia i zanurzania są prawidłowe. Po zakończeniu procesu nanoszenia wyjąć uchwyty podłoży z urządzenia.
      UWAGA: Gdy duże serie wydruków uniemożliwiają zakończenie etapów blokowania w ciągu jednego dnia, naniesione szkiełka można inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez noc. Inkubować szkiełka obok małego zlewka z wodą wewnątrz kartonowego pudełka uszczelnionego folią spożywczą.
    6. Blokować szkiełka w buforze blokującym przez 30 min w temperaturze pokojowej przy mieszaniu.
    7. Myć szkiełka 2 x 10 min w temperaturze pokojowej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), pH 7,6 przy mieszaniu. Osuszyć szkiełka poprzez wirowanie w wirówce do szkiełek mikromacierzy przez 30 s w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Do przetwarzania dużej liczby szkiełek jednocześnie można użyć wysokoprzepustowej komory do mycia szkiełek mikroskopowych, umożliwiającej równoległe mycie 50 szkiełek.
    8. W przypadku szkiełek zaprojektowanych do podziału woskiem, przejść do sekcji 4.1. We wszystkich innych projektach przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem i wilgocią.
      UWAGA: Naniesione biotynilowane peptydy histonowe są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy przy takim sposobie przechowywania.

4. Podział szkiełek do mikromacierzy

  1. Pisak do wosku hydrofobowego (Rycina 3C)
    1. Za pomocą pisaka do wosku nanieść wosk wokół obszarów zawierających elementy. Pozostawić wosk do wyschnięcia na powietrzu przez 5 min przed przejściem do sekcji 5.
      UWAGA: Po blokowaniu plamki macierzy mogą być bardzo trudne do zauważenia gołym okiem. Projekt slajdu z programu ArrayNinja można wydrukować w skali i wykorzystać jako wzór podczas nakładania wosku.
  2. Uszczelka silikonowa (Rycina 3D)
    1. Odkleić przezroczystą folię z tyłu uszczelki macierzy i położyć stronę klejącą na slajdzie mikromacierzy.
    2. Przytrzymać uszczelkę w miejscu przez 5 s przed przejściem do sekcji 5.
  3. Odcisk woskowy (Rycina 3E)
    1. W przypadku slajdów przeznaczonych do podziału za pomocą wosku, wydrukować slajd testowy na zwykłym szkle, używając 10% BSA. Wykorzystać ten slajd testowy do optymalizacji prowadnic urządzenia do odcisków woskowych lub ustawień macierzy, aby upewnić się, że wszystkie elementy znajdą się wewnątrz komór formy woskowej.
    2. Nagrzać urządzenie do odcisków woskowych mikromacierzy do 85 °C, aż cały wosk całkowicie się stopi, co zajmuje około 30 min.
    3. Wsunąć slajd stroną nadrukowaną do dołu i przesunąć go do końca w stronę prawej prowadnicy urządzenia do odcisków mikromacierzy. Podnieść dźwignię, aby doprowadzić formę do kontaktu z powierzchnią slajdu. Przytrzymać przez 2 s.
      UWAGA: Czas przytrzymania można zmienić, aby uzyskać optymalną grubość obramowania woskowego.
    4. Szybko wyjąć slajd i sprawdzić wzrokowo obramowania woskowe, aby upewnić się, że wszystkie dołki są zamknięte i że obramowania nie są tak grube, by nachodziły na plamki. Przechowywać slajdy w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed wilgocią i światłem.
      UWAGA: Czas przytrzymania można zwiększyć lub zmniejszyć w celu uzyskania grubszych lub cieńszych obramowań.

figure-protocol-3
Rycina 3: Wytwarzanie mikromacierzy. (A) Wytwarzanie mikromacierzy z peptydów histonowych na szkiełkach mikroskopowych powlekanych streptawidyną przy użyciu kontaktowej drukarki mikromacierzy. (B) Mikromacierze wykonane z 3 podmacierzy w postaci siatki 48 x 48 punktów peptydowych. Rozdzielenie (C) 3 podmacierzy za pomocą hydrofobowego pisaka woskowego, (D) 2 podmacierzy za pomocą kleju silikonowego oraz (E) 48 podmacierzy za pomocą odcisku woskowego. Wszystkie przedstawione mikromacierze zostały wykonane na szkiełkach mikroskopowych o wymiarach 25 x 75 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Hybrydyzacja przeciwciała przeciwko PTM histonów z mikrotablicą peptydową

  1. Przygotować bufor do hybrydyzacji (PBS, pH 7.6, 5% BSA, 0.1% Tween-20).
  2. Urównoważyć preparat na szkiełku w buforze do hybrydyzacji, korzystając z naczynia do hybrydyzacji. Całkowicie przykryć szkiełko buforem do hybrydyzacji i inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości.
  3. Przygotować roztwór zawierający rozcieńczone przeciwciało przeciwko PTM histonów w buforze do hybrydyzacji.
    UWAGA: W danych przykładu zarówno przeciwciało przeciwko histonom #1, jak i przeciwciało przeciwko histonom #2 zostały rozcieńczone 1:1,000 w buforze do hybrydyzacji. Jako punkt wyjścia zaleca się zastosowanie zakresu rozcieńczeń podobnego do stosowanego w immunoblottingu.
  4. Inkubować macierz z roztworem przeciwciał przez 1 h w temperaturze 4 °C. Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć macierz 3 razy przez 5 min w temperaturze 4 °C zimnym PBS, pH 7.6.
  5. Przygotować rozcieńczenie 1:5,000 - 1:10,000 przeciwciała wtórnego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym w buforze do hybrydyzacji.
  6. Inkubować macierz z roztworem przeciwciał wtórnych przez 30 min w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i przemyć szkiełko z mikromacierzą 3 razy przez 5 min w temperaturze 4 °C w PBS, pH 7.6. Zanurzyć mikromacierz w probówce stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej 0.1x PBS, pH 7.6, aby usunąć nadmiar soli w temperaturze pokojowej. Osuszyć szkiełko w wirówce do szkiełek z mikromacierzami w temperaturze pokojowej.
  7. Zeskanować szkiełko za pomocą skanera do mikromacierzy z rozdzielczością 25 µm lub wyższą, zgodnie z protokołem skanowania zalecanym przez producenta skanera do mikromacierzy.
    UWAGA: Jeśli obecny jest znacznik biotyny znakowany fluoresceiną, należy zeskanować zarówno kanał zielony (ex: 488 nm, em: 509 nm), jak i kanał odpowiadający przeciwciału wtórnemu sprzężonemu z barwnikiem fluorescencyjnym, zazwyczaj czerwony (ex: 635 nm, em: 677 nm). Celem skanowania jest uzyskanie pojedynczych plików .tif z poszczególnych kanałów, które można połączyć w jeden plik .png (jak opisano w sekcji 6.1).

6. Analiza danych z mikromacierzy przy użyciu ArrayNinja

  1. Przygotowanie scalonego obrazu mikromacierzy
    UWAGA: Celem tej sekcji jest utworzenie pliku obrazu w formacie .png, który łączy dwa jednokanałowe pliki .tif (uzyskane w sekcji 5). Jest to jedyny format obrazu kompatybilny z modułem analitycznym ArrayNinja. Poniższe instrukcje przedstawiają jeden z możliwych sposobów uzyskania połączonego pliku obrazu. Dostępne są jednak również inne rozwiązania (np., darmowy program ImageJ).
    1. Z poziomu wiersza poleceń w terminalu bash na komputerze z zainstalowanym darmowym oprogramowaniem ImageMagick należy przejść do folderu zawierającego jednokanałowe pliki .tif, a następnie skopiować i wkleić poniższe kroki, naciskając klawisz „Enter” po każdym z nich (6.1.4 – 6.1.7).
      UWAGA: Nazwy plików zapisane wielkimi literami (np., RED_CHANNEL) należy zastąpić nazwą pliku obrazów płytki mikrotablicowej.
    2. W razie potrzeby należy najpierw odwrócić obrazy za pomocą polecenia „convert INPUT.tif -negate OUTPUT.tif”. Jest to wymagane, jeśli skaner zapisuje pliki .tif z sygnałem w kolorze białym i tłem w kolorze czarnym.
      1. convert -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel GB -evaluate set 0 -delete 0 out.png 2>plik.błędu
      2. convert - depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel RB -evaluate set 0 -delete 0 outa.png 2>błąd.plik.
      3. convert -depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel RG -evaluate set 0 -delete 0 outB.png 2>Błąd pliku.
      4. convert out.png outa.png outB.png -set colorspace RGV -combine merged.png.
        UWAGA: Plik o nazwie „merged.png” zostanie zapisany w tym samym folderze, co oryginalne pliki .tif.
  2. Kwantyfikacja danych przy użyciu ArrayNinja
    1. Otwórz program ArrayNinja i kliknij odpowiedni link do drukarki mikromacierzy w sekcji "W celu ilościowej analizy obrazów pochodzących ze znanej płytki źródłowej." Wpisz nazwę zapisanego projektu slajdu (krok 2.5) w "napełnij płytkę" okno dialogowe i kliknij „enter”. Patrz Rycina 4 zrzut ekranu modułu analizy ArrayNinja.
    2. Kliknij „Choose File”, przejdź do pliku „merged.png” utworzonego w sekcji 6.1 i wybierz go. Zostanie załadowany obraz scalony oraz siatka układu preparatu.
    3. Użyj suwaków znajdujących się na dole panelu sterowania ArrayNinja, aby dostosować kontrast, jasność i punkt środkowy.
      UWAGA: Regulacje te służą wyłącznie celom wizualizacji i nie mają wpływu na kwantyfikację.
    4. Wybierz "rozdzielczość" i wprowadź wartość odpowiadającą rozdzielczości zeskanowanego obrazu. Użyj "margines boczny" i "margines górny" przesuń siatkę tak, aby była wyrównana z plamkami w matrycy. Dokonaj niezbędnych korekt, aby siatka była możliwie najdokładniej dopasowana do każdej plamki.
    5. Kliknij „Spot Seek” i poczekaj, aż przycisk powróci do pierwotnego szarego koloru.
      UWAGA: Czynność tę można powtarzać kilkakrotnie, aby wyśrodkować okręgi siatki na poszczególnych plamkach. Funkcja Seek (Wyszukiwanie) dopasowuje siatkę do każdej plamki w celu precyzyjnego wyrównania.
    6. Zmień "Supermatryce" wartość do "1" aby opracować każdy panel podmacierzy indywidualnie (jeśli jest to pożądane). W przypadku zastosowania układu slajdów z odciskiem wosku 4 x 12 (Rysunek 3E), użyj "iPin" "jPin" i "subA" elementy sterujące pozwalające wyłączyć funkcje w celu analizy dowolnej kombinacji dołków w układzie 4 x 12. Na przykład, aby przeanalizować dołki w lewym górnym i prawym górnym rogu jako powtórzenia, należy wprowadzić "1 4" do iPin, "1 1" do jPin i "1 4" do subA. Naciśnij 'enter'.
    7. Najeżdżaj kursorem myszy na poszczególne plamki, aby wyświetlić tożsamość danej cechy.
    8. Kliknij „Toggle zoom”, aby dokładniej przejrzeć funkcje. Wybierz referencyjne plamki tła, naciskając klawisz „R”, gdy kursor myszy znajduje się nad plamką. Plamki referencyjne zostaną podświetlone na pomarańczowo.
      UWAGA: W "przełącz powiększenie" tryb, w prawym górnym rogu wyświetlany jest powiększony obraz elementu, nad którym znajduje się kursor myszy. Szczegółowa analiza dodatkowych funkcji korekcji tła w programie ArrayNinja została przedstawiona w innym opracowaniu28.
    9. Wyłącz plamki (o bardzo zróżnicowanej morfologii lub zawierające zanieczyszczenia, które mogłyby wpłynąć na dokładność kwantyfikacji), naciskając klawisz „A” podczas najechania kursorem myszy na odpowiednie plamki. Wyłączone plamki zmienią kolor na biały.
    10. Kliknij „populate”, a następnie „Submit”, aby przeprowadzić kwantyfikację plamek.
      UWAGA: Otworzy się nowa karta, w której zostanie wyświetlony wykres słupkowy danych znormalizowanych do średniej wartości najjaśniejszego punktu. Tabela znajdująca się poniżej wykresu słupkowego zawiera zarówno znormalizowane, jak i surowe wartości danych. Tabelę tę można skopiować do arkusza kalkulacyjnego w celu archiwizacji i dalszej analizy.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Moduł analizy ArrayNinja. Przedstawiono zrzut ekranu modułu analizy ArrayNinja. Panel sterowania (lewy górny róg) zawiera wszystkie parametry, które można dostosować w celu wizualizacji matrycy, wykrywania plamek oraz dopasowania siatki do obrazu matrycy. Najechanie kursorem myszy na dany element wyświetla powiększony widok (prawy górny róg) oraz okno pop-up zawierające informacje identyfikacyjne przypisane do tego elementu (dół). Plamki referencyjne wybrane do korekcji tła są koloru pomarańczowego. Elementy wykluczone z dalszej analizy są białe. Program ArrayNinja posiada funkcję wyszukiwania tekstowego, która zaznacza pasujące elementy kolorem żółtym, co pokazano na przykładzie dla H4K16. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół został wykorzystany do zaprojektowania i wykonania platformy mikromacierzy peptydowej służącej do analizy specyficzności przeciwciał przeciwko PTM histonów. Macierz analizuje bibliotekę ponad 300 unikalnych cech peptydowych (o długości od 20 do 40 reszt), reprezentujących wiele znanych kombinacji PTM występujących w rdzeniowych i wariantowych białkach histonowych38. Ten schemat postępowania stanowił podstawowe narzędzie do przesiewania wielu pows...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niezawodność przeciwciał w zastosowaniach badań biomedycznych jest najważniejsza 46,47. Jest to szczególnie prawdziwe w biochemii chromatyny, biorąc pod uwagę pozycję przeciwciał jako kluczowych narzędzi dla większości technik opracowanych w celu scharakteryzowania obfitości i dystrybucji histonów PTM. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowany proces projektowania, wytwarzania i stosowania mikromacierzy peptydowych do analizy swoistości prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Instytut Badawczy Van Andel oraz grant badawczy z National Institutes of Health (CA181343) dla S.B.R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukowanie BufferArrayItPPB
BSAOmnipure2390
Szkiełka mikroskopowe powlekane streptawidynąGreiner Bio-one439003-25
polipropylen 384 dołkowaGreiner Bio-one784201
Biotyna-fluoresceinaKontaktowa53608
Aushon2470Aushon 2470 Drukarka mikrotablicowa
Kontaktowa drukarka mikrotablicowaGene MachinesOmniGrid 100OmniGrid Drukarka mikrotablicowa
PBSInvitrogen14190
BlokującatablicaSBB
Hydrofobowy długopis woskowyVector LabsH-4000ImmEdge Hydrofobowa bariera PAP Pen
Silikon UszczelkaGrace Bio-labs622511
Naczynie hybrydyzacyjneThermo Scientific267061lub podobne naczynie
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnymLife TechnologiesA-21244Alexa Fluor 647 (anty-królik)
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnymLife TechnologiesA-21235Alexa Fluor 647 (anty-mysie)
Wosk ImprinterArrayItMSI48
Tween-20Omnipure9490
Skaner mikromacierzyInnopsysInnoScan 1100ALlub równoważny skaner mikromacierzy
EipTitan Histone PeptideMicroarray Epicypher112001
AbSurance Pro Histone Peptide MicroarrayMillipore16668
MODified Histone Peptide ArrayActive Motif13001
Histone Code Mikrotablice peptydoweJPTHis_MA_01
WaxRoyal OakGulfWaxdo drukarki woskowej
Nawilżana komora hybrydyzacyjna Microarray SlideVWR97000-284
Wysokoprzepustowa komora do mycia szkiełek mikroskopowychMikroskop ArrayItHTW
wirówka szkiełkowaVWR93000-204
Przeciwciało 1Abcam8898
Przeciwciało 2Milipory07-473
Biotynylowany peptyd histonowyEpiCypher12-0001Przykładowy peptyd. Podobne peptydy z różnymi modyfikacjami są dostępne w kilku komercyjnych źródłach.
ImageMagickhttps://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinjahttps://rothbartlab.vai.org/tools/
drukarka mikromatrycowa Sigma buforowa

Bibliografia

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458(2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. International Human Epigenome Consortium. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49(2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160(2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489(2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726(2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the "histone code" . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. "On silico" peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modyfikacje potranslacyjneoprogramowanie ArrayNinjaprojekt mikromacierzyprofilowanie przeciwciadetekcja fluorescencyjnaanaliza PTM histon wbadania epigenetycznebiochemia chromatyny
Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.