Method Article

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

DOI:

10.3791/55914

⸱

August 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Haematopoietic Stem Cell Laboratory, The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) znajdują się w niszy szpiku kostnego (BM), skomplikowanej, wieloczynnikowej sieci składników wytwarzających cytokiny, czynniki wzrostu i macierz zewnątrzkomórkową. Zdolność HSC do pozostawania w stanie spoczynku, samoodnawiania się lub różnicowania oraz nabywania mutacji i stawania się złośliwymi zależy od złożonych interakcji, które ustanawiają z różnymi składnikami zrębu. Aby zaobserwować wzajemne oddziaływanie między ludzkimi HSC a ludzką niszą BM w warunkach fizjologicznych i patologicznych, zaprojektowaliśmy protokół ektopowego modelowania i obrazowania humanizowanej niszy BM u myszy z niedoborem odporności. Pokazujemy, że zastosowanie różnych składników komórkowych pozwala na tworzenie humanizowanych struktur i możliwość utrzymania długotrwałego wszczepienia krwi człowieka. Korzystając z mikroskopii dwufotonowej, możemy obrazować te struktury na żywo in situ w rozdzielczości pojedynczej komórki, dostarczając potężnego nowego narzędzia do funkcjonalnej charakterystyki mikrośrodowiska ludzkiego BM i jego roli w regulacji prawidłowej i złośliwej hematopoezy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Decyzje dotyczące losu komórek obserwowane w komórkach macierzystych są ściśle regulowane zarówno przez czynniki wewnętrzne, jak i zewnętrzne. W szczególności powszechnie uznaje się, że mikrośrodowisko BM odgrywa fundamentalną rolę w kontrolowaniu przełączania HSC ze stanu spoczynku do stanu aktywnego, a także w podejmowaniu decyzji o ich samoodnawianiu się lub różnicowaniu losu1. Co więcej, ostatnie odkrycia wskazują, że nowotwory hematologiczne wpływają na funkcjonowanie mikrośrodowiska BM, co wskazuje na istnienie aktywnego przesłuchu między dwoma przedziałami2,3,4,5,6. Pomimo ostatnich postępów, pozostaje wiele kluczowych pytań dotyczących tego, w jaki sposób aktywność określonych komponentów niszowych BM przyczynia się do zachowania HSC i złośliwej transformacji.

Mikrośrodowisko BM jest wysoce heterogeniczną i złożoną mieszaniną wielu różnych typów komórek, z których każda ma wyspecjalizowane funkcje. Obfity śródbłonek (EC) i składnik naczyniowy regulują obrót składników odżywczych i metabolitów, wchodzenie i wychodzenie różnych komórek do i z BM oraz kilka funkcji HSC7,8. Mezenchymalne komórki zrębu (MSC), niejednorodna populacja niezróżnicowanych komórek macierzystych i progenitorów zaangażowanych przez trzy różne linie (tj. osteogenną, chondrogeniczną, adipogenną), są kolejnym podstawowym składnikiem niszy BM. Te MSCs lokalizują się zarówno w centralnych obszarach BM, jak i w pobliżu regionu śródkostnego. Mogą być związane ze strukturami naczyniowymi i są zaangażowane w regulację funkcji HSC9,10,11,12,13,14,15.

Wiele raportów sugeruje, że HSC znajdują się w różnych zdefiniowanych miejscach w szpiku kostnym i że ich funkcja może zależeć od ich dokładnej lokalizacji. Większość obecnej wiedzy na temat HSC i ich interakcji z mikrośrodowiskiem BM pochodzi z badań na myszach1. Zastosowanie modeli ksenoprzeszczepów rozszerzyło tę wiedzę na ludzkie normalne i złośliwe HSC, wszczepiając się w mysi BM myszy z niedoborem odporności16,17,18,19,20. Chociaż jest to prawidłowy model, nadal wiąże się z wieloma wyzwaniami, takimi jak konieczność kondycjonowania myszy biorcy w większości przypadków, aby umożliwić naprowadzanie i wszczepienie ludzkiego HSC lub bariera międzygatunkowa i jej słabo poznany wpływ na interakcje i funkcje komórka-komórka.

Użycie przeciwciał neutralizujących i genetycznie modyfikowanych myszy, wraz z ksenotransplantacją, odegrało kluczową rolę w podkreśleniu złożonego dialogu, jaki ludzkie HSC nawiązują ze swoimi mikrośrodowiskami. Wprowadzenie i rozwój dwufotonowej mikroskopii konfokalnej w trybie przyżyciowym posunęło te badania o krok naprzód, umożliwiając bezpośrednie, dynamiczne obrazowanie szpiku kostnego w wysokiej rozdzielczości19,20,21,22 i zapewnia potężne narzędzie do funkcjonalnej charakterystyki mikrośrodowiska BM i jego roli w regulacji funkcji HSC. W celu obejścia niektórych problemów pojawiających się w klasycznych modelach ksenotransplantacji, na pierwszy plan wysunęła się koncepcja inżynierii humanizowanej struktury BM. Łącząc biomateriały i koncepcje implantacji komórek, raporty wykazały możliwość naśladowania mikrośrodowiska ludzkiego szpiku kostnego w regionach heterotopowych23,24,25,26,27. Otwiera to możliwość wykorzystania bioinżynierii w modelach mysich do badania prawidłowej i złośliwej hematopoezy u ludzi28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, nowotworzenie i przerzuty40,41,42,43,44.

Na podstawie wcześniejszych doświadczeń w inżynierii tkanki kostnej i obrazowaniu in vivo19,22,45,46,47,48,49,50,51,52, opisujemy protokół do bioinżynierii i organotypowego obrazu na żywo ludzkich tkanek BM. Struktury te pochodzą z implantacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z BM do rusztowań na bazie kolagenu przeszczepionych podskórnie u myszy z niedoborem odporności. W poprzednim raporcie wykazaliśmy, że ludzkie MSCs zapewniają tworzenie ludzkiego mikrośrodowiska odpowiedniego do wszczepienia ludzkich komórek krwiotwórczych45. Ponadto w tym miejscu opisujemy, w jaki sposób koimplantacja innych ludzkich składników komórkowych BM, takich jak ludzkie komórki śródbłonka (hEC) i/lub cytokiny ważne dla tworzenia kości (np. hBMP2), współpracują z hMSC w celu wytworzenia różnych humanizowanych mikrośrodowisk, które można obrazować na żywo in situ.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z PPL 70/8904, zatwierdzone przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych i zgodne z wytycznymi Cancer Research UK. Wykorzystanie próbek ludzkiej krwi pępowinowej (UCB) i pierwotnej ludzkiej ostrej białaczki szpikowej (AML) zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Wschodniego Londynu po uzyskaniu zgody i zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Bioinżynieryjne rusztowania oparte na kolagenie z ludzkimi komórkami krwiotwórczymi i zrębowymi

UWAGA: Cały protokół powinien być wykonany w sterylnych warunkach i z użyciem sterylnego materiału. Pożywka do hodowli komórkowych 1 odpowiada pożywce hMSC (MEM-α, P/S i 10% hMSC-FBS); pożywka do hodowli komórkowej 2 odpowiada pożywce EC (M199, 20% FBS, P/S, 10 mM HEPES, 50 μg/ml heparyny, 2 mM glutaminy i 50 μg/ml ECGS), a pożywka do hodowli komórkowej 3 odpowiada pożywce komórek krwiotwórczych (H5100 i P/S).

  1. Przygotuj jednojądrzaste komórki krwi pępowinowej (CB-MNC) lub pierwotną AML (MNC szpiku kostnego lub krwi obwodowej) przy użyciu gradientu gęstości Ficoll-Paque, zgodnie z dobrze znanymi protokołami53.
    1. W przypadku AML należy zubożyć limfocyty T za pomocą przeciwciała OKT.3. Inkubować 4 μg OKT.3 na 1 x 106 AML MNC przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed myciem komórek w PBS. W razie potrzeby kriokonserwuj MNC w FBS z 10% DMSO przy 2 x 108 komórkach na ml.
  2. Przygotować hodowle komórkowe hMSC (pożywka 1) i EC (pożywka hodowlana 2). Płytki komórek hMSC (patrz tabela materiałów) na zwykłych kolbach do hodowli komórkowych w pożywce hMSC. Płytki EC (patrz tabela materiałów) na powierzchniach pokrytych kolagenem 1 w pożywce EC.
  3. Przy 85-90% zbiegu komórek usuń pożywkę, przemyj dwukrotnie PBS i dodaj roztwór trypsyny-EDTA (20 μl nacm2).
    1. Po 5 minutach sprawdź, czy komórki są odłączone. Odzyskaj komórki, rozcieńczając 1:3 pożywką do hodowli komórkowych. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w odpowiednim pożywce dla każdego typu komórek i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.
    2. Użyj komórek w proporcji 2 x 106 - 107 komórek na ml. Jeśli oba typy komórek muszą być używane razem, wymieszaj zawiesiny hMSC i EC w stosunku 1:1.
  4. Przenieść zawiesinę komórkową do strzykawki insulinowej.
  5. Za pomocą skalpela pokrój wysterylizowane rusztowanie początkowe gąbki żelatynowej (np. żelpianki) (20 mm x 60 mm x 7 mm) na 24 części o podobnej wielkości (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm; Rysunek 1A i B).
  6. Rozpuścić rusztowania żelatynowe przez zanurzenie w PBS (5 min).
  7. Jedno po drugim delikatnie umieść rusztowania na sterylnej tkance, aby usunąć nadmiar PBS. Przenieść rusztowania do jednego dołka na 24-dołkowej płytce (bardzo niska powierzchnia mocowania) i za pomocą strzykawki wstrzyknąć 50 μl zawierających 105 - 106 komórek (hMSC samodzielnie lub w połączeniu z hEC; Rysunek 1C).
  8. Powtórz krok 1.7 z każdym rusztowaniem, aż wszystkie wymagane rusztowania zostaną obsiane komórkami zrębu.
  9. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i CO2 5%).
  10. Napełnij każdą studzienkę 3 ml pożywki do hodowli komórkowych 1 (Rysunek 1D) i umieść rusztowania z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i CO2 5%) w celu inkubacji przez noc. Użyj pożywki do hodowli komórkowej 2, jeśli EC są używane w rusztowaniach.
  11. Rozmrozić CB-MNC i wyizolować z nich komórki CD34+ zgodnie z odpowiednim protokołem zestawu sekcji CD34+. Zawieś wybrane komórki CD34+ w pożywce 3 i policz je w komorze Neubauera.
    UWAGA: Tutaj użyto komórek w stężeniu 2 x 106 komórek na ml.
    1. Jeśli używane są próbki pierwotne pochodzące od pacjenta z AML, rozmrozić komórki, rozcieńczyć je w stosunku 1:10 w FBS, odwirować je przez 5 minut przy 300 x g, ponownie zawiesić komórki w PBS-2% FBS, dodać przeciwciało anty-ludzkie CD3 (2 - 4 μg na 106 komórek) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. Wirować przez 5 minut przy 300 x g i ponownie zawiesić w pożywce komórek krwiotwórczych uzupełnionej cytokinami (20 ng/ml czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), 20 ng/ml IL-3 i 20 ng/ml trombopoetyny (TPO)).
  12. Powtórz kroki 1.7 - 1.9, ale w tym przypadku wysiewaj 1 x 105 ludzkich komórek krwiotwórczych zamiast składników zrębu, jak powyżej.
    1. Napełnij studzienkę 3 ml pożywki do hodowli komórkowych 3 (Rysunek 1D) i umieść rusztowania z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i CO2 5%) w celu inkubacji przez noc. Użyć mieszanki pożywek do hodowli komórkowych w stosunku 1:1 2 i 3 Jeśli EC są używane w rusztowaniach.
  13. Tylko w przypadku rusztowań nośnych rekombinowanego białka morfogenetycznego ludzkiej kości-2 (rhBMP-2) należy delikatnie umieścić rusztowania jedno po drugim na sterylnej tkance, aby usunąć nadmiar PBS. Przenieś rusztowania do jednej studzienki na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U (Rysunek 1E) i dodaj 5 μl rhBMP-2, dokładnie pokrywając rusztowanie.
    1. Dodaj 20 μl trombiny, a następnie 20 μl fibrynogenu, za każdym razem dokładnie pokrywając rusztowanie (Rysunek 1F). Powtarzać procedurę dla każdego rusztowania, aż wszystkie wymagane rusztowania zostaną poddane obróbce, a następnie inkubować przez 5 - 10 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdzić, czy koagulacja się pomyślnie wytworzyła.

2. Chirurgiczne wszczepianie rusztowań bioinżynieryjnych

UWAGA: Tutaj, zarówno samce, jak i samice, użyto myszy NSG w wieku od 6 do 12 tygodni. Ponieważ zwierzęta mają niedobór odporności, wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. Kroki 2.10 - 2.13 są związane ze strategiami przeżycia i opieką pooperacyjną.

  1. 60 - 120 min przed zabiegiem podskórnie podać leki przeciwbólowe (karprofen, 5 mg/kg masy ciała/mysz).
  2. Wywołać znieczulenie w komorze z 0,5% izofluranem i 2 l/minO2. Myszy powinny być stale monitorowane podczas zabiegu. Przenieś zwierzę na obszar operacyjny w pozycji leżącej, aby mieć łatwy dostęp do pleców. Zwierzę należy przechowywać w znieczuleniu za pomocą stożka nosowego dostarczającego 1,5% izofluranu i 2 l/minO2. Trzymaj mysz pod narkozą podczas zabiegu chirurgicznego i często sprawdzaj stan zwierzęcia.
  3. Podczas znieczulenia użyj żelu okulistycznego na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymuj mysz w temperaturze 37 °C.
  4. Ogol obszar chirurgiczny z tyłu myszy za pomocą trymera elektrycznego. Aby wysterylizować skórę, zanurz bawełnianą końcówkę w rozcieńczonej kreksydynie (rozcieńczonej 1:10 w PBS) i użyj tej końcówki do oczyszczenia powierzchni skóry. Powtórz tę procedurę dwukrotnie.
  5. Za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela (lub nożyczek) wykonaj pełne nacięcie skóry od 0,5 do 0,7 cm od przodu do tyłu. Za pomocą kleszczy wprowadzonych pod tkankę podskórną wykonaj kieszonkę.
  6. Włóż rusztowanie podskórnie, upewniając się, że jest umieszczone głęboko w kieszeni (Rysunek 1G i H). Zamknij nacięcie klejem chirurgicznym (Ryc. 1I i J).
  7. W leczeniu bólu pooperacyjnego należy podawać podskórnie buprenorfinę (0,1 mg/kg masy ciała).
  8. Podczas rekonwalescencji umieść zwierzę na boku we wstępnie ogrzanej klatce i monitoruj powrót do zdrowia, aż do zaobserwowania normalnego zachowania.
  9. Rozcieńczyć leki przeciwbólowe w wodzie (karprofen, 0,1 mg/ml wody) i podawać zwierzętom jako wodę pitną przez 4 dni po zabiegu.
  10. Często sprawdzaj zwierzę i ranę w ciągu 48 godzin po operacji pod kątem możliwych działań niepożądanych.

3. Leczenie myszy, eutanazja i pobieranie próbek do obrazowania

UWAGA: Analiza rusztowań jest wykonywana między 8 a 24 tygodniem po implantacji.

  1. 60 minut przed obrazowaniem należy utrzymać wszczepioną mysz w cieple w pomieszczeniu grzewczym w temperaturze 37 °C i podać dożylnie 100 μl ludzkiej immunoglobuliny w celu zablokowania niespecyficznych miejsc.
  2. 30 minut przed obrazowaniem należy podać dożylnie 10 μg (na mysz) specyficznych przeciwciał w celu oznaczenia interesujących komórek.
  3. 5 minut przed obrazowaniem podać dożylnie 15 μl (rozcieńczonych w 100 μl PBS) znakowanego fluoroforem środka do gromadzenia naczyń krwionośnych 655 nm (655-VPA) w celu uwidocznienia struktur naczyniowych.
  4. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  5. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj podłużne nacięcie skóry z tyłu myszy, w pobliżu pierwotnego miejsca implantacji.
  6. Za pomocą pęsety i nożyczek ostrożnie oddziel skórę od kieszonki podskórnej, w którą wszczepiono rusztowanie.
  7. Przytrzymaj rusztowanie pęsetą i delikatnie usuń je ze skóry, przecinając resztki błony i tkanki otaczającej rusztowanie za pomocą nożyczek. Zobacz przykłady rusztowań do odzyskania w Rysunek 2.
  8. Przymocuj rusztowanie za pomocą szybko działającego kleju samoprzylepnego do płytki obrazowej (szalka Petriego 35 mm x 10 mm) i napełnij roztworem soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze pokojowej.
  9. W przypadku rusztowań BMP, przed wypełnieniem płytki PBS, należy użyć mikrowiertła chirurgicznego, aby rozrzedzić powierzchnię kości pod mikroskopem mikrochirurgicznym; umożliwia to wizualizację fluoroforu i uchwycenie obrazu w wysokiej rozdzielczości. Użyj zadziorów o średnicy 1,2 lub 1,6 mm, w zależności od rozmiaru rusztowania.
    UWAGA: Użytkownik zda sobie sprawę, ile należy wiercić w zależności od grubości kości. Ogólnie rzecz biorąc, gdy rusztowania BMP są unaczynione, kość nieznacznie zmieni kolor i stanie się bardziej czerwona, gdy zbliży się do odpowiedniej grubości do obrazowania.
  10. Włóż płytkę na stolik mikroskopu konfokalnego.

4. Obrazowanie na żywo za pomocą mikroskopii dwufotonowej

UWAGA: Podczas korzystania z detektorów NDD, zawsze używaj suwaka NDD do obrazowania, aby skierować fluorescencję do NDD. Konfiguracja mikroskopu jest przedstawiona w Rysunek 3.

  1. Włącz mikroskop i komputer, uruchom oprogramowanie, klikając "Uruchom system" i przejdź do trybu "Akwizycja".
  2. Zaznacz pole "Pokaż narzędzia ręczne". W menu "Laser" włącz laser dwufotonowy i pozwól mu się rozgrzać i ustabilizować.
  3. W menu "Ustawienia obrazowania" aktywuj jednocześnie "Tryb kanałów" i "Przełącz ścieżkę co klatkę". W menu "Ścieżka światła" wybierz "Non Descanned" i "Main Beam Splitter MBS 760+". Zaznacz, aby aktywować cztery NDD i ustawić konfigurację zgodnie z ilustracją w Rysunek 3.
    UWAGA: Przy tej konfiguracji sygnał kolagenowy ze struktur kostnych (generacja drugiej harmonicznej, SHG) jest zbierany przy 380 - 485 nm, ludzkich komórkach śródbłonka FITC-hCD31+ i ludzkich komórkach krwiotwórczych AF488-hCD45+ przy 500-550 nm i 655-VPA przy 640 - 690 nm.
  4. W menu "Kanały" ustaw "długość fali lasera" na 890 nm, a moc na 50%. Ustaw "Wzmocnienie (Master)" na 500-600, "Digital Offset" na 0, a "Digital Gain" na 15 dla każdego kanału. Dostosuj te wartości po rozpoczęciu pobierania.
  5. W "Trybie akwizycji" ustaw wymagane parametry, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości bez uszkadzania tkanki i wybielania fluoroforów. Ustaw "Tryb skanowania" na "Ramka", "Rozmiar ramki" na "x512 y512", Krok linii" na 1, "Prędkość" na 9, "Liczba uśredniania" na 8, "Głębia bitowa" na "8 bitów", "Tryb" na "linia", "Kierunek" na "dwukierunkowy", " i "Metoda" na "średnia".
    1. Ustaw "Zoom" na 1 dla początkowego skanowania obrazu i zwiększ go, jeśli jest to wymagane, aby ustawić ostrość na określonych obszarach.
  6. Umieść płytkę zawierającą rusztowanie na stoliku mikroskopu pod soczewką zanurzeniową 20X, 1.0 NA i opuść soczewkę, aż dotknie roztworu soli fizjologicznej. Ustaw ostrość soczewki na rusztowaniu za pomocą okularów mikroskopu, używając lampy jako źródła światła.
  7. Aktywuj menu "Z-stack", wybierz funkcję "First/Last" i ustaw żądany interwał między dwoma podsekwencyjnymi plasterkami (np. 2-μm Z-stack). Utrzymuj stałe interwały w stosie Z.
  8. Wybierz "Na żywo", aby zobrazować skan próbki na żywo i dostosuj "Wzmocnienie cyfrowe" i "Przesunięcie cyfrowe" w celu uzyskania optymalnej ekspozycji. Aby wyświetlić wiele kanałów w tym samym czasie, wybierz funkcję "Split".
  9. W menu "Stage", w trybie "Live", zeskanuj obraz i "Oznacz" obszary zainteresowania (ROI), takie jak lokalizacja ludzkich komórek krwiotwórczych i struktur naczyniowych. Po zakończeniu skanowania próbki przejdź do pierwszego zwrotu z inwestycji, aby rozpocząć obrazowanie.
  10. W trybie "Na żywo" ustaw górną i dolną część stosu Z 3D otaczającego obszar zainteresowania za pomocą funkcji "Ustaw najpierw" i "Ustaw ostatni". Po zakończeniu ustaw środek na "C". Rozpocznij pozyskiwanie ROI za pomocą przycisku "rozpocznij eksperyment". Zobacz przykłady obrazów w Rysunek 4, Rysunek 5 i Rysunek 6.
  11. Po zakończeniu akwizycji zapisz obraz w wyznaczonym folderze. Przejdź do następnego zwrotu z inwestycji i powtórz krok 4.10. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij płytkę obrazową z mikroskopu, ostrożnie odłącz próbkę od płytki i wyczyść resztki kleju.
  12. Przygotować próbkę do następnej techniki analizy.

5. Przetwarzanie próbek do badań histologicznych i immunologicznych

UWAGA: Próbki są przetwarzane zgodnie z protokołem opisanym w ogólnych technikach laboratoryjnych JoVE54 opisującym procesy utrwalania, osadzania i cięcia próbek. Próbki kościotwórcze należy poddawać działaniu środka odwapniającego na bazie EDTA przez 7 dni pomiędzy procesem utrwalania i zatapiania. Roztwór blokujący/przepuszczalny to 10 mM bufor PBS pH 7,4 z 1% Triton X-100, 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 10% normalną surowicą kozią (NGS).

  1. Plastry włożyć do ksylenu na 10 min), ksylenu na 5 min, 100% etanolu na 5 min, 70% etanolu na 5 min, 50% etanolu na 5 min iH2Ona 5 min.
  2. Przenieś plastry do roztworu roboczego demaskującego antygen na bazie cytrynianu.
  3. Gotuj plastry przez 15 minut i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.
  4. Umyj plastry w 10 mM roztworze PBS o pH 7,4 z 1% Triton X-100 (5 min, 3 razy).
  5. Przenieść próbki do roztworu blokującego/przepuszczalnego i inkubować przez 30 minut.
  6. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym/przepuszczalnym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Umyj plastry w 10 mM roztworze PBS o pH 7,4 z 1% Triton X-100 (5 min, 3 razy).
  8. Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym/permeabilizacyjnym przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.
  9. Umyć za pomocą H2O (5 min, 3 razy).
  10. Aby zmniejszyć fluorescencję tła, zanurz plastry w roztworze roboczym Sudan Black na 10 minut, w ciemności i w temperaturze pokojowej.
  11. Umyj plastry w H2O(5 min, 3 razy).
  12. Plastry należy umocować za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego z DAPI (0,5 μg/ml).
  13. Przechowywać plastry w temperaturze 4 °C i sprawdzić, czy podłoże montażowe jest suche przed przystąpieniem do obrazowania fluorescencyjnego. Zobacz przykładowe obrazy w Rysunek 7.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 1 pokazane są reprezentatywne obrazy procesów wysiewu i implantacji komórek rusztowania. W Rysunek 1C, zauważ, że komórki są wstrzykiwane bezpośrednio do rusztowania. W Rysunek 1G, zauważ, że z tyłu myszy wykonuje się nacięcie, gdzie tworzy się kieszeń podskórna i wszczepia się rusztowanie. Rysunek 2 pokazuje ogólną morfologię różnych rusztowań wszczepionych myszom NSG i pobranych po 8 tygodniach. Zwróć uwagę na lekkie unaczynienie w rusztowaniach wysiewanych hMSC (Rysunek 2A). Jednoczesne wysiewanie ludzkich EC z hMSC w rusztowaniu pozwala na tworzenie bardziej odpowiednich naczyń krwionośnych w rusztowaniach (Rysunek 2B). Wreszcie, obecność rhBMP-2 indukuje tworzenie kości. Wydobyte rusztowania są w tym przypadku większe i składają się z twardej tkanki przypominającej kość.

Rysunek 3 pokazuje konfigurację kanału w mikroskopie do obrazowania na żywo z NDD (szczegóły w legendzie rysunku). Rysunek 4 i Wideo 1 pokazują ludzkie komórki krwiotwórcze w rusztowaniach pokrytych hMSC. Rusztowania eksplantowano 8 tygodni po implantacji i po dożylnym zaszczepieniu przeciwciałem AF488-hCD45 i 655-VPA. Procedura ta pozwala na wizualizację wszczepionych ludzkich komórek krwiotwórczych i struktury naczyniowej za pomocą dwufotonowej mikroskopii konfokalnej. W tym przypadku obrazy pokazują naczynia krwionośne (655-VPA) w rusztowaniach oraz długotrwałe wszczepienie ludzkich komórek krwiotwórczych (AF488-hCD45) w miąższ rusztowania. Rysunek 5 i Wideo 2 odpowiadają ludzkim rusztowaniu obsadzonym hEC i hMSC. 8 tygodni po operacji po dożylnym zaszczepieniu przeciwciałem FITC-hCD31 i 655-VPA usunięto rusztowania, a obrazy uzyskano za pomocą dwufotonowego mikroskopu konfokalnego, jak wspomniano wcześniej. Obrazy pokazują udział hEC w tworzeniu naczyń w rusztowaniu, co skutkuje myso-ludzkim chimerycznym unaczynieniem.

Rysunek 6A pokazuje reprezentatywne dane podejścia stosowanego do stymulowania tworzenia kości w rusztowaniach MSC. Podobnie jak w poprzednich liczbach, 8 tygodni po implantacji przeprowadzono dożylną inokulację 655-VPA, pobrano rusztowania i uzyskano obrazy za pomocą dwufotonowej mikroskopii konfokalnej. Rusztowania stymulowane przez rhBMP-2 indukują tworzenie się tkanki kostnej, która może być uwidoczniona dzięki SHG (cyjan kolor na obrazach) dostarczany przez wapń w kości. Na dostarczonych obrazach widoczne jest również powstawanie ubytków i unaczynionej tkanki śródkostnej, które bardzo przypominają tkankę śródkostną BM. W Rysunek 6B i Wideo 3, hECs były współimplantowane z hMSC. Rusztowania zostały pobrane po dożylnym zaszczepieniu przeciwciała FITC-hCD31 i 655-VPA, a obrazy z dwufotonowej mikroskopii konfokalnej pokazują udział hEC w neowaskularyzacji w rusztowaniu kościotwórczym.

Rysunek 7 przedstawia reprezentatywne obrazy histologii, procedury wykonywanej w celu potwierdzenia wcześniej opisanych wyników. Obrazy immunofluorescencyjne pokazują unaczynienie myszy, hEC, hMSC i długotrwale wszczepione ludzkie komórki krwiotwórcze w strukturach rusztowania. Rusztowania pobrane od myszy zostały utrwalone i użyte do immunofluorescencji. W rusztowaniach kostno-nośnych rhBMP-2 (Ryc. 7D-F) należy zwrócić uwagę na morfologię tkanki, przypominającą dojrzały szpik kostny z tkanką tłuszczową. W tym rusztowaniu kościotwórczym pokazujemy, że hMSC są fibroblastami, co wskazywałoby, że przyczyniają się do nowo powstałej tkanki jako komórki zrębu. Wykazujemy również ekspresję ludzkich markerów adipocytów, co wskazywałoby, że hMSCs również przyczyniają się do tworzenia tkanki tłuszczowej.

figure-results-1
Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy procesów wysiewu i implantacji komórek. A) Rusztowanie wstępne i sposób jego cięcia przy użyciu skalpela. B) 24 sztuki uzyskane z pierwotnego rusztowania. C) Metoda wysiewu komórek rusztowania za pomocą strzykawki. D) Rusztowania wysiewane komórkowo z pożywką hodowlaną, gotowe do wszczepienia. E-F) Poszczególne etapy tworzenia rusztowań kościotwórczych: E) przeniesienie rusztowania do 96-dołkowej płyty w kształcie litery U oraz F) reprezentatywny obraz metody zastosowanej do dodania rhBMP2, trombiny i fibrynogenu do rusztowania. G-J) Zabieg implantacji chirurgicznej w znieczuleniu ogólnym: G) wszczepienie rany powstałej w skórze i rusztowania, H) metoda implantacji oraz I-J) zabieg zamykania rany za pomocą kleju chirurgicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Różne rusztowania odzyskane od myszy. Reprezentatywne obrazy rusztowań MSC (po lewej), rusztowań MSC+EC (w środku) i rusztowań MSC+EC+BMP (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Konfiguracja kanałów. Pokazano konfigurację filtra mikroskopu. A) Istnieją cztery moduły detektora NDD: w pierwszym module znajdują się dwie kostki filtracyjne; drugi i trzeci moduł mają po jednej kostce filtracyjnej; a ostatni moduł nie ma kostki (nieużywanej). Pierwsza lampa fotopowielacza (PMT) jest przeznaczona dla kanału dalekiej czerwieni (640 - 690 nm), odbijającego dolne długości fal; Kolejne to 380 - 485 nm, 500 - 550 nm i 555 - 625 nm (kolejność jest zawsze od dolnej do wyższej długości fali). B) Emisje fluoroforu wykrywalne w powyższych konfiguracjach (oznaczone kolorami). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Rusztowania MSC pozwalają na wytworzenie niszy dla ludzkich komórek krwiotwórczych. A) i B) Rekonstrukcje 3D stosów Z pobranych po eksplantacji, po dożylnym zaszczepieniu AF488-hCD45 (zielony), w celu znakowania ludzkich komórek krwiotwórczych i 655-VPA (magenta)m w celu znakowania naczyń krwionośnych. Podziałki reprezentują 20 μm w A i B (górne panele) i 5 μm w B (dolne panele). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Wideo 1. Rusztowania MSC pozwalają na wytworzenie niszy dla ludzkich komórek krwiotwórczych. Rekonstrukcja 3D ludzkich komórek krwiotwórczych (AF488-hCD45) związanych z układem naczyniowym (655-VPA) w rusztowaniu MSC (struktury kolagenowe: SHG, cyjan). Każdy stos ma wymiary 140 x 140 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-6
Rysunek 5. Ludzkie EC uczestniczą w tworzeniu humanizowanych naczyń w rusztowaniach MSC. Rekonstrukcja 3D układu naczyniowego (655-VPA) wyłożonego EC pochodzenia ludzkiego (FITC-hCD31) w rusztowaniach MSC+EC. Podziałka skali reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Wideo 2. Ludzkie EC uczestniczą w tworzeniu humanizowanych naczyń w rusztowaniach MSC. Rekonstrukcja 3D ludzkich EC (FITC-hCD31) wyściełających naczynia krwionośne (655-VPA) w rusztowaniach MSC+EC. Każdy stos ma wymiary 240 x 240 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-8
Ryc. 6. Rusztowania nośne rhBMP-2 mają powierzchnie kostne i humanizowane naczynia krwionośne podobne do szpiku kostnego. A) Rekonstrukcja 3D rusztowań MSC+BMP pokazująca tworzenie się struktur kostnych (SHG-cyjan) i naczyniowych (655-VPA). Podziałki liniowe reprezentują 100 μm (po lewej), 70 μm (w środku) i 50 μm (po prawej). B) Rekonstrukcja 3D rusztowań MSC+EC+BMP przedstawiających humanizowane naczynia (655-VPA) wyłożone ludzkimi EC (FITC-hCD31). Podziałki skali reprezentują 50 μm (po lewej) i 30 μm (po środku i po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Wideo 3. Rusztowania nośne rhBMP-2 mają powierzchnie kostne i humanizowane naczynia krwionośne podobne do szpiku kostnego. Rekonstrukcja 3D rusztowania MSC+VERA+BMP (kość: SHG; naczynia: 655-VPA; ludzkie EC: FITC-hCD31). Każdy stos ma wymiary 600 x 600 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-10
Rysunek 7. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencji wykonywanej na rusztowaniach stałych. A-F) Badania immunofluorescencyjne wykonywane w celu zlokalizowania komórek ludzkich wszczepionych w rusztowania. A-C) Rusztowania z wszczepionymi hEC, hMSC i hHSC. D-F) Rusztowania kościotwórcze z wszczepionymi hEC, hMSC i hHSC. Kanały kolorystyczne są następujące: A-D) ludzka EC (hCD31) i mysia struktura naczyniowa (endomucyna, ENDOM), B-E) hMSC (hVimentin, hVIM) i mysie komórki naczyniowe (endomucyna, ENDOM), C) ludzkie komórki krwiotwórcze (hCD45) i mysie unaczynienie (endomucyna, ENDOM) oraz F) ludzkie białko związane z różnicowaniem tkanki tłuszczowej (hADRP) i unaczynienie myszy (endomucyna, ENDOM). Podziałki skali reprezentują 10 μm (A i C), 20 μm (B i E) oraz 40 (D i F) μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod:

W tym protokole opisaliśmy metodę generowania różnych humanizowanych mikrośrodowisk u myszy i wizualizacji ich architektury za pomocą mikroskopii dwufotonowej i histologii. Dostarczone reprezentatywne dane pokazują wykonalność tego podejścia, wykorzystującego różne komórki zrębu do inżynierii humanizowanych tkanek. Protokół ma specyficzne zastosowania w badaniu ludzkich komórek krwiotwórczych i komórek pochodzących z niszy szpiku kostnego w warunkach normalnych i patologicznych. Zastosowania te obejmują badanie ewolucji klonów, badania przesiewowe leków i przesłuchy między ludzkimi HSC a komponentami zrębu. W rozwijającej się dziedzinie inżynierii tkankowej zaproponowano kilka alternatywnych podejść. Podejścia godne uwagi obejmują rozwój humanizowanych struktur BM 3D in vitro 55,56,57,58,59,60,61,62,63 oraz ortotopowy przeszczep humanizowanych rusztowań BM u myszy64. Nasze podejście ma tę zaletę, że łączy w sobie zarówno złożoność systemu in vivo, jak i łatwą dostępność anatomiczną humanizowanego przeszczepu tkankowego.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:

Źródłem zmienności w tym protokole może być wybór komórek używanych do zasiewania rusztowań. W naszej pracy wykorzystaliśmy hMSC pochodzące od BM. Jednak komórki mezenchymalne można uzyskać z kilku tkanek, które mogą wykazywać charakterystyczne właściwości w zależności od pochodzenia. W związku z tym można rozważyć zastosowanie hMSC pochodzących z różnych narządów. Jednak ich zdolność do tworzenia tkanki kostnej in vivo powinna zostać przetestowana przed zastosowaniem w tym protokole. Protokół ten wykorzystuje komercyjnie dostępne źródło ludzkich komórek śródbłonka (tj. HUVEC transdukowany przez E4ORF1). Ostatnio odnotowano wykorzystanie komórek śródbłonka specyficznych dla narządów do różnych celów65,66. Co więcej, zastosowanie pierwotnych heC pochodzących z BM może stanowić interesujące ulepszenie protokołu. W związku z tym stosowanie różnych źródeł komórek śródbłonka może dawać różne wyniki in vivo.

Użyliśmy myszy biorców NSG z obniżoną odpornością, aby sprzyjać implantacji humanizowanych rusztowań i uniknąć odrzucenia tkanki. Nie wykluczamy możliwości wykorzystania tego protokołu do inżynierii ektopowych tkanek szpiku kostnego w innych szczepach myszy. Rzeczywiście, rhBMP-2 może indukować tworzenie kości w różnych modelach ssaków 47,48,49,50,52. Jednak różnice w żywotności komórek i długotrwałym przeszczepie mogą być obserwowane przy użyciu różnych szczepów/modeli.

Czas odzyskiwania rusztowania może być również elastyczny, w zależności od ostatecznego celu eksperymentu. W przedstawionym protokole pobieramy próbki po 8 - 12 tygodniach od implantacji w celu oceny długotrwałego wszczepienia krwiotwórczego. Aby zbadać wczesne etapy tworzenia się niszy BM u człowieka (np. tworzenie tkanki kostno-chrzęstnej47 lub rozwój naczyniowy), można wybrać różne punkty czasowe.

Technika obrazowania na żywo, którą opisaliśmy w tym protokole, jest wskazana do krótkotrwałego obrazowania eksplantatów. W przypadku długotrwałego obrazowania, takiego jak badanie zachowań motorycznych, należy rozważyć zastosowanie komory równowagi w celu utrzymania temperatury fizjologicznej, napięcia tlenu i stężenia CO2 .

Kluczowe kroki w ramach Protokołu:

Wśród wyzwań związanych z protokołem zwrócilibyśmy uwagę na umiejętności techniczne wymagane do wykonania niektórych kroków. Komórki mezenchymalne i śródbłonka powinny być używane przy niskich liczbach pasaży komórkowych; W przeciwnym razie nie będą w stanie wspierać wszczepiania ludzkich komórek krwiotwórczych in vivo ani uczestniczyć w tworzeniu naczyń krwiotwórczych de novo i kości in vivo. Zalecamy stosowanie hMSC i hEC w przejściach 1 - 5. Etapy przygotowania rusztowania i wysiewu komórek wymagają podstawowych umiejętności w zakresie hodowli komórkowych oraz wiedzy na temat właściwości konkretnych komórek wykorzystywanych w procedurze. Protokół chirurgiczny jest dość prosty, ale wymaga pewnej praktyki. Utrzymanie aseptycznego środowiska w celu uniknięcia zanieczyszczenia wszczepionych rusztowań u myszy z niedoborem odporności ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia powodzenia eksperymentu. Eksplantat próbki i obrazowanie na żywo wymagają praktyki chirurgicznej (zwłaszcza w przypadku użycia mikrowiertła) i znajomości systemu mikroskopowego. Wreszcie, przetwarzanie próbek i histologia wymagają podstawowej wiedzy na temat technik, które mają być stosowane.

Ograniczenia techniki:

Opisywane przez nas podejście pozwala na wizualizację żywych ludzkich komórek krwiotwórczych zasiewających humanizowane mikrośrodowisko szpiku kostnego, z ludzkimi komórkami śródbłonka tworzącymi struktury naczyniowe i komórkami mezenchymalnymi tworzącymi przestrzeń kości/szpiku kostnego. Ponieważ tkanka jest formowana in vivo, końcowe zmodyfikowane rusztowanie nadal będzie chimeryczne (ludzkie i mysie). Kwestię tę należy wziąć pod uwagę, ponieważ tkanka chimeryczna może nie w pełni naśladować złożoność ludzkiego szpiku kostnego i środowisko.

Wszczepiane rusztowania mają ograniczony rozmiar (próbowaliśmy maksymalnie 6,6 x 7,5 x 7 mm), a zatem są w stanie pomieścić ograniczoną liczbę komórek do ksenotransplantacji. Ograniczona będzie również bezwzględna liczba odzyskanych komórek; W związku z tym liczba wszczepionych rusztowań powinna być obliczana jako funkcja liczby komórek wymaganych do eksperymentu.

Opisana przez nas aplikacja do obrazowania jest szczególnie przydatna do obserwacji dużych obszarów żywych tkanek na głębokości 150-200 μm od powierzchni bez naruszania architektury i uszkadzania komórek. W związku z tym nie pozwala na wizualizację całego rusztowania. Jeśli wymagane jest pełne skanowanie tkanki, bardziej odpowiednie byłyby standardowe metody immunofluorescencji.

Przyszłe aplikacje:

Przyszłym kierunkiem tego bioinżynieryjnego modelu byłoby zwiększenie złożoności ludzkich komponentów w tkance. Wiedza i charakterystyka ludzkiej niszy BM poczyniła postępy w ostatnich latach67 , a opisany protokół może być interesującą platformą do badania funkcji tych nowych składników komórkowych i rozpuszczalnych czynników, a także ich roli we wspieraniu normalnych/złośliwych HSC.

Co więcej, technika obrazowania zapewnia potencjał obrazowania przyżyciowego rusztowań w badaniach podłużnych, co wymagałoby ulepszeń technicznych w obrazowaniu rusztowań u żywych, znieczulonych myszy, z rekonwalescencją po operacji. Takie podejście wymagałoby dodatkowych kroków i jest obecnie badane w laboratorium.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy personelowi w głównych obiektach Instytutu Francisa Cricka (ośrodek badań biologicznych, obrazowanie in vivo i eksperymentalna histopatologia) oraz Yolandzie Saavedra-Torres i Mercedes Sanchez-Garzon, weterynarzom z Crick i LRI, za ich cenną pomoc. Jesteśmy wdzięczni dr W. Greyowi za krytyczną lekturę manuskryptu. D.P. był wspierany przez niekliniczne stypendium badawcze od EHA. Prace te były wspierane przez Instytut Francisa Cricka, który otrzymuje podstawowe fundusze od Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045) i Welcome Trust (FC001045).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-PaqueGe Healthcare17-1440-03
Cd34 pozytywna selekcja ZestawStemcell18056Przechowywać 4°C.
MagnetStemcell18000
Przeciwciało anty-ludzkie CD3, klon OKT-3BioxcellBE0001-2Przechowywać w temperaturze 4&stopieC. Stosowany do zubożenia limfocytów T w pierwotnych próbkach AML. 
Cytokiny (IL3, G-CSF i TPO)PeproTech200-03, 300-23 i 300-18Do przygotowania zapasu: Rozcieńczyć każdą z cytokin w 100 μ L wody i wymieszaj je. Dodaj 200 μ L, do alicuots 45 μ L i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Technologie DMSOSigmaD4540
FBSLife10270106Inaktywacja termiczna przy 56 stopniach; C przez 30 minut, zrób porcje i zamroź. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
MEM-αInvitrogen32571-028Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ciepło w temperaturze 37 stopni Celsjusza. C kąpiel wodna przed użyciem.
Myelocult H5100corning5100Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
199Gibco41150-020Przechowywać w 4 & st; C. Ciepło w 37 & st.; C kąpiel wodna przed użyciem.
hMSC-FBS, Inaktywowany termicznieGibco12662-029Przechowywać w temperaturze -20 & st. C. Ciepły w 37 & st; C kąpiel wodna przed użyciem.
P/SSigma-AldrichP0781Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Ciepło w temperaturze 37 stopni Celsjusza. C kąpiel wodna przed użyciem.
ECGSMillipore02-102Rozcieńczyć w pożywce hodowlanej i użyć filtra 0,22 mm.
HEPESSigma-AldrichS1558-50MLPrzechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
HeparinSigma-AldrichH3149Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.
GlutaminaGibco25030Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Kolagen 1 powlekana płytka do hodowli komórkowejcorning354505
Roztwór trypsyny-EDTAThermo-Fisher25200056Przechowywać w temperaturze -20 °C. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
hMSCLonzaPT-2501Alternatywnie, hMSC jesteśmy również uprzejmie dostarczyli Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) z ludzkiego szpiku kostnego uzyskanego podczas operacji ortopedycznej na podstawie zgody etycznej 10-038 z IRB00006477. 
VeraVec HUVEC śródbłonekAngiocrine biologiahVera101Alternatywnie można użyć innego źródła ludzkich komórek śródbłonka.
Ludzkie komórkiPróbki krwi pępowinowej lub pierwotnej ostrej białaczki szpikowej (AML) uzyskano z Royal London Hospital (Londyn, Wielka Brytania) po uzyskaniu świadomej zgody i zatwierdzeniu protokołu użycia przez Komitet Etyczny Wschodniego Londynu i przeprowadzeniu zgodnie z Deklaracją Helsińską.
Pianka żelowa, rozmiar 12 - 7 mmPfizer00009-0315-08Alternatywny dostawca: Febelco
PBSThermo-Fisher10010023
Materiał chirurgicznyWielesterylnych kleszczy, pęset i ostre nożyczki.
ChusteczkiChusteczki papierowe sterylizowane termicznie.
1 ml strzykawka z igłą 25GTerumoSS+01H25161
Płytki wielodołkowe o ultra niskim nasadceCorning3473 lub 3471
BMP2NoricumrhBMP-2Rozcieńczyć w 5 mg/ml w kwasie octowym 50 mM i przechowywać w temperaturze 4 °C.
TrombinSigmaT8885Rozcieńczyć w CaCl2 2%, 500 ml na fiolkę i przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
FibrinogenSigmaF3879Rozcieńczyć w stężeniu 4 mg/100 ml w PBS. Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Przed użyciem rozgrzać się.
Szalki do hodowli tkankowych 35 mm x 10 mmFalcon353001
U-Botton 96-dołkowa płytkaFalcon353077
myszy NSGMyszy Jackson Laboratory5557NSG były miłym prezentem od dr Leonarda Shultza (The Jackson Laboratory).
ChlorheksydynaG9Rozcieńczony w stosunku 1:10 przed użyciem
CarprofenPfizerRimadyl5 mg/kg myszy
BuprenorfinaAlstoeVetergesic0,1 mg/kg masy ciała myszy
IzofluranAbbottB506Indukcja znieczulenia 2%, utrzymanie 1%
TrymerWellaContura HS61
Klej chirurgiczny3MVetbond
karbomer (kwas poliakrylowy) jako żel okulistycznyNovartisViscotears Liquid Gel
Human Normal ImmunoglobulinGammaplex10g fiolka100 ml / mysz dożylnie, 30 minut przed infuzją specyficznego przeciwciała.
NT-QTrackerInvitrogenQ21021MPAgent poolingu statków. Podawać 15 ml / mysz dożylnie 5 minut przed obrazowaniem.
AF488-hCD45Biolegend304017100 ml / mysz dożylnie, 30 minut przed obrazowaniem.
FITC-hCD31BD Pharmigen555445100 ml / mysz dożylnie, 30 minut przed obrazowaniem.
Super klejLoctiteSuper Glue
Micro-Drill KitIDEALNY - Fisher ScientificNC9010016
MikroskopNie jest zalecana żadna konkretna marka/firma.
LSM 710 NLOZeissPionowy mikroskop konfokalny z zmotoryzowanym stolikiem, laserem dwufotonowym i soczewką zanurzeniową 20X 1.0 NA. Alternatywnie można użyć mikroskopu o podobnych parametrach.
MaiTai " Wysoka wydajność" w pełni zautomatyzowany 1-skrzynkowy laser Ti:Sapphire 1-box 517 z blokadą trybu z kompensacją dyspersji DeepSeeSpectra-Physics
buforowany neutralnie, 10% Sigma-AldrichHT501128
EtanolSigma-Aldrich32294
OsteosoftMillipore1.01728.1000
Plastry polisynoweThermo scientificJ2800AMNZ
Roztwór do demaskowania antygenuVectorH-3300Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć w stosunku 1:100 w H2O do roztworu roboczego.
Triton 100xSigma-AldrichT9284
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA96470Przechowywać w temperaturze 4 & C.
Normalna surowica kozia (NGS)Sigma-AldrichG9023Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Endomucyna PrzeciwciałoSanta Cruzsc-65495Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Przeciwciało przeciwko hVimentinSanta Cruzsc-6260Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Przeciwciało hCD31DAKOM0823Przechowywać w temperaturze 4 & C.
Przeciwciało hCD45DAKOM0701Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
Przeciwciała ADRP (Perilipin2)-onlineABIN283918Przechowywać w temperaturze 4 & stopni C.
Kozie przeciwciała wtórne przeciwko mysimInvitrogenA11029 lub A11005Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Kozie przeciwciała drugorzędowe przeciwko królikowiInvitrogenA11037 lub A11008Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Kozie przeciwciała drugorzędowe anty szczurzeInvitrogenA11007 lub A21247Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
Sudan BlackSigmaS2380Przygotuj zapas 1% sudan black w etanolu 70%. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór roboczy 0,1% sudan black w etanolu 70% i przed użyciem przefiltrować za pomocą bibuły filtracyjnej.
DAPISigmaD8417Przygotować zapas w H20 w stężeniu 100 mg/mg. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Fluorescencyjne media montażoweDakoS3023Dodaj DAPI przed użyciem (1:400 z magazynu DAPI).
Szkło osłonoweVWR631-0147
krwiotwórcze sterylne mikrochirurgiczny Roztwór formaliny ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoggatt, J., Kfoury, Y., Scadden, D. T. Hematopoietic Stem Cell Niche in Health and Disease. Annu Rev Pathol. 11, 555-581 (2016).
  2. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  3. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  4. Zhang, B., et al. Altered microenvironmental regulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia. Cancer Cell. 21 (4), 577-592 (2012).
  5. Schepers, K., et al. Myeloproliferative neoplasia remodels the endosteal bone marrow niche into a self-reinforcing leukemic niche. Cell Stem Cell. 13 (3), 285-299 (2013).
  6. Krause, D. S., et al. Differential regulation of myeloid leukemias by the bone marrow microenvironment. Nat Med. 19 (11), 1513-1517 (2013).
  7. Mendez-Ferrer, S., Scadden, D. T., Sanchez-Aguilera, A. Bone marrow stem cells: current and emerging concepts. Ann N Y Acad Sci. 1335, 32-44 (2015).
  8. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  9. Ding, L., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches. Nature. 495 (7440), 231-235 (2013).
  10. Kunisaki, Y., et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 502 (7473), 637-643 (2013).
  11. Pinho, S., et al. PDGFRalpha and CD51 mark human nestin+ sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion. J Exp Med. 210 (7), 1351-1367 (2013).
  12. Mizoguchi, T., et al. Osterix marks distinct waves of primitive and definitive stromal progenitors during bone marrow development. Dev Cell. 29 (3), 340-349 (2014).
  13. Zhou, P., Wang, Y., Li, D., Hu, S. Y., Chen, G. H. Therapeutic efficacy of mixed hematopoietic stem cell transplantation for pediatric hematologic diseases. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22 (2), 434-439 (2014).
  14. Sugiyama, T., Kohara, H., Noda, M., Nagasawa, T. Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches. Immunity. 25 (6), 977-988 (2006).
  15. Tzeng, Y. S., et al. Loss of Cxcl12/Sdf-1 in adult mice decreases the quiescent state of hematopoietic stem/progenitor cells and alters the pattern of hematopoietic regeneration after myelosuppression. Blood. 117 (2), 429-439 (2011).
  16. Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
  17. Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
  18. Uzan, B., et al. Interleukin-18 produced by bone marrow-derived stromal cells supports T-cell acute leukaemia progression. EMBO Mol Med. 6 (6), 821-834 (2014).
  19. Foster, K., et al. Different Motile Behaviors of Human Hematopoietic Stem versus Progenitor Cells at the Osteoblastic Niche. Stem Cell Reports. 5 (5), 690-701 (2015).
  20. Hawkins, E. D., et al. T-cell acute leukaemia exhibits dynamic interactions with bone marrow microenvironments. Nature. 538 (7626), 518-522 (2016).
  21. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
  22. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  23. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  24. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  25. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  26. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J Bone Miner Res. 12 (9), 1335-1347 (1997).
  27. Bianco, P., Robey, P. G. Skeletal stem cells. Development. 142 (6), 1023-1027 (2015).
  28. Vaiselbuh, S. R., Edelman, M., Lipton, J. M., Liu, J. M. Ectopic human mesenchymal stem cell-coated scaffolds in NOD/SCID mice: an in vivo model of the leukemia niche. Tissue Eng Part C Methods. 16 (6), 1523-1531 (2010).
  29. Groen, R. W., et al. Reconstructing the human hematopoietic niche in immunodeficient mice: opportunities for studying primary multiple myeloma. Blood. 120 (3), e9-e16 (2012).
  30. Chen, Y., et al. Human extramedullary bone marrow in mice: a novel in vivo model of genetically controlled hematopoietic microenvironment. Blood. 119 (21), 4971-4980 (2012).
  31. Reinisch, A., et al. A humanized bone marrow ossicle xenotransplantation model enables improved engraftment of healthy and leukemic human hematopoietic cells. Nat Med. 22 (7), 812-821 (2016).
  32. Sontakke, P., et al. Modeling BCR-ABL and MLL-AF9 leukemia in a human bone marrow-like scaffold-based xenograft model. Leukemia. 30 (10), 2064-2073 (2016).
  33. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  34. Antonelli, A., et al. Establishing human leukemia xenograft mouse models by implanting human bone marrow-like scaffold-based niches. Blood. 128 (25), 2949-2959 (2016).
  35. Holzapfel, B. M., et al. Tissue engineered humanized bone supports human hematopoiesis in vivo. Biomaterials. 61, 103-114 (2015).
  36. Reinisch, A., et al. Epigenetic and in vivo comparison of diverse MSC sources reveals an endochondral signature for human hematopoietic niche formation. Blood. 125 (2), 249-260 (2015).
  37. Lee, J., et al. Implantable microenvironments to attract hematopoietic stem/cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (48), 19638-19643 (2012).
  38. Lee, J., Heckl, D., Parekkadan, B. Multiple genetically engineered humanized microenvironments in a single mouse. Biomater Res. 20 (19), 1-13 (2016).
  39. Ho, M. S., Medcalf, R. L., Livesey, S. A., Traianedes, K. The dynamics of adult haematopoiesis in the bone and bone marrow environment. Br J Haematol. 170 (4), 472-486 (2015).
  40. Bersani, F., et al. Bioengineered implantable scaffolds as a tool to study stromal-derived factors in metastatic cancer models. Cancer Res. 74 (24), 7229-7238 (2014).
  41. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  42. Holzapfel, B. M., et al. Species-specific homing mechanisms of human prostate cancer metastasis in tissue engineered bone. Biomaterials. 35 (13), 4108-4115 (2014).
  43. Thibaudeau, L., Holzapfel, B. M., Hutmacher, D. W. Humanized mice models for primary bone tumor and bone metastasis research. Cell Cycle. 14 (14), 2191-2192 (2015).
  44. Thibaudeau, L., et al. A tissue-engineered humanized xenograft model of human breast cancer metastasis to bone. Dis Model Mech. 7 (2), 299-309 (2014).
  45. Abarrategi, A., Foster, K., Hamilton, A., Mian, S., Passaro, D., Gribben, J., Mufti, G., Bonnet, D. Versatile humanized niche model enables study of normal and malignant human hematopoiesis. J Clin Invest. 127 (2), (2017).
  46. Abarrategi, A., et al. In vivo ectopic implantation model to assess human mesenchymal progenitor cell potential. Stem Cell Rev. 9 (6), 833-846 (2013).
  47. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (5), 1136-1148 (2014).
  48. Abarrategi, A., et al. Multiwall carbon nanotube scaffolds for tissue engineering purposes. Biomaterials. 29 (1), 94-102 (2008).
  49. Abarrategi, A., et al. Gene expression profile on chitosan/rhBMP-2 films: A novel osteoinductive coating for implantable materials. Acta Biomater. 5 (7), 2633-2646 (2009).
  50. Abarrategi, A., et al. Biological properties of solid free form designed ceramic scaffolds with BMP-2: in vitro and in vivo evaluation. PLoS One. 7 (3), e34117(2012).
  51. Abarrategi, A., et al. Chitosan scaffolds for osteochondral tissue regeneration. J Biomed Mater Res A. 95 (4), 1132-1141 (2010).
  52. Abarrategi, A., et al. Improvement of porous beta-TCP scaffolds with rhBMP-2 chitosan carrier film for bone tissue application. Tissue Eng Part A. 14 (8), 1305-1319 (2008).
  53. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  54. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. J Vis Exp. , (2016).
  55. Hong, J. K., Yun, J., Kim, H., Kwon, S. Three-dimensional culture of mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 12 (4), 211-221 (2015).
  56. Bara, J. J., et al. Three-dimensional culture and characterization of mononuclear cells from human bone marrow. Cytotherapy. 17 (4), 458-472 (2015).
  57. Dong, H. W., Qin, S., Rafailovich, M., Ma, Y. Developing an Optimal Biofunctional Scaffold for Hematopoietic Stem Cell Quiescent Maintenance and Expansion. N Am J Med Sci. 8 (2), (2015).
  58. Raic, A., Rodling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  59. Miyoshi, H., Morita, M., Ohshima, N., Sato, C. Expansion of mouse hematopoietic progenitor cells in three-dimensional cocultures on frozen-thawed stromal cell layers formed within porous scaffolds. Exp Hematol. 43 (2), 115-124 (2015).
  60. Cuddihy, M. J., Wang, Y., Machi, C., Bahng, J. H., Kotov, N. A. Replication of bone marrow differentiation niche: comparative evaluation of different three-dimensional matrices. Small. 9 (7), 1008-1015 (2013).
  61. Sharma, M. B., Limaye, L. S., Kale, V. P. Mimicking the functional hematopoietic stem cell niche in vitro: recapitulation of marrow physiology by hydrogel-based three-dimensional cultures of mesenchymal stromal cells. Haematologica. 97 (5), 651-660 (2012).
  62. Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
  63. Ferreira, M. S., et al. Cord blood-hematopoietic stem cell expansion in 3D fibrin scaffolds with stromal support. Biomaterials. 33 (29), 6987-6997 (2012).
  64. Baldwin, J. G., et al. Periosteum tissue engineering in an orthotopic in vivo platform. Biomaterials. 121, 193-204 (2017).
  65. Rafii, S., Butler, J. M., Ding, B. S. Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells. Nature. 529 (7586), 316-325 (2016).
  66. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  67. Medyouf, H. The microenvironment in human myeloid malignancies: emerging concepts and therapeutic implications. Blood. 129 (12), 1617-1626 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Humanized Bone MarrowHematopoietic Stem CellsBone Marrow NicheTwo Photon MicroscopyStromal CellsScaffold ImplantationLive ImagingHuman Hematopoietic EngraftmentBone Morphogenetic ProteinEndothelial Cells

Related Articles