Ten protokół opisuje kroki klonowania wielu pojedynczych przewodnikowych RNA do jednego wektora konkategorującego RNA przewodnika, co jest szczególnie przydatne w tworzeniu wielogenowych nokautów przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Wytwarzanie podwójnych nokautów w organoidach jelitowych przedstawiono jako możliwe zastosowanie tej metody.
Artykuł metodologiczny
Protokół wielokrotnego nokautu genów w organoidach jelita cienkiego myszy przy użyciu konkategomera CRISPR
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Technologia CRISPR/Cas9 znacznie poprawiła wykonalność i szybkość badań nad utratą funkcji, które są niezbędne do zrozumienia funkcji genów. U wyższych eukariontów geny paralogiczne mogą maskować potencjalny fenotyp, kompensując utratę genu, ograniczając w ten sposób informacje, które można uzyskać z badań genetycznych opierających się na nokautach pojedynczych genów. Opracowaliśmy nowatorską, szybką metodę klonowania konkamerów przewodnika RNA (gRNA) w celu stworzenia wielogenowych nokautów po pojedynczej rundzie transfekcji w organoidach jelita cienkiego myszy. Nasza strategia pozwala na konkategoryzację do czterech pojedynczych gRNA w jeden wektor poprzez przeprowadzenie pojedynczej reakcji tasowania Golden Gate z wyżarzonymi oligonukleotykami gRNA i wstępnie zaprojektowanym wektorem retrowirusowym. Pozwala to na jednoczesny nokaut do czterech różnych genów lub zwiększenie skuteczności nokautu po ukierunkowaniu jednego genu przez wiele gRNA. W tym protokole pokazujemy szczegółowo, jak skutecznie sklonować wiele gRNA do retrowirusowego wektora konkategorowego CRISPR i jak osiągnąć wysoce wydajną elektroporację w organoidach jelitowych. Jako przykład pokazujemy, że jednoczesny nokaut dwóch par genów kodujących negatywne regulatory szlaku sygnałowego Wnt (Axin1/2 i Rnf43/Znrf3) sprawia, że organoidy jelitowe stają się odporne na wycofanie kluczowych czynników wzrostu.
Wprowadzenie
Podejście do genetyki odwrotnej jest powszechnie stosowaną metodą badania funkcji genu. W szczególności badania nad utratą funkcji, w których zaburzenie genu powoduje zmiany fenotypowe, odgrywają kluczową rolę w budowaniu naszego zrozumienia procesów biologicznych. Metoda CRISPR/Cas9 stanowi najnowszy postęp w technologii inżynierii genomu i zrewolucjonizowała obecną praktykę genetyki w komórkach i organizmach. Cas9 jest endonukleazą kierowaną przez RNA, która wiąże się ze specyficzną sekwencją DNA komplementarną do gRNA i generuje pęknięcie podwójnej nici (DSB). Ten DSB rekrutuje maszynerię naprawy DNA, która w przypadku braku matrycy DNA do rekombinacji homologicznej, będzie ponownie zligować przeciętą nić DNA poprzez podatne na błędy niehomologiczne łączenie końców, co może w ten sposób skutkować insercjami lub delecjami nukleotydu (nukleotydów) powodując mutacje przesunięcia ramki odczytu1.
Ogromna łatwość i wszechstronność podejścia CRISPR/Cas9 sprawiły, że jest to bardzo atrakcyjne narzędzie do badań przesiewowych w skali genomu, mających na celu rozwikłanie nieznanych funkcji genów2,3. Niemniej jednak, podejścia oparte na nokaucie pojedynczego genu mają ograniczone zastosowanie, jeśli istnieje wiele paralogów z nadmiarowymi funkcjami. W związku z tym ablacja pojedynczego genu może nie wystarczyć do określenia funkcji tego genu, biorąc pod uwagę możliwą kompensację za pomocą paralogów, co skutkuje niewielką lub żadną zmianą fenotypową4. Dlatego ważne jest, aby równolegle eliminować paralogi poprzez dostarczanie wielu wektorów gRNA ukierunkowanych na różne geny paralogiczne w celu przezwyciężenia wpływu kompensacji genetycznej.
Aby rozszerzyć zastosowanie CRISPR/Cas9 na paralogiczny nokaut genów, niedawno opracowaliśmy szybką, jednoetapową metodę klonowania do czterech wstępnie wyżarzonych gRNA do jednego wektora retrowirusowego5. Szkielet, nazwany konkatelerem CRISPR, oparty jest na plazmidzie retrowirusowym MSCV zawierającym powtarzalne kasety ekspresji gRNA. Każda kaseta zawiera dwa odwrócone miejsca rozpoznawania enzymu restrykcyjnego typu IIS BbsI, który może być nieodwracalnie zastąpiony przez wyżarzony oligo gRNA z pasującymi zwisami przy użyciu reakcji tasowania Golden Gate w pojedynczej probówce6. Ta metoda klonowania składa się z powtarzających się cykli trawienia i ligacji, które umożliwiają jednoczesne składanie wielu fragmentów DNA poprzez wykorzystanie różnych sekwencji zwisów generowanych przez BbsI. Wyjątkowość tego enzymu polega na przykład na zdolności do wykonywania asymetrycznych cięć poza jego sekwencją rozpoznawania; w związku z tym każda kaseta może mieć inną sekwencję z niestandardowymi zwisami otaczającymi miejsce rdzenia BbsI, w ten sposób każde gRNA może być klonowane w określonej pozycji i orientacji wektora konkategorowego.
Jako dowód zasady, zademonstrowaliśmy zastosowanie tej strategii w organoidach jelitowych myszy, rozbijając jednocześnie dwie pary paralogicznych ujemnych regulatorów szlaku Wnt przez jedną rundę elektroporacji5.
W ciągu ostatnich kilku lat wiele innych grup opracowało podobne strategie oparte na wielu wektorach ekspresji gRNA skonstruowanych przy użyciu Golden Gate shuffling7 w celu osiągnięcia wielogenowego nokautu w różnych systemach modelowych, takich jak ludzkie linie komórkowe8,9, danio pręgowany10 i Escherichia coli11. W ich protokołach gRNA są najpierw klonowane do pojedynczych wektorów pośrednich, a następnie łączone razem w jeden produkt końcowy. W przeciwieństwie do tego, główną zaletą naszej strategii CRISPR-concatemer jest wygoda pojedynczego kroku tasowania i klonowania BbsI. Podobnie jak inne konkawery gRNA, nasza metoda umożliwia jednoczesny nokaut do czterech różnych genów lub zwiększoną skuteczność nokautu CRISPR po ukierunkowaniu jednego lub dwóch genów z wieloma gRNA (Figura 1).
W tym protokole szczegółowo opisujemy każdy krok w generowaniu wektorów CRISPR-concatemer, od projektu gRNA do reakcji Golden Gate i potwierdzenia udanego klonowania. Zapewniamy również wysoce wydajny protokół transfekcji konkatecherów CRISPR do organoidów jelita cienkiego myszy poprzez elektroporację i późniejsze eksperymenty z odstawieniem czynnika wzrostu.
Protokół
1. Projekt gRNA dla wektora konkategorów CRISPR
Uwaga: Celem tej sekcji jest wyjaśnienie, jak wybrać najlepszą strategię targetowania i jak zaprojektować gRNA zawierające specyficzne zwisy dla wektora CRISPR-concatemer.
- Zaprojektuj gRNA w odniesieniu do genów będących przedmiotem zainteresowania, korzystając z wybranego narzędzia do projektowania gRNA CRISPR. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z przykładem.
UWAGA: W przypadku celowania w parę genów paralogicznych, chociaż możliwe jest zaprojektowanie jednego gRNA na gen, zaleca się zaprojektowanie dwóch gRNA na gen, aby zwiększyć szanse na osiągnięcie podwójnego nokautu (Rysunek 1). - Upewnij się, że gRNA nie zawierają miejsca rozpoznawania BbsI, używając narzędzia do mapowania ograniczeń (patrz Tabela materiałów dla przykładu).
- Dodaj określone zwisy wektorów CRISPR-concatemer do każdego oligogo, jak pokazano w tabeli 1.
| Kaseta 1 | Kaseta 2 | Kaseta 3 | Kaseta 4 | |
| Sekwencja (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
| Sekwencja (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Tabela 1: Zwisy dla każdej kasety wektora konkateleracyjnego CRISPR.
2. Klonowanie gRNA do wektora konkatenera CRISPR
- Fosforylacja i wyżarzanie oligonukleotydów
UWAGA: Ten krok ilustruje, jak wyżarzać górne i dolne nici dla każdego oligo gRNA i jak fosforylować ich końce w jednej reakcji.- Przygotować mieszaninę reakcyjną do fosforylacji oligonukleotydów i wyżarzania górnych i dolnych pasm na lodzie, zgodnie z poniższymi instrukcjami.
UWAGA: Wszystkie oligonukleotydy można połączyć w jedną reakcję; na przykład w przypadku wektora konkatenerowego 4 gRNA, połącz ze sobą 8 oligonukleotydów. - W przypadku 3 konkatenerów użyj 3,0 μl górnej nici gRNA (1,0 μl z każdego gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3,0 μl dolnej nici gRNA (1,0 μL z każdego gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2,0 μl buforu ligazy DNA T4 (10x), 1,0 μL T4 PNK i dodajH2Odo całkowitej objętości 20,0 μL.
- Dobrze wymieszaj przez pipetowanie i uruchom to w termocyklerze, stosując następujące ustawienia: 37 °C przez 30 minut, 95 °C przez 5 minut, obniż do 25 °C przy 0,3 °C/min, trzymaj w 4 °C.
- Przygotować mieszaninę reakcyjną do fosforylacji oligonukleotydów i wyżarzania górnych i dolnych pasm na lodzie, zgodnie z poniższymi instrukcjami.
- BbsI reakcja tasowania
UWAGA: W tej sekcji wstępnie wyżarzone oligonukleotydy gRNA są włączane do odpowiedniej pozycji wektora konkategorowego w jednym kroku poprzez naprzemienne cykle trawienia i ligacji.- Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną w stosunku 1:100 w wodzie wolnej od DNazy/RNazy, aby wytworzyć 3 i 4 wektory konkategorów gRNA.
UWAGA: Podczas klonowania 2 konkamerów gRNA ten krok nie jest potrzebny. - Złóż reakcję tasowania kulek BbsI na lodzie, zgodnie z poniższymi instrukcjami. Uwzględnij kontrolę ujemną, która zawiera tylko wektor.
- Użyj 100 ng wektora konkategomera CRISPR, 10,0 μl mieszaniny oligo, 1,0 μl buforu enzymu restrykcyjnego zawierającego BSA (10x), 1,0 μl DTT (10 mM), 1,0 μl ATP (10 mM), 1,0 μl BbsI, 1,0 μl ligazy T7 iH2Odo całkowitej objętości 20,0 μL.
- Dobrze wymieszaj przez pipetowanie i uruchom to w termocyklerze, stosując następujące ustawienia: Uruchom 50 cykli dla klonowania 3 i 4 konkategomerów gRNA i 25 cykli dla 2 konkatenerów gRNA, oba w temperaturze 37 °C przez 5 minut, 21 °C przez 5 minut, przytrzymaj w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie 4 °C na zawsze.
- Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną w stosunku 1:100 w wodzie wolnej od DNazy/RNazy, aby wytworzyć 3 i 4 wektory konkategorów gRNA.
- Leczenie egzonukleazą
UWAGA: Ten krok jest wysoce zalecany, ponieważ zwiększa wydajność klonowania poprzez usunięcie wszelkich śladów zlinearyzowanego DNA.- Traktować reakcję tasowania BbsI egzonukleazą DNA (patrz tabela materiałów) w następujący sposób.
- Pobrać 11,0 μl mieszanki ligacyjnej z poprzedniego kroku (2.2.3), dodać 1,5 μl buforu egzonukleazy (10x), 1,5 μl ATP (10 mM), 1,0 μl egzonukleazy DNA i zwiększyć całkowitą objętość do 15,0 μl wodą. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 70 °C przez 30 min.
UWAGA: Ten krok usuwa wszelkie pozostałości zlinearyzowanego DNA w mieszaninie, zwiększając w ten sposób wydajność klonowania. - Użyj 2 μl mieszaniny reakcyjnej do przekształcenia się w chemicznie kompetentne bakterie E. coli przez szok termiczny12.
UWAGA: Alternatywnie reakcja może być przechowywana przez okres do jednego tygodnia w temperaturze -20 °C.
- Trawienie restrykcyjne
UWAGA: Celem tego etapu jest ocena powodzenia procedury klonowania za pomocą trawienia restrykcyjnego.- Aby potwierdzić obecność insercji gRNA w wektorze konkategorowym CRISPR, wybierz 4 - 8 kolonii bakteryjnych z pętlą zaszczepiającą, hoduj każdy klon w 4 ml pożywki LB przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej. Ekstrahuj DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
- Trawienie ~200 ng DNA za pomocą 10 U EcoRI + 5 U BglII w reakcji 10 μL, inkubując go w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w inkubatorze bakterii. Dołączyć oddzielną mieszaninę reakcyjną z odpowiednim pierwotnym wektorem jako kontrolę pozytywną do porównania wielkości.
UWAGA: To potwierdzi, czy wszystkie konkamery są obecne, ponieważ te dwa enzymy restrykcyjne wycinają całe konkamery. Oto oczekiwane rozmiary dla każdego konkategomera: 2 konkatenery gRNA (800 pz), 3 gRNA-konkatenery (1,2 kbp) i 4 gRNA-konkategomery (1,6 kbp). - Przeprowadzaj reakcje trawienia na 1% żelu agarozowym pod napięciem 90 V przez około 20 minut.
- Wizualizacja żelu za pomocą transiluminatora UV. Zidentyfikuj klony z prawidłowym rozmiarem wstawki, upewniając się, że ich wzór prążka pasuje do wzoru oryginalnego wektora i że każdy fragment ma oczekiwany rozmiar za pomocą drabiny DNA.
- Trawić wybrane klony za pomocą 5 U BbsI w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w inkubatorze bakterii. Dołącz oddzielną mieszaninę reakcyjną z odpowiadającym jej pierwotnym wektorem jako kontrolę.
UWAGA: Ten dodatkowy etap trawienia ma na celu potwierdzenie, że gRNA zostały sklonowane we właściwej pozycji, w wyniku czego wszystkie miejsca rozpoznawania BbsI zostały utracone. - Przeprowadzaj reakcje trawienia na 1% żelu agarozowym pod napięciem 90 V przez około 20 minut. Za poprawne należy uznać tylko te wektory, które nie są cięte przez BbsI, ponieważ zawierają one tylko gRNA.
- Sekwencjonowanie wektorowe
UWAGA: Celem tego etapu jest potwierdzenie obecności sekwencji gRNA w tych wektorach, które zostały zidentyfikowane jako prawidłowe przez analizę trawienia restrykcyjnego.- Potwierdź dodatnie wektory konkategorów za pomocą sekwencjonowania Sangera sequencing13 przy użyciu następujących starterów:
Do przodu: TCAAGCCCTTTGTACACCCTAAG (do sprawdzenia pierwszej kasety gRNA)
Linker1_Forward: GACTACAAGGACGACGATGACACA (do sprawdzania drugiej kasety gRNA)
Linker2_Reverse: GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGT (do sprawdzania drugiej kasety gRNA)
Linker2_Forward: ACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC (do sprawdzania trzeciej kasety gRNA)
Linker3_Reverse: TCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCAT (do sprawdzania trzeciej kasety gRNA)
Rewers: AGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAG (do sprawdzenia ostatniej kasety gRNA) - Sprawdź obecność wszystkich gRNA, przeszukując ich sekwencje w odczytach sekwencjonowania.
- Potwierdź dodatnie wektory konkategorów za pomocą sekwencjonowania Sangera sequencing13 przy użyciu następujących starterów:
3. Transfekcja organoidów jelitowych za pomocą elektroporacji
UWAGA: Proszę zauważyć, że ta procedura jest oparta na protokole opublikowanym przez Fujii et al. w 2015 roku, z adaptacją do hodowli organoidów w jelicie cienkim myszy14.
- Elektroporacja wstępna
UWAGA: W tej sekcji opisano, jak przygotować organoidy jelitowe myszy przed elektroporacją poprzez usunięcie wszystkich antybiotyków i kondycjonowanych pożywek z pożywki hodowlanej. Zapobiegnie to ewentualnym skutkom toksycznym podczas elektroporacji.- W dniu 0 procedury transfekcji podzielić organoidy w stosunku 1:2.
UWAGA: Hodowle organoidów jelitowych można uzyskać, wykonując izolację krypty zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami15. Proszę zapoznać się z Tabelą 2 dla wszystkich kompozycji mediów.- Podczas dzielenia organoidów do elektroporacji należy wysiać co najmniej 6 dołków z 48-dołkowej płytki na transfekcję.
- Wysiewaj organoidy w 20 μl-kroplach macierzy piwnicznej i hoduj je w pożywce WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondyna + nikotynamid) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze (jak opisano wcześniej15).
- W dniu 2 należy zmienić pożywkę, zastępując WENR+Nic 250 μl EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (inhibitor kinazy syntazy glikogenu-3) + Y-27632 (inhibitor ROCK), bez antybiotyków (patrz Tabela 2).
UWAGA: We wszystkich etapach ilość pożywki dodawanej do każdego dołka płytki 48-dołkowej wynosi 250 μL. - W dniu 3 zmień pożywkę organoidową na EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v dimetylosulfotlenku (DMSO), bez antybiotyków.
- W dniu 0 procedury transfekcji podzielić organoidy w stosunku 1:2.
- Przygotowanie komórek
UWAGA: Tutaj opisujemy, jak rozdrobnić organoidy na małe klastry komórek poprzez dysocjację mechaniczną i chemiczną. Te kroki mają kluczowe znaczenie dla powodzenia zabiegu.- W 4 dniu rozbij kopuły matrycy piwnicznej za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml i przenieś organoidy do probówki o pojemności 1,5 ml. Zawartość czterech studzienek z 48-dołkowej płytki należy zebrać do probówki.
- Organoidy należy rozbić mechanicznie na małe fragmenty, pipetując w górę i w dół pipetą P200 około 200 razy. Wirować w temperaturze pokojowej, 5 min przy 600 x g.
- Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad w 1 ml rekombinowanej proteazy klasy hodowli komórkowej (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 37 °C maksymalnie przez 5 minut, a następnie sprawdzić kroplę próbki o objętości 50 μl pod mikroskopem światła odwróconego z obiektywem 4x.
UWAGA: Pożądane są klastry 10 - 15 komórek, ponieważ zwiększa to przeżywalność komórek po elektroporacji. - Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o niskim stopniu wiązania 15 ml i zatrzymać dysocjację poprzez dodanie 9 ml podłoża podstawowego bez antybiotyków (patrz Tabela 2). Odwirować w temperaturze pokojowej, 5 minut przy 600 x g, następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml zredukowanej pożywki surowicy (patrz tabela materiałów).
- Policz liczbę ogniw z komorą Bürkera i użyj minimum 1 x 105 ogniw na reakcję elektroporacji. Dodać 9 ml zredukowanej pożywki surowicy do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze pokojowej, 3 minuty przy 400 x g.
- Elektroporacja
UWAGA: Poniższe sekcje zawierają instrukcje dotyczące wykonywania elektroporacji i późniejszej regeneracji organoidów.- Usunąć cały sklarowany osad i zawiesić osad w roztworze do elektroporacji (patrz Tabela Materiałów). Dodać całkowitą ilość 10 μg DNA do zawiesiny komórkowej i dodać roztwór do elektroporacji do końcowej objętości 100 μl i utrzymać mieszaninę komórka-DNA na lodzie. Użyj wektorów konkatameru CRISPR w połączeniu z plazmidem ekspresji Cas9 (np. Addgene #41815) w stosunku 1:1.
UWAGA: Całkowita objętość dodanego DNA powinna być mniejsza lub równa 10% całkowitej objętości reakcji. - Dołącz oddzielną mieszankę transfekcyjną zawierającą plazmid GFP w celu oceny skuteczności transfekcji (np. pCMV-GFP, Addgene #11153 lub dowolny ogólny plazmid wykazujący ekspresję GFP).
- Dodaj mieszaninę komórka-DNA do kuwety do elektroporacji i umieść ją w komorze elektroporatora. Zmierz impedancję, naciskając odpowiedni przycisk na elektroporatorze i upewnij się, że wynosi 0,030-0,055 kΩ. Przeprowadzić elektroporację zgodnie z ustawieniami pokazanymi w Tabeli 3.
UWAGA: Jeśli wartość impedancji wykracza poza dozwolony zakres, wyreguluj objętość roztworu w kuwecie. - Dodać 400 μl buforu do elektroporacji + Y-27632 do kuwety, a następnie przenieść całość do probówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić komórkom regenerację, a następnie wirować je w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 400 x g.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl/studzienkę matrycy podstawowej. Wysiewaj około 1 x 104 do 1 x 105 komórek na studzienkę na płytce 48-dołkowej i dodaj EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v DMSO. Inkubować w temperaturze 37 °C.
- W dniu 5 zmień pożywkę na EN + CHIR99021 + Y-27632 i sprawdź wydajność transfekcji, obserwując ekspresję GFP (Rysunek 2). Utrzymać organoidy w temperaturze 37 °C i po 2 dniach odświeżyć pożywkę EN + CHIR99021 + Y-27632.
- W dniu 9 zmienić pożywkę na WENR + Nic + Y-27632 i inkubować w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Y-27632 można usunąć po 7-10 dniach (w dniach 16-19).
- Usunąć cały sklarowany osad i zawiesić osad w roztworze do elektroporacji (patrz Tabela Materiałów). Dodać całkowitą ilość 10 μg DNA do zawiesiny komórkowej i dodać roztwór do elektroporacji do końcowej objętości 100 μl i utrzymać mieszaninę komórka-DNA na lodzie. Użyj wektorów konkatameru CRISPR w połączeniu z plazmidem ekspresji Cas9 (np. Addgene #41815) w stosunku 1:1.
| Puls porowy | Impuls transferowy | |
| napięcie | 175V | 20V |
| Długość impulsu | 5 ms | 50 ms |
| Interwał impulsów | 50 ms | 50 ms |
| Liczba impulsów | cyfra arabska | 5 |
| Szybkość zaniku | 10% | 40 proc |
| biegunowość | + | +/- |
Tabela 3: Ustawienia elektroporacji.
4. Wycofanie czynnika wzrostu
Uwaga: Tutaj jest zilustrowany, jak przeprowadzić eksperyment z odstawieniem czynnika wzrostu podczas eliminowania negatywnych regulatorów szlaku Wnt w organoidach jelitowych.
- 10-14 dni po elektroporacji rozdzielić organoidy w stosunku 1:3 na 48-dołkowej płytce, postępując zgodnie z wyżej wymienionymi krokami (3.2.1 - 3.2.2).
- Zawiesić osad organoidowy w 20 μl matrycy błony podstawnej i pozostawić do zestalenia w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Następnie nałóż 250 μl pożywki pozbawionej czynnika wzrostu (np. EN), aby sprawdzić, czy osiągnięto nokaut docelowych genów5.
- Podziel organoidy w warunkach pozbawionych czynnika wzrostu przez co najmniej 2 - 3 przejścia, aby zobaczyć różnicę w przeżywalności między organoidami kontrolnymi typu dzikiego (WT) a organoidami zmutowanymi5,15.
UWAGA: Organoidy typu dzikiego nie powinny być w stanie przetrwać w pożywce pozbawionej czynnika wzrostu przez dwa przejścia, podczas gdy linie zmutowane powinny być w stanie rosnąć.
Wyniki
Aby potwierdzić obecność prawidłowej liczby wstawek gRNA w wektorze konkatemeru, przeprowadza się trawienie restrykcyjne enzymami (EcoRI + BglII) flankującymi wszystkie kasety ekspresyjne gRNA (rozmiar każdej kasety wynosi ~400 bp, Rycina 1). Na przykład podczas generowania wektora konkatemeru z 4 gRNA, oczekiwany rozmiar dolnego prążka w żelu agarozowym wynosi około 1,6 Kbp; każdy prążek poniżej tej wartości wskazuje, że nie wszystkie 4 kasety gRNA zostały wstawione do wektora (Rycina 2A). Ponadto zawsze zaleca się sprawdzenie, czy wszystkie miejsca rozpoznawania przez BbsI zostały utracone i czy enzym nie przecina wektora (Rycina 2B).
Po potwierdzeniu konstruktów można wprowadzić je do mysich organoidów jelitowych za pomocą elektroporacji, aby osiągnąć optymalny poziom wydajności transfekcji (do 70%), co wykazano w kontroli GFP (Rycina 3).
Na koniec, aby funkcjonalnie przetestować wydajność tej strategii, organoidy jelitowe przetransfekowane Cas9 oraz wektorami konkatamerowymi przeciwko Axin1/2 i Rnf43/Znrf3 hodowano w pożywkach EN (po odstawieniu R-spondyny) oraz EN + IWP2 (po odstawieniu R-spondyny i Wnt, IWP2: inhibitor porcupiny, 2,5 μM) przez minimum 3 pasaże (Rysunek 4). Podczas gdy nieprzetransfekowane organoidy WT obumarły w obu warunkach, organoidy z knockoutem Axin1/2 przeżyły w obu przypadkach ze względu na aktywację szlaku Wnt w dalszych etapach kaskady; dodatkowo organoidy z mutacją Rnf43/Znrf3 przeżywają w przypadku braku R-spondyny, ale nie są w stanie przeżyć w obecności IWP2, który powoduje wyczerpanie Wnt aktywującego szlak. Wspólnie obserwacje te wykazują, że knockout tych par paralogów jest możliwy poprzez uzyskanie oczekiwanego fenotypu organoidów. Szczegóły tych wyników zostały opublikowane w Developmental Biology5.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie konkatemeru CRISPR z 4 kasetami.Schemat wektora konkatemeru 4 gRNA, w którym każda kaseta o długości 400 bp zawiera promotor U6, dwie odwrócone powtórzone sekwencje rozpoznawcze BbsI (oznaczone również jako BB) oraz rusztowanie gRNA w tej kolejności. Podczas reakcji przetasowania miejsca BbsI są zastępowane fragmentami gRNA o pasujących nawisach, a w konsekwencji ulegają utracie. Miejsca wiązania starterów sekwencjonujących służących do weryfikacji prawidłowej insercji oligosów gRNA zaznaczono niebieskimi strzałkami. Fwd = starter przedni, Rev = starter odwrotny, Link 1/2/3 = regiony łącznikowe 1/2/3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Reprezentatywne wzory trawienia wektorów konkatemerycznych. (A) Podwójne trawienie wektorów z 3 i 4 konkatemerami gRNA za pomocą EcoRI i BglII. Prawidłowy wzór trawienia oznaczono zielonym ptaszkiem, natomiast wektory z tylko 1 lub 2 insercjami gRNA oznaczono czerwonym krzyżykiem. Ścieżka 1 przedstawia trawienie rodzimego wektora z 4 konkatemerami gRNA użytego jako kontrola pozytywna (oznaczonego znakiem „+”); analogicznie, ścieżka 5 przedstawia trawienie rodzimego wektora z 3 konkatemerami gRNA, oznaczonego znakiem „+”. (B) Trawienie enzymem BbsI, pokazujące prawidłowy rozmiar nietrawionych wektorów konkatemerycznych (wskazane zielonymi ptaszkami). Trawienie wektora konkatemerycznego zawierającego gRNA, który utracił miejsca rozpoznawania BbsI, służy jako kontrola pozytywna i jest oznaczone znakiem „+”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Reprezentatywny obraz pomyślnie elektroporowanych organoidów jelitowych. Transfekcja plazmidu GFP służy do oceny wydajności transfekcji. Około 24 h po elektroporacji widoczne są już organoidy zawierające niewielką liczbę komórek i, jeśli procedura elektroporacji przebiegła pomyślnie, do 70% z nich wykazuje zieloną fluorescencję. BF = światło przechodzące, GFP = zielone białko fluorescencyjne. Pasek skali = 2,000 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy mutantowych organoidów jelitowych. Knockout negatywnych regulatorów szlaku Wnt, Axin1 i Rnf43, wraz z ich paralogami, czyni organoidy jelitowe odpornymi na deprywację czynników wzrostu. W szczególności organoidy z knockoutem Axin1/2 (Axin1/2 KO) mogą rosnąć w nieobecności zarówno R-spondiny (EN: EGF + Noggin), jak i Wnt (EN + IWP2: EN + inhibitor Porcupine), podczas gdy organoidy mutantowe Rnf43/Znrf3 (R&Z KO) mogą przeżyć jedynie w nieobecności R-spondiny (EN). W przeciwieństwie do nich, organoidy WT mogą przeżyć tylko w kontrolnych warunkach hodowlanych, WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + nikotynamid). Paski skali = 1,000 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Pożywka podstawowa | Uwagi | |
| Przechowywać w 4 °C przez 4 tygodnie | ||
| Pożywka do hodowli komórkowej | 500 mL | Patrz tabela materiałów |
| L-Glutamina 100x | 5 mL | |
| Bufor 1 M | 5 mL | Patrz tabela materiałów |
| Penicylina Streptomycyna 100x | 5 mL | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondyna + nikotynamid) | ||
| Przechowywać w 4 °C przez 2 tygodnie | ||
| Pożywka podstawowa | do 50 mL | |
| Surowiczy suplement do komórek neuronalnych (50x) | 1 mL | Patrz tabela materiałów |
| Surowiczy suplement do komórek neuronalnych (100x) | 500 μL | Patrz tabela materiałów |
| n-Acetylocysteina (500 mM) | 125 μL | |
| mysi EGF (100 μg/mL) | 25 μL | |
| mysi Noggin (100 μg/mL) | 50 μL | |
| Pożywka warunkowana R-Spondiną | 5 mL | |
| Pożywka warunkowana Wnt3a | 25 mL | |
| Nikotynamid (1 M) | 250 μL | |
| EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | ||
| Przechowywać w 4 °C przez 2 tygodnie | ||
| Pożywka podstawowa bez penicyliny streptomycyny | do 20 mL | |
| Surowiczy suplement do komórek neuronalnych (50x) | 400 μL | Patrz tabela materiałów |
| Surowiczy suplement do komórek neuronalnych (100x) | 200 μL | Patrz tabela materiałów |
| n-Acetylocysteina (500 mM) | 50 μL | |
| mysi EGF (100 μg/mL) | 10 μL | |
| mysi Noggin (100 μg/mL) | 20 μL | |
| Y-27632 (10 μM) | 20 μL | |
| CHIR99021 (8 μM) | 10 μL | |
| EN (EGF + Noggin) | ||
| Przechowywać w 4 °C przez 4 tygodnie | ||
| Pożywka podstawowa | do 50 mL | |
| Surowiczy suplement do komórek neuronalnych (50x) | 1 mL | Patrz tabela materiałów |
| Surowiczy suplement do komórek neuronalnych (100x) | 500 μL | Patrz tabela materiałów |
| n-Acetylocysteina (500 mM) | 125 μL | |
| mysi EGF (100 μg/mL) | 25 μL | |
| mysi Noggin (100 μg/mL) | 50 μL |
Tabela 2: Skład pożywki do organoidów.
Dyskusja
W tym protokole szczegółowo opisujemy wszystkie kroki niezbędne do wygenerowania konkamerów CRISPR i zastosowania konkamerów CRISPR w organoidach jelitowych myszy w celu jednoczesnego wyeliminowania wielu genów. Jak wspomniano wcześniej, strategia ta ma kilka zalet, takich jak szybkość, wysoka wydajność i opłacalność.
Aby pomyślnie przeprowadzić całą procedurę, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych aspektów. Po pierwsze, ważne jest, aby wszystkie oligonukleotydy gRNA były odpowiednio wyżarzane i fosforylowane, ponieważ stanowią one materiał wyjściowy dla reakcji klonowania BbsI, która sama w sobie jest bardzo wydajna. Po drugie, podczas elektroporacji organoidów, im więcej komórek jest używanych w danym stanie, tym wyższa jest maksymalna możliwa wydajność transfekcji. Ponadto ważne jest również, że po dysocjacji komórek małe klastry komórek dominują nad pojedynczymi komórkami.
Niemniej jednak możliwe jest napotkanie problemów technicznych przy pierwszej próbie klonowania lub transfekcji; w przypadku problemów podczas klonowania gRNA zaleca się dwukrotne sprawdzenie sekwencji oligonugolaktycznej gRNA i, jeśli jest prawidłowa, wybranie dodatkowych kolonii bakteryjnych do badań przesiewowych w celu trawienia restrykcyjnego. Jeśli wydajność transfekcji i żywotność komórek są niskie po elektroporacji, zaleca się powtórzenie protokołu przy użyciu większej liczby komórek na warunek i skrócenie czasu dysocjacji komórek do 3 minut.
Chociaż wytwarzanie konkamerów CRISPR jest stosunkowo tanie i łatwe, wykonywanie badań genetycznych na większą skalę w organoidach już nie, ponieważ skala jest ograniczona kosztami związanymi z hodowlą organoidów i jej pracochłonnym charakterem. Warto w tym przypadku wspomnieć, że metoda CRISPR-concatemer jest również kompatybilna z liniami komórkowymi, takimi jak HEK293 i embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy.
Niezależnie od systemu komórkowego, kolejną potencjalną wadę tej strategii można napotkać, dążąc do jednoczesnego znokautowania trzech lub czterech różnych genów. Na przykład każde gRNA będzie miało inną skuteczność celowania, a zmiany wynikające z trafienia we wszystkie geny w tym samym czasie mogą być stosunkowo niskie; z tego powodu zaleca się stosowanie systemu konkatenerów do kierowania więcej niż jednego gRNA przeciwko temu samemu genowi.
Na przestrzeni lat zaproponowano alternatywne strategie oparte na tasowaniu Golden Gate w celu wygenerowania multipleksowych wektorów gRNA 7,8. Jednak w naszej metodzie możliwe jest bezpośrednie złożenie wielu gRNA w jeden wektor retrowirusowy w jednej rundzie klonowania, co sprawia, że nadaje się do generowania bibliotek gRNA do docelowych paralogów.
Nasz konkategomer CRISPR jest wbudowany w retrowirusową sieć szkieletową wektora MSCV. W ten sposób retrowirus zawierający konkatechery gRNA może być używany do generowania stabilnych linii komórkowych, które nadmiernie eksprymują gRNA. W połączeniu z systemem indukowanym przez Cas9, można wykonywać indukowane nokauty paralogu za pomocą naszego systemu.
Podsumowując, tutaj opisujemy, jak sklonować do czterech różnych gRNA do tego samego wektora w jednym kroku i jak zastosować tę strategię do hodowli organoidów z wysoką wydajnością transfekcji. Ponadto podajemy przydatne sugestie, aby zmaksymalizować szanse na sukces podczas całej procedury.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Autorzy nie mają zadeklarowanego konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Christopherowi Hindleyowi za krytyczną lekturę rękopisu. A.M. jest wspierany przez Wntsapp (Marie Curie ITN), A.A-R. jest wspierany przez Radę Badań Medycznych (MRC), a B-K.K. i R.M. są wspierani przez Sir Henry Dale Fellowship z Wellcome Trust i Royal Society [101241/Z/13/Z] i otrzymują wsparcie poprzez grant podstawowy od Wellcome Trust i MRC dla Wellcome Trust - MRC Cambridge Stem Cell Instytut.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zoptymalizowane narzędzie do projektowania CRISPR | Feng Zhang | Narzędzie do projektowania gRNA CRISPR; http://crispr.mit.edu/ | |
| Narzędzie do mapowania ograniczeń | Webcutter 2.0 | ||
| T4 PNK (kinaza polinukleotydowa) | New England Biolabs | M0201L | |
| T4 bufor ligazy DNA | New England Biolabs | M0202S | |
| T7 DNA Ligaza | New England Biolabs | M0318L | |
| DTT (ditiotreitol) | Promega | P1171 | |
| ATP (trifosforan adenozyny) | New England Biolabs | P0756S | |
| FastDigest BbsI (BpiI) | Bufor Thermo Fisher | FD1014 | |
| Tango (bufor enzymu restrykcyjnego zawierający BSA) | Thermo Fisher | BY5 | |
| BglII | New England Biolabs | R0144 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
| Bezpieczny dla plazmidu egzonukleaza | Cambio | E3101K | |
| Termocykler | Zastosowane biosystemy | 4359659 | |
| 10G kompetentne bakterie E. coli | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
| Mini zestaw plazmidowy | Qiagen | 12125 | |
| Mikrowirówka stołowa | Eppendorf | UY-02580-01 | |
| Pętle inokulacyjne | Microspec | PLS5 | |
| Inkubator bakterii | Sanyo | MIR-262 | |
| Bulion Luria-Bertani (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
| Agaroza | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Aparat do elektroforezy w żelu agarozowym | Bioneer | A-7020 | |
| Advanced DMEM/F12 (pożywka do hodowli komórkowych) | Invitrogen | 12634-034 | |
| Glutamax (L-glutamina) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
| HEPES 1 M (środek buforujący) | Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicylina-streptomycyna 100x | Suplement Invitrogen | 15140-122 | |
| B27 (Komórka neuronalna suplement bez surowicy) 50x | suplement Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 (suplement bez surowicy komórek neuronalnych) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| n-acetylocysteina 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Mysz EGF 500 µ g/ml | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
| Mouse Noggin 100 &mikro; g/mL | Peprotech | 250-38 | |
| Nikotynamid 1 M | Sigma | N0636 | |
| Pożywka kondycjonowana R-Spondyną | n.a.Produkowana | we własnym zakresie z komórek HEK293, szczegóły patrz Sato i Clevers 2013 | |
| Pożywka kondycjonowana Wnt | n.a.n.a.Produkowana | we własnym zakresie z komórek HEK293, szczegóły patrz Sato i Clevers 2013 | |
| Y-27632 10 &mikro; M | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| Standardowa matryca BD Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| 48-dołkowa płytka | Greiner Bio One | 677980 | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
| IWP-2 | Systemy naprowadzania komórek | SM39-10 | |
| TrypLE (proteaza rekombinowana) | Invitrogen | 12605-010 | |
| Opti-MEM (pożywka o zredukowanej surowicy) Technologie | życia | 51985-034 | |
| Kuwety do elektroporacji 2 mm szczelina | NepaGene | EC-002S | |
| Probówki o niskim poziomie wiązania 15 ml | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Bü rker' powiedział: s komora | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
| NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | Formularz kontaktowy | |
| Białkowe rurki LoBind o niskim poziomie wiązania | Bufor | ||
| BTXpress | Aparat Harvard 45-0805 | ||
| DMSO (dimetylosulfotlenek) | AppliChem | A3672 |
Bibliografia
- Mali, P., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. -P., Velasco-Herrera, M. D. C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat Biotech. 32 (3), 267-273 (2014).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A Genome-Wide CRISPR Library for High-Throughput Genetic Screening in Drosophila Cells. J Genet Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Diss, G., Ascencio, D., DeLuna, A., Landry, C. R. Molecular mechanisms of paralogous compensation and the robustness of cellular networks. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 322 (7), 488-499 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Merenda, A., Mustata, R. C., Li, T., Dietmann, S., Koo, B. -K. Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids. Dev Biol. 420 (2), 1-7 (2016).
- Ran, F. A., Hsu, P. P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS ONE. 4 (5), (2009).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4 (5), 5400(2014).
- Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), 1-11 (2014).
- Yin, L., et al. Multiplex Conditional Mutagenesis Using Transgenic Expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
- Cress, B. F., Toparlak, O. D., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synth Biol. 4 (9), 987-1000 (2015).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
- Zimmermann, J., Voss, H., Schwager, C., Stegemann, J., Ansorge, W. Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol. FEBS Letters. 233 (2), 432-436 (1988).
- Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nat. Protoc. 10 (10), 1474-1485 (2015).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer
Posted by JoVE Editors on 1/02/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer. There was a typo in step 3.3 of the Protocol.
