Artykuł metodologiczny

Skanowanie retrowirusowe: mapowanie miejsc integracji MLV w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55919

⸱

28 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół mapowania całego genomu miejsc integracji wektorów retrowirusowych opartych na wirusie mysiej białaczki Moloneya w komórkach ludzkich.

Streszczenie

wektory retrowirusowe oparte na wirusie mysiej białaczki Moloneya (MLV) integrują się głównie z acetylowanymi wzmacniaczami i promotorami. Z tego powodu miejsca integracji mLV mogą być wykorzystywane jako funkcjonalne markery aktywnych elementów regulatorowych. W tym miejscu przedstawiamy narzędzie do skanowania retrowirusowego, które pozwala na identyfikację w całym genomie wzmacniaczy i promotorów specyficznych dla komórki. Krótko mówiąc, docelowa populacja komórek jest transdukowana za pomocą wektora pochodzącego z mLV, a genomowe DNA jest trawione za pomocą często tnącego enzymu restrykcyjnego. Po ligacji fragmentów genomu za pomocą kompatybilnego łącznika DNA, reakcja łańcuchowa polimerazy za pośrednictwem łącznika (LM-PCR) umożliwia amplifikację połączeń genomowych wirus-gospodarz. Masowe sekwencjonowanie amplikonów służy do zdefiniowania profilu integracji mLV w całym genomie. Na koniec definiowane są klastry powtarzających się integracji w celu identyfikacji regionów regulatorowych specyficznych dla komórki, odpowiedzialnych za aktywację programów transkrypcyjnych specyficznych dla typu komórki.

Narzędzie do skanowania retrowirusowego pozwala na identyfikację całego genomu specyficznych dla komórek promotorów i wzmacniaczy w prospektywnie izolowanych populacjach komórek docelowych. Warto zauważyć, że skanowanie retrowirusowe stanowi instrumentalną technikę retrospektywnej identyfikacji rzadkich populacji (np. somatycznych komórek macierzystych), w których brakuje solidnych markerów do prospektywnej izolacji.

Wprowadzenie

Tożsamość komórki jest określana przez ekspresję określonych zestawów genów. Rola elementów cis-regulatorowych, takich jak promotory i wzmacniacze, ma kluczowe znaczenie dla aktywacji programów transkrypcyjnych specyficznych dla typu komórki. Te regiony regulatorowe charakteryzują się specyficznymi cechami chromatyny, takimi jak osobliwe modyfikacje histonów, wiązanie czynników transkrypcyjnych i kofaktorów oraz dostępność chromatyny, które są szeroko stosowane do ich identyfikacji w całym genomie w kilku typach komórek1,2,3. W szczególności profil acetylacji histonu H3 lizyny 27 (H3K27ac) obejmujący cały genom jest powszechnie stosowany do definiowania aktywnych promotorów, wzmacniaczy i superwzmacniaczy4,5,6.

Wirus mysiej białaczki Moloneya (MLV) jest gamma-retrowirusem, który jest szeroko stosowany do transferu genów w komórkach ssaków. Po zakażeniu komórki docelowej retrowirusowy genom RNA jest retrotranskrybowany w dwuniciowej cząsteczce DNA, która wiąże białka wirusowe i komórkowe w celu złożenia kompleksu wstępnej integracji (). dostaje się do jądra i wiąże chromatynę komórki gospodarza. W tym przypadku integraza wirusowa, kluczowy składnik, pośredniczy w integracji prowirusowego DNA z genomem komórki gospodarza. Integracja mLV w genomowym DNA nie jest przypadkowa, ale zachodzi w aktywnych elementach cis-regulatorowych, takich jak promotory i wzmacniacze, w sposób specyficzny dla komórki7,8,9,10. W tym osobliwym profilu integracji pośredniczy bezpośrednia interakcja między integrazą mLV a komórkowymi białkami bromodomeny i domeny pozaterminalnej (BET)11,12,13. Białka BET (BRD2, BRD3 i BRD4) działają jak pomost między chromatyną gospodarza a mLV: poprzez swoje bromodomeny rozpoznają wysoce acetylowane regiony cis-regulatorowe, podczas gdy domena pozaterminalna oddziałuje z integrazą mLV 11,12,13.

Tutaj opisujemy skanowanie retrowirusowe, nowatorskie narzędzie do mapowania aktywnych regionów cis-regulatorowych w oparciu o właściwości integracyjne mLV. Krótko mówiąc, komórki są transdukowane wektorem retrowirusowym pochodzącym z mLV, który wykazuje ekspresję genu reporterowego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP). Po ekstrakcji genomowego DNA połączenia między 3' długim powtórzeniem końcowym (LTR) wektora mLV a genomowym DNA są amplifikowane przez PCR za pośrednictwem łącznika (LM-PCR) i masowo sekwencjonowane. Miejsca integracji mLV są mapowane do ludzkiego genomu, a regiony genomu silnie ukierunkowane przez mLV definiuje się jako klastry miejsc integracji mLV.

Skanowanie retrowirusowe zostało użyte do zdefiniowania specyficznych dla komórki aktywnych elementów regulatorowych w kilku ludzkich komórkach pierwotnych14,15. Klastry mLV współmapowane z epigenetycznie zdefiniowanymi promotorami i wzmacniaczami, z których większość zawierała aktywne znaczniki histonowe, takie jak H3K27ac, i były specyficzne dla komórki. Skanowanie retrowirusowe umożliwia identyfikację elementów regulatorowych DNA w całym genomie w prospektywnie oczyszczonych populacjach komórek7,14, a także w retrospektywnie zdefiniowanych populacjach komórek, takich jak komórki macierzyste keratynocytów, które nie mają skutecznych markerów do prospektywnej izolacji15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transdukcja komórek ludzkich za pomocą MLV

  1. Wyizolować komórki docelowe i poddać je transdukcji wektorem retrowirusowym pochodzącym z mLV, zawierającym gen reporterowy eGFP i pseudotypowanym białkiem G wirusa zapalenia jam ustnych (VSV-G) lub amfotropicznym glikoproteinowym białkiem otoczki16.
    1. Komórki poddane pozorowanej transdukcji zachować jako kontrolę negatywną do dalszych analiz. Ponieważ retrowirusowe wektory oparte na mLV mogą wydajnie transdukować komórki w fazie podziału, populację komórek docelowych hodować w warunkach stymulujących podziały komórkowe. Warunki transdukcji wymagają specyficznej optymalizacji dla każdego badanego typu komórek. Warunki wzrostu komórek i transdukcji dla ludzkich progenitorów krwiotwórczych, limfocytów T oraz komórek naskórka opisano w referencjach 7, 14, 15 i 17.
  2. 48 h po transdukcji resuspender 100 000 komórek w 300 μL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej i zmierzyć ekspresję eGFP za pomocą analizy cytometrycznej (laser wzbudzający 488 nm). W jako kontroli negatywnej wykorzystać komórki poddane pozorowanej transdukcji. Aby uzyskać optymalne wyniki analizy miejsc integracji, oczyścić komórki GFP+ za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).
  3. Zebrać od 0,5 do 5 milionów komórek do preparatyki genomowego DNA. Preferowany jest dłuższy okres hodowli (>7 dni), aby rozcieńczyć niezuintegrowany prowirus; jest to niezbędne przy analizie długoterminowego potomstwa rzeczywistych (bona fide) komórek macierzystych (patrz Sekcja Dyskusja oraz referencja15). Osady komórkowe można zamrozić błyskawicznie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Amplifikacja miejsc integracji mLV za pomocą PCR z użyciem linkera (LM-PCR)

  1. Przygotowanie DNA genomowego (gDNA)
    1. Wyizolować gDNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA opartego na kolumience, postępując zgodnie z protokołem dla komórek hodowlanych i instrukcjami producenta.
  2. Trawienie enzymami restrykcyjnymi
    1. Przygotować 4 reakcje trawienia enzymami restrykcyjnymi na próbkę w probówkach 1,5 mL. W każdej probówce strawić od 0,1 do 1 μg gDNA, dodając 1 µL Tru9I (10U) i 1 µL Buforu M do końcowej objętości 10 µL. Inkubować reakcje w temperaturze 65 °C przez 6 h lub przez noc.
    2. Do każdej reakcji dodać 1 µL PstI (10U), 1 µL Buforu H i 8 µL wody. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 6 h lub przez noc. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  3. Ligacja linkerów
    1. Przygotować w probówce 1,5 mL roztwór zapasowy linkera Tru9I o stężeniu 100 μM, mieszając oligonukleotydy pasma plus i pasma minus linkera w stężeniu 100 μM. Umieścić probówkę w łaźni wodnej ustawionej na 100 °C, a następnie pozostawić do ochłodzenia w temperaturze pokojowej. Roztwór zapasowy linkera Tru9I można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    2. Przygotować 8 reakcji ligacji linkerów w probówkach 1,5 mL. Do każdej reakcji dodać następujące składniki do 10 µL trawienia enzymami restrykcyjnymi: 1,4 µL 10X buforu do reakcji T4 DNA Ligase, 1 µL 10 μM linkera Tru9I, 1 µL (2 000U) ligazy T4 DNA i 0,6 µL wody. Inkubować w temperaturze 16 °C od 3 do 6 h. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  4. Pierwsza PCR
    1. Przygotować 48 reakcji PCR (6 reakcji z każdej probówki po ligacji) w probówkach 0,2 mL. Do każdej PCR dodać następujące odczynniki do 2 µL reakcji ligacji: 5 µL 10X buforu PCR, 2 µL 50 mM siarczanu magnezu, 1 µL 10 mM mieszaniny deoksynukleotydów (dNTP), 1 µL 10 μM startera linkera, 1 µL 10 μM startera mLV-3' LTR, 0,3 µL (1,5U) polimerazy Taq DNA i 37,7 µL wody. Sekwencje starterów podano w Tabeli 1.
    2. Przeprowadzić reakcję PCR w termocyklerze z grzaną pokrywą według następującego programu: 95 °C przez 2 min; 25 cykli: 95 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min; 72 °C przez 5 min; utrzymywanie w 4 °C. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  5. Druga PCR
    1. Przygotować 48 reakcji PCR (1 z każdej probówki po „pierwszej PCR”) w probówkach 0,2 mL. Do każdej PCR dodać następujące składniki do 2 µL pierwszej reakcji PCR: 5 µL 10X buforu PCR, 2 µL 50 mM siarczanu magnezu, 1 µL 10 mM mieszaniny dNTP, 1 µL 10 μM gniazdowego startera linkera, 1 µL 10 μM gniazdowego startera mLV-3' LTR, 0,3 µL polimerazy Taq DNA (1,5 U) i 37,7 µL wody. Użyć starterów gniazdowych zaprojektowanych dla wybranej konkretnej strategii sekwencjonowania masowego: (i) gniazdowy starter linkera i gniazdowy starter mLV-3' LTR kompatybilne z platformą Illumina; (ii) gniazdowy starter linkera i gniazdowy starter mLV-3' LTR kompatybilne z platformą Roche. Sekwencje starterów wymieniono w Tabeli 1.
    2. Przeprowadzić reakcję PCR w termocyklerze z grzaną pokrywą według następującego programu: 95 °C przez 2 min; 25 cykli: 95 °C przez 15 s, 58 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min; 72 °C przez 5 min; utrzymywanie w 4 °C. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    3. Połączyć 48 reakcji gniazdowej PCR w probówce 15 mL (objętość końcowa ok. 2,4 mL). Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  6. Określenie obecności i wielkości produktów LM-PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    1. Do 20 µL produktów LM-PCR dodać 4 µL buforu do nakładania i nałożyć próbkę na 1% żel agarozowy wraz z markerem DNA 100 bp. Prowadzić elektroforezę przy 5 V/cm przez 30 do 60 min i zwizualizować produkty PCR poprzez barwienie bromkiem etydyny.
    2. Przeprowadzić reakcję LM-PCR z próbką mock-transdukowaną jako kontrolę negatywną.
  7. Wytrącić amplikony, dodając 0,1 objętości roztworu octanu sodu (3 M; pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu. Wymieszać i zamrozić w temperaturze -80 °C na 20 min.
    1. Wirować z maksymalną prędkością w standardowej mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 20 min. Odlać nadsącz i przemyć osad 70% etanolem. Wirować z maksymalną prędkością w standardowej mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 5 min.
    2. Odlać nadsącz i wysuszyć osad na powietrzu. Dodać 200 µL wody klasy PCR i resuspender DNA. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  8. Do 100 µL produktów LM-PCR dodać 20 μL buforu do nakładania i nałożyć próbkę na 1% żel agarozowy wraz z markerem DNA 100 bp.
    1. Prowadzić elektroforezę przy 5 V/cm przez 30 do 60 min i wyciąć fragment żelu zawierający amplikony o długości od 150 do 500 bp.
    2. Oczyścić produkty LM-PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu opartego na kolumience i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru UV.
  9. Użyć 1 µL biblioteki w celu oceny długości produktów LM-PCR za pomocą analizatora bioanalyzer, zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Klonowanie amplikonów metodą shotgun
    1. Użyć 20 ng oczyszczonych produktów LM-PCR i sklonować je w wektorze pCR2.1-TOPO zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przeprowadzić reakcje sekwencjonowania przy użyciu uniwersalnego startera M13, a następnie wykonać mapowanie genomowe otrzymanych sekwencji, aby wykazać obecność złączy genomu wirusowego (w tym gniazdowego startera mLV-3' LTR) w >50% klonów w celu zidentyfikowania próbek odpowiednich do sekwencjonowania masowego. Przykład złącza genomu wirusowego:
      figure-protocol-1
      Gniazdowy starter mLV-3' LTR 454 i gniazdowy starter linkera 454 (Tabela 1) są zaznaczone pogrubieniem, a koniec 3' wirusowego LTR kursywą. Ludzka sekwencja genomowa jest wyróżniona czerwonym tekstem (chr10:6439408-6439509, hg19).

3. Masowe sekwencjonowanie miejsc integracji mLV

UWAGA: Produkty LM-PCR mogą być sekwencjonowane przy użyciu platform komercyjnych (po wyborze odpowiedniej pary starterów zagnieżdżonych w drugiej reakcji PCR, patrz podrozdział 2.5.1). W celu sekwencjonowania na platformie pirosekwencjonowania Roche GS-FLX należy odnieść się do wcześniejszych publikacji7,14,15. W tej sekcji opisano nowo zoptymalizowany protokół dla platformy sekwencjonowania Illumina.

  1. Przygotowanie biblioteki
    1. Przygotować po jednej reakcji PCR indeksującej na próbkę w probówkach 0,2 mL. Do każdego PCR dodać następujące odczynniki do 5 µL (150-170 ng) oczyszczonego produktu LM-PCR: 5 µL startera indeksującego 1 (Index Primer 1), 5 µL startera indeksującego 2 (Index Primer 2), 25 µL 2X Master Mix oraz 10 µL wody klasy PCR. Dla każdej próbki należy zastosować inną kombinację indeksów.
    2. Reakcje PCR przeprowadzić w termocyklerze z grzaną pokrywą według następującego programu: 95 °C przez 3 min; 8 cykli: 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 5 min; przechowywanie w 4 °C.
    3. Produkty PCR oczyścić za pomocą protokołu izolacji z użyciem kulek do odwracalnej immobilizacji w fazie stałej (SPRI): do nowych probówek 1,5 mL dodać 56 µL kulek do każdej próbki i postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować w 25 µL Tris-HCl 10 mM. Biblioteki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Kontrola biblioteki
    1. Użyć 1 µL próbki do oceny wielkości biblioteki za pomocą bioanalizatora.
    2. Użyć 1 µL próbki do oznaczenia molarności biblioteki za pomocą fluorescencyjnego testu Real time PCR, zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Rozcieńczanie biblioteki i sekwencjonowanie
    1. Rozcieńczyć biblioteki do stężenia 10 nM za pomocą Tris-HCl 10 mM. W celu połączenia bibliotek (pooling), przenieść 5 µL każdej rozcieńczonej biblioteki do nowej probówki 1,5 mL, a następnie rozcieńczyć pulę do 4 nM w Tris-HCl 10 mM.
    2. W nowej probówce 1,5 mL wymieszać 5 µL rozcieńczonej puli z 5 µL 0,2 N NaOH, krótko wymieszać w wirówce typu vortex, odwirować i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu denaturacji bibliotek.
    3. Umieścić probówki na lodzie i dodać 990 µL schłodzonego buforu do hybrydyzacji (HT1). Odmierzyć 300 µL zdenaturowanej puli do nowej probówki 1,5 mL i dodać 300 µL schłodzonego HT1, aby uzyskać końcową pulę bibliotek o stężeniu 10 pM.
    4. Równolegle wymieszać 2 µL biblioteki kontrolnej PhiX (10 nM) z 3 µL Tris-HCl 10 mM w probówce 1,5 mL. Dodać 5 µL NaOH 0,2 N, krótko wymieszać w wirówce typu vortex, odwirować i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu denaturacji rozcieńczonego PhiX. Umieścić probówkę na lodzie i dodać 990 µL schłodzonego HT1.
    5. Odmierzyć 300 µL zdenaturowanego PhiX do nowej probówki 1,5 mL i dodać 300 µL schłodzonego HT1, aby uzyskać końcowe stężenie PhiX 10 pM.
    6. W nowej probówce 1,5 mL wymieszać 510 µL zdenaturowanej puli bibliotek z 90 µL zdenaturowanej biblioteki PhiX, uzyskując w ten sposób końcową pulę 10 pM z 15% zawartości kontroli PhiX.
    7. Pipetować 600 µL tej objętości próbki do zbiornika Load Sample rozmrożonego kartridża z odczynnikami do sekwencjonowania i niezwłocznie przeprowadzić sekwencjonowanie w trybie single-read (150 cykli).
      UWAGA: Krytyczne odczynniki i sekwencje starterów wymagane w tym protokole są wymienione w Tabeli 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat procedury skanowania retrowirusowego

Schemat procedury skanowania retrowirusowego przedstawiono na Rysunku 1. Docelowa populacja komórek zostaje oczyszczona i transdukowana retrowirusowym wektorem pochodzącym z mLV, wykazującym ekspresję genu reporterowego eGFP. Transgen jest flankowany przez dwa identyczne długie powtórzenia końcowe (5' i 3' LTR), co zapewnia syntezę, odwrotną transkrypcję i i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy protokół mapowania całego genomu miejsc integracji mLV, retrowirusa, który atakuje regiony chromatyny, epigenetycznie oznaczone jako aktywne promotory i wzmacniacze. Krytyczne etapy i/lub ograniczenia protokołu obejmują: (i) transdukcję mLV w docelowej populacji komórek; (ii) amplifikacja połączeń wirus-gospodarz metodą LM-PCR; (iii) odzyskanie dużej części miejsc integracji. Wektory retrowirusowe oparte na mLV skutecznie transdukują dzielące się komórki. Potencjalnym ograniczeniem tej techniki j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), włoskiego Ministerstwa Edukacji, Uniwersytetów i Badań (FIRB-Futuro w Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro w Ricerca 2012-RBFR126B8I_003, EPIGEN Epigenomics Flagship Project), włoskiego Ministerstwa Zdrowia (Young researchers Call 2011 GR-2011-02352026) oraz Fundacji Imagine Institute (Paryż, Francja).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBS, pH 7,4ThermoScientific10010031lub równoważny
Płodowa surowica bydlęcaThermoScientific16000044lub równoważna
probówka 0,2 mlogólny dostawca
laboratoryjny 1,5 ml probówkiogólny dostawca
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit QIAGEN51306lub równoważna
ligaza DNA T4 New England BioLabsM0202T
T4 Ligaza DNA Bufor reakcyjnyNew England BioLabsM0202T
Linker Plus Nitka oligonukleotydogólny dostawcalaboratoryjny 5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3'   (Stopień oczyszczenia: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonukleotydogólny dostawca5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Stopień oczyszczenia: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
Bufor SuRE/Cut MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
Bufor SuRE/Cut HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platynowa polimeraza DNA Taq o wysokiej wierności Invitrogen11304011
10 mM dNTP MixInvitrogen18427013lub równoważny
Woda klasy PCROgólny dostawca
96-dołkowy termocykler (z podgrzewaną pokrywą)Ogólny dostawca
Łącznik ElementarzOgólny dostawcalaboratoryjny 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Stopień oczyszczenia: klasa PCR)
Zobacz materiał MLV-3' Ogólnydostawca5'-GACTTGTGGTCTCTCTCGTTCCTTGG-3' (Stopień oczyszczenia: klasa PCR)
Łącznik zagnieżdżony starter 454ogólny dostawca5'-GCCTTGCCAGCCCCCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Stopień oczyszczania: SDS-PAGE)
MLV-3' Zagnieżdżony starter LTR 454ogólny dostawca5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Stopień oczyszczania: SDS-PAGE)
linker zagnieżdżony starter Illuminaogólny dostawca5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Stopień oczyszczania: SDS-PAGE)
MLV-3' Zagnieżdżony starter LTR Ogólnydostawca5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Stopień oczyszczania: SDS-PAGE)
Roztwór octanu sodu (3M) pH 5.2ogólny dostawca
Etanol (bezwzględny) do biologii molekularnejSigma-AldrichE7023lub równoważny
Topo TA Zestaw do klonowania (z wektorem pCR2.1-TOPO)InvitrogenK4500-01
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQIAGEN28704
AgarozaSigma-AldrichA9539lub równoważny
bromek etydyny Sigma-AldrichE1510lub równoważny
100 pz drabinka DNAInvitrogen15628019lub równoważny
6x Bufor ładującyThermoScientificR0611lub równoważny
Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop 2000ThermoScientificND-2000
Nextera XT Zestaw indeksówIlluminaFC-131-1001 lub FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix KAPA BiosystemsKK2601
Stojak magnetyczny Dynal do probówek 2 mlInvitrogen12321Dlub odpowiednik
Agencourt AMPure XP zestaw 60 mlBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8,5ogólny dostawca
System Agilent 2200 TapeStationAgilent TechnologiesG2964AAlub równoważny
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582lub równoważny
D1000 OdczynnikiAgilent Technologies5067-5583lub równoważny
Zestaw kwantyfikacyjny biblioteki KAPA dla platform Illumina (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems4329003
NaOH 1,0 N, molekularny laboratoriów
biologicznych HT1 (bufor hybrydyzacyjny)Illumina Dostarczany w zestawie
MiSeq MiSeq Reagent Kit v3 (150 cykli)IlluminaMS-102-3001
MiSeq SystemIlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
laboratoryjny laboratoryjny laboratoryjnylaboratoryjny laboratoryjny podkładu LTR laboratoryjny laboratoryjny laboratoryjny laboratoryjny Illumina laboratoryjnylaboratoryjny Dostawca odczynników

Bibliografia

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724(2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688(2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158(2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PCR z u yciem linker wtrawienie DNA genomowegotrawienie enzymami restrykcyjnymianaliza cytometrycznaelektroforeza w elu agarozowymprzygotowanie bibliotekisekwencjonowanie g bokie

Powiązane artykuły