Method Article

Półautomatyczna ilościowa analiza strukturalna oparta na mikrotomografii komputerowej nagiego szczura Model złamania kręgów związanego z osteoporozą

DOI:

10.3791/55928

⸱

September 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Skeletal Biotech Laboratory, Hebrew University-Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest wygenerowanie modelu złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą u nagich szczurów, który może być oceniany in vivo za pomocą półautomatycznej ilościowej analizy strukturalnej opartej na mikrotomografii komputerowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompresyjne złamania kręgów związane z osteoporozą (OVCFs) są powszechną i klinicznie niezaspokojoną potrzebą, której częstość występowania wzrasta wraz ze starzeniem się światowej populacji. Zwierzęce modele OVCF mają zasadnicze znaczenie dla przedklinicznego rozwoju translacyjnych strategii inżynierii tkankowej. Chociaż obecnie istnieje wiele modeli, protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę wywoływania wielu wysoce powtarzalnych wad kręgów u jednego nagiego szczura. Szczegółowo opisano również nowatorską, półautomatyczną analizę ilościową wad kręgów opartą na podłużnej półautomatycznej tomografii komputerowej (μCT). Krótko mówiąc, szczury zostały sfotografowane w wielu punktach czasowych po operacji. Skan dnia 1 został przeorientowany na standardową pozycję i zdefiniowano standardowy wolumen zainteresowania. Kolejne skany μCT każdego szczura były automatycznie rejestrowane w badaniu klinicznym pierwszego dnia, więc ta sama objętość zainteresowania była następnie analizowana w celu oceny tworzenia się nowej kości. To wszechstronne podejście można zaadaptować do wielu innych modeli, w których analiza oparta na obrazowaniu podłużnym może skorzystać z precyzyjnego półautomatycznego wyrównania 3D. Podsumowując, protokół ten opisuje łatwo mierzalny i łatwy do odtworzenia system do badań nad osteoporozą i kośćmi. Sugerowany protokół zajmuje 4 miesiące na wywołanie osteoporozy u nagich szczurów po owariektomii i od 2,7 do 4 godzin na wygenerowanie, zobrazowanie i analizę dwóch wad kręgów, w zależności od wielkości tkanki i sprzętu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponad 200 milionów ludzi na całym świecie cierpi na osteoporozę1. Leżące u podstaw patologiczne zmniejszenie gęstości mineralnej kości (BMD) i zmieniona mikroarchitektura kości zwiększają kruchość kości, a w konsekwencji względne ryzyko złamań2. Osteoporoza jest tak powszechna i szkodliwa dla zdrowia, że WHO określiła ją jako poważny problem zdrowia publicznego. Co więcej, wraz ze starzeniem się światowej populacji, osteoporoza stanie się jeszcze bardziej powszechna.

Osteoporotyczne złamania kompresyjne kręgów są najczęstszymi złamaniami łamliwości, szacowanymi na ponad 750 000 rocznie w USA. Wiążą się one ze znaczną zachorowalnością i aż dziewięciokrotnie wyższą śmiertelnością3. W badaniach klinicznych stwierdzono, że obecnie dostępne interwencje chirurgiczne, takie jak wertebroplastyka i kyfoplastyka, nie są bardziej skuteczne niż leczenie pozorowane4,5, pozostawiając tym pacjentom dostępne tylko leczenie bólu. Ponieważ obecne metody leczenia OVCF są ograniczone, konieczne jest opracowanie modelu zwierzęcego, który może odtworzyć zaburzenie6,7,8. Takie modele zwierzęce mogłyby ułatwić zarówno badanie obecnych metod leczenia, jak i opracowywanie nowych terapii, które przełożą się na praktykę kliniczną. Osteoporoza została wywołana i utrzymana u zwierząt modelowych poprzez podawanie diety niskowapniowej (LCD) w połączeniu z wycięciem jajników1,9,10,11,12,13,14,15. Aby dokładniej modelować ubytek masy kostnej związany z OVCFs, stwierdzono ubytki kości kręgów u osteoporotycznych szczurów immunokompetentnych 16,17,18,19,20,21,22,23,24. W pracy przedstawiono model ubytku kręgów u szczurów z obniżoną odpornością i modelowaną osteoporozą. Ten nowatorski model może być wykorzystany do oceny terapii komórkowych z wykorzystaniem komórek macierzystych pochodzących z różnych źródeł i gatunków w celu naprawy trudnych złamań, takich jak OVCF.

Obrazowanie kości jest kluczowym elementem oceny złamań i chorób kości. Opracowano zaawansowane metody obrazowania w celu dokładnej oceny strukturalnych zmian kostnych i strategii regeneracji25. Wśród nich obrazowanie μCT stało się nieinwazyjną, łatwą w użyciu i niedrogą metodą, która zapewnia obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie μCT ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami oceny pacjentów z osteoporozą, ponieważ oferuje mikroarchitekturę kości 3D o wysokiej rozdzielczości26, które można następnie analizować ilościowo. Te ostatnie można następnie wykorzystać do porównania efektów terapeutycznych proponowanych metod leczenia. Rzeczywiście, obrazowanie μCT in vivo jest złotym standardem w monitorowaniu regeneracji wad kręgów1,16,27. Jednak kilka publikacji28,29,30,31 wykorzystuje zautomatyzowane narzędzia rejestracji, aby zminimalizować zależność od użytkownika, błąd interpolacji i błąd precyzji analizy opartej na obrazowaniu μCT. Niedawno jako pierwsi zastosowaliśmy procedurę rejestracji w celu usprawnienia analizy regeneracji kości w standaryzowanym pustym plomby kostnej, jak wyjaśniono w tym protokole32 .

Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do badania efektu nowych terapii komórkowych dla OVCFs, nieskrępowanego przez odpowiedzi komórek T gospodarza, które mogą odrzucać komórki ksenogeniczne lub allogeniczne. Osteoporoza jest wywoływana u młodych szczurów poprzez jajnikomię (OVX) i 4-miesięczną LCD. Młody wiek szczurów OVX, w połączeniu z wyświetlaczem LCD, pozwolił nam osiągnąć niską szczytową masę kostną, naśladując osteoporozę pomenopauzalną, prowadząc do nieodwracalnej utraty masy kostnej. Można to częściowo wytłumaczyć faktem, że podczas LCD i w wieku około 3 miesięcy szczury przechodzą z fazy modelowania kości do fazy przebudowy kręgów lędźwiowych33, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo utrzymania się osteoporozy w czasie. Wykorzystanie młodych zwierząt sprawia, że model ten jest bardziej opłacalny, ponieważ kosztują mniej. Niemniej jednak jest to ograniczone przez to, że z natury nie uwzględnia zmian biologicznych w starzejącym się zwierzęciu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Medycznego Cedars-Sinai (Protokół # 3609). Znieczulenie podawano do wszystkich zabiegów obrazowych i chirurgicznych. Wszystkie zwierzęta były trzymane zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC.

UWAGA: Eksperymentalny projekt tego protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Kup sześciotygodniowe szczury z chirurgicznie usuniętymi jajnikami i nakarm je produktem LCD składającym się z 0,01% wapnia i 0,77% fosforanu. Po okresie 4 miesięcy od wykonania LCD należy wywiercić ubytek kręgowy o krytycznej wielkości w czwartym i piątym trzonie kręgu lędźwiowego (L4-L5). Po operacji zobrazuj szczury w dniu 1 i tygodniach 2, 4, 8 i 12 po ustaleniu wady. Zlokalizuj marginesy defektów w skanowaniu w dniu 1, zmień orientację do standardowej pozycji i zdefiniuj cylindryczną objętość zainteresowania (VOI). Automatycznie rejestruj kolejne skany μCT (tj. dla tygodni 2, 4, 8 i 12) każdego szczura w standardowej pozycji zdefiniowanej dla odpowiedniego skanu w dniu 1. Zastosuj wstępnie zdefiniowany VOI dnia 1 do zarejestrowanych skanów. Oceń gęstość objętości kości i gęstość pozorną VOI.

1. Indukcja osteoporozy

  1. Umieść sześciotygodniowe szczury po atakimicznej owariektomii na 4-miesięcznym LCD składającym się z 0,01% wapnia i 0,77% fosforanu.
  2. Wróć do normalnej diety.
    UWAGA: Szczury te będą dalej określane jako "szczury osteoporotyczne".

2. Model wady kręgu

UWAGA: Czas to 40 - 50 minut na zwierzę.

  1. Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem.
  2. W przypadku wielu operacji należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne.
    1. Umyj narzędzia i umieść je w kąpieli sonikatora na 5 minut. Umieść je w gorącym sterylizatorze perełkowym ustawionym na 250 °C na 20 s. Pozwól narzędziom ostygnąć przez 5 minut.
  3. Wywołaj znieczulenie.
    1. Umieść szczura z osteoporozą w komorze indukcyjnej podłączonej do urządzenia do znieczulenia z centralnym systemem oczyszczania. Wywołać znieczulenie za pomocą 5% izofluranu w 100% tlenu i utrzymać przez stożek nosowy na poziomie 2 - 3% izofluranu. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    2. Zastosuj bodziec szczypania palców u stóp, aby zapewnić odpowiednią płaszczyznę znieczulenia. Jeśli nie zostanie odnotowana żadna odpowiedź, wszcząć procedurę.
  4. Umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej grzbietowej na poduszce grzewczej (37 °C) i rozciągnij kończyny za pomocą magnetycznego systemu retrakcji stabilizatora (Rysunek 2A).
    UWAGA: Temperatura poduszki grzewczej jest ważna dla zapobiegania hipotermii, ponieważ znieczulony szczur nie jest w stanie regulować temperatury ciała.
  5. Ogol okolice brzucha za pomocą golarki elektrycznej. Przetrzyj go środkiem antyseptycznym na bazie jodu i glukonianem chlorheksydyny 0,5%, a następnie 70% etanolem.
  6. Wstrzyknąć szczurowi karprofen (5 mg/kg masy ciała (BW), podskórnie (SQ)) przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
  7. Użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć skórę. Rozpocznij nacięcie 1 cm poniżej wyrostka mieczykowatego i przetnij linię środkową (~5 - 8 cm) (Ryc. 2B).
  8. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie rozcięgna przez linię białką, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej (Ryc. 2C).
  9. Odsłoń jamę brzuszną za pomocą retraktorów (Rysunek 2D).
  10. Odchyl jelita na prawo od szczura, aby odsłonić aortę brzuszną i lewą nerkę (Rysunek 2E). Zbadaj palpacyjnie odcinek lędźwiowy kręgosłupa przed przystąpieniem do jego odsłaniania. Aby uniknąć odwodnienia, użyj sterylnych nasączonych gaz ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej do owinięcia narządów wewnętrznych.
  11. Użyj termokoagulacji, aby odsłonić warstwami przednią część lędźwiowych trzonów kręgów L4-5 i wyizolować je od otaczającej tkanki łącznej i mięśni (Rysunek 2F-G).
    UWAGA: Termokoagulacja powinna być stosowana w celu zatamowania krwawienia podczas sekcji.
  12. Użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć krew i resztki tkanki z kręgów L4. Użyj sterylnego wiertła Trephine (o średnicy ~2 mm), aby wywiercić ubytek kostny o głębokości 5 mm w środku odsłoniętej przedniej części trzonu kręgu (ryc. 2H-I).
    UWAGA: Zastosuj minimalny nacisk, aby przewiercić się tylko przez korę brzuszną i leżącą pod nią kość beleczkową; Unikaj wiercenia w korze grzbietowej. Należy pamiętać, że kręgi szczurów z osteoporozą są bardzo delikatne. Użyj bawełnianego wacika, aby oczyścić wadę i uciskać, aby zatrzymać krwawienie, jeśli występuje.
  13. Powtórz krok 2.11 na kręgu L5, aby utworzyć w sumie 2 wady na szczura ( Rysunek 2J).
  14. Wróć jelita do jamy brzusznej.
  15. Użyj syntetycznego wchłanialnego szwu chirurgicznego vicryl (3-0 vicryl niebarwiony stożek 27" SH) w ciągłym wzorze, aby zszyć rozcięgno (Rysunek 2K).
  16. Zamknij skórę za pomocą niewchłanialnego szwu z monofilamentu nylonowego 4-0 w prostym, przerywanym wzorze (Rysunek 2L).
  17. Nałóż 100 μl miejscowego kleju do skóry na szwy skórne i między nimi, aby zapewnić całkowite zamknięcie skóry.
  18. Wstrzyknąć szczurowi ciepły (37 °C) roztwór Ringera z mleczanami (1CC/100 g m.c.), aby zapobiec hipotermii i odwodnieniu.
  19. Wstrzyknąć szczurowi buprenorfinę (0,5 mg/kg m.c.) przed zabiegiem i co 8 - 12 godzin w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego, jeśli to konieczne.
  20. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Nie należy również zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
  21. Po tym, jak zwierzę dojdzie do siebie na poduszce grzewczej, włóż je z powrotem do klatki.
    UWAGA: Szczury należy trzymać pojedynczo (tj. w oddzielnych klatkach), aby zapobiec okaleczaniu szwów i ran przez szczury.
  22. Umieść karmę namoczoną w wodzie na szalce Petriego na podłodze klatki na kilka dni po operacji, aby pomóc szczurom dotrzeć do jedzenia.
  23. Karprofen (5 mg/kg m.c., SQ) należy podawać 24 godziny po zabiegu w celu złagodzenia bólu co 24 godziny w razie potrzeby.
  24. Usuń szwy skórne, gdy zwierzę jest pod 2% znieczuleniem izofluranem 10 - 14 dni po operacji.

3. Skanowanie mikrotomografią komputerową

UWAGA: Czas to 30 - 40 minut na zwierzę.

  1. Następnego dnia po zabiegu chirurgicznym należy umieścić szczura z osteoporozą w komorze indukcyjnej podłączonej do urządzenia do znieczulenia z centralnym systemem oczyszczania. Wywołać znieczulenie za pomocą 5% izofluranu w 100% tlenu i utrzymać przez stożek nosowy na poziomie 2 - 3% izofluranu.
  2. Zeskanuj szczura za pomocą skanera μCT in vivo. Powtórz skanowanie w celu analizy podłużnej regeneracji kości.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie zwierzęta są skanowane przy użyciu tych samych ustawień (tj. energii promieniowania rentgenowskiego, medium skanowania, intensywności, rozmiaru woksela i rozdzielczości obrazu) i w podobnej orientacji. Na przykład: energia promieniowania rentgenowskiego, 55 kVP; prąd, 145 μA; wielkość woksela, 35 μm; przyrosty, 115 μm; i czas integracji, 200 ms; z próbkami w PBS. Patrz Bouxtein i wsp.34 w celu uzyskania dalszych wyjaśnień i rozważań związanych ze skanowaniem μCT gryzoni w celu oceny mikrostruktury kości. Idealnie byłoby, gdyby dla wszystkich skanów była używana najwyższa dostępna rozdzielczość skanowania; Jednak skany o wyższej rozdzielczości wymagają dłuższego czasu akwizycji, generują duże zestawy danych i narażają zwierzęta na większe promieniowanie jonizujące. Te ostatnie mogą powodować działania niepożądane, w tym spowolnione gojenie się złamań. Dlatego należy dokładnie rozważyć kompromis między dodatkowymi danymi a czasem skanowania.

4. Separacja kręgów

UWAGA: Czas wynosi 20 - 30 minut na próbkę.

  1. Konturuj interesujący nas kręg, jak pokazano na rysunku Rysunek 3A-I. Upewnij się, że uwzględniłeś wszystkie części kręgu, wykluczając części należące do sąsiednich kręgów.
    1. Kliknij "program do oceny μCT" i wybierz próbkę z menu.
    2. Konturuj każdy plasterek za pomocą myszy.
    3. Użyj paska "Z", aby przejść do następnego plasterka.
  2. Zapisz wyprofilowany kręg jako osobny plik (Rysunek 3J-K), klikając na "Plik" → "Zapisz GOBJ" co kilka plasterków.

5. Definicja VOI dla długoterminowej oceny ilościowej

UWAGA: Następujące kroki zależą od tego, czy skan jest od 1 dnia po operacji (kręg referencyjny), czy od kolejnych punktów czasowych (kręgi docelowe).

  1. Kręg odniesienia.
    UWAGA: Czas wynosi 20 - 30 minut na próbkę.
    1. W przypadku obrotu Z zmierz kąt marginesów za pomocą wycinka XY od środka wady (Rysunek 4A-B).
      1. Na płaszczyźnie Z przejdź do obszaru kręgu, w którym wada jest najbardziej wyraźna i uchwyć kręg na ekranie.
      2. W oprogramowaniu do prezentacji przygotuj obiekt w kształcie prostokąta, który będzie pasował do wady.
      3. Obróć obraz kręgu tak, aby wada była skierowana do góry, a brzegi wady były równoległe do boków prostokąta.
      4. Zmierz kąt obrotu (kliknij obraz prawym przyciskiem myszy → "Formatuj obraz" → "Rozmiar").
      5. Użyj zmierzonego kąta, aby obrócić kręg (Rysunek 4C).
        1. Otwórz nowe okno DECterm ("Menedżer sesji" → "Aplikacje" → "DECterm").
        2. Uruchom "ipl":
        3. Ipl> turn3d
        4. -input [w]>
        5. -wyjście [wyjście]>
        6. -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000]> 90 90 0
        7. -kąt obrotu [0,000]> kąt pomiarowy
        8. -img_interpol_option [1]>
    2. W przypadku obrotu X zmierz kąt marginesów za pomocą wycinka YZ od środka wady (Rysunek 4D-E). Użyj zmierzonego kąta, aby obrócić kręg (Rysunek 4F).
      1. Kliknij "YZ" w "programie ewaluacyjnym uCT" i powtórz kroki 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
      2. Ipl> isq
      3. -aim_name [w]>
      4. -isq_filename [default_file_name]> Wstaw katalog plików ISQ (np. "DK0:[MICROCT. DANE. GAZIT. MAKSYMA.80.DZIEŃ1]Z2102970. ISQ")
      5. -pos [0 0 0]>
      6. -dim [-1 -1 -1]>
    3. Odwróć obrócony kręg, zmieniając płaszczyznę XY na płaszczyznę ZX.
      1. Otwórz nowe okno DECterm ("Menedżer sesji" → "Aplikacje" → "DECterm").
      2. Uruchom "ipl":
      3. Klapka Ipl>
      4. -wejście [wejście] > wyjście
      5. -input [out] > out2
      6. -new_xydir [yz] > zx
    4. Zdefiniuj VOI.
      1. Narysuj okrągły kontur wady za pomocą przekroju od środka wady, wybierając ikonę okrągłego konturu w "programie oceny uCT" (Rysunek 6A). Skopiuj ten kontur i wklej go na wszystkich wycinkach w defektu (Rysunek 6B).
        UWAGA: Ponieważ wszystkie wady zostały utworzone przy użyciu tej samej procedury, należy przeanalizować tę samą liczbę plastrów, a następnie całkowitą objętość (TV) dla wszystkich próbek.
  2. Kręg docelowy.
    UWAGA: Czas wynosi 10 - 20 minut na próbkę.
    1. Załaduj pliki DICOM zarówno kręgu docelowego, jak i referencyjnego do głównego okna oprogramowania do analizy obrazu.
      UWAGA: Aby uniknąć zmian wartości w skali szarości, w menu ładowania zdefiniuj ten sam typ danych wyjściowych, co oryginalne pliki DICOM.
    2. Zarejestruj się do kręgu referencyjnego.
      1. Uruchom moduł "3-D Voxel Registration" i wprowadź kręg referencyjny jako "Objętość podstawową", a kręg docelowy jako "Objętość dopasowania". Kliknij "Zarejestruj", aby zarejestrować kręgi (Rysunek 5).
    3. Zapisz zarejestrowany plik przy użyciu tego samego typu danych i zaimportuj go do środowiska μCT.
    4. Zastosuj VOI.
      1. Zastosuj VOI zdefiniowany dla kręgu referencyjnego do zarejestrowanego kręgu docelowego, klikając "program oceny uCT" → "Plik" → "Załaduj GOBJ" i wybierając wcześniej utworzony GOBJ. Sprawdź, czy VOI i wada są koncentryczne.

6. Analiza mikrotomografii komputerowej

UWAGA: Czas to 10 - 20 minut na próbkę.

  1. Wyślij VOI do oceny za pomocą programu ewaluacyjnego μCT (Rysunek 6).
    UWAGA: Upewnij się, że używasz tych samych parametrów podczas analizowania wszystkich VOI. Upewnij się, że próg jest ustawiony wystarczająco wysoko, aby pominąć szumy tła przy minimalnej utracie kości. Jeśli zostanie wykorzystany biomateriał nieprzepuszczający promieni rentgenowskich, można zastosować szereg strategii do analizy tworzenia się kości. Jeśli istnieje różnica w gęstości między biomateriałem a tkanką kostną, biomateriał można podzielić na segmenty35,36. W przeciwnym razie badacze mogliby jakościowo ocenić różnice w tworzeniu kości między grupami eksperymentalnymi.

7. Eutanazja

  1. Umieść szczura z osteoporozą w komorze indukcyjnej podłączonej do aparatu do znieczulenia. Wywołaj znieczulenie za pomocą 5% izofluranu w 100% tlenie.
  2. Utrzymuj znieczulenie przez stożek nosowy i przeprowadź eutanazję, nacinając jamę klatki piersiowej w celu wytworzenia obustronnej odmy opłucnowej37.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, można zobrazować i określić ilościowo regenerację n = 8 modelowanych osteoporotycznych wad kręgów w różnych punktach czasowych. Dopasowanie anatomiczne uzyskane w procedurze rejestracji pozwala na analizę tego samego VOI we wszystkich punktach czasowych. Skutkuje to bardzo dokładną podłużną analizą histomorfometryczną 3D, nawet jeśli marginesy pierwotnej wady nie są już rozpoznawalne. Użyliśmy pięciu punktów czasowych (dzień 1, tydzień 2, tydzień 4, tydzień 8...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoporoza jest najczęstszą przyczyną złamań kompresyjnych kręgów spowodowanych zwiększonym obciążeniem kręgosłupa, które skutkują zapadnięciem się trzonu kręgu. Jednak praktycznie niemożliwe jest wygenerowanie urazu u gryzonia, który autentycznie odtwarza podobny zapad kręgowy. Zamiast tego naukowcy tworzą cylindryczną pustkę w środku trzonu kręgu, aby naśladować OVCF 16,17,18,19,20,21,24,38,39.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te zostały wsparte grantem z Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (CIRM) (TR2-01780).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania były wspierane przez grant z Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (CIRM) (TR2-01780).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
IsofluraneMWI Animal Health, Pasadena, CA501017
BetadineSolutionMWI Animal Health, Pasadena, CA4677
Glukonian chlorheksydyny 2% peelingMWI Animal Health, Pasadena, CA510083
Alkohol izopropylowy 70%-kwartaMWI Animal Health, Pasadena, CA501044
CarprofenMWI Animal Health, Pasadena, CA26357
Buprenorfina 0,3 mg/mlMWI Animal Health, Pasadena, CA56163
Owariektomizowane nagie szczury atymiczneHarlan Laboratories, Indianapolis, INHsd:RH-Foxn1 rnu
Żywność o niskiej zawartości wapniaNewco Distributors, Inc., CA1814948 (5AV8 AIN-93M z niską wartością wapnia)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies Corporation
DermabondJ AND J ETHICONDHVM12
Aparat anestezjologicznyPatterson ScientificTEC 3EX
Komory indukcyjne z przesuwnym topemPatterson Scientific78917833
ProStation Podgrzewana stacja roboczaPatterson Scientific78914731
Serweta chirurgicznaHALYARD HEALTH INC89101
Magnetyczny system chowania stabilizatoraFine Science Tools, Inc., CA18200-50
Nożyczki preparacyjne, 10 cm, zakrzywione, SSWorld Precision Instruments, FL14394
Nożyczki do irysów, 11,5 cm, 45 ° Kąt, ząbkowany, ostry/ostryWorld Precision Instruments, kleszcze 503225
nr 5World Precision Instruments, FL555048FT
Kleszcze hemostatyczne Micro MosquitoWorld Precision Instruments, FL503360
Sterylna gaza bawełnianaMedtronic, MINNEAPOLIS, MN9024
Włócznie absorpcyjne - zamontowane/sterylneFine Science Narzędzia, CA18105-01
Strzykawka, 1 mLTERUMO TERUMO MEDSS-01T
Igła, 25 gaugeBD MED SYS INJECTION SYS
Okap z przepływem laminarnymBakerSterilGARD e3-Class II Type A2 Jednostka
kauteryzacji termicznejPrecision Instruments, FL501292
Micro-Drill OmniDrill115/230VWorld Precision Instruments, FL503598
Trephines do Micro Drill, średnica 2 mmFine Science Tools, CA18004-20
3-0 Vicryl niebarwiony 27" StożekSH J I J ETHICON1663G
4-0 Ethilon 18" PC3 Cięcie konwencjonalneJ I J ETHICON1954G
Stożek in vivo microCT (vivaCT 40)Scanco MedicalvivaCT 40
Pakiet oprogramowania SCANCO Medical microCTvivaCT 40
Obrazowaniebiomedyczne, Mayo Clinic, Rochester, MNAnalyze 12Oprogramowanie do analizy obrazu
Weteryneryjskamaść do oczu
14190250FL, 305127 World Scanco Medical Oprogramowanie do analizy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
  2. Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
  3. Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
  4. Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
  5. Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
  6. Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
  7. Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, Suppl 2. S27-S31 (1992).
  8. Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
  9. Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
  10. Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
  11. Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
  12. Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
  13. Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
  14. Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
  15. Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
  16. Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
  17. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
  18. Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
  19. Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
  20. Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
  21. Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
  22. Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
  23. Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
  24. Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
  25. Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
  26. Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, Suppl 4. 9-16 (2008).
  27. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  28. Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
  29. de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
  30. Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
  31. Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
  32. Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
  33. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
  34. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  35. de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
  36. Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
  37. Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
  38. Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
  39. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
  40. Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
  41. Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  42. Turner, A. S. Animal models of osteoporosis--necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Osteoporosis ModelVertebral FractureMicrocomputed TomographyBone RegenerationNude RatsLongitudinal ImagingSemiautomated AnalysisBone DefectBone Volume DensityApparent Density

Related Articles