Modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji kwaśnego kondycjonowania końcowego przeciwko niedokrwieniu mózgu

Podsumowanie

Kwaśne kondycjonowanie końcowe chroni przed niedokrwieniem mózgu. Poniżej przedstawiamy dwa modele do uruchamiania APC. Osiąga się je odpowiednio poprzez przeniesienie wycinków korowo-prążkowych do buforu kwaśnego po deprywacji tlenu i glukozy in vitro oraz przez wdychanie 20% CO₂ po niedrożności tętnicy środkowej mózgu in vivo.

Streszczenie

Udar mózgu jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności i niepełnosprawności na całym świecie, z ograniczonymi metodami terapeutycznymi. Jako endogenna strategia neuroprotekcji, terapie kondycjonujące okazały się obiecującymi terapiami przeciwko niedokrwieniu mózgu. Jednak skomplikowane procedury i potencjalne problemy z bezpieczeństwem ograniczają ich zastosowanie kliniczne. Aby przezwyciężyć te wady, opracowaliśmy kwaśne kondycjonowanie końcowe (APC) jako terapię eksperymentalnego ogniskowego niedokrwienia mózgu. APC odnosi się do łagodnego leczenia kwasicy poprzez wdychanie CO₂ podczas reperfuzji po niedokrwieniu. W tym miejscu przedstawiamy dwa modele do wykonywania APC odpowiednio in vitro i in vivo. Leczenie deprywacji tlenowo-glukozowej (OGD) myszy oraz okluzja korowo-prążkowa i niedrożność tętnic środkowych mózgu (MCAO) u myszy zastosowano w celu naśladowania niedokrwienia mózgu. APC można po prostu osiągnąć, przenosząc wycinki mózgu do kwaśnego buforu z pęcherzykami 20% CO_{2 lub} przez myszy wdychające 20% CO_{2 .} APC wykazywał znaczące działanie ochronne przed niedokrwieniem mózgu, co znalazło odzwierciedlenie w żywotności tkanek i objętości zawału mózgu.

Wprowadzenie

Udar mózgu jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności i niepełnosprawności na całym świecie. W ostatnich dziesięcioleciach podjęto ogromne wysiłki w celu znalezienia skutecznych metod leczenia udaru mózgu, jednak osiągnięcie to jest dość niezadowalające. Kondycjonowanie końcowe to proces, na który wpływają stresy subtoksyczne po epizodzie niedokrwiennym. Kondycjonowanie końcowe, w tym kondycjonowanie niedokrwienne, niedotlenieniowe, niskoglukozowe i odległe niedokrwienne, uruchamia endogenne mechanizmy adaptacyjne i udowodniono, że jest obiecującym terapią przeciwko niedokrwieniu mózgu^1,2,3,4. Jednak kondycjonowanie niedokrwienne może spowodować dodatkowe urazy. Kondycjonowanie niedokrwienne kończyn na odległość kończyny zwykle wymaga kilku cykli po 5 - 20 minut okluzji i reperfuzji na ipsilateralnych lub obustronnych kończynach tylnych^5,6,7. Dlatego te manipulacje po kondycjonowaniu są niebezpieczne lub niepraktyczne w praktyce klinicznej. Aby przezwyciężyć te wady, opracowaliśmy APC jako terapię ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy⁸. Wywołany po prostu przez wdychanie 20% CO₂ APC, APC znacznie zmniejsza niedokrwienne uszkodzenie mózgu w bardziej wykonalny i bezpieczniejszy sposób. Ostatnio udowodniliśmy, że APC wydłuża okno reperfuzji, podkreślając znaczenie APC w terapii udaru mózgu⁹.

Tutaj prezentujemy dwa eksperymentalne modele do badania neuroprotekcji APC przed niedokrwieniem mózgu. Pierwszym z nich jest model deprywacji tlenowo-glukozowej (OGD) w wycinkach korowo-prążkowych myszy. Szybkie przygotowanie i przeniesienie wycinków mózgu do sztucznego środowiska, zwykle sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ASCF), może utrzymać żywotność komórek i obwody neuronalne, co umożliwia badanie funkcji mózgu in vitro^10,11. OGD w ASCF naśladuje niedokrwienie mózgu i wywołuje uszkodzenie niedokrwienne^12,13,14. Po OGD wycinki mózgu są odświeżane w zwykłym ASCF (r-ASCF) w celu zapewnienia reperfuzji, a następnie traktowane APC przy użyciu kwaśnego ASCF z pęcherzykami 20% CO₂ . Wycinek korowo-prążkowy zachowuje nienaruszoną charakterystykę histologiczną w porównaniu z pierwotnymi komórkami hodowlanymi.

Do badania funkcji mózgu in vivo wykorzystuje się model mysiej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Tętnica środkowa mózgu jest blokowana przez wprowadzenie stępionej płomieniowo żyłki przez tętnicę szyjną wspólną. Jako jeden z najczęściej stosowanych modeli udarowych, model MCAO wykazuje znaczenie kliniczne, a zastosowanie monofilamentu ułatwia uzyskanie reperfuzji. Po prostu wdychając normoksyjną mieszaninę gazów zawierających 20% CO₂ po rozpoczęciu reperfuzji, APC wykazał znaczące działanie ochronne przed niedokrwieniem mózgu, na które wskazuje zmniejszona objętość zawału mózgu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi Komitetu Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Zhejiang i były w pełni zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować ból i dyskomfort, a także wykorzystano minimalną liczbę zwierząt.

1. OGD plastrów kortykostriiatalnych

1. Przygotowanie roztworu:
   1. Przygotować 1 000 ml r-ACSF (124 mmol/L, NaCl, 5 mmol/L KCl, 1,25 mmol/L KH₂PO₄, 2 mmol/L MgSO₄, 26 mmol/L NaHCO₃, 2 mmol/L CaCl₂, 10 mmol/L glukozy, końcowe pH 7,4). Bąbelkować 5% CO₂ i 95% O₂ przez cały eksperyment.
   2. Przygotować 200 ml bezglukozowego ACSF (gf-ACSF) jak powyżej, ale bez glukozy, z bąbelkami 5% CO₂ i 95% N₂ . Bąbelkować gazy przez 30 minut przed nałożeniem na plastry mózgu, aby zmniejszyć zawartość tlenu w roztworze. Kontynuuj bulgotanie, aż procedura OGD zostanie zakończona.
   3. Przygotować kwaśny ACSF (a-ACSF), równoważąc 200 ml r-ACSF z 20% CO₂ i 80% O_{2 .} Bąbelkować gazy przez 30 minut przed nałożeniem na plasterki mózgu, aby obniżyć pH roztworu do pH 6,8 i kontynuować bulgotanie, aż procedura APC zostanie zakończona.
   4. Umieść trzy uchwyty na tkanki odpowiednio w r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF.
2. Przygotowanie plastrów mózgu:
   Uwaga: W tym badaniu wykorzystano 8-tygodniowe samce myszy C57Bl / 6J. Zwierzęta trzymano w kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C), z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność oraz dostępem do granulowanego pokarmu i wody.
   1. Ofiarować mysz z przedawkowaniem izofluranu w komorze indukcyjnej. Odetnij głowę myszy. Wypreparuj mózg za pomocą małych nożyczek i kleszczy. Wyjmij mózg cienką szpatułką i ostrożnie wrzuć go do szklanej zlewki zawierającej lodowaty r-ACSF zrównoważony 5% CO₂ i 95% O₂,
      UWAGA: Te kroki należy wykonać tak szybko, ale skrupulatnie, jak to możliwe.
   2. Utrzymuj mózg w lodowatym r-ACSF przez 5 minut. Dostosuj ciśnienie gazu, aby uniknąć ruchów mózgu.
   3. Umieść klej krioprecypitacyjny na płytce wibratomu w dwóch paskach. Połóż kawałek 3% agarozy na pasku kleju z dala od ostrza, aby podeprzeć mózg.
   4. Odwróć 10-centymetrową szalkę Petriego na lodzie, a następnie połóż na niej bibułę filtracyjną. Zwilż bibułę filtracyjną kroplami lodowatego r-ACSF.
   5. Przenieś mózg na bibułę filtracyjną za pomocą kleszczy. Odetnij biegun czołowy i móżdżek ostrzem i kleszczami.
      UWAGA: Sekcje poprzeczne powinny być jak najbardziej gładkie i pionowe do płaszczyzny strzałkowej.
   6. Umieść pozostałą tkankę mózgową pionowo na drugim pasku kleju i utrzymuj mózg oparty o agarozę. Dodaj lodowaty r-ACSF do zbiornika tnącego, aby zanurzyć mózg i dodaj lód do obszaru uchwytu lodu. Utrzymuj r-ACSF w zbiorniku z bąbelkami 5% CO₂ i 95% O₂
   .
   7. Podnieś zbiornik i dostosuj położenie maszynki do golenia, aby umieścić maszynkę jak najbliżej mózgu i tuż nad mózgiem.
   8. Wybierz tryb "CONT", aby ciąć sekcje mózgu w sposób ciągły. Ustaw grubość cięcia na 400 μm, częstotliwość wibracji na 6 - 8, a prędkość na 3 - 4. Naciśnij przycisk "start/stop", aby rozpocząć automatyczne cięcie.
   9. Odetnij końcówkę pipety Pasteura o pojemności 3 ml, aby zrobić otwór pasujący do wielkości plasterków mózgu.
      UWAGA: Otwór powinien być wystarczająco duży, aby uniknąć dodatkowego uszkodzenia wycinków mózgu.
   10. Wyciągnij pięć wycinków mózgu jeden po drugim za pomocą pipety Pasteura z końcówką i umieść je w uchwycie na chusteczki w lodowatym r-ACSF z bąbelkami 5% CO₂ i 95% O_{2 .} Nie zbieraj pierwszego wyprodukowanego plasterka. Dostosuj ciśnienie gazu, aby uniknąć ruchów plasterków mózgu.
       UWAGA: Wycinki mózgu nie powinny się nawzajem zakrywać.
   11. Umieść plastry mózgu z r-ACSF w temperaturze pokojowej na 30 minut, a następnie w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej na kolejne 10 minut, aby odzyskać funkcje synaptyczne.
3. OGD i APC:
   1. Umieścić gf-ACSF i a-ACSF w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i bąbelkować odpowiednimi gazami, jak wspomniano powyżej w 1.1.2 i 1.1.3 przez 30 minut.
   2. Pozostaw jeden plasterek w r-ACSF jako kontrolkę. Ostrożnie przenieś pozostałe cztery wycinki mózgu do uchwytu na tkanki z podgrzanym gf-ACSF i inkubuj przez 15 minut. Przenieś plastry z powrotem do uchwytu na tkankę w r-ACSF, aby uzyskać reperfuzję.
   3. Aby zbadać okno czasowe APC, przenieś jeden wycinek bezpośrednio z gf-ACSF do a-ACSF. Najpierw przenieś pozostałe trzy wycinki do r-ACSF, a następnie przenieś dwie z nich do uchwytu na tkankę w a-ACSF odpowiednio 5 i 15 minut po reperfuzji.
   4. Inkubuj dwa plastry w a-ACSF przez 3 minuty, a następnie przenieś je z powrotem do r-ACSF. Inkubować trzy plastry w r-ACSF przez kolejną 1 godzinę. Ustaw pozostałe wycinki w r-ACSF jako grupę OGD.
   5. W przypadku badania zależności od dawki, należy przenieść wszystkie cztery wycinki do uchwytu na tkankę w r-ACSF najpierw po OGD i inkubować przez 5 minut. Następnie pozostaw jeden plasterek w r-ACSF jako grupę OGD i przenieś pozostałe trzy plasterki do a-ACSF. Inkubuj plastry w a-ACSF odpowiednio przez 1, 3 i 5 minut, a następnie przenieś je z powrotem do r-ACSF. Inkubować trzy plastry w r-ACSF przez kolejną 1 godzinę.
4. Określanie żywotności warstw:
   1. Przygotować 0,25% roztwór soli fizjologicznej chlorowodorku 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC). Dodać 1,25 g proszku TTC do 500 ml roztworu soli fizjologicznej.
      UWAGA: Po całkowitym rozpuszczeniu proszku przenieść roztwór na 24-dołkową płytkę (500 μl na studzienkę) pokrytą folią i przechowywać w temperaturze 4 °C. TTC i tkanka wybarwiona TTC są wrażliwe na światło.
   2. Przenieś plastry na 24-dołkową płytkę (po jednym plasterku na studzienkę) zawierającą roztwór TTC i rozciągnij plasterek w roztworze. Plastry inkubować w roztworze TTC w temperaturze 37 °C w płytkiej łaźni wodnej przez 30 minut.
   3. Przenieś plastry do czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml pokrytych folią i zmierz suchą masę plastrów.
   4. Dodać etanol/dimetylosulfotlenek (1:1) do probówek wirówkowych (v:w = 10:1) w celu ekstrakcji formazanu. Inkubować plastry w etanolu/dimetylosulfotlenku w temperaturze pokojowej z dala od światła przez 24 godziny.
   5. Dodać cały etanol/dimetylosulfotlenek z probówek do 96-dołkowej płytki i zmierzyć absorbancję przy 490 nm za pomocą czytnika płytek.
   6. Znormalizować absorbancję w stosunku do suchej masy wycinka i wyrazić żywotność jako procent wycinka kontrolnego.

2. MCAO

1. preparat:
   1. Zdezynfekuj stół warsztatowy, powierzchnię urządzenia do laserowego przepływomierza dopplerowskiego (LDF) i jego akcesoria 70% alkoholem etylowym.
   2. Przygotuj narzędzia autoklawowane: dwie nożyczki, 10 cm; dwa kleszcze, 10 cm; jeden kleszcz okulistyczny 11 cm; jeden mikro nożyczki okulistyczne, 9 cm; jeden zacisk do mikronaczyń, 1,8 cm; jeden napęd igły, r 12,5 cm; kilka szwów chirurgicznych (△ 1/2 4 × 10); waciki.
   3. Przygotować strzykawkę (bez igły) z roztworem soli fizjologicznej, aby utrzymać nawodnione miejsce operacji.
   4. Przygotuj gaz znieczulający (100%_O2 + izofluran).
2. Wykrywanie przepływu krwi w mózgu:
   1. Skonfiguruj instrument LDF.
   2. Leki przeciwbólowe należy wstrzykiwać dootrzewnowo myszy: metamizol 200 mg/kg, karprofen 4 mg/kg i buprenorfina 0,1 mg/kg.
   3. Umieść mysz w komorze indukcyjnej z 4% izofluranem w tlenie, aby znieczulić ją do momentu ustania spontanicznych ruchów ciała i wibrysów.
   4. Umieść mysz w pozycji leżącej z nosem dopasowanym do stożka nosa i utrzymuj izofluran na poziomie 1,5% do następnego zabiegu.
   5. Nałóż maść do oczu z dekspantenolem na oba oczy.
   6. Zdezynfekuj głowę 70% alkoholem etylowym.
   7. Wykonaj prawe nacięcie skóry przyśrodkowej między oczami a uszami za pomocą skalpela, aby odsłonić bregmę.
   8. Przetrzyj czaszkę sterylną bawełną.
   9. Nałóż jedną lub dwie krople kleju chirurgicznego na powierzchnię czaszki.
   10. Umieść końcówkę sondy światłowodowej 5 mm doogonowo do bregmy i 6 mm bocznie do linii środkowej.
   11. Rozpocznij rejestrowanie przepływu krwi w oprogramowaniu komputerowym. Poczekaj, aż pojawi się stabilna linia podstawowa przepływu krwi, a następnie nałóż katalizator o pojemności 20 μl na klej, aby zamocować sondę.
       UWAGA: Idealna linia bazowa powinna wynosić ponad 500 strumieni
   .
   12. Jeśli linia bazowa jest mniejsza niż 200 strumieni, dokładnie wyreguluj pozycję, aby uzyskać odpowiednią linię bazową. Trzymaj sondę przymocowaną do czaszki na czas trwania eksperymentu.
   13. Zdezynfekuj głowicę jodoforem po założeniu sondy światłowodowej.
3. MCAO:
   1. Umieść i zamocuj znieczuloną mysz (z sondą LDF przymocowaną do czaszki) w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj temperaturę ciała za pomocą lampy grzewczej przez cały czas trwania operacji. Zdezynfekuj szyję 70% alkoholem etylowym.
   2. Wykonaj przyśrodkowe nacięcie skóry na szyi za pomocą skalpela; tępo wypreparuj tkanki miękkie kleszczami, aby odsłonić naczynia. Dodaj jedną kroplę soli fizjologicznej do odsłoniętych tkanek, aby utrzymać je nawodnione.
   3. Wyciąć tętnicę szyjną wspólną z otaczającej tkanki i nerwu błędnego za pomocą kleszczy okulistycznych. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego. Ponownie zdezynfekuj skórę szyi jodoforem po odsłonięciu tętnicy szyjnej wspólnej.
   4. Umieść zacisk mikronaczynia na dystalnym końcu tętnicy szyjnej wspólnej, a następnie zawiąż martwy węzeł za pomocą jedwabnych szwów 6-0 na bliższym końcu. Umieść clamp jak najbardziej proksymalnie do kolejnych operacji. Upewnij się, że długość naczynia między zaciskiem a martwym węzłem jest jak najdłuższa dla kolejnych operacji.
   5. Wykonaj tymczasowy szew proksymalny do zacisku, zawiązując luźny węzeł. Upewnij się, że między dwoma węzłami jest wystarczająco dużo miejsca na włożenie żyłki.
   6. Wykonaj małe, podłużne nacięcie między dwoma węzłami za pomocą mikronożyczek okulistycznych. Upewnij się, że nacięcie znajduje się jak najbliżej martwego węzła dla kolejnych operacji. Uważaj, aby nie odciąć naczynia.
   7. Przełóż 12-milimetrową żyłkę z końcówką przez nacięcie, aby wejść do światła tętnicy i przesunąć ją o kilka mm. Zaciśnij luźny węzeł wokół końcówki żyłki, a następnie zdejmij zacisk.
   8. Wsuń włókno do tętnicy szyjnej wewnętrznej (10 mm, aby zamknąć tętnicę środkową mózgu) za pomocą kleszczyków okulistycznych, aż oprogramowanie LDF wykaże gwałtowny spadek (>80% zmniejszenie w stosunku do wyjściowego przepływu krwi). Zapisz czas rozpoczęcia okluzji.
      UWAGA: Konfiguracja przyrządu LDF jest opisana w sekcji 2.2.
   9. Niedrożność tętnicy środkowej mózgu na 1 godzinę. Odciąć sondę LDF i umieścić myszy w inkubatorze o temperaturze 30 °C na czas okluzji.
4. Reperfuzja i APC:
   1. Ponownie znieczulić zwierzęta izofluranem, jak opisano powyżej, 55 minut po rozpoczęciu okluzji. Umieść i unieruchom myszy w pozycji leżącej. Otwórz nacięcie szyi i ponownie odsłoń tętnicę szyjną wspólną.
   2. Delikatnie wyciągnij włókno za pomocą kleszczyków okulistycznych po okresie okluzji, aby uzyskać reperfuzję i zamień szew tymczasowy w stały, zaciskając węzeł.
   3. W leczeniu kwasicy należy zmienić gaz wdychany przez stożek nosowy na gaz mieszany zawierający 20% CO₂, 20% O₂ i 60% N₂ przez 5 minut po 5, 50 lub 100 minutach po reperfuzji. Zamknij nacięcie przerwanym szwem chirurgicznym.
   4. Umieść myszy w klatce grzewczej o temperaturze 30 °C, aż myszy odzyskają przytomność, a następnie zwróć myszy do czystych, oddzielnych klatek. Zapewnij myszom szalkę Petriego z wodą i zwilżonym pokarmem. Uważnie monitoruj myszy po operacji pod kątem nadmiernego bólu i śmierci.
5. Pomiar objętości zawału mózgu:
   1. Zmierz objętość zawału mózgu za pomocą barwienia TTC 24 godziny po reperfuzji.
   2. Przygotuj 0,25% roztwór TTC, jak wspomniano w kroku 1.4.1, przed wyznaczonym czasem ofiarowania. Przenieść roztwór na 24-dołkową płytkę (1 ml na studzienkę) pokrytą folią i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: TTC i tkanki barwione TTC są wrażliwe na światło.
   3. Po 24 godzinach od reperfuzji należy złożyć zwierzę z przedawkowaniem izofluranu w komorze indukcyjnej. Odetnij głowę myszom. Wypreparuj mózg za pomocą małych nożyczek i kleszczy. Zbadaj punkty krwi w mózgu, aby wykluczyć myszy, które przeszły krwotok podpajęczynówkowy w Kręgu Willisa.
   4. Umieść mózg na czystym szkiełku podstawowym na okładzie z lodu o temperaturze -20 °C. Umieść mózg i szkiełko w lodówce w temperaturze -20 °C na 5 minut, aby mózg był łatwiejszy do krojenia.
   5. Wyjmij mózg i szkiełko z -20 °C i umieść je z powrotem na okład z lodu o temperaturze -20 °C. Wypreparuj biegun czołowy i móżdżek za pomocą ostrza i kleszczy.
   6. Pokrój skrawki mózgu poziomo na grubość 1 mm za pomocą ostrza, aby uzyskać 5 plasterków. Przenieś plastry do 24-dołkowej płytki zawierającej roztwór TTC (1 plasterek na studzienkę) za pomocą kleszczyków i rozciągnij plastry w roztworze. Plastry inkubować w roztworze TTC w temperaturze 37 °C w płytkiej łaźni wodnej przez 30 minut.
   7. Zassać roztwór TTC. Dodać 10% formaldehydu (1 ml na studzienkę) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umieść plastry w kolejności, w jakiej zostały pocięte, na arkuszu celofanu i zeskanuj segmenty do aparatu fotograficznego.
   8. Przeanalizuj rozmiar zawału jako procent całego wycinka mózgu za pomocą oprogramowania do analizy ImageJ⁸w oparciu o identyfikację wizualną; patrz Rysunek 2 (po lewej).

Wyniki

W opisanym powyżej modelu wycinka korowo-prążkowiowego, żywotność warstwy korowo-prążkowej określono ilościowo za pomocą testu TTC po 1 godzinie od reperfuzji. Konwersję TTC obliczono poprzez normalizację absorpcji przy 490 nm do warstwy kontrolnej. Zgodnie z konwersją TTC, APC chronił przed uszkodzeniem reperfuzyjnym wywołanym przez OGD w sposób zależny od czasu wystąpienia i czasu trwania. W szczegółach, zarówno 1, jak i 3 minuty leczenia kwasicy znacznie poprawiły żywotność po 5 minuta...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy dwa modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji APC przed niedokrwieniem mózgu. W wycinkach mózgu APC uzyskuje się przez inkubację wycinków korowo-prążkowych myszy w kwaśnym buforze bąbelkowym z 20% CO₂ po rozpoczęciu reperfuzji, podczas gdy w modelu MCAO APC uzyskuje się przez wdychanie 20% CO₂ myszom po reperfuzji. Oba modele odzwierciedlają neuroprotekcję APC przed niedokrwieniem mózgu. Ochrona była porównywalna z ochroną uzyskaną przez kondycjonowanie niedokrwien...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu	Sigma	S5886
Chlorek potasu	Sigma	P5405
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma	P9791
Siarczan magnezu	Sigma	M2643
Wodorowęglan sodu	Sigma	S5761
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma	C5080
D-(+)-Glukoza	Sigma	G7021
Vibratome	Leica	VT1000 S
Chlorowodorek 2,3,5-trifenylotetrazolu	Sigma	T8877
Absolutny etanol	Aladdin Industrial Corporation	E111993
Dimetylosulfotlenek	Sigma	D8418
Laserowy Doppler Flowmetry	Moor Instruments Ltd	Model Moor VMS-LDF2
Eter dietylowy bezwodny	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	80059618
Hydrat taldehykulu trichlorooctowego	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	30037517
10% Formalina	Aladdin Industrial Corporation	F111936
płytki 24-dołkowe	Jet Biofil	TCP-010-024