Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Podsumowanie

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Streszczenie

Nicienie, zwarty układ nerwowy Caenorhabditis elegans, składający się zaledwie z 302 neuronów, kryją za sobą różnorodny repertuar zachowań. Aby ułatwić analizę obwodów neuronalnych leżących u podstaw tych zachowań, konieczne jest opracowanie solidnych i powtarzalnych testów behawioralnych. Poprzednie badania behawioralne C. elegans wykorzystywały warianty "testu kropli", "testu chemotaksji" i "testu retencji" w celu zbadania odpowiedzi C. elegans na rozpuszczalne związki. Metoda opisana w tym artykule ma na celu połączenie uzupełniających się zalet trzech wyżej wymienionych testów. Krótko mówiąc, mały okrąg pośrodku każdej płytki testowej jest podzielony na cztery ćwiartki, w których roztwory kontrolne i doświadczalne są umieszczane naprzemiennie. Po dodaniu robaków płytki testowe są ładowane do komory behawioralnej, w której kamery mikroskopowe rejestrują spotkania robaków z leczonymi obszarami. Następnie przeprowadzana jest automatyczna analiza wideo i generowana jest wartość indeksu preferencji (PI) dla każdego filmu. Funkcje akwizycji wideo i automatycznej analizy tej metody minimalizują zaangażowanie eksperymentatora i wszelkie związane z tym błędy. Co więcej, na test stosuje się niewielkie ilości eksperymentalnego związku, a konfiguracja wielu kamer w komorze behawioralnej zwiększa wydajność eksperymentalną. Metoda ta jest szczególnie przydatna do przeprowadzania behawioralnych badań przesiewowych mutantów genetycznych i nowych związków chemicznych. Jednak metoda ta nie jest odpowiednia do badania nawigacji gradientu bodźca ze względu na bliskie sąsiedztwo regionów roztworu kontrolnego i eksperymentalnego. Nie należy go również stosować, gdy dostępna jest tylko niewielka populacja robaków. Chociaż metoda ta jest odpowiednia do oznaczania odpowiedzi tylko na związki rozpuszczalne w obecnej postaci, można ją łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić multimodalną interakcję sensoryczną i badania optogenetyczne. Metodę tę można również dostosować do oznaczania odpowiedzi chemosensorycznych innych gatunków nicieni.

Wprowadzenie

Zwierzęta poszukujące pożywienia muszą zintegrować dane wejściowe z wielu modalności sensorycznych i wybrać odpowiednie strategie behawioralne, aby skutecznie poruszać się w swoim środowisku. Zrozumienie, w jaki sposób zewnętrzne bodźce sensoryczne są odbierane i przekształcane w informacje neuronowe w celu kierowania wyborem działań, jest głównym celem w dziedzinie neurobiologii. Genetycznie podatny nicień, C. elegans, jest atrakcyjnym organizmem modelowym, w którym można badać mechanizmy neuronalne leżące u podstaw biologii sensorycznej i integracji multimodalnej. Chociaż C. elegans ma tylko 302 neurony, może wykrywać i rozróżniać szeroką gamę bodźców środowiskowych, w tym rozpuszczalne związki, lotne substancje zapachowe i temperaturę otoczenia^{1,2,3,4,5,6,7}. Nicień C. elegans w dużym stopniu polega na swoim aparacie chemosensorycznym, aby zlokalizować źródła pożywienia i ostrzec się o potencjalnych zagrożeniach. W związku z tym testy behawioralne mające na celu badanie przesiewowe reakcji dzikich i zmutowanych C. elegans na bodźce chemiczne odgrywają kluczową rolę w analizie mechanizmów genetycznych, komórkowych i neuronalnych leżących u podstaw niezwykłych zdolności sensorycznych C. elegans.

Aby ocenić reakcję na rozpuszczalne związki, opisano trzy rodzaje testów - test kropli, test chemotaksji i test retencji. W teście upuszczania mała kropla związku jest umieszczana na ogonie poruszającego się robaka, a decyzja robaka o odwróceniu lub przesunięciu się do przodu, gdy płyn dotrze do przedniego aparatu czuciowego, jest oceniana⁴. Test upuszczania wymaga niewielkiego przygotowania eksperymentalnego i jest przydatny, gdy wielkość próbki robaków jest mała, jak w przypadku robaków sterowanych laserowo. Ponieważ jednak tylko jeden robak może być badany na raz, a eksperymentator musi być obecny przez cały czas trwania testu, test kroplowy może być czasochłonny. Test kroplowy jest również podatny na różnice w dostarczaniu kropli między każdym robakiem w próbce, co może mieć wpływ na ogólne wyniki testu. Innym ograniczeniem testu upuszczania jest to, że można go użyć tylko do zbadania reakcji robaka na związki awersyjne, ponieważ nie jest możliwe odróżnienie atrakcyjnego lub neutralnego efektu związku od ruchu robaka do przodu.

Test chemotaksji dla rozpuszczalnych związków zazwyczaj polega na podzieleniu płytki agarowej na cztery ćwiartki, przy czym eksperymentalny roztwór miesza się z agarem dwóch przeciwległych ćwiartek, a roztwór kontrolny miesza się z pozostałymi dwoma kwadrantami8^,9. Na początku testu kroplę buforu zawierającą robaki umieszcza się na środku płytki, a liczbę robaków w każdej ćwiartce ocenia się w różnych punktach czasowych. Test chemotaksji zapewnia większą moc statystyczną w porównaniu z testem kroplowym, ponieważ w każdym teście testowana jest duża liczba robaków. Jednak jednym z ograniczeń tej metody jest to, że przygotowanie płytek do testów chemotaksji wymaga dużych ilości doświadczalnego związku. Utrudni to przeprowadzanie badań przesiewowych zachowań na dużą skalę, jeśli do uzyskania interesującego związku wymagany jest skomplikowany proces oczyszczania o ograniczonej wydajności, jak w przypadku cząsteczek sygnałowych askarozydu¹⁰. Ponadto ręczne liczenie robaków w trakcie testu jest podatne na błędy, a perturbacja płytek podczas procesu liczenia może mieć wpływ na wyniki.

W przeciwieństwie do dwóch wyżej wymienionych metod, test retencji wykorzystuje widzenie maszynowe, co minimalizuje błędy podczas procesu oceniania i zmniejsza ingerencję eksperymentatora podczas testu¹¹. Komputerowa analiza nagrań wideo przedstawiających zachowanie robaków może również potencjalnie ujawnić subtelniejszą dynamikę behawioralną, która zostanie pominięta, gdy punktacja jest wykonywana tylko w kilku dyskretnych punktach czasowych. W teście retencji dodaje się dwie plamki roztworów po przeciwnych stronach małego okrągłego bakteryjnego plastra pokarmowego, a następnie umieszcza się niewielką liczbę robaków na środku plastra pokarmowego. Zachowanie robaków jest następnie nagrywane i analizowane, a wartość indeksu preferencji jest obliczana na podstawie całkowitej liczby pikseli robaka w każdym regionie rozwiązania. Chociaż obecność atrakcyjnej plamy pokarmowej umożliwia wykorzystanie mniejszych populacji robaków w każdym teście, wcześniej wykazano, że żywność uwrażliwia zachowania unikające na rozpuszczalne repelenty¹². Co więcej, robaki wykazują fotofobową reakcję na światło o krótkiej długości fali, a użycie mikroskopowych źródeł światła, które emitują białe światło w konfiguracji rejestracji zachowania, może wpływać na zachowanie¹³.

Celem metody omawianej w tym artykule jest zarejestrowanie i przeanalizowanie preferencji C. elegans dla rozpuszczalnych związków za pomocą testu populacyjnego. W tym celu obecna metoda integruje i ulepsza aspekty wszystkich trzech wcześniej omówionych metod. Umożliwia badanie dużych populacji robaków i wymaga użycia tylko niewielkich ilości roztworu doświadczalnego w każdym teście. Ponadto test jest przeprowadzany w specjalnie zbudowanej, zamkniętej komorze behawioralnej z podświetleniem LED na podczerwień, aby zminimalizować wpływ światła o krótkiej długości fali na zachowanie. Każda komora może być również wyposażona w wiele kamer mikroskopowych, co zwiększa przepustowość eksperymentalną bez uszczerbku dla miejsca na stole. Na koniec oprogramowanie do analizy wideo generuje wartość indeksu preferencji dla każdego filmu, a także towarzyszący mu wykres obecności robaków, aby zobrazować dynamikę zachowań populacji w czasie. Konfiguracja komory i protokół testu mogą być dalej modyfikowane w celu zbadania multimodalnych reakcji behawioralnych, takich jak wpływ substancji zapachowych lub temperatury na zachowania chemosensoryczne.

Ten artykuł opisuje konstrukcję komory behawioralnej i protokół testu. Wykazano również użyteczność tej metody w oznaczaniu odpowiedzi robaków typu dzikiego i mutantów z wadami chemosensorycznymi na znany rozpuszczalny repelent jony miedzi⁴. Na koniec szczegółowo opisany jest proces analizy wideo przy użyciu dostarczonego oprogramowania.

Protokół

1. Zgromadzenie Izby Zachowań

UWAGA: Komora behawioralna składa się z ramy w kształcie zbliżonego do sześcianu, wykonanej z ekstrudowanych aluminiowych prętów, pokrytej nieprzezroczystymi osłonami z tkaniny, z przezroczystym akrylowym dnem i wspornikami kamery. Połączenia między wytłaczanymi prętami aluminiowymi tworzącymi komorę behawioralną są prostopadłe i są zabezpieczone za pomocą wsporników narożnych w kształcie litery "L" (szerokość 1 cala z nogami 1 cala), które mocują jedną nogę wspornika narożnego do każdego pręta za pomocą i wsuwanych nakrętek teowych. Każde połączenie jest zabezpieczone jednym lub dwoma wspornikami narożnymi, jak opisano poniżej. Osłony tkaniny nad komorą są przymocowane do aluminiowych prętów ramy za pomocą tych samych i wsuwanych nakrętek teowych, ale przez przelotki w rogach tkaniny. są prawidłowo wkręcane w stronę z stożkowym wsuwanych nakrętek teowych, a nie w stronę z wystającą wargą. Podczas mocowania zespołu/nakrętki teowej do pręta aluminiowego, należy wsunąć nakrętkę teową w kanał po odpowiedniej powierzchni pręta tak, aby wystawał z rowka.

1. Przygotuj pokrowce z tkaniny.
   1. Za pomocą nożyczek przeciąć pięć kawałków nieprzezroczystej tkaniny poliestrowej, aby przykryć górę i cztery boki komory.
      1. Wytnij jeden kwadratowy arkusz materiału o wymiarach 14 x 14 cali² na górę komory. Wytnij cztery prostokątne arkusze tkaniny o wymiarach 11 x 14 cali² na boki komory.
   2. Zamontuj przelotki w rogach arkuszy tkaniny.
      1. Zaznacz linię odniesienia w odległości 0,5 cala od każdej krawędzi wszystkich pięciu arkuszy tkaniny poliestrowej za pomocą ołówka i prostej krawędzi.
      2. W przypadku czterech prostokątnych arkuszy użyj szczypiec do przelotek, aby wstawić przelotki wyśrodkowane w miejscu, w którym linie ołówka przecinają się w każdym rogu (to znaczy 4 przelotki na arkusz).
      3. W przypadku arkusza kwadratowego włóż dwie przelotki wzdłuż każdej krawędzi, przy czym każda przelotka jest wyśrodkowana na linii ołówka i umieszczona 1.5 cala od końca każdej z czterech linii ołówka (czyli w sumie 8 przelotek, po dwie w pobliżu każdego rogu).
   3. Włóż do każdego otworu przelotki i luźno przymocuj nakrętkę teową do każdego z nich.
2. Wyprodukuj listwy montażowe kamery.
   1. Użyj piły taśmowej lub jej odpowiednika, aby wyciąć jeden kawałek aluminiowej belki do wytłaczania o długości 2 cali dla każdej kamery, upewniając się, że odcięty koniec pręta jest prostopadły do długości pręta, aby ułatwić późniejszy montaż.
   2. Użyj wiertarki z wiertłem o średnicy 0.25 cala, aby wywiercić otwór przez środkowe środniki każdego pręta montażowego kamery, 0.75 cala od jednego końca, tak aby otwór był prostopadły do górnej i dolnej powierzchni i przechodził przez linię środkową pręta. Opcjonalnie wywierć otwór za pomocą ręcznej wiertarki elektrycznej z wiertłem 0.25 cala, ale upewnij się, że otwór jest prostopadły do górnej i dolnej powierzchni pręta.
3. Przygotuj wszystkie wsporniki narożne.
   1. Włóż przez otwór w każdej nodze wspornika narożnego, wkładając od wewnętrznej strony kątownika. Luźno nakręć nakrętkę teową na każdą.
4. Przygotuj zespół mocowania kamery (Rysunek 1B, warstwa 2).
   UWAGA: Zespół mocowania kamery to zespół w kształcie litery "H", który podtrzymuje trzy kabury na kamerę.
   1. Przymocuj pręty montażowe kamery do środkowego pręta zespołu mocowania kamery.
      1. Rozłóż trzy pręty mocujące kamerę wykonane w kroku 1.2 tak, aby wywiercone otwory były zorientowane pionowo. Wsuń dwa wsporniki narożne po bokach każdej belki montażowej na końcu najbardziej oddalonym od wywierconego otworu.
      2. Ustaw wsporniki narożne tak, aby nogi wsporników znajdowały się równo z końcem pręta i dokręć, aby zamocować na miejscu. Tworzy to kształt litery "T" z wywierconym otworem w dolnej części litery "T".
      3. Połóż profil aluminiowy o długości 1 stopy na powierzchni roboczej. Wsuń nakrętki teowe jednego zespołu pręta montażowego kamery (z poprzedniego kroku) na jedną stronę pręta o długości 1 stopy. Wyśrodkuj belkę montażową wzdłuż długości 1 stopy i dokręć, aby zamocować na miejscu. Wsuń pozostałe dwa pręty montażowe po przeciwnej stronie pręta o długości 1 stopy.
      4. Umieść dwa pręty w równej odległości od środka pręta o długości 1 stopy, tak aby ich wewnętrzne wsporniki narożne były oddalone od siebie o około 2.5 cala. Wsuń wsporniki narożne po bokach pręta o długości 1 stopy, po dwa na każdym końcu pręta. Ustaw wsporniki narożne tak, aby nogi wsporników zrównały się z końcami pręta i dokręć, aby zamocować na miejscu.
   2. Przymocuj pręty końcowe do pręta środkowego.
      1. Wsuń dwa aluminiowe profile o długości 1 stopy na nakrętki teowe na każdym końcu zespołu z poprzedniego kroku, tworząc kształt litery "H". Wyśrodkuj każdy pręt końcowy na drążku środkowym i zabezpiecz, dokręcając cztery.
      2. Wsuń cztery nawiasy narożne na górę dwóch prętów końcowych dodanych w poprzednim kroku, po jednym na każdym końcu każdego pręta. Ustaw wsporniki narożne tak, aby nogi wsporników znajdowały się równo z końcami prętów i dokręć, aby zamocować na miejscu.
   3. Przymocuj stojaki i kabury na kamerę do zespołu mocowania kamery.
      1. W przypadku każdego z trzech stojaków na aparat mikroskopowy wyjmij kaburę aparatu, poluzowując skrzydełkową i zsuwając się z pręta statywu.
      2. Dla każdego pręta montażowego kamery (teraz przymocowanego do środkowego pręta "H") umieść jedną podkładkę na z okrągłym, wsuń w górę przez wywiercony otwór w listwie montażowej kamery i umieść drugą podkładkę na. Nakręć gwintowany otwór pręta stojaka kamery w dół na, mocno dokręcając do pręta montażowego kamery.
      3. Powtórz kroki 14.3.2 dla pozostałych dwóch listew montażowych kamery.
      4. Wsuń kaburę na aparat na każdy pręt stojaka na kamerę, tak aby szerszy otwór był skierowany w stronę pręta montażowego kamery i przykręcił. Tymczasowo przymocuj kaburę do pręta statywu aparatu za pomocą skrzydełkowej kabury.
         UWAGA: Ostateczna pozycja robocza zostanie ustawiona w rozdziale 2.
5. Zmontuj ramę komory zachowania (Rysunek 1A).
   UWAGA: Aby ułatwić budowę, zmontuj ramę do góry nogami, zaczynając od "góry" ramy komory na powierzchni roboczej (Rysunek 1B, warstwa 1) i kierując się w górę w kierunku "stóp" ramy ( Rysunek 1B, warstwa 3).
   1. Aby zmontować górną warstwę komory behawioralnej, przymocuj cztery wytłaczane pręty aluminiowe o długości 1 stopy do kwadratowego arkusza poliestru (Rysunek 1B, warstwa 1).
      1. Wsuń jeden pręt na dwie nakrętki teowe wzdłuż każdej krawędzi arkusza tkaniny, centrując pręt wzdłuż szerokości tkaniny. Dokręć łączniki, aby przymocować arkusz tkaniny do każdego pręta.
      2. Rozłóż kwadratowy arkusz poliestru na powierzchni roboczej z czterema dołączonymi aluminiowymi prętami na górze. Wsuń osiem wsporników narożnych na górne powierzchnie czterech aluminiowych prętów, po jednym na każdym końcu każdego pręta. Umieść wsporniki narożne na prętach tak, aby pionowe nogi wsporników znajdowały się równo z końcami prętów. Zabezpiecz, dokręcając w nakrętkach teowych.
   2. Z kolei w każdym rogu ustaw dodatkowy profil aluminiowy o długości 1 stopy w pozycji pionowej, wsuwając profil na nakrętki teowe na dwóch nogach wspornika narożnego.
   3. Przymocuj pionową belkę do prętów poziomych, dokręcając łączniki, łącząc w ten sposób dwie sąsiednie pręty poziome.
      UWAGA: Po zakończeniu, osiem profili (cztery poziome i cztery pionowe) utworzy kwadratowy pierścień na stole z czterema słupkami wystającymi do góry (Rysunek 1B, warstwa 1).
   4. Wsuń luźne nakrętki teowe zespołu mocowania kamery w kształcie litery "H" od sekcji 1.4 w dół do słupków ramy z poprzedniego kroku. Pozwól, aby litera "H" zsunęła się do samego dołu, aby spocząć na wspornikach narożnych w każdym rogu ramy. Zamocuj zespół mocowania kamery na miejscu, dokręcając cztery wspornika narożnego.
   5. Zamontuj dolną warstwę komory za pomocą ostatnich czterech wytłaczanych prętów aluminiowych o długości 1 stopy (Rysunek 1B, warstwa 3).
      1. Wsuń po jednym wsporniku narożnym na każdy koniec każdego pręta o długości 1 stopy, ustaw wsporniki narożne tak, aby nogi wsporników zrównały się z końcami pręta i dokręć, aby zamocować na miejscu.
      2. Wsuń pręty między słupki ramy za pomocą luźnych nakrętek teowych w kanałach słupków. Ustaw pręty tak, aby górne krawędzie ich wsporników narożnych znajdowały się 1 cal poniżej otwartego końca słupków i zabezpiecz na miejscu, dokręcając wspornika narożnego.
6. Wsuń nakrętki teowe czterech prostokątnych arkuszy poliestru w dół do kanałów na pionowych prętach wytłaczanych, aby zakryć boki komory i dokręcić łączniki, aby zamocować na miejscu.
7. Wybierz jedną stronę, która ma być drzwiami umożliwiającymi dostęp do wnętrza komory i usuń dwie i nakrętki teowe w dolnej warstwie komory.
   UWAGA: Gdy rama zostanie obrócona do pionu, spód tej pokrywy będzie zwisał luźno u dołu i można go podnieść, aby uzyskać dostęp do wnętrza komory.
8. Umieść plastikową nasadkę na górnym końcu każdego elementu narożnego, aby służyła jako nóżki dla gotowej ramy. Obróć ramkę prawą stroną do góry. Włóż dwa uchwyty paneli z każdej strony do warstwy podstawowej ramy i przekręć, aby zamocować je na miejscu (Rysunek 1B, warstwa 3). Umieść kawałek przezroczystego akrylu o wymiarach 12 x 12 cali i^{rozmiarach 2} na wierzchu uchwytów panelu, aby zapewnić scenę dla płytek testowych (Rysunek 1B, warstwa 3).

2. Umiejscowienie szablonu kamery i sceny

1. Pobierz i zainstaluj na komputerze oprogramowanie do akwizycji wideo z kamery mikroskopowej ze strony producenta.
2. Wsuń kamerę mikroskopową do każdej z trzech kabur na aparat z optyką kamery skierowaną w dół w kierunku akrylowej sceny i podświetlenia. Podłącz aparaty do portów USB komputera. Umieść panel podświetlenia LED na podczerwień pod ramą, wyśrodkowany pod sceną. Podłącz panel podświetlenia, aby włączyć.
3. Wydrukuj dostarczone szablony umieszczania roztworu i wyrównania płyt na arkuszach przezroczystości (patrz Plik uzupełniający).
   UWAGA: W szablonie umieszczania roztworu okrąg obwodowy płyty ma średnicę 3,8 cm, a wewnętrzny okrąg obszaru zainteresowania ma średnicę 0,9 cm.
4. Wytnij wzdłuż linii siatki, aby uzyskać prostokątne przezroczyste kawałki otaczające okrągłe szablony.
5. Uruchom oprogramowanie do akwizycji wideo i kliknij ponumerowane miniatury w górnej części okna, aby wyświetlić kanały z kamer
.
6. Dostosuj wyrównanie i powiększenie kamery mikroskopu.
   1. Umieść szablon do wyrównywania płytki pod obiektywem kamery mikroskopowej (Rysunek 2B).
   2. Zmień odległość roboczą, przesuwając w pionie kaburę aparatu wzdłuż pręta stojaka na aparat i wyreguluj powiększenie aparatu, obracając pokrętło powiększenia aparatu, aż znaczniki numeru szablonu będą wyraźnie widoczne na krawędziach pola widzenia kamery.
   3. Przyklej szablon do wyrównywania płyt do stolika akrylowego.
   4. Umieść płytkę z próbką robaków na szablonie do wyrównywania płytki pod kamerą mikroskopu i dalej dopracowuj powiększenie i odległość roboczą, aż do uzyskania ostrego obrazu robaków, zachowując jednocześnie znaczniki liczbowe w polu widzenia.
   5. Powtórz kroki 2.6.1-2.6.4 dla pozostałych dwóch kamer mikroskopowych.

3. Wzrost i synchronizacja nicieni

1. Cztery dni przed eksperymentami wysiewaj dwadzieścia cztery płytki agarowe 60 mm pożywki do wzrostu nicieni (NGM) z 50 μl OP50 Escherichia coli w bulionie Luria-Bertani (LB) (przepis znajduje się w sekcji 5).
   UWAGA: Każda 60-milimetrowa płytka zapewni wystarczającą ilość robaków na jedną płytkę testową. Zaleca się uzyskanie sześciu powtórzeń na leczenie lub genotyp.
2. Pozostaw talerze z nasionami do wyschnięcia w pozycji pionowej z przykrytymi pokrywkami na noc w temperaturze pokojowej.
3. Następnego dnia przenieś piętnaście dobrze odżywionych grawitacyjnych hermafrodytów na każdą wysianą płytkę i pozwól robakom złożyć jaja przez sześć godzin. Daje to >360 jaj na talerzu.
4. Po 6 godzinach usunąć robaki z wysianych płytek i pozwolić potomstwu wyrosnąć na trzy dni dorosłe osobniki w temperaturze 20 °C.

4. Test preferencji chemosensorycznej

1. Dzień przed eksperymentem przygotuj płytki testowe z agarem o średnicy 35 mm NGM.
   1. Przygotuj 250 ml agaru NGM (przepis znajduje się w sekcji 5).
   2. Ułóż dwadzieścia osiem pustych talerzy o średnicy 35 mm w stosach po pięć lub mniej na płaskiej powierzchni. Napełnij każdą płytkę testową 5 ml agaru NGM. Pozostaw płytki testowe do wyschnięcia w pozycji pionowej z przykrytymi pokrywkami na noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Z reguły należy przygotować jedną dodatkową płytkę testową dla każdego zabiegu lub genotypu, który ma być badany w przypadku nieprzewidzianych okoliczności.
2. W dniu eksperymentu włącz podświetlenie, uruchom komputer i uruchom oprogramowanie do przechwytywania wideo z kamery mikroskopu.
3. Podłącz kamerę mikroskopową do komputera i dostosuj ustawienia nagrywania wideo.
   1. Kliknij ponumerowaną miniaturę kamery w górnej części okna oprogramowania, aby wyświetlić obraz na żywo z kamery.
   2. Rozwiń menu "Format wideo" w lewym górnym rogu obrazu z kamery i wybierz "MJPG 1280 x 1024". Rozwiń menu "Folder" obok menu "Format wideo" i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki wideo.
   3. Kliknij ikonę "Automatyczna ekspozycja" w prawym górnym rogu obrazu z kamery i wyłącz automatyczną ekspozycję. Kliknij ikonę "LED" znajdującą się bezpośrednio po prawej stronie ikony "Automatyczna ekspozycja", aby wyłączyć wbudowane diody LED kamery mikroskopu. Kliknij sąsiednią ikonę "Ustawienia": Wybierz "Monochromatyczny", zmaksymalizuj "Kontrast" i dostosuj "Jasność", aż robaki pojawią się wyraźnie z tła.
4. Obejrzyj filmy z kalibracją.
   1. Wyrównaj szablon umieszczania rozwiązania na szablonie wyrównania płyty stołu montażowego (Rysunek 2A). Kliknij ikonę nagrywania "Wideo poklatkowe" po lewej stronie obrazu z kamery i wprowadź "5" s dla czasu trwania i "1" s dla interwału, aby nagrać wideo trwające 5 sekund przy 1 klatce / s. Kliknij "Start", aby rozpocząć nagrywanie wideo.
5. Powtórz kroki opisane w 4.3 i 4.4 dla pozostałych dwóch kamer mikroskopowych.
6. Wyjmij szablon do umieszczania roztworu z komory.
7. Umyj robaki trzykrotnie buforem do mycia, aby usunąć jedzenie.
   1. Za pomocą szklanej pipety o pojemności 5 ml dodaj 1,2 ml buforu NGM do płytki ze zsynchronizowanymi robakami i delikatnie porusz płytkę, aby przemieścić robaki do buforu. Odpipetować bufor z płytki i dozować robaki w buforze do czystej probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Robaki są wrażliwe na odchylenia od stężenia soli agarowej w ich hodowli¹⁴. Aby zminimalizować zmiany stężenia soli agarowej po umieszczeniu robaków, zaleca się stosowanie buforu NGM do procesu mycia (przepis znajduje się w sekcji 5). Nie używaj plastikowych pipet do usuwania robaków z talerzy, ponieważ robaki przykleją się do boków. Przygotować liczbę probówek równoważną liczbie płytek do oznaczania, które mają być uruchamiane jednocześnie.
   2. Pozostaw trzy rurki na 1-2 minuty, aby robaki mogły osiąść na dnie. Użyj plastikowej końcówki pipety, aby usunąć jak najwięcej buforu do płukania z probówek, nie naruszając osadu zagnieżdżonych robaków na dnie probówek. Napełnij probówki po 1 ml czystego buforu NGM.
   3. Powtórz krok 4.7.2 raz.
8. Dodać 10 mM roztworów buforowych CuCl₂ i M13 do płytek testowych (przepisy znajdują się w sekcji 5).
   1. Przyklej szablon do umieszczania roztworu na stoliku mikroskopu preparacyjnego.
   2. Umieść pasek taśmy dwustronnej po obu stronach szablonu do wyrównywania płyty. Upewnij się, że taśma zachodzi na okrąg obwodowy płyty, ale nie zasłania obszaru zapisu w środku szablonu.
   3. Wyrównaj obwód płytki testowej z okręgiem na szablonie do wyrównywania płytki i dociśnij, aż szablon przylgnie do dna płytki. Wyrównaj znaczniki numeru szablonu płytki testowej ze znacznikami szablonu umieszczania roztworu na mikroskopie preparacyjnym.
   4. Użyj pipety P2 i plastikowej końcówki, aby umieścić po 1 μl buforu M13 w ćwiartkach 1 i 4 (Rysunek 2A). Użyj nowej końcówki, aby umieścić 1 μl 10 mM roztworu CuCl₂ każdy w ćwiartkach 2 i 3 (Rysunek 2A).
   5. Powtórzyć kroki 4.8.2–4.8.4 dla pozostałych dwóch płytek do oznaczania.
9. Gdy krople roztworu zostaną całkowicie wchłonięte przez agar, użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść umyte robaki z każdej probówki mikrowirówki na odpowiednią płytkę testową.
10. Umieść po jednej kropli robaków na obszarze powyżej i poniżej okrągłego leczonego obszaru. Złożyć chusteczkę cztery razy i użyć krawędzi, aby wchłonąć nadmiar buforu do płukania na wszystkich płytkach testowych.
11. Natychmiast ułóż trzy płytki testowe pod kamerami mikroskopowymi w komorze behawioralnej, wyrównując liczby w rogach szablonu. Odczekaj 2-3 minuty, aby robaki mogły zaaklimatyzować się na płytkach testowych.
    UWAGA: Upewnij się, że klapa drzwi komory zachowania jest zamknięta przed rozpoczęciem nagrywania wideo w następnym kroku.
12. Kliknij ikonę nagrywania "Wideo poklatkowe" po lewej stronie obrazu z kamery i wprowadź "10" min dla czasu trwania i "1" s dla interwału, aby nagrać 10-minutowy film z prędkością 1 klatki na sekundę. Kliknij "Start", aby rozpocząć nagrywanie wideo. Po nagraniu i zapisaniu filmów wyjmij płytki testowe z komory.
13. Powtórz kroki 4.7-4.12 dla następnej rundy płytek testowych. Należy uzyskać co najmniej sześć powtórzeń lub dwie rundy zapisu dla każdego produktu lub genotypu.

5. Przygotowanie odczynnika

1. Przygotować agar NGM i bufor.
   1. W szklanej butelce o pojemności 1 l dodaj 1,5 g chlorku sodu, 8,5 g agaru i 1,25 g peptonu. Do butelki dodaj 500 ml wody destylowanej i mieszadło. Butelka do autoklawu z zawartością.
   2. Umieść butelkę na talerzu mieszającym i włącz funkcję mieszania.
   3. Dodaj kolejno techniką sterylną: 0,5 ml 5 mg/ml cholesterolu, 0,5 ml 1 M chlorku wapnia, 0,5 ml 1 M siarczanu magnezu i 12,5 ml 1 M fosforanu potasu.
   4. Powtórz kroki od 5.1.1 do 5.1.2, aby utworzyć bufor NGM, ale pomiń agar i pepton w kroku 5.1.1.
2. Przygotuj bulion LB.
   1. W szklanej butelce o pojemności 1 l dodaj 5 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g chlorku sodu, 500 ml wody destylowanej i 0,5 ml 1 N wodorotlenku sodu. Butelka do autoklawu z zawartością.
3. Przygotuj bufor M13.
   1. W szklanej butelce o pojemności 1 l dodaj 1,817 g Tris, 2,922 g chlorku sodu, 0,373 g chlorku potasu i 500 ml wody destylowanej. Obudź butelkę z zawartością w autoklawie.
4. Przygotować roztwór chlorku miedzi (CuCl₂).
   1. Odważyć 0,134 g CuCl₂. Dodaj substancję rozpuszczoną do 10 ml buforu M13 w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać 100 mM CuCl₂ roztwór podstawowy. Odwróć plastikową rurkę, aż cała substancja rozpuszczona się rozpuści.
   2. Użyj strzykawki i filtra membranowego 0,2 μm do przefiltrowania, oczyść 100 mM roztwór CuCl₂ do czystej plastikowej probówki o pojemności 15 ml.
   3. Aby przygotować 10 mM roztworu CuCl₂, dodaj 900 μl buforu M13 i 100 μl 100 mM roztworu podstawowego CuCl₂ do probówki mikrowirówkowej. Odwróć probówkę mikrowirówki, aby dobrze wymieszać.

6. Analiza wideo

1. Pobierz Pythona 3 (https://www.python.org/downloads/) i bibliotekę oprogramowania OpenCV (http://opencv.org/downloads.html).
2. Pobierz trzy skrypty języka Python do analizy (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   UWAGA: Przed kontynuowaniem upewnij się, że wszystkie pliki wideo, które mają być używane, są w formacie mp4.
3. Aby wyświetlić opisy funkcji i parametrów, wpisz "help (wprowadź nazwę funkcji)" w konsoli i naciśnij Enter. Na przykład wpisz "help (kalibracja)" i naciśnij Enter.
4. Wykonaj funkcję kalibracji z parametrami wejściowymi, aby zdefiniować obszary zainteresowania wideo (ROI).
   1. Wprowadź nazwę pliku filmu kalibracyjnego wykonanego w sekcji 4 dla zmiennej 'mp4filename'. Umieść znaki cudzysłowu podczas wprowadzania nazwy pliku.
   2. Zacznij od wartości 600 i 360 dla zmiennych "Q*x" i "Q*y". *Wprowadź numery kwadrantów od 1 do 4. Zacznij od wartości 310 dla zmiennej "rad". Dostosuj wartości zmiennych, aż maski ROI zrównają się z konturami kwadrantu na szablonie.
   3. Zapisz łączną liczbę pikseli w każdym ROI, które zostaną wydrukowane w konsoli po wykonaniu tej funkcji. Wprowadź tę wartość dla parametru "ROI_size" w funkcji preference_index.
5. Wykonaj funkcję threshold_constant, aby określić odpowiednią stałą progową. Dostosuj "stałą" wartość, aż robaki (białe) będą wyraźnie widoczne, a w tle będzie minimalny dźwięk soli i pieprzu ().
6. Wykonaj funkcję preference_index, aby wygenerować arkusz danych w formacie csv, indeks preferencji wideo i towarzyszący mu wykres zajętości robaków.
   1. Użyj wartości "Q*x", "Q*y", "rad", "ROI_size" i "stałe" określonych w krokach 6.4 i 6.5 jako parametrów wejściowych dla funkcji preference_index.
      UWAGA: Dla każdej klatki wideo funkcja preference_index zlicza liczbę pikseli robaka w każdym ROI i oblicza procent pikseli robaka w całkowitej liczbie pikseli ROI. Następnie funkcja generuje wartość indeksu preferencji dla każdej klatki wideo przy użyciu formuły:
      
      UWAGA: Gdy program przeanalizuje wszystkie klatki w filmie, generowana jest średnia wartość indeksu preferencji dla filmu. Wykres zajętości robaka z indeksem preferencji wideo wydrukowanym na górze, a także arkusz danych csv zawierający piksel robaka, procentowe wartości zajętości robaka i indeks preferencji dla każdej klatki wideo zostaną zapisane w wyznaczonym folderze po zakończeniu działania programu.

Wyniki

Rysunek 3A pokazuje wartości indeksu preferencji uzyskane dla różnych par genotypów i leczenia. Wartość indeksu preferencji równa 1 wskazuje na silne przyciąganie do rozwiązania umieszczonego w eksperymentalnym ROI, podczas gdy wartość indeksu preferencji -1 wskazuje na silne odpychanie. Indeks preferencji 0,02 uzyskano, gdy roztwór buforowy M13 umieszczono zarówno w kontrolnym, jak i eksperymentalnym ROI, wykazując, że nie ma odchylenia przestrzennego w kierunku któregokolwiek z ROI. Robaki N2 zdecydowanie unikały jonów miedzi, co skutkowało indeksem preferencji -0,67, co potwierdza wcześniejsze ustalenia, że jony miedzi są silnym środkiem odstraszającym (Dodatkowy film 1)⁴. Mutanty osm-3, u których brakuje prawidłowego tworzenia dystalnych segmentów rzęsek czuciowych, wykazywały znacznie zmniejszone unikanie jonów miedzi (PI = -0,19)15. Mutanty ocr-2, które są wadliwe w wielu odpowiedziach nocyceptywnych za pośrednictwem ASH, w tym unikaniu miedzi, wykazują również znacznie zmniejszone unikanie, a nawet łagodne przyciąganie do jonów miedzi (PI = 0,19) (Film uzupełniający 2)¹⁶.

Rysunek 3B pokazuje reprezentatywne wykresy obecności robaków, które wskazują na gęstość robaków w grupie kontrolnej w porównaniu z eksperymentalnymi ROI w czasie w każdym filmie. Im ciemniejszy kolor obszaru kreślenia, tym większa liczba pikseli robaka w ROI. Wykres zajętości robaków N2 traktowanych kontrolą buforową M13 pokazuje, że liczba robaków w obu ROI pozostaje podobna w całym teście. Jednak wykres zajętości robaków N2 traktowanych jonami miedzi wskazuje, że robaki silnie i konsekwentnie unikają eksperymentalnego zwrotu z inwestycji przez cały czas trwania testu.

Rysunek 1: Zdjęcie i schematyczne przedstawienie projektu komory behawioralnej. (A) Widok z przodu konfiguracji komory behawioralnej (po lewej) i odpowiadające jej schematyczne przedstawienie ramy komory (po prawej). Nieprzezroczyste arkusze poliestru otaczają komorę ze wszystkich stron z wyjątkiem dolnej powierzchni, która przepuszcza światło z panelu podświetlenia na podczerwień. Numery 1, 2 i 3 odpowiadają warstwom wytłaczanym w (B). (B) Schemat widoku z góry warstw wytłaczania składających się na ramę komory zachowania. Obejmuje to górną warstwę (1), środkową warstwę montażową mocowania kamery (2) i dolną warstwę stolika (3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Szablony umieszczania roztworów i wyrównywania płyt. (A) Szablon umieszczania rozwiązania ma cztery ćwiartki i znaczniki wyrównania liczb. Roztwór kontrolny umieszcza się w lewym górnym i prawym dolnym kwadrancie, podczas gdy roztwór eksperymentalny umieszcza się w prawym górnym i lewym dolnym kwadrancie. (B) Szablon wyrównania płytki zawiera tylko znaczniki wyrównania numerycznego, aby zminimalizować okluzję robaków w polu widzenia podczas nagrywania i analizy wideo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykładowe dane zebrane za pomocą tego testu. (A) Wartości wskaźnika preferencji (PI) dla N2 typu dzikiego i zmutowanego C. elegans w odpowiedzi na bufor M13 i 10 mM CuCl₂. Robaki N2 nie wykazywały preferencji między kontrolnym a eksperymentalnym ROI, gdy roztwór kontrolny M13 został umieszczony w obu ROI, ale zdecydowanie unikały eksperymentalnego ROI, gdy umieszczono w nim jony miedzi (PI = odpowiednio 0,02 i -0,67). Mutanty OSM-3 (p802) i mutanty OCR-2 (AK47) wykazywały znacznie zmniejszone unikanie jonów miedzi w porównaniu z N2 (PI = odpowiednio -0,1 i 0,2). N = 6 testów dla każdej pary genotyp-traktowanie, >360 robaków na test, słupki błędów wskazują ± 1 S.E.M., ***p <0,001, jednoczynnikowa ANOVA, a następnie test Hoc Tukey Honestly Significant Difference (HSD) post hoc. (B) Reprezentatywne wykresy zajętości robaków dla robaków N2 z buforem M13 w obu ROI (u góry) i robaków N2 z buforem M13 w kontrolnym ROI i jonów miedzi w eksperymentalnym ROI (u dołu). Skala kolorów poniżej każdego wykresu zajętości reprezentuje liczbę pikseli robaka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Reakcja behawioralna robaków N2 na 10 mM Chlorku Miedzi. Robaki są przyciągane do kwadrantów kontrolnych z buforem M13 (lewy górny i prawy dolny róg), ale zdecydowanie unikają kwadrantów zawierających jony miedzi rozpuszczone w buforze M13 (prawy górny i lewy dolny róg). Wideo zostało nagrane z prędkością 1 klatki na sekundę i przyspieszone 15x. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 2: Reakcja behawioralna robaków ocr-2 (ak47) na 10 mM chlorku miedzi. Robaki wędrują w mniej więcej równym stopniu zarówno w kwadrantach kontrolnych z buforem M13 (u góry po lewej i u dołu po prawej), jak i w kwadrantach zawierających jony miedzi rozpuszczone w buforze M13 (u góry po prawej i na dole) przez cały czas nagrywania. Mutanty wykazują niewielką preferencję dla kwadrantów zawierających jony miedzi na początku nagrania. Wideo zostało nagrane z prędkością 1 klatki na sekundę i przyspieszone 15x. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający: Szablony rozmieszczania rozwiązań i wyrównywania płyt. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Kluczowym krokiem w protokole jest zapewnienie, że płytki testowe mają stały poziom suchości w różnych dniach doświadczalnych. Różne poziomy wysuszenia spowodują różne szybkości dyfuzji roztworu do agaru, a co za tym idzie, różnice w wynikach behawioralnych. W związku z tym płytki testowe powinny być zawsze świeże po południu przed eksperymentami. Liczba badanych robaków w jednym teście powinna być również regulowana w celu ułatwienia porównania między zabiegami. Dla porównania, robak typu dzikiego składa średnio 4-10 jaj / h, dając > 360 robaków na test, jeśli przestrzegany jest powyższy protokół synchronizacji robaków¹⁷. Jeśli niektóre zmutowane szczepy są wadliwe w składaniu jaj, wybierz bardziej ciężkie dorosłe robaki do składania jaj, aby osiągnąć docelową liczbę potomstwa. Kolejnym ważnym krokiem w protokole jest delikatne obchodzenie się z robakami podczas procesu mycia i umieszczania robaków. Robaki są wrażliwe na bodźce mechaniczne, które wywołują reakcje stresowe, takie jak odwrócenie i zahamowanie składania jaj¹⁸. Ponadto przed przystąpieniem do analizy wideo należy zadbać o dokładne zdefiniowanie zwrotu z inwestycji i określenie optymalnej wartości stałej progowej dla określonych warunków oświetleniowych. Zaleca się również powtórzenie procesów kalibracji i progowania, jeśli od przeprowadzenia ostatniego eksperymentu upłynęło dużo czasu.

Ograniczeniem tej metody jest to, że nie nadaje się ona do oznaczania małych populacji robaków. Jeśli jednak zostaną przeprowadzone odpowiednie kontrole w celu określenia wpływu obecności pokarmu na zachowanie sensoryczne, wówczas wykorzystanie pożywienia do ograniczenia przestrzennej lokalizacji eksploracyjnej robaków, tak jak w teście retencji, jest również możliwe w tej konfiguracji. Ponadto metoda ta nie jest przeznaczona do badania nawigacji gradientu bodźca ze względu na bliskie sąsiedztwo i niewielkie ilości zastosowanych kropli roztworu kontrolnego i doświadczalnego.

W przyszłości do tego systemu będzie można zintegrować oprogramowanie programistyczne, które umożliwia śledzenie wielu robaków i wyodrębnianie cech pojedynczych robaków^19,20. Rejestrowanie subtelnych parametrów zachowania pojedynczego robaka, takich jak prędkości odwrócenia i amplituda zgięć ciała, zapewni bardziej szczegółowy obraz zachowań chemosensorycznych poszczególnych robaków w kontekście testu populacyjnego. Test można również zmodyfikować w celu zbadania habituacji poprzez wiercenie otworów w ROI za pomocą igieł strzykawkowych o odpowiednim rozmiarze i wypełnianie otworów agarem z dodatkiem związku doświadczalnego lub buforu kontrolnego. Zapewni to bardziej spójne stężenie powierzchniowe związku przez dłuższy okres czasu rejestracji, co jest konieczne podczas badań habituacji. Innym potencjalnym zastosowaniem tej metody jest przeprowadzenie porównawczych badań zachowania różnych gatunków nicieni. Ponadto komora behawioralna może być modyfikowana na wiele sposobów, aby badać reakcje behawioralne na bodźce multimodalne. W przypadku zastosowań optogenetycznych obok mocowania kamery można przymocować matryce LED o wysokiej intensywności, aby selektywnie aktywować neurony będące przedmiotem zainteresowania podczas testu. Do zestawu można również dodać elementy grzejne, systemy chłodzenia i czujniki temperatury, aby badać wpływ temperatury na zachowania sensoryczne. Co więcej, wewnątrz komory można zainstalować systemy dostarczania zapachów w celu zbadania interakcji między modalnościami sensorycznymi i chemosensorycznymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aluminiowe profile ramowe z rowkiem T	McMaster-Carr	47065T101	Pojedynczy profil, rozmiar 1", pełne
Wsporniki	McMaster-Carr	47065T236	1" długie do wytłoczek jednoprofilowych o wysokości 1"
Kompaktowe łączniki końcowe	McMaster-Carr	47065T139	1" (pojedyncze), zestaw 4
Skręcane uchwyty do paneli pełnych	McMaster-Carr	47065T251	Do 1" wysokiej ekstruzji
Plastikowe zaślepki	McMaster-Carr	47065T91	Do 1" wysokiego wytłaczania
Optycznie przezroczysty odlew akrylowy	McMaster-Carr	8560K211	Grubość 3/16", 12" x 12"Tkanina
poliestrowa powlekana winylem	McMaster-Carr	88505K57	Grubość 0,027", szerokość 61",
Mosiężne przepusty	McMaster-Carr	9604K22	Rozmiar handlowy 0, 0,545" średnica zewnętrzna
Podkładki stalowe	McMaster-Carr	90107A029	Rozmiar 1/4"
z zaokrąglonym	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20 rozmiar gwintu, 1 - 1/2" długości
Standardowe podświetlenie operacyjne	Inteligentne światła wizyjne	Zobacz lokalnego dostawcę	8" x 8", podczerwień 850 nm
IVP-C1 Zmienna kontrola garnka	Inteligentne światła wizyjne	Zobacz lokalnego dostawcę
Zasilacz T1	Inteligentne światła wizyjne	Zobacz lokalnego sprzedawcę
Mikroskop cyfrowy Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite	Zobacz lokalnego dostawcę
Stojak na mikroskop MS09B	Mikroskop cyfrowy Dino-Lite	Zobacz lokalnego dostawcę