Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55963

⸱

13 lipca 2017

 ,  , 
1Division of Biology and Bioengineering, California Institute of Technology, 2Howard Hughes Medical Institute, California Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Streszczenie

Nicienie, zwarty układ nerwowy Caenorhabditis elegans, składający się zaledwie z 302 neuronów, kryją za sobą różnorodny repertuar zachowań. Aby ułatwić analizę obwodów neuronalnych leżących u podstaw tych zachowań, konieczne jest opracowanie solidnych i powtarzalnych testów behawioralnych. Poprzednie badania behawioralne C. elegans wykorzystywały warianty "testu kropli", "testu chemotaksji" i "testu retencji" w celu zbadania odpowiedzi C. elegans na rozpuszczalne związki. Metoda opisana w tym artykule ma na celu połączenie uzupełniających się zalet trzech wyżej wymienionych testów. Krótko mówiąc, mały okrąg pośrodku każdej płytki testowej jest podzielony na cztery ćwiartki, w których roztwory kontrolne i doświadczalne są umieszczane naprzemiennie. Po dodaniu robaków płytki testowe są ładowane do komory behawioralnej, w której kamery mikroskopowe rejestrują spotkania robaków z leczonymi obszarami. Następnie przeprowadzana jest automatyczna analiza wideo i generowana jest wartość indeksu preferencji (PI) dla każdego filmu. Funkcje akwizycji wideo i automatycznej analizy tej metody minimalizują zaangażowanie eksperymentatora i wszelkie związane z tym błędy. Co więcej, na test stosuje się niewielkie ilości eksperymentalnego związku, a konfiguracja wielu kamer w komorze behawioralnej zwiększa wydajność eksperymentalną. Metoda ta jest szczególnie przydatna do przeprowadzania behawioralnych badań przesiewowych mutantów genetycznych i nowych związków chemicznych. Jednak metoda ta nie jest odpowiednia do badania nawigacji gradientu bodźca ze względu na bliskie sąsiedztwo regionów roztworu kontrolnego i eksperymentalnego. Nie należy go również stosować, gdy dostępna jest tylko niewielka populacja robaków. Chociaż metoda ta jest odpowiednia do oznaczania odpowiedzi tylko na związki rozpuszczalne w obecnej postaci, można ją łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić multimodalną interakcję sensoryczną i badania optogenetyczne. Metodę tę można również dostosować do oznaczania odpowiedzi chemosensorycznych innych gatunków nicieni.

Wprowadzenie

Zwierzęta poszukujące pożywienia muszą zintegrować dane wejściowe z wielu modalności sensorycznych i wybrać odpowiednie strategie behawioralne, aby skutecznie poruszać się w swoim środowisku. Zrozumienie, w jaki sposób zewnętrzne bodźce sensoryczne są odbierane i przekształcane w informacje neuronowe w celu kierowania wyborem działań, jest głównym celem w dziedzinie neurobiologii. Genetycznie podatny nicień, C. elegans, jest atrakcyjnym organizmem modelowym, w którym można badać mechanizmy neuronalne leżące u podstaw biologii sensorycznej i integracji multimodalnej. Chociaż C. elegans ma tylko 302 neurony, może wykrywać i rozróżniać szeroką gamę bodźców środowiskowych, w tym rozpuszczalne związki, lotne substancje zapachowe i temperaturę otoczenia1,2,3,4,5,6,7. Nicień C. elegans w dużym stopniu polega na swoim aparacie chemosensorycznym, aby zlokalizować źródła pożywienia i ostrzec się o potencjalnych zagrożeniach. W związku z tym testy behawioralne mające na celu badanie przesiewowe reakcji dzikich i zmutowanych C. elegans na bodźce chemiczne odgrywają kluczową rolę w analizie mechanizmów genetycznych, komórkowych i neuronalnych leżących u podstaw niezwykłych zdolności sensorycznych C. elegans.

Aby ocenić reakcję na rozpuszczalne związki, opisano trzy rodzaje testów - test kropli, test chemotaksji i test retencji. W teście upuszczania mała kropla związku jest umieszczana na ogonie poruszającego się robaka, a decyzja robaka o odwróceniu lub przesunięciu się do przodu, gdy płyn dotrze do przedniego aparatu czuciowego, jest oceniana4. Test upuszczania wymaga niewielkiego przygotowania eksperymentalnego i jest przydatny, gdy wielkość próbki robaków jest mała, jak w przypadku robaków sterowanych laserowo. Ponieważ jednak tylko jeden robak może być badany na raz, a eksperymentator musi być obecny przez cały czas trwania testu, test kroplowy może być czasochłonny. Test kroplowy jest również podatny na różnice w dostarczaniu kropli między każdym robakiem w próbce, co może mieć wpływ na ogólne wyniki testu. Innym ograniczeniem testu upuszczania jest to, że można go użyć tylko do zbadania reakcji robaka na związki awersyjne, ponieważ nie jest możliwe odróżnienie atrakcyjnego lub neutralnego efektu związku od ruchu robaka do przodu.

Test chemotaksji dla rozpuszczalnych związków zazwyczaj polega na podzieleniu płytki agarowej na cztery ćwiartki, przy czym eksperymentalny roztwór miesza się z agarem dwóch przeciwległych ćwiartek, a roztwór kontrolny miesza się z pozostałymi dwoma kwadrantami8,9. Na początku testu kroplę buforu zawierającą robaki umieszcza się na środku płytki, a liczbę robaków w każdej ćwiartce ocenia się w różnych punktach czasowych. Test chemotaksji zapewnia większą moc statystyczną w porównaniu z testem kroplowym, ponieważ w każdym teście testowana jest duża liczba robaków. Jednak jednym z ograniczeń tej metody jest to, że przygotowanie płytek do testów chemotaksji wymaga dużych ilości doświadczalnego związku. Utrudni to przeprowadzanie badań przesiewowych zachowań na dużą skalę, jeśli do uzyskania interesującego związku wymagany jest skomplikowany proces oczyszczania o ograniczonej wydajności, jak w przypadku cząsteczek sygnałowych askarozydu10. Ponadto ręczne liczenie robaków w trakcie testu jest podatne na błędy, a perturbacja płytek podczas procesu liczenia może mieć wpływ na wyniki.

W przeciwieństwie do dwóch wyżej wymienionych metod, test retencji wykorzystuje widzenie maszynowe, co minimalizuje błędy podczas procesu oceniania i zmniejsza ingerencję eksperymentatora podczas testu11. Komputerowa analiza nagrań wideo przedstawiających zachowanie robaków może również potencjalnie ujawnić subtelniejszą dynamikę behawioralną, która zostanie pominięta, gdy punktacja jest wykonywana tylko w kilku dyskretnych punktach czasowych. W teście retencji dodaje się dwie plamki roztworów po przeciwnych stronach małego okrągłego bakteryjnego plastra pokarmowego, a następnie umieszcza się niewielką liczbę robaków na środku plastra pokarmowego. Zachowanie robaków jest następnie nagrywane i analizowane, a wartość indeksu preferencji jest obliczana na podstawie całkowitej liczby pikseli robaka w każdym regionie rozwiązania. Chociaż obecność atrakcyjnej plamy pokarmowej umożliwia wykorzystanie mniejszych populacji robaków w każdym teście, wcześniej wykazano, że żywność uwrażliwia zachowania unikające na rozpuszczalne repelenty12. Co więcej, robaki wykazują fotofobową reakcję na światło o krótkiej długości fali, a użycie mikroskopowych źródeł światła, które emitują białe światło w konfiguracji rejestracji zachowania, może wpływać na zachowanie13.

Celem metody omawianej w tym artykule jest zarejestrowanie i przeanalizowanie preferencji C. elegans dla rozpuszczalnych związków za pomocą testu populacyjnego. W tym celu obecna metoda integruje i ulepsza aspekty wszystkich trzech wcześniej omówionych metod. Umożliwia badanie dużych populacji robaków i wymaga użycia tylko niewielkich ilości roztworu doświadczalnego w każdym teście. Ponadto test jest przeprowadzany w specjalnie zbudowanej, zamkniętej komorze behawioralnej z podświetleniem LED na podczerwień, aby zminimalizować wpływ światła o krótkiej długości fali na zachowanie. Każda komora może być również wyposażona w wiele kamer mikroskopowych, co zwiększa przepustowość eksperymentalną bez uszczerbku dla miejsca na stole. Na koniec oprogramowanie do analizy wideo generuje wartość indeksu preferencji dla każdego filmu, a także towarzyszący mu wykres obecności robaków, aby zobrazować dynamikę zachowań populacji w czasie. Konfiguracja komory i protokół testu mogą być dalej modyfikowane w celu zbadania multimodalnych reakcji behawioralnych, takich jak wpływ substancji zapachowych lub temperatury na zachowania chemosensoryczne.

Ten artykuł opisuje konstrukcję komory behawioralnej i protokół testu. Wykazano również użyteczność tej metody w oznaczaniu odpowiedzi robaków typu dzikiego i mutantów z wadami chemosensorycznymi na znany rozpuszczalny repelent jony miedzi4. Na koniec szczegółowo opisany jest proces analizy wideo przy użyciu dostarczonego oprogramowania.

Protokół

1. Montaż komory behawioralnej

UWAGA: Komora behawioralna składa się z ramy o kształcie zbliżonym do sześcianu, wykonanej z profili aluminiowych, przykrytej nieprzezroczystymi osłonami z tkaniny, z przezroczystym akrylowym dnem oraz wspornikami do kamer. Połączenia między profilami aluminiowymi tworzącymi komorę behawioralną są prostopadłe i zabezpieczone za pomocą kątowników w kształcie litery „L” (szerokość 1 cal, ramiona 1 cal), które mocują każde ramię kątownika do profilu za pomocą śrub i wsuwanych nakrętek T. Każkie połączenie jest zabezpieczone jednym lub dwoma kątownikami, zgodnie z opisem poniżej. Osłony z tkaniny na komorze są przymocowane do profili aluminiowej ramy za pomocą tych samych śrub i wsuwanych nakrętek T, lecz przez przelotki w rogach tkaniny. Śruby należy wprowadzać prawidłowo w stronę zrowCountem (zatapianą) wsuwanych nakrętek T, a nie w stronę z wystającym kołnierzem. Podczas mocowania zestawu śruby i nakrętki T do profilu aluminiowego, należy wsunąć nakrętkę T do kanału na odpowiedniej ściance profilu tak, aby łeb śruby wystawał poza szczelinę.

  1. Przygotowanie osłon z tkaniny.
    1. Używając nożyczek, wytnij pięć kawałków nieprzezroczystej tkaniny poliestrowej, aby pokryć górę i cztery boki komory.
      1. Wytnij jeden kwadratowy arkusz tkaniny o wymiarach 14 x 14 inch2 na górę komory. Wytnij cztery prostokątne arkusze tkaniny o wymiarach 1 x 14 inch2 na boki komory.
    2. Zamontuj przelotki w narożnikach arkuszy tkaniny.
      1. Wyznacz linię pomocniczą 0,5 inch od każdej krawędzi wszystkich pięciu arkuszy tkaniny poliestrowej, używając ołówka i linijki.
      2. W przypadku czterech prostokątnych arkuszy, użyj kleszczy do przelotek, aby wstawić przelotki w miejscach przecięcia się linii ołówka w każdym narożniku (tj. 4 przelotki na arkusz).
      3. W przypadku arkusza kwadratowego, wstaw dwie przelotki wzdłuż każdej krawędzi, tak aby każda przelotka znajdowała się na linii ołówka w odległości 1,5 inch od końca każdej z czterech linii (łącznie 8 przelotek, po dwie w pobliżu każdego narożnika).
    3. Włóż śrubę w każdy otwór przelotki i luźno przymocuj do każdej z nich nakrętkę T.
  2. Wykonanie prętów mocowania kamery.
    1. Używając piły taśmowej lub zamiennika, odetnij jeden kawałek aluminiowego profilu o długości 2 inch dla każdej kamery, upewniając się, że cięcie jest prostopadłe do długości pręta, aby ułatwić późniejszy montaż.
    2. Używając wiertarki stołowej z wiertłem o średnicy 0,25 inch, wywierć otwór przez środkowe ścianki każdego pręta mocującego kamerę, 0,75 inch od jednego z końców, tak aby otwór był prostopadły do górnej i dolnej powierzchni i przechodził przez linię środkową pręta. Opcjonalnie otwór można wywiercić za pomocą ręcznej wiertarki elektrycznej z wiertłem 0,25 inch, dbając jednak o to, aby otwór był prostopadły do górnej i dolnej powierzchni pręta.
  3. Przygotowanie wszystkich wsporników narożnych.
    1. Włóż śrubę przez otwór w każdym ramieniu wspornika narożnego, wkładając śrubę od strony kąta wewnętrznego. Luźno nakręć nakrętkę T na każdą śrubę.
  4. Przygotowanie zespołu mocującego kamerę (Rycina 1B, warstwa 2).
    UWAGA: Zespół mocujący kamerę to konstrukcja w kształcie litery „H”, która podtrzymuje trzy uchwyty kamer.
    1. Przymocuj pręty mocujące kamerę do pręta środkowego zespołu mocującego.
      1. Rozłóż trzy pręty mocujące wykonane w kroku 1.2, orientując wywiercone otwory pionowo. Nasuń dwa wsporniki narożne na boki każdego pręta mocującego na końcu najdalej oddalonym od otworu.
      2. Ustaw wsporniki narożne tak, aby ich ramiona przylegały do końca pręta, i dokręć śruby, aby je zabezpieczyć. Tworzy to kształt litery „T” z otworem w dolnej części „T”.
      3. Połóż profil aluminiowy o długości 1 foot na powierzchni roboczej. Nasuń nakrętki T jednego zespołu pręta mocującego (z poprzedniego kroku) na jeden bok pręta o długości 1 foot. Wycentruj pręt mocujący wzdłuż długości pręta 1 foot i dokręć śruby. Nasuń pozostałe dwa pręty mocujące na przeciwną stronę pręta 1 foot.
      4. Ustaw dwa pręty w równych odstępach od środka pręta 1 foot, tak aby ich wewnętrzne wsporniki narożne były oddalone od siebie o około 2,5 inch. Nasuń wsporniki narożne na boki pręta 1 foot, po dwa na każdym końcu. Ustaw wsporniki tak, aby ich ramiona przylegały do końców pręta, i dokręć śruby.
    2. Przymocuj pręty końcowe do pręta środkowego.
      1. Nasuń dwa profile aluminiowe o długości 1 foot na nakrętki T na każdym końcu zespołu z poprzedniego kroku, tworząc kształt litery „H”. Wycentruj każdy pręt końcowy względem pręta środkowego i zabezpiecz, dokręcając cztery śruby.
      2. Nasuń cztery wsporniki narożne na górną część dwóch prętów końcowych dodanych w poprzednim kroku, po jednym na każdym końcu każdego pręta. Ustaw wsporniki tak, aby ich ramiona przylegały do końców prętów, i dokręć śruby.
    3. Przymocuj statywy i uchwyty kamer do zespołu mocującego.
      1. W przypadku każdego z trzech statywów kamer mikroskopowych zdejmij uchwyt kamery, luzując śrubę kciukową i zsuwając go z pręta statywu.
      2. Dla każdego pręta mocującego (teraz zabezpieczonego do pręta środkowego litery „H”), nałóż jedną podkładkę na śrubę z okrągłym łbem, przełóż śrubę przez wywiercony otwór w pręcie mocującym i nałóż drugą podkładkę od góry. Wkręć gwintowany otwór pręta statywu na śrubę, dokręcając go mocno do pręta mocującego.
      3. Powtórz kroki 14.3.2 dla dwóch pozostałych prętów mocujących.
      4. Nasuń uchwyt kamery na każdy pręt statywu, orientując szerszy otwór w stronę pręta mocującego i śruby. Tymczasowo zabezpiecz uchwyt na pręcie statywu za pomocą śruby kciukowej uchwytu.
        UWAGA: Końcową pozycję roboczą ustali się w sekcji 2.
  5. Montaż ramy komory behawioralnej (Rycina 1A).
    UWAGA: Dla ułatwienia konstrukcji, montuj ramę do góry nogami, zaczynając od „góry” ramy komory na powierzchni roboczej (Rycina 1B, warstwa 1) i kierując się ku „stopom” ramy (Rycina 1B, warstwa 3).
    1. Aby zmontować górną warstwę komory behawioralnej, przymocuj cztery aluminiowe profile o długości 1 foot do kwadratowego arkusza poliestrowego (Rycina 1B, warstwa 1).
      1. Wsuń jeden pręt na dwie nakrętki T wzdłuż każdej krawędzi arkusza tkaniny, centrując pręt wzdłuż szerokości tkaniny. Dokręć elementy mocujące, aby przymocować arkusz tkaniny do każdego pręta.
      2. Rozłóż kwadratowy arkusz poliestrowy na powierzchni roboczej z czterema przymocowanymi profilami aluminiowymi na górze. Nasuń osiem wsporników narożnych na górne powierzchnie czterech profili aluminiowych, po jednym na każdym końcu każdego pręta. Ustaw wsporniki na prętach tak, aby ich pionowe ramiona przylegały do końców prętów. Zabezpiecz, dokręcając śruby w nakrętkach T.
    2. Kolejno w każdym narożniku ustaw pionowo dodatkowy profil aluminiowy o długości 1 foot, nasuwając go na nakrętki T na dwóch ramionach wspornika narożnego.
    3. Zabezpiecz pionowy pręt do prętów poziomych, dokręcając elementy mocujące, łącząc w ten sposób dwa sąsiednie pręty poziome.
      UWAGA: Po zakończeniu osiem profili (cztery poziome i cztery pionowe) utworzy na stole kwadratowy pierścień z czterema wystającymi pionowo słupkami (Rycina 1B, warstwa 1).
    4. Wsuń luźne nakrętki T zespołu mocującego kamerę w kształcie litery „H” z sekcji 1.4 w dół do pionowych elementów ramy z poprzedniego kroku. Pozwól, aby litera „H” zsunęła się całkowicie i spoczęła na wspornikach narożnych w każdym narożniku ramy. Zabezpiecz zespół mocujący w miejscu, dokręcając cztery śruby wsporników narożnych.
    5. Zmontuj dolną warstwę komory, używając ostatnich czterech aluminiowych profili o długości 1 foot (Rycina 1B, warstwa 3).
      1. Nasuń jeden wspornik narożny na każdy koniec każdego pręta 1 foot, ustawiając wsporniki tak, aby ich ramiona przylegały do końców pręta, i dokręć śruby.
      2. Wsuń pręty pomiędzy pionowe elementy ramy, z luźnymi nakrętkami T w kanałach pionowych elementów. Ustaw pręty tak, aby górne krawędzie ich wsporników narożnych znajdowały się 1 inch poniżej otwartego końca elementów pionowych, i zabezpiecz, dokręcając śruby wsporników narożnych.
  6. Wsuń nakrętki T czterech prostokątnych arkuszy poliestrowych w kanały pionowych prętów, aby pokryć boki komory, i dokręć elementy mocujące, aby je zabezpieczyć.
  7. Wybierz jedną stronę jako drzwi do wnętrza komory i wyjmij dwie śruby i nakrętki T w dolnej warstwie komory.
    UWAGA: Po postawieniu ramy w pozycji pionowej, dół tej osłony będzie luźny i będzie można go podnieść, aby uzyskać dostęp do wnętrza komory.
  8. Nałóż plastikową zaślepkę na górny koniec każdego elementu narożnego, aby służyły jako stopki dla gotowej ramy. Odwróć ramę do właściwej pozycji. Wstaw dwa uchwyty paneli na każdą stronę wewnątrz dolnej warstwy ramy i przekręć, aby je zabezpieczyć (Rycina 1B, warstwa 3). Połóż kawałek przezroczystego akrylu o wymiarach 12 x 12 inch2 na uchwytach paneli, aby stworzyć podstawę dla płytek analitycznych (Rycina 1B, warstwa 3).

2. Pozycjonowanie szablonu kamery i stolika

  1. Pobrać i zainstalować na komputerze oprogramowanie do akwizycji wideo z kamery mikroskopowej ze strony internetowej producenta.
  2. Wsunąć kamerę mikroskopową do każdego z trzech uchwytów na kamery, kierując optykę kamery w dół, w stronę akrylowego stołu i podświetlenia tylnego. Podłączyć kamery do portów USB komputera. Umieścić panel podświetlenia tylnego LED na podczerwień pod ramą, centrując go pod stołem. Podłączyć panel podświetlenia tylnego, aby go włączyć.
  3. Wydrukować dostarczone szablony rozmieszczenia roztworów i wyrównywania płytek na arkuszach przezroczystych (patrz Plik uzupełniający).
    UWAGA: Na szablonie rozmieszczenia roztworów okrąg obrysowy płytki ma średnicę 3,8 cm, a wewnętrzny okrąg obszaru zainteresowania ma średnicę 0,9 cm.
  4. Wyciąć wzdłuż linii siatki, aby uzyskać prostokątne kawałki folii przezroczystej zawierające okrągłe szablony.
  5. Uruchomić oprogramowanie do akwizycji wideo i kliknąć ponumerowane miniatury u góry okna, aby wyświetlić obrazy z kamer.
  6. Dostosować ustawienie i powiększenie kamery mikroskopowej.
    1. Umieścić szablon wyrównywania płytek pod obiektywem kamery mikroskopowej (Rysunek 2B).
    2. Zmienić odległość roboczą, przesuwając pionowo uchwyt kamery wzdłuż pręta statywu, oraz dostosować powiększenie kamery, obracając pokrętło powiększenia, aż markery numeryczne szablonu staną się wyraźnie widoczne na krawędziach pola widzenia kamery.
    3. Przykleić szablon wyrównywania płytek do akrylowego stołu za pomocą taśmy.
    4. Umieścić próbkową płytkę z nicieniami na szablonie wyrównywania płytek pod kamerą mikroskopową i dalej doprecyzować powiększenie oraz odległość roboczą, aż do uzyskania ostrego obrazu nicieni, zachowując jednocześnie markery numeryczne w polu widzenia.
    5. Powtórzyć kroki 2.6.1-2.6.4 dla dwóch pozostałych kamer mikroskopowych.

3. Wzrost i synchronizacja nicieni

  1. Na cztery dni przed eksperymentami zaszczep dwadzieścia cztery 60-mm szalki z agarem NGM (Nematode Growth Media), nakładając 50 µL Escherichia coli szczepu OP50 w bulionie Luria-Bertani (LB) (przepis znajduje się w sekcji 5).
    UWAGA: Każda szalka 60-mm dostarczy wystarczającą liczbę nicieni dla jednej szalki testowej. Zaleca się przygotowanie sześciu powtórzeń dla każdego wariantu traktowania lub genotypu.
  2. Pozostaw zaszczepione szalki do wyschnięcia w pozycji pionowej z zamkniętymi pokrywkami, przez noc w temperaturze pokojowej.
  3. Następnego dnia przenieś piętnaście dobrze odżywionych, ciążących hermafrodytów na każdą zaszczepioną szalkę i pozwól nicieniom składać jaja przez sześć godzin. Pozwoli to uzyskać >360 jaj na szalkę.
  4. Po 6 h usuń nicienie z zaszczepionych szalek i pozwól potomstwu rozwijać się przez trzy dni do stadium dorosłego w temperaturze 20 °C.

4. Test preferencji chemosensorycznych

  1. Dzień przed eksperymentem należy przygotować 35 mm płytki agarowe NGM do analizy.
    1. Przygotować 250 mL agaru NGM (przepis znajduje się w sekcji 5).
    2. Ułożyć dwadzieścia osiem pustych płytek 35 mm w stosy po maksymalnie pięć sztuk na płaskiej powierzchni. Napełnić każdą płytkę 5 mL agaru NGM. Pozostawić płytki do wyschnięcia w pozycji pionowej z zamkniętymi pokrywkami przez noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Jako ogólną zasadę, dla każdego badanego wariantu lub genotypu należy przygotować jedną dodatkową płytkę na wypadek nieprzewidzianych zdarzeń.
  2. W dniu eksperymentu włączyć podświetlenie, uruchomić komputer i uruchomić oprogramowanie do przechwytywania wideo z kamery mikroskopu.
  3. Podłączyć kamerę mikroskopu do komputera i dostosować ustawienia nagrywania wideo.
    1. Kliknąć ponumerowaną miniaturkę kamery w górnej części okna oprogramowania, aby wyświetlić obraz na żywo z kamery.
    2. Rozwinąć menu „Video Format” w lewym górnym rogu obrazu z kamery i wybrać „MJPG 1280 x 1024”. Rozwinąć menu „Folder” obok menu „Video Format” i wybrać folder, w którym mają być zapisywane pliki wideo.
    3. Kliknąć ikonę „Auto Exposure” w prawym górnym rogu obrazu z kamery i wyłączyć automatyczną ekspozycję. Kliknąć ikonę „LED” bezpośrednio po prawej stronie ikony „Auto Exposure”, aby wyłączyć wbudowane diody LED kamery mikroskopu. Kliknąć sąsiednią ikonę „Settings”: wybrać „Monochrome”, ustawić maksymalny „Contrast” i dostosować „Brightness”, aż nicienie będą wyraźnie odróżniać się od tła.
  4. Nagrać filmy kalibracyjne.
    1. Dopasować szablon rozmieszczenia roztworów do szablonu wyrównania płytek na stoliku (Rysunek 2A). Kliknąć ikonę nagrywania „Time-Lapsed Video” po lewej stronie obrazu z kamery i wprowadzić „5” s jako czas trwania oraz „1” s jako interwał, aby nagrać 5 s wideo w tempie 1 klatka/s. Kliknąć „Start”, aby rozpocząć nagrywanie wideo.
  5. Powtórzyć kroki 4.3 i 4.4 dla dwóch pozostałych kamer mikroskopu.
  6. Usunąć szablon rozmieszczenia roztworów z komory.
  7. Przemyć nicienie trzykrotnie buforem do przemywania, aby usunąć pożywkę.
    1. Używając szklanej pipety 5 mL, dodać 1,2 mL buforu NGM na płytkę zsynchronizowanymi nicieniami i delikatnie potrząsnąć płytką, aby przemieścić nicienie do buforu. Pobrać bufor z płytki i przelać nicienie w buforze do czystej probówki do mikrocentryfugi.
      UWAGA: Nicienie są wrażliwe na odchylenia od stężenia soli w agarze hodowlanym14. Aby zminimalizować zmiany stężenia soli w agarze po umieszczeniu nicieni, zaleca się stosowanie buforu NGM do procesu przemywania (przepis w sekcji 5). Do usuwania nicieni z płytek nie należy używać plastikowych pipet, ponieważ nicienie przywierają do ścianek. Przygotować taką liczbę probówek, jaka odpowiada liczbie płytek do analizy wykonywanych jednocześnie.
    2. Pozostawić trzy probówki na 1-2 min, aby nicienie opadły na dno. Używając plastikowego końcówki do pipety, usunąć z probówek jak najwięcej buforu do przemywania, nie zakłócając osadu zagregowanych nicieni na dnie probówek. Ponownie napełnić probówki, dodając do każdej 1 mL czystego buforu NGM.
    3. Powtórzyć krok 4.7.2 raz jeszcze.
  8. Dodać roztwory 10 mM CuCl2 oraz buforu M13 na płytki do analizy (przepisy w sekcji 5).
    1. Przymocować taśmą szablon rozmieszczenia roztworów na stoliku mikroskopu stereoskopowego.
    2. Nakleić pasek dwustronnej taśmy po obu stronach szablonu wyrównania płytek. Upewnić się, że taśma nachodzi na okrąg obrysu płytki, ale nie zasłania centralnego obszaru zainteresowania (ROI) na szablonie.
    3. Dopasować obrys płytki do analizy do okręgu na szablonie wyrównania płytek i docisnąć, aż szablon przylgnie do dna płytki. Dopasować znaczniki numerów szablonu płytki do analizy do znaczników szablonu rozmieszczenia roztworów na mikroskopie stereoskopowym.
    4. Używając pipety P2 z plastikową końcówką, nanieść 1 µL buforu M13 w kwadrantach 1 i 4 (Rysunek 2A). Używając nowej końcówki, nanieść 1 µL roztworu 10 mM CuCl2 w kwadrantach 2 i 3 (Rysunek 2A).
    5. Powtórzyć kroki 4.8.2–4.8.4 dla dwóch pozostałych płytek do analizy.
  9. Po całkowitym wchłonięciu kropel roztworu przez agar, za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieść przemyte nicienie z każdej probówki do mikrocentryfugi na odpowiednią płytkę do analizy.
  10. Umieścić kroplę nicieni odpowiednio w obszarze powyżej i poniżej okrągłego regionu traktowanego. Złożyć chusteczkę czterokrotnie i użyć krawędzi do wchłonięcia nadmiaru buforu do przemywania ze wszystkich płytek do analizy.
  11. Niezwłocznie ustawić trzy płytki do analizy pod kamerami mikroskopu w komorze behawioralnej, dopasowując numery w narożnikach szablonów. Odczekać 2-3 min, aby nicienie zaaklimatyzowały się na płytkach do analizy.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem nagrywania wideo w następnym kroku upewnić się, że klapa drzwi komory behawioralnej jest zamknięta.
  12. Kliknąć ikonę nagrywania „Time-Lapsed Video” po lewej stronie obrazu z kamery i wprowadzić „10” min jako czas trwania oraz „1” s jako interwał, aby nagrać 10 min wideo w tempie 1 klatka na sekundę. Kliknąć „Start”, aby rozpocząć nagrywanie wideo. Po nagraniu i zapisaniu filmów usunąć płytki z komory.
  13. Powtórzyć kroki 4.7–4.12 dla kolejnej serii płytek do analizy. Pozyskać co najmniej sześć powtórzeń lub dwie serie nagrań dla każdego wariantu lub genotypu.

5. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotowanie agaru NGM i buforu.
    1. Do szklanej butelki o pojemności 1 L dodać 1,5 g chlorku sodu, 8,5 g agaru oraz 1,25 g peptonu. Do butelki wlać 50 mL wody destylowanej i włożyć mieszadło magnetyczne. Butelkę wraz z zawartością poddać autoklawowaniu.
    2. Butelkę umieścić na mieszalce i włączyć funkcję mieszania.
    3. Stosując techniki sterylne, dodać kolejno: 0,5 mL cholesterolu (5 mg/mL), 0,5 mL chlorku wapnia (1 M), 0,5 mL siarczanu magnezu (1 M) oraz 12,5 mL fosforanu potasu (1 M).
    4. Powtórzyć kroki od 5.1.1 do 5.1.2 w celu przygotowania buforu NGM, pomijając dodanie agaru i peptonu w kroku 5.1.1.
  2. Przygotowanie pożywki LB.
    1. Do szklanej butelki o pojemności 1 L dodać 5 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g chlorku sodu, 50 mL wody destylowanej oraz 0,5 mL wodorotlenku sodu (1 N). Butelkę wraz z zawartością poddać autoklawowaniu.
  3. Przygotowanie buforu M13.
    1. Do szklanej butelki o pojemności 1 L dodać 1,817 g Tris, 2,92 g chlorku sodu, 0,373 g chlorku potasu oraz 50 mL wody destylowanej. Butelkę wraz z zawartością poddać autoklawowaniu.
  4. Przygotowanie roztworu chlorku miedzi (CuCl2).
    1. Odważyć 0,134 g CuCl2. Substancję rozpuścić w 10 mL buforu M13 w plastikowej probówce o pojemności 15 mL, aby przygotować roztwór stokowy CuCl2 o stężeniu 10 mM. Odwracać probówkę do czasu całkowitego rozpuszczenia substancji.
    2. Za pomocą strzykawki i filtra membranowego 0,2 µm przefiltrować roztwór CuCl2 10 mM do czystej plastikowej probówki o pojemności 15 mL.
    3. Aby przygotować roztwór CuCl2 10 mM, dodać 90 µL buforu M13 oraz 100 µL roztworu stokowego CuCl2 10 mM do probówki do mikrocentryfugi. Odwracać probówkę, aby dokładnie wymieszać składniki.

6. Analiza wideo

  1. Pobierz język Python 3 (https://www.python.org/downloads/) oraz bibliotekę oprogramowania OpenCV (http://opencv.org/downloads.html).
  2. Pobierz trzy skrypty Python do analizy (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
    UWAGA: Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie pliki wideo, które będą wykorzystywane, są w formacie mp4.
  3. Aby wyświetlić opisy funkcji i parametrów, wpisz w konsoli „help(nazwa funkcji)” i naciśnij enter. Na przykład wpisz „help(calibration)” i naciśnij enter.
  4. Uruchom funkcję kalibracji z parametrami wejściowymi w celu zdefiniowania obszarów zainteresowania (ROI) w obrazie wideo.
    1. Wprowadź nazwę pliku filmu kalibracyjnego nagranego w sekcji 4 dla zmiennej 'mp4filename'. Podczas wprowadzania nazwy pliku użyj cudzysłowu.
    2. Zacznij od wartości 60 i 360 dla zmiennych „Q*x” i „Q*y”. Wprowadź numery kwadrantów od 1 do 4. Zacznij od wartości 310 dla zmiennej „rad”. Dostosuj wartości zmiennych, aż maski ROI pokryją się z konturami kwadrantów na szablonie.
    3. Zanotuj całkowitą liczbę pikseli w każdym ROI, która zostanie wyświetlona w konsoli po uruchomieniu tej funkcji. Wartość tę wprowadź jako parametr 'ROI_size' w funkcji preference_index.
  5. Uruchom funkcję threshold_constant, aby wyznaczyć odpowiednią stałą progowania. Dostosuj wartość parametru 'constant' tak, aby nicienie (białe) były wyraźnie widoczne, a w tle (czarnym) występowała minimalna ilość szumu typu „sól i pieprz”.
  6. Uruchom funkcję preference_index, aby wygenerować arkusz danych w formacie csv, indeks preferencji filmu oraz towarzyszący wykres zajętości nicieni.
    1. Wartości „Q*x”, „Q*y”, „rad”, „ROI_size” oraz „constant” wyznaczone w krokach 6.4 i 6.5 należy wykorzystać jako parametry wejściowe dla funkcji preference_index.
      UWAGA: Dla każdej klatki wideo funkcja preference_index zlicza liczbę pikseli odpowiadających nicieniom w każdym ROI i oblicza procentowy udział pikseli nicieni w całkowitej liczbie pikseli ROI. Następnie funkcja generuje wartość indeksu preferencji dla każdej klatki wideo, korzystając z następującego wzoru:
      Wzór na wskaźnik preferencji (PI) do analizy behawioralnej nicieni; równanie matematyczne stosowane w badaniach.
      UWAGA: Po przeanalizowaniu przez program wszystkich klatek w filmie generowana jest średnia wartość indeksu preferencji dla całego nagrania. Po zakończeniu działania programu w wyznaczonym folderze zostaną zapisane: wykres zajętości nicieni z wydrukowanym u góry indeksem preferencji dla filmu oraz arkusz danych w formacie csv zawierający wartości pikseli nicieni, procentowej zajętości nicieni oraz indeks preferencji dla każdej klatki filmu.

Wyniki

Rysunek 3A przedstawia wartości indeksu preferencji uzyskane dla różnych par genotypów i zastosowanych zabiegów. Wartość indeksu preferencji równa 1 wskazuje na silne przyciąganie do roztworu umieszczonego w eksperymentalnym ROI, natomiast wartość -1 wskazuje na silne odpychanie. Wartość indeksu preferencji wynosząca 0,02 została uzyskana, gdy roztwór buforu M13 umieszczono zarówno w kontrolnym, jak i eksperymentalnym ROI, co dowodzi braku stronniczości przestrzennej względem któregokolwiek z ROI. Nicie N2 silnie unikały jonów miedzi, co zaowocowało indeksem preferencji wynoszącym -0,67, co potwierdza wcześniejsze ustalenia, że jony miedzi są silnym repelentem (Supplementary Movie 1)4. Mutanty osm-3, u których nie dochodzi do prawidłowego sformowania dystalnych segmentów rzęsek sensorycznych, wykazały znacznie zmniejszone unikanie jonów miedzi (PI = -0,19)15. Mutanty ocr-2, u których występuje defekt wielu odpowiedzi nocyceptywnych zależnych od neuronów ASH, w tym unikanie miedzi, również wykazują znacznie zmniejszone unikanie, a nawet słabe przyciąganie do jonów miedzi (PI = 0,19) (Supplementary Movie 2)16.

Rysunek 3B przedstawia reprezentatywne wykresy zajętości nicieni, które wskazują gęstość nicieni w obszarach ROI kontrolnych i eksperymentalnych w czasie dla każdego filmu. Im ciemniejszy kolor obszaru wykresu, tym większa liczba pikseli odpowiadających nicieniom w ROI. Wykres zajętości dla nicieni N2 traktowanych kontrolnym buforem M13 pokazuje, że liczba nicieni w obu obszarach ROI pozostaje podobna przez cały czas trwania testu. Natomiast wykres zajętości dla nicieni N2 traktowanych jonami miedzi wskazuje, że nicienie silnie i konsekwentnie unikają eksperymentalnego ROI przez cały czas trwania testu.

Schemat konfiguracji mikroskopu do śledzenia komórek z kamerami, aluminiową ramą i panelem podświetlenia.
Rysunek 1: Zdjęcie i schematyczna reprezentacja konstrukcji komory behawioralnej. (AWidok z przodu konfiguracji komory behawioralnej (po lewej) oraz odpowiadający jej schematyczny rysunek ramy komory (po prawej). Nieprzezroczyste arkusze poliestrowe otaczają komorę ze wszystkich stron z wyjątkiem dolnej ścianki, która przepuszcza światło z panelu podświetlenia podczerwienią. Numery 1, 2 i 3 odpowiadają warstwom ekstruzji w punkcie (B).B) Schemat widoku z góry warstw ekstruzyjnych tworzących ramę komory pomiarowej. Obejmuje on warstwę górną (1), środkową warstwę zespołu mocowania kamery (2) oraz dolną warstwę podstawy (3). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat kwadrantów kontrolnych i eksperymentalnych; konfiguracja mikroskopowa do analizy porównawczej.
Rysunek 2: Szablony do dozowania roztworów i wyrównywania płytek. (A) Szablon do nanoszenia roztworów posiada cztery kwadranty oraz markery wyrównania numerów. Roztwór kontrolny nanosi się w kwadrantach górnym lewym i dolnym prawym, natomiast roztwór eksperymentalny w kwadrantach górnym prawym i dolnym lewym. (BSzablon do wyrównywania płytek posiada jedynie markery wyrównawcze w postaci numerów, aby zminimalizować zasłanianie nicieni w polu widzenia podczas rejestracji i analizy wideo. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres indeksu preferencji oraz mapa ciepła szeregów czasowych porównująca genotypy w warunkach traktowania Cu²⁺.
Rysunek 3: Przykład danych zebranych za pomocą tego testu. (AWartości indeksu preferencji (PI) dla typu dzikiego N2 oraz mutantów C. elegans w odpowiedzi na bufor M13 oraz 10 mM CuCl2Nematody *C. elegans* nie wykazały preferencji między kontrolnymi a eksperymentalnymi obszarami zainteresowania (ROI), gdy w obu ROI umieszczono roztwór kontrolny M13, natomiast silnie unikały eksperymentalnego ROI, gdy znajdowały się w nim jony miedzi (PI odpowiednio 0,02 i -0,67). osm-3 (p802) mutanty i ocr-2 (ak47) mutanty wykazały istotnie zmniejszone unikanie jonów miedzi w porównaniu z N2 (PI = odpowiednio -0,1 i 0,2). N= 6 analiz dla każdej pary genotyp-metoda traktowania, >360 nicieni na analizę, słupki błędów oznaczają ± 1 S.E.M., ***p <0,01, jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA), po której zastosowano test post-hoc Tukeya (HSD). (B) Reprezentatywne wykresy zajętości nicieni dla nicieni N2 z buforem M13 w obu ROI (góra) oraz dla nicieni N2 z buforem M13 w ROI kontrolnym i jonami miedzi w ROI eksperymentalnym (dół). Skala kolorów pod każdym wykresem zajętości reprezentuje liczbę pikseli nicieni. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Odpowiedź behawioralna nicieni N2 na 10 mM chlorku miedzi. Nicienie są przyciągane do kwadrantów kontrolnych z buforem M13 (lewy górny i prawy dolny), lecz silnie unikają kwadrantów zawierających jony miedzi rozpuszczone w buforze M13 (prawy górny i lewy dolny). Nagranie wideo wykonano w tempie 1 klatki na sekundę, a następnie przyspieszono 15-krotnie. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 2: Reakcja behawioralna ocr-2 (ak47) Robaki do 10 mM chlorku miedzi. Robaki przemieszczają się w zbliżonym stopniu zarówno w kwadrantach kontrolnych z buforem M13 (lewy górny i prawy dolny), jak i w kwadrantach zawierających jony miedzi rozpuszczone w buforze M13 (prawy górny i lewy dolny) przez cały czas trwania rejestracji. Mutanty wykazują lekką preferencję wobec kwadrantów zawierających jony miedzi na początku rejestracji. Wideo nagrywano z częstotliwością 1 klatki na sekundę i przyspieszono 15-krotnie. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający: Szablony rozmieszczenia roztworów i wyrównania płytek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Kluczowym krokiem w protokole jest zapewnienie, że płytki testowe mają stały poziom suchości w różnych dniach doświadczalnych. Różne poziomy wysuszenia spowodują różne szybkości dyfuzji roztworu do agaru, a co za tym idzie, różnice w wynikach behawioralnych. W związku z tym płytki testowe powinny być zawsze świeże po południu przed eksperymentami. Liczba badanych robaków w jednym teście powinna być również regulowana w celu ułatwienia porównania między zabiegami. Dla porównania, robak typu dzikiego składa średnio 4-10 jaj / h, dając > 360 robaków na test, jeśli przestrzegany jest powyższy protokół synchronizacji robaków17. Jeśli niektóre zmutowane szczepy są wadliwe w składaniu jaj, wybierz bardziej ciężkie dorosłe robaki do składania jaj, aby osiągnąć docelową liczbę potomstwa. Kolejnym ważnym krokiem w protokole jest delikatne obchodzenie się z robakami podczas procesu mycia i umieszczania robaków. Robaki są wrażliwe na bodźce mechaniczne, które wywołują reakcje stresowe, takie jak odwrócenie i zahamowanie składania jaj18. Ponadto przed przystąpieniem do analizy wideo należy zadbać o dokładne zdefiniowanie zwrotu z inwestycji i określenie optymalnej wartości stałej progowej dla określonych warunków oświetleniowych. Zaleca się również powtórzenie procesów kalibracji i progowania, jeśli od przeprowadzenia ostatniego eksperymentu upłynęło dużo czasu.

Ograniczeniem tej metody jest to, że nie nadaje się ona do oznaczania małych populacji robaków. Jeśli jednak zostaną przeprowadzone odpowiednie kontrole w celu określenia wpływu obecności pokarmu na zachowanie sensoryczne, wówczas wykorzystanie pożywienia do ograniczenia przestrzennej lokalizacji eksploracyjnej robaków, tak jak w teście retencji, jest również możliwe w tej konfiguracji. Ponadto metoda ta nie jest przeznaczona do badania nawigacji gradientu bodźca ze względu na bliskie sąsiedztwo i niewielkie ilości zastosowanych kropli roztworu kontrolnego i doświadczalnego.

W przyszłości do tego systemu będzie można zintegrować oprogramowanie programistyczne, które umożliwia śledzenie wielu robaków i wyodrębnianie cech pojedynczych robaków19,20. Rejestrowanie subtelnych parametrów zachowania pojedynczego robaka, takich jak prędkości odwrócenia i amplituda zgięć ciała, zapewni bardziej szczegółowy obraz zachowań chemosensorycznych poszczególnych robaków w kontekście testu populacyjnego. Test można również zmodyfikować w celu zbadania habituacji poprzez wiercenie otworów w ROI za pomocą igieł strzykawkowych o odpowiednim rozmiarze i wypełnianie otworów agarem z dodatkiem związku doświadczalnego lub buforu kontrolnego. Zapewni to bardziej spójne stężenie powierzchniowe związku przez dłuższy okres czasu rejestracji, co jest konieczne podczas badań habituacji. Innym potencjalnym zastosowaniem tej metody jest przeprowadzenie porównawczych badań zachowania różnych gatunków nicieni. Ponadto komora behawioralna może być modyfikowana na wiele sposobów, aby badać reakcje behawioralne na bodźce multimodalne. W przypadku zastosowań optogenetycznych obok mocowania kamery można przymocować matryce LED o wysokiej intensywności, aby selektywnie aktywować neurony będące przedmiotem zainteresowania podczas testu. Do zestawu można również dodać elementy grzejne, systemy chłodzenia i czujniki temperatury, aby badać wpływ temperatury na zachowania sensoryczne. Co więcej, wewnątrz komory można zainstalować systemy dostarczania zapachów w celu zbadania interakcji między modalnościami sensorycznymi i chemosensorycznymi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center (CGC), które jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Praca ta jest wspierana przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa, w którym P.W.S. jest badaczem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aluminiowe profile ramowe z rowkiem TMcMaster-Carr47065T101Pojedynczy profil, rozmiar 1", pełne
WspornikiMcMaster-Carr47065T2361" długie do wytłoczek jednoprofilowych o wysokości 1"
Kompaktowe łączniki końcoweMcMaster-Carr47065T1391" (pojedyncze), zestaw 4
Skręcane uchwyty do paneli pełnychMcMaster-Carr47065T251Do 1" wysokiej ekstruzji
Plastikowe zaślepkiMcMaster-Carr47065T91Do 1" wysokiego wytłaczania
Optycznie przezroczysty odlew akrylowyMcMaster-Carr8560K211Grubość 3/16", 12" x 12"Tkanina
poliestrowa powlekana winylemMcMaster-Carr88505K57Grubość 0,027", szerokość 61",
Mosiężne przepustyMcMaster-Carr9604K22Rozmiar handlowy 0, 0,545" średnica zewnętrzna
Podkładki staloweMcMaster-Carr90107A029Rozmiar 1/4"
z zaokrąglonymMcMaster-Carr90272A5461/4" - 20 rozmiar gwintu, 1 - 1/2" długości
Standardowe podświetlenie operacyjneInteligentne światła wizyjneZobacz lokalnego dostawcę8" x 8", podczerwień 850 nm
IVP-C1 Zmienna kontrola garnkaInteligentne światła wizyjneZobacz lokalnego dostawcę
Zasilacz T1Inteligentne światła wizyjneZobacz lokalnego sprzedawcę
Mikroskop cyfrowy Dino lite Pro AM4113TDino-LiteZobacz lokalnego dostawcę
Stojak na mikroskop MS09BMikroskop cyfrowy Dino-LiteZobacz lokalnego dostawcę

Bibliografia

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  4. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
  5. Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans. EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).
  6. Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).
  7. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
  8. Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).
  9. Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation. EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).
  10. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  11. Choe, A., et al. Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes. Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).
  12. Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling. EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).
  13. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).
  14. Kunitomo, H., et al. Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 4, 2210(2013).
  15. Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
  16. Tobin, D. M., et al. Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons. Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).
  17. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).
  18. Sawin, E. R. Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , M.I.T. Cambridge, MA. (1996).
  19. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208(2008).
  20. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Preferencje chemosensoryczne nicienizautomatyzowana analiza wideotest behawioralny C eleganskonfiguracja wielokamerowaobliczanie indeksu preferencjiadaptacja testu chemotaksjiprzesiew mutant w genetycznychszablon rozmieszczenia roztwor wmonta komory behawioralnejledzenie populacji nicieni
Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.