Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
U większości roślin kwitnących, zygota i zarodek są ukryte głęboko w tkance matki, dlatego od dawna pozostaje tajemnicą, jak rozwijają się dynamicznie; na przykład, jak zygota polaryzuje się, aby ustalić oś ciała i jak zarodek określa różne losy komórek podczas tworzenia organów. Manuskrypt opisuje metodę hodowli zalążków in vitro w celu wykonania obrazowania żywych komórek rozwijających się zygot i zarodków Arabidopsis thaliana. Zoptymalizowane podłoże uprawowe pozwala zygotom lub wczesnym zarodkom wyrosnąć na płodne rośliny. Łącząc go z urządzeniem z poli(dimetylosiloksanem) (PDMS) z matrycą mikrofilarową, zalążek jest utrzymywany w ciekłym podłożu w tej samej pozycji. To utrwalenie jest niezbędne do obserwacji tego samego zalążka pod mikroskopem przez kilka dni od podziału jarzmowego do późnego stadium zarodka. Uzyskane w ten sposób obrazowanie żywych komórek może być wykorzystane do monitorowania dynamiki polaryzacji zygoty w czasie rzeczywistym, takiej jak migracja jądra i rearanżacja cytoszkieletu, a także czasu podziału komórki i specyfikacji losu komórki podczas modelowania zarodka. Co więcej, ten system hodowli zalążków może być łączony z leczeniem inhibitorami w celu analizy wpływu różnych czynników na rozwój zarodka oraz z manipulacjami optycznymi, takimi jak przerywanie laserowe, w celu zbadania roli komunikacji komórka-komórka.
Wprowadzenie
Podstawowy plan budowy organizmu rozwija się z jednokomórkowej zygoty. U większości roślin kwitnących podział zygoty prowadzi do powstania komórki apikalnej i bazalnej, z których rozwijają się odpowiednio pęd i korzeń1. Dlatego istotne jest zrozumienie, w jaki sposób ciało rośliny formuje się podczas embriogenezy, jednak do tej pory brakowało skutecznego narzędzia do bezpośredniej obserwacji dynamiki żywych zygot i embrionów, ponieważ rozwijają się one głęboko w kwiecie. U kilku gatunków jednoliściennych, takich jak kukurydza i ryż, opracowano metodę zapłodnienia in vitro2,3. W tej metodzie izolowane komórki plemników i komórki jajowe są łączone elektrycznie lub chemicznie, a powstała komórka może rozwinąć się w płodną roślinę. Jednak w przypadku roślin dwuliściennych nie istnieje metoda zapłodnienia in vitro, która pozwalałaby na wytworzenie prawidłowych embrionów, prawdopodobnie ze względu na niezsynchronizowany stan cyklu komórkowego gamet męskich i żeńskich4,5. Ponadto tkanka otaczająca embrion (endosperm) odgrywa istotną rolę w rozwoju embrionu6.
W modelowym gatunku dwuliściennych, A. thaliana, opracowano metodę hodowli in vitro koncentrującą się na całej zalążni, która zawiera zarówno embrion, jak i endosperm7. System ten został z powodzeniem wykorzystany do analizy wpływu różnych odczynników chemicznych na embriogenezę, jednak nie nadaje się on do obrazowania poklatkowego ze względu na niską przeżywalność. W związku z tym opracowano nowy system hodowli zalążni in vitro, aby umożliwić rozpoczęcie obserwacji już na etapie zygoty i uzyskać płodne rośliny z wysoką wydajnością8. Po licznych próbach stwierdzono, że pożywka Nitscha oraz trehaloza znacząco poprawiają przeżywalność zalążni8. Ponadto, ponieważ zalążnia powiększa się w miarę wzrostu i w konsekwencji często przemieszcza się poza pole widzenia mikroskopu, opracowano urządzenie z PDMS służące do unieruchomienia zalążni w pożywce9. Urządzenie PDMS umożliwiło długoterminowe obrazowanie przez 3 – 4 dni, co jest wystarczające do śledzenia rozwoju od zygoty do embrionu w stadium serca. Dzięki zastosowaniu tej metody możliwe staje się wizualizowanie dynamiki polaryzacji zygoty i wzorca rozwoju embrionu nie tylko w warunkach normalnych, ale także w obecności inhibitorów chemicznych lub w różnych liniach mutantów8,10,1.
Rysunek 1: Schemat specyficznych markerów fluorescencyjnych wykorzystanych do wizualizacji zygot i zarodków wewnątrz zalążka.
The Arabidopsis zygota rozwija się w embrion w zalążku, który powstaje głęboko wewnątrz kwiatu. W tym in vitro systemie hodowli zygota i zarodek są obserwowane poprzez zalążnię, dlatego ważne jest stosowanie specyficznych markerów fluorescencyjnych, które nie wykazują ekspresji w innych tkankach zalążni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie pożywki do hodowli zalążków in vitro
- Przygotować płynną pożywkę do hodowli zalążków in vitro („pożywka N5T”) zawierającą 1x mieszaninę soli podstawowych Nitscha, 5% (w/v) trehalozy dwuwodnika, 0,05% (w/v) kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES)-KOH (pH 5,8) oraz 1x roztwór witamin Gamborga.
- Dostosować pH do wartości 5,8 za pomocą KOH.
- Sterylizować pożywkę poprzez autoklawowanie (121 °C, 20 min) lub filtrowanie przez filtr 0,2-µm.
UWAGA: Sterylna pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 2 - 3 miesiące.
2. Przygotowanie urządzenia z macierzą mikrosłupków z PDMS
- Dotnij urządzenie z mikropilarami z PDMS za pomocą noża, żyletki lub nożyczek, aby pasowało do szklanej części (14 mm φ) szalki z dna szklanego o średnicy 35 mm.
UWAGA: Pełna procedura konstrukcji urządzenia z PDMS została opisana w poprzednich publikacjach8,9, dlatego szczegóły zostały tutaj pominięte. Szalki z dna szklanego o mniejszej objętości, takie jak płytki 4-dołkowe lub 96-dołkowe, mogą być używane do obrazowania krótkoterminowego bez użycia urządzenia. - Sterylizuj górną stronę urządzenia z PDMS pod światłem UV przez 15 min.
- Odwróć urządzenie z PDMS za pomocą pęsety z płaskimi końcami i pozostaw pod światłem UV przez 15 min w celu sterylizacji spodu.
- Przenieś wysterylizowane urządzenie z PDMS do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm i dodaj pożywkę N5T, aż urządzenie zostanie całkowicie zanurzone w pożywce (około 5 - 7 mL).
- Umieść szalkę w komorze próżniowej i zmniejsz ciśnienie, aby odgazować układ. Kontynuuj odsysanie przez 3 h lub przez noc, aż powietrze w urządzeniu zostanie zastąpione pożywką.
UWAGA: Pod wpływem silnej próżni urządzenie może zostać odklejone przez pęcherzyki powietrza. - Wyjmij urządzenie z szalki, trzymając je pęsetą z płaskimi końcami, i połóż na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar pożywki z bocznych krawędzi i spodu.
UWAGA: Pożywka na matrycy mikropilarów (powierzchnia górna) nie powinna być usuwana, ponieważ będzie ona wykorzystywana do hodowli przyrodek. - Przenieś urządzenie na szkiełko przedmiotowe o wymiarach 76 mm x 26 mm, upewniając się, że część z mikropilarami znajduje się na górze, a następnie przykryj urządzenie pokrywką od szalki hodowlanej 35 mm, aby zapobiec wysychaniu pożywki podczas następnego etapu ekstrakcji przyrodek.
3. Disekcja strąka i ekstrakcja zalążków
- Zesterylizować igłę (0,40 mm G) oraz precyzyjną pęsetę, przecierając je 70% etanolem. Dla łatwiejszej obsługi igłę można przymocować do strzykawki lub drewnianego patyczka.
- Należy sprawdzić kwiatostan rośliny i wybrać odpowiednie strąki do eksperymentu. Strąki o długości około 5 mm zawierają zygoty, natomiast strąki o długości 8–10 mm zawierają młode embriony w stadium globularnym.
- Wyciąć strąki za pomocą pęsety i umieścić je na dwustronnej taśmie na szkiełku przedmiotowym o wymiarach 76 x 26 mm. Jeden strąk zawiera około 40–60 zalążków, a 3–4 strąki (t. j., 120 – 240 czopków) jest wystarczająca dla jednego urządzenia.
- Otwórztorewkę (ścianę zalążni), aby zobaczyć znajdujące się wewnątrz zalążki, używając sterylnej igły i pęsety pod stereomikroskopem. Przetnij wyłącznie ścianę zalążni, tak aby nie uszkodzić zalążków.
- Przenieś otwartątątątątą strączkę do pożywki N5T na urządzeniu PDMS (przygotowanym w kroku 2.7), a następnie za pomocą igły lub pęsety uwolnij zalążki do pożywki.
- Nałóż małe szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm) na urządzenie z PDMS, aby wcisnąć przyleknie w przestrzenie w obrębie macierzy mikropillarów.
- Zdejmij szkiełko okrywek, przesuwając je poziomo pęsetą lub palcami, aby usunąć nadmiar medium.
- Odwróć urządzenie z PDMS do góry dnem, umieść je w naczyniu z szklanym dnem o średnicy 35 mm, a następnie lekko dociśnij urządzenie za pomocą pęsety z płaskim końcem, aby przylgnęło do szkła.
- Ostrożnie wlej pożywkę N5T do szalki z szklanym dnem, przelewając zawartość z butelki z pożywką, aż urządzenie PDMS zostanie całkowicie zanurzone w pożywce, a następnie szczelnie zamknij szalkę folią parafinową.
UWAGA: Urządzenie z PDMS może być używane ponownie, jednak urządzenia zbyt stare łatwo odrywają się od szklanego dna. Ponadto urządzenie może wypłynąć, jeśli nie zostało całkowicie odgazowane w kroku 2.5 lub jeśli medium zostało wlane zbyt szybko.
Rycina 2: Schemat procedury przygotowania próbek.
Ten schematycznemu przepływowi odpowiadają kroki od 3.5 do 4.1. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
4. Obrazowanie poklatkowe
- Umieść naczynie z szklanym dnem przygotowane w kroku 3.9 na mikroskopie odwróconym i wybierz odpowiednie przylecie do ustawienia ostrości.
UWAGA: Ponieważ przylecie różnią się stadiumm, położeniem i kierunkiem, odpowiednie okazy należy zlokalizować, sprawdzając fluorescencję ich markerów. - Rozpocznij obrazowanie na żywo zgodnie z instrukcją obsługi systemu mikroskopowego dostarczoną przez producenta.
UWAGA: Sprzęt mikroskopowy i parametry są zróżnicowane, dlatego użytkownicy powinni dobrać odpowiednie ustawienia dopasowane do celu eksperymentu. Przykładowo, ustawienia zastosowane w niniejszym opracowaniu wymieniono w Tabeli 1.
| Sprzęt/konfiguracja | Rycina 3 (A) oraz filmy uzupełniające 1 i 4 | Rycina 3 (B) oraz Wideo uzupełniające 2 | Wideo uzupełniające 3 |
| Mikroskop | odwrócony mikroskop skaningowy z detekcją laserową (A1R MP) | odwrócony mikroskop konfokalny z dyskiem wirującym (CSU-W1) | system odwróconego mikroskopu konfokalnego typu box z stabilną komorą inkubacyjną (CV10) |
| Laser | femtosekundowy laser impulsowy Ti:szafir | lasery LD 488 nm i 561 nm | lasery LD 48 nm i 561 nm |
| Obiektyw | obiektyw imersyjny 40X (NA = 1,15) z medium imersyjnym | obiektyw imersyjny z olejem silikonowym 60x (NA = 1,30), zamontowany na piezoelektrycznym napędzie ogniskowania | obiektyw 40X (NA = 0,95) |
| Detektor | zewnętrzny detektor PMT z GaAsP bez skanowania wstępnego | Kamera EMCCD | Kamera EMCCD |
| Lustro dichroiczne | DM495 i DM560 | DM48/561 | DM40-410/48/561 |
| Filtr | filtry pasmowe; 534/30 nm i 578/105 nm | filtry przepustowe; 520/35 nm oraz 593/46 nm | filtry przepustowe pasmowych; 520/50 nm i 617/73 nm |
| Przekrój wzdłuż osi z | 31 stosów z-stack z 1-µm interwały | 17 stosów z (z-stacks) z 3-µm interwały | 7 stosów z-stack z 5-µm przedziały |
| Odstęp czasowy | 20 min | 5 min | 10 min |
Tabela 1: Systemy mikroskopowe i ustawienia użyte w niniejszej pracy.
Mikroskopy i parametry są zróżnicowane, dlatego każdy użytkownik powinien dobrać odpowiedni system do przeprowadzanego eksperymentu.
- Sprawdź pozyskaną sekwencję obrazów i przekonwertuj ją na ogólny format filmowy, taki jak .avi lub .mov, w celu prezentacji.
UWAGA: Jeśli oprogramowanie mikroskopu nie pozwala na eksport obrazów w formacie filmowym, można zapisać obrazy w formacie .tif, a następnie otworzyć je w programie ImageJ – programie o otwartym kodzie źródłowym zainspirowanym przez NIH Image – aby zmienić typ pliku. Program ImageJ jest dostępny pod adresem: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ może być również wykorzystany do tworzenia filmów z serii Z (Z-stack), np. poprzez projekcję maksymalnej intensywności, zgodnie z opisem pod adresem: https://imagej.net/Z-functions.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dzięki zastosowaniu tego systemu hodowli zalążków, metoda ta pozwala na śledzenie dynamiki żywych procesów polaryzacji zygoty i wzorowania zarodka. Jest to istotne osiągnięcie, ponieważ wcześniej nie istniała technika umożliwiająca wizualizację w czasie rzeczywistym zachowania zygoty i zarodka, które są ukryte głęboko w tkance macierzystej. Rycina 3A oraz Wideo uzupełniające 1 pokazują, że mikrotubule (MTs) w młodej zygocie gromadzą się w pos...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy manuskrypt przedstawia prosty protokół hodowli zalążków in vitro, który jest efektywny w obrazowaniu żywych komórek rozwijających się zygot i embrionów.
Projekt urządzenia z PDMS może wymagać optymalizacji w zależności od stopnia rozwoju zarodka. Pierwszym opracowanym urządzeniem była macierz mikroklatek służąca do regulacji orientacji i ustalenia pozycji przyląków9, a następnie skonstruowano urządzenie z mikropillarami, aby skuteczniej chwytać przylą...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Mikroskopia w tej pracy została przeprowadzona w Instytucie Transformacyjnych Bio-Molekuł (WPI-ITbM) Uniwersytetu w Nagoi i wspierana przez Japan Advanced Plant Science Network. Praca ta została wsparta grantami z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (projekt ERATO dla T.H. i M.U.) oraz z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (nr JP24113514, JP26113710, JP15H05962 i JP15H05955 dla M.U. oraz nr JP16H06465, JP16H06464 i JP16K21727 dla T.H.), Grant-in-Aid dla Młodych Naukowców (B, nr JP24770045 i JP26840093 dla M.U.) oraz Grant-in-Aid dla ambitnych badań eksploracyjnych (nr JP16K14753 dla M.U.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nitsch podstawowa mieszanka soli | Duchefa | N0223 | |
| trehaloza dwuwodna | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg' s roztwór witamin | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-milimetrowe naczynie ze szklanym dnem | Matsunami Szklane | naczynie | |
| 35 mm | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| igła (rozstaw 0,40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Medium zanurzeniowe Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | Jest to sprzęt niestandardowy, dlatego numer katalogowy nie jest dostępny. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
Bibliografia
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
