Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Summary

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Abstract

Aby przekształcić tradycyjną hodowlę komórkową 2D do hodowli komórek 3D, zintegrowaliśmy mikrofabrykację z technologią kriożelowania do produkcji makroporowatych kriożeli w mikroskali (mikrokriogeli), które mogą być ładowane różnymi typami komórek, tworząc mikrotkanki 3D. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół wytwarzania wszechstronnych mikrotkanek 3D i ich zastosowania w terapii regeneracyjnej i badaniach przesiewowych leków. Mikrokriożele o kontrolowanej wielkości i kształcie mogą być wytwarzane na chipie matrycowym, który może być zbierany poza chipem jako pojedyncze nośniki komórkowe do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej lub dalej montowany na chipie w matryce mikrotkanek 3D w celu wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Ze względu na wysoką elastyczność tych krioweli w mikroskali, mikrotkanki 3D wykazują dużą zdolność do wstrzykiwania w minimalnie inwazyjnej terapii komórkowej, chroniąc komórki przed mechaniczną siłą ścinającą podczas wstrzykiwania. Zapewnia to zwiększoną przeżywalność komórek i efekt terapeutyczny w modelu niedokrwienia kończyn myszy. Z kolei montaż matryc mikrotkanek 3D w standardowym formacie wielodołkowym 384 ułatwia korzystanie ze wspólnych urządzeń i sprzętu laboratoryjnego, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków na tej wszechstronnej platformie hodowli komórkowych 3D.

Introduction

Tradycyjna hodowla komórkowa na spłaszczonych dwuwymiarowych (2D) powierzchniach, takich jak szalka hodowlana lub płytki wielodołkowe, z trudem może wywołać zachowanie komórek zbliżone do ich rodzimych stanów. Dokładna rekapitulacja natywnych mikrośrodowisk komórkowych, które składają się z różnych typów komórek, macierzy zewnątrzkomórkowych i bioaktywnych czynników rozpuszczalnych w architekturach trójwymiarowych (3D)^1,2,3,4, jest niezbędna do konstruowania tkanek biomimikujących in vitro Do zastosowań w inżynierii tkankowej, medycynie regeneracyjnej, badaniach biologii podstawowej i odkrywaniu leków^5,6,7,8,9.

Zamiast hodowli komórkowej 2D, hodowla komórkowa 3D jest szeroko stosowana do rozwoju biomimetycznych mikroarchitektur i funkcjonalnych cech komórek hodowanych in vitro. Popularną metodą hodowli komórkowej 3D jest agregowanie komórek w sferoidy^7,8,9,10. Sferoidy komórkowe mogą być wstrzykiwane do uszkodzonych tkanek ze zwiększoną retencją komórkową i przeżyciem w porównaniu z wstrzykiwaniem komórek rozproszonych. Jednak niejednorodne rozmiary sferoid i nieuniknione uszkodzenia mechaniczne nałożone na komórki przez siłę ścinającą płynu podczas wstrzykiwania prowadzą do słabych efektów terapeutycznych komórek^11,12,13. Podobnie, nieodłączna niejednorodność podczas agregacji sferoid sprawiła, że ich translacja na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków w 3D oparta na komórkach stała się wyzwaniem¹⁰.

Inna metoda hodowli komórek 3D jest osiągana za pomocą biomateriałów, które zazwyczaj zamykają komórki w wodnych hydrożelach lub porowatych rusztowaniach. Pozwala to na większą elastyczność w konstruowaniu architektur 3D. W przypadku terapii komórki zamknięte w rusztowaniach są zwykle dostarczane do organizmu zwierzęcia poprzez implantację chirurgiczną, która jest inwazyjna i traumatyczna, co ogranicza jej szerokie przenikanie do łóżka pacjenta. Z drugiej strony, hydrożele wodne umożliwiają minimalnie inwazyjną terapię poprzez wstrzykiwanie komórek zawieszonych w roztworze prekursora hydrożelu do ciał zwierząt, umożliwiając żelowanie in situ poprzez sieciowanie termiczne, chemiczne lub enzymatyczne¹¹. Ponieważ jednak komórki są dostarczane, gdy prekursory hydrożelu są jeszcze w stanie wodnym, są one również narażone na mechaniczne ścinanie podczas wstrzykiwania. Co więcej, chemiczne lub enzymatyczne sieciowanie podczas żelowania hydrożelu in situ może również spowodować uszkodzenie komórek w środku. W przypadku badań przesiewowych leków, hodowle komórkowe wspomagane biomateriałem napotykają problemy z jednorodnością, sterowalnością i przepustowością. Używając hydrożeli, komórki są zwykle zaangażowane w żelowanie, przez co proces ten może wpływać na żywotność i funkcję komórek. Żelowanie podczas wysiewu komórek utrudnia również użycie przez większość urządzeń o wysokiej przepustowości, ponieważ hydrożel może wymagać przechowywania na lodzie, aby zapobiec żelowaniu przed wysiewem komórek, a hydrożel może zaciąć końcówki dozujące, które są zwykle bardzo cienkie, aby zapewnić dokładność przesiewania o wysokiej przepustowości. Wstępnie uformowane rusztowania mogą potencjalnie oddzielić procedury wytwarzania biomateriałów od hodowli komórkowych, jednak większość produktów opartych na rusztowaniach jest dostępna jako materiały masowe o stosunkowo niższej przepustowości¹⁴.

Aby przezwyciężyć niektóre niedociągnięcia obecnych metod hodowli 3D, opracowaliśmy zintegrowaną technologię mikrofabrykacji i kriożelacji, aby stworzyć gotowy i przyjazny dla użytkownika chip do mikrokriożelu¹⁵. W tym protokole żelatyna została wybrana jako przykład techniki wytwarzania mikrokriożelu, ponieważ jest biokompatybilna, degradowalna, opłacalna i nie jest wymagana dalsza modyfikacja do łączenia komórek. Inne polimery pochodzenia naturalnego lub syntetycznego mogą być również używane do produkcji, w zależności od zastosowania. Dzięki tej technologii możemy wytwarzać zminiaturyzowane i wysoce elastyczne mikrokriożele o kontrolowanym rozmiarze, kształcie i układzie. Po załadowaniu różnymi typami komórek, mikrotkanki 3D mogą być formowane do różnych zastosowań. Te unikalne cechy umożliwiają pożądaną wstrzykiwalność, ochronę komórek i retencję ukierunkowaną na miejsce po wstrzyknięciu in vivo w celu zwiększenia efektów terapeutycznych. Co więcej, mikrokriożele mogą być dalej przetwarzane w celu utworzenia matryc mikrotkanek 3D, które są kompatybilne z powszechnym sprzętem laboratoryjnym i instrumentami w celu realizacji wysokoprzepustowej hodowli komórkowej do wszechstronnych badań przesiewowych leków i innych testów komórkowych. W tym miejscu szczegółowo omówimy proces wytwarzania mikrokriożeli i ich obróbkę końcową jako pojedyncze mikrotkanki 3D lub matryce mikrotkanek 3D do dwóch ważnych zastosowań, odpowiednio, terapii komórkowej i badań przesiewowych leków^10,15.

Protocol

Eksperymenty na zwierzętach przebiegały zgodnie ze ścisłym protokołem zatwierdzonym przez Komisję Etyki Zwierząt w Centrum Analiz Biomedycznych Uniwersytetu Tsinghua. Za zgodą Komisji Etycznej pobrano ludzką tkankę tłuszczową z Oddziału Chirurgii Plastycznej Szpitala Beijing Union za świadomą zgodą pacjentów.

1. Produkcja mikrokriożeli 3D

1. Projektowanie i produkcja układów mikroszablonowych
   1. Użyj komercyjnego oprogramowania do projektowania tablic o określonych geometriach, takich jak okręgi, elipsy, trójkąty lub koniczyny¹⁴, w zależności od późniejszej aplikacji.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat projektu można znaleźć w sekcji 2 protokołu dotyczącej medycyny regeneracyjnej i sekcji 3 protokołu dotyczącego badań przesiewowych leków.
   2. Zaimportuj projekt do oprogramowania do grawerowania laserowego dołączonego do maszyny do grawerowania laserowego. Korzystając z ustawień lasera zgodnie z zaleceniami fabrycznymi dla maszyny do grawerowania laserowego, graweruj laserowo zaimportowany wzór na arkuszach z poli(metakrylanu metylu) (PMMA).
   3. Umyj chipy matrycy mikroszablonów wodą dejonizowaną, aby usunąć zanieczyszczenia z grawerowania laserowego. Wysuszyć chipy układu mikroszablonów w temperaturze 60 °C. Przechowywać w szczelnie zamkniętej torbie w temperaturze pokojowej przez wiele miesięcy.
2. Produkcja chipów do mikrokriożeli
   1. Umieść 4 chipy z matrycą mikroszablonów na tacy na próbki i włóż do myjki plazmowej. Zamknij drzwiczki odkurzacza i włącz pompę próżniową na 2 minuty, a następnie włącz maksymalną moc RF (18 W), aby poddać obróbce chipy układu mikroszablonów w myjce plazmowej przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby zwiększyć hydrofilowość.
   2. Dodaj 0,06 g żelatyny do 1 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać 6% (wag./obj.) roztwór prekursora żelatyny (wystarczająco dużo, aby uzyskać 5 chipsów). Ogrzać w temperaturze 60 °C w łaźni wodnej do odpowiedniego rozpuszczenia. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
   3. Dodać 3 μl aldehydu glutarowego do roztworu prekursora żelatyny do końcowego stężenia 0,3%. Dokładnie wymieszaj.
   4. Odpipetować 200 μl roztworu prekursora z aldehydem glutarowym na górną powierzchnię chipa matrycy mikroszablonowej.
      UWAGA: 200 μL jest wystarczające dla chipa 75 mm × 25 mm, niezależnie od konstrukcji. Zwiększ ilość proporcjonalnie, gdy zwiększa się powierzchnia wióra.
   5. Ręcznie rozprowadź roztwór równomiernie na chipie, skrobając tam iz powrotem wygiętym szklanym prętem 2 do 3 razy.
      UWAGA: Każda mikrostudzienka na chipie mikroszablonu może być wypełniona roztworem prekursora ze względu na ich hydrofilowy charakter po obróbce plazmowej.
   6. Natychmiast umieścić wypełniony roztworem prekursora układ scalony w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 16 godzin w celu kriożelacji.
   7. Ustawić liofilizator na -40 °C na 30 min. Umieścić chipy matrycy po kriożelacji w liofilizatorze i liofilizować chipy matrycy przez 2 godziny w próżni.
      UWAGA: Mikrokriożele żelatynowe z połączonymi makroporami powstają, ponieważ lód powstały podczas kriożelowania sublimuje w liofilizatorze.
   8. Przejdź do sekcji 2 dotyczącej leczenia krytycznego niedokrwienia kończyn (CLI) i sekcji 3 dotyczącej wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.

2. Pobieranie pojedynczych mikrokriożeli w celu utworzenia wstrzykiwalnych mikrotkanek 3D do leczenia CLI

1. Zbieranie pojedynczych mikrokriożeli
   1. Zaprojektuj matryce (75 mm × 25 mm) składające się z 600 okręgów o średnicy 400 μm każdy w komercyjnym oprogramowaniu do iniekcyjnej budowy mikrotkanek 3D. Użyj PMMA o grubości 300 μm do produkcji chipa matrycy mikroszablonów, jak opisano w sekcji 1.1.
   2. Wytwarzać chipy do mikrokriożelu, jak w sekcji 1.2.
   3. Stwórz układ pinów wypychacza PDMS o takim samym wyglądzie, jak w kroku 2.1.1, za pomocą standardowej miękkiej litografii^16,17.
   4. Nałóż układ macierzy mikrokriożelu na układ pinów wypychacza PDMS, wyrównując każdy mikrokriożel z kołkiem wypychacza na tablicy. Naciśnij układ macierzy mikrokriożelu w kierunku układu kołków wypychających, aby wypchnąć mikrokriożele z mikrostudzienek za pomocą wystających kołków na układzie kołków wypychacza PDMS w celu zebrania pojedynczych mikrokriogeli.
   5. Zbierz mikrokriożel do wody i zbierz go za pomocą sitek do komórek. Użyj jednego sitka, aby zebrać mikrokriożele z jednego chipa (tj. 600 mikrokriokelów).
   6. Myć mikrokriożele 0,1 M NaBH₄ na lodzie przez 20 minut, aby stłumić wszelkie pozostałości nieusieciowanych aldehydów. Użyj 5 ml 0,1 M NaBH₄ na chip. Wyrzuć NaBH₄ i myj 5 ml wody dejonizowanej przez 3 do 5 razy, za każdym razem 15 minut.
   7. Wylej wodę z sitka komórkowego i zbierz mikrokriożele w jeden klaster na sitko na komórki, a następnie umieść jeden plik na jednej szalce Petriego o średnicy 35 mm za pomocą zakrzywionej pęsety. Do każdej grupy dodać 50 - 70 μl wody dejonizowanej i przykryć pokrywkę szalki Petriego. Delikatnie postukaj w szalkę Petriego o blat stołu, aby wyrównać wszystkie mikrokriogle, tak aby żadne mikrokriożele nie leżały na innym mikrokriożelu, tworząc monowarstwę mikrokriożeli na powierzchni szalki Petriego.
   8. Zebrane mikrokriożele należy zamrozić w temperaturze -20 °C przez 4–16 godzin, a następnie liofilizować je przez 2 godziny (patrz krok 1.2.7). Przechowuj mikrokriożele w próżni w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia.
2. Charakterystyka mikrokriożeli
   1. Oceń pory mikrokriożeli za pomocą obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
      1. Unieruchomić zebrane i liofilizowane mikrokriożele na uchwycie próbki za pomocą dwustronnej taśmy klejącej i pokryć złotem za pomocą napylarki przez 90 s, przed obrazowaniem za pomocą SEM¹¹. Oceń i przeanalizuj rozkład średnic porów w mikrokriożelu na podstawie siedmiu różnych obrazów SEM za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
   2. Zważyć jedną grupę 600 liofilizowanych mikrokriożeli na szalce Petriego o średnicy 35 mm w celu przeliczenia na masę wysuszonych mikrokriożeli żelatynowych (GM). Dodaj 60 μl wody dejonizowanej do klastra liofilizowanych mikrokriożeli i poczekaj 30 sekund, aż mikrokriożele całkowicie wchłoną wodę i pęcznieją. Zważ spuchnięte mikrokriogle.
      1. Określ odpowiednio równowagowy współczynnik pęcznienia i porowatość mikrokriogeli jako stosunek masy napęcznionych mikrokriożeli do masy wysuszonych mikrokriożeli żelatynowych oraz stosunek masy wody przechowywanej w mikrokriożelach do masy uwodnionych mikrokriożeli¹³.
   3. Pomiar wstrzykiwalności mikrokriożeli za pomocą programowalnej pompy strzykawkowej zintegrowanej z cyfrowym miernikiem siły¹⁴.
      1. Zabarwić 600 kawałków mikrokriożeli za pomocą błękitu trypanowego i zawiesić w 600 μl 15% roztworu żelatyny, aby uzyskać jednorodne rozprowadzenie. Załadować 1 ml zawiesiny mikrokriożelu do strzykawki o pojemności 1 ml. Wstrzyknąć mieszaninę przez igłę o rozmiarze 27 dołączoną do strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą programowalnej pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 1 ml/min.
      2. Monitoruj siłę wtrysku w czasie rzeczywistym za pomocą cyfrowego miernika siły i wykreślaj krzywą siła-czas. Po wstrzyknięciu należy obserwować integralność mikrokriożeli pod mikroskopem.
         UWAGA: GM zawieszone w 15% (wag./obj.) roztworze żelatyny mogą być płynnie wstrzykiwane i pozostają nienaruszone po wstrzyknięciu.
   4. Scharakteryzuj degradowalność mikrokriogeli.
      1. Najpierw zmierz masę jednego klastra 600 liofilizowanych mikrokriożeli na 35-milimetrowej szalce Petriego jako suchą masę. Następnie zanurz 600 liofilizowanych mikrokriożeli w 2 ml 0,025% (obj./obj.) trypsyny/EDTA.
      2. Zebrać mikrokriożele z roztworu za pomocą sitka do komórek w różnych punktach czasowych (tj. 10, 20, 30, 40, 50, 60 i 70 min). Nadmiar roztworu odchować chusteczką. Zmierz masę mikrokriożeli w różnych punktach czasowych i oblicz stopień degradacji, jako stosunek masy mikrokriożelu w określonym punkcie czasowym do masy mikrokriożelu w czasie zero.
3. Automatyczne ładowanie komórek do mikrokriożeli w celu utworzenia mikrotkanek 3D
   1. Sterylizować mikrokriożele od kroku 2.1.8 za pomocą systemu sterylizacji tlenkiem etylenu z 12-godzinną ekspozycją na gaz, a następnie 12-godzinnym odgazowaniem w próżni.
   2. Wybierz ludzkie mezenchymalne komórki zrębu (hMSC) pochodzące z tkanki tłuszczowej do leczenia niedokrwiennej kończyny tylnej myszy. Wyizoluj komórki, postępując zgodnie z procedurami opisanymi wcześniej¹⁸.
   3. Posiew hMSC w pożywce wzrostowej zawierającej 2% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 10 ng/ml płytkopochodnego czynnika wzrostu bb (PDGF-bb), 1X selen transferyny insuliny (ITS), ^10-8 M deksametazonu, ^10-4 M 2-fosforan kwasu askorbinowego, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w DMEM/F12. Przejdź komórki w stosunku 1:3 podczas zlewania. Użyj komórek przejścia od 3 do 5 w następujących eksperymentach.
   4. Zebrać hMSC za pomocą trypsyny i określić ilościowo liczbę komórek za pomocą komory liczącej Fuchsa-Rosenthala i ponownie zawiesić do gęstości 8 x 10⁶ komórek/ml w pożywce wzrostowej hMSC.
   5. Odpipetować zawiesinę 60 μL hMSC na monowarstwie 600 mikrokriożeli o średnicy 400 μm w naczyniu o średnicy 35 mm z sekcji 2.1. Komórki są automatycznie wchłaniane przez porowate mikrostruktury mikrokriomeli.
   6. Przechowywać w wilgotnej komorze i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby umożliwić przyczepienie się komórek. Po 2 godzinach inkubacji dodać 2 ml pożywki hodowlanej. Zmieniaj podłoże co 2 dni. Hodowla mikrokriożeli ładowanych hMSC przez 2 dni w celu utworzenia mikrotkanek 3D.
   7. Po 2 dniach hodowli odpipetować 100 mikrokriożeli załadowanych hMSCs na dołek na 96-dołkową płytkę, dodać 120 μl roztworu roboczego rezazuryny przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta do każdego dołka. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
      1. Wykryj fluorescencję rezazuryny metabolizowanej przez żywe komórki w czytniku mikropłytek o długości fali światła wzbudzenia 560 nm i długości fali światła emisyjnego 590 nm. Ustal standardową krzywą liczby komórek w funkcji fluorescencji za pomocą hMSC do interpolacji liczby komórek na podstawie intensywności fluorescencji do przyszłego eksperymentu zgodnie z protokołem zestawu¹³.
   8. Oceń liczbę hMSC w mikrokriożelach od dnia 0 do dnia 4 za pomocą resazuryny, jak opisano w kroku 2.3.7, od dnia 0 do dnia 4.
   9. Zabarwić komórki w mikrokriożelach rozcieńczeniem kalceiny AM w stosunku 1:500 i rozcieńczeniem jodku propidyny w stosunku 1:250 (znanym jako barwienie żywe/martwe) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym.
4. Iniekcja mikrotkanek 3D in vivo w leczeniu CLI w modelu mysim
   1. Ustal krytyczne niedokrwienie kończyn tylnych samic nagich myszy BALB/c zgodnie z raportem^11,19, aby określić efekt terapeutyczny terapii opartej na mikrotkankach 3D.
   2. Przenieść mikrotkanki z kroku 2.3.6 za pomocą pipety o pojemności 5 ml do sitka do komórek i odfiltrować pożywkę hodowlaną.
   3. Ponownie zawiesić mikrotkanki 3D obciążone hMSC w 15% roztworze żelatyny, o gęstości 100 mikrokriożeli na 100 μl roztworu.
   4. Przed zabiegiem wysterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie i wykonaj operację na sali operacyjnej dla zwierząt w Centrum Zoologicznym.
   5. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia zawierającej 1-3% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1 l/min. Nałóż erytromycynę na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu. Przez nacięcie skóry o długości 1 cm podwiązaj tętnicę udową i jej odgałęzienia za pomocą 5-10 jedwabnych szwów i excise¹⁹.
   6. Wstrzyknąć zieleń indocyjaninową (ICG) (0,1 ml ze 100 μg/ml) przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej w celu monitorowania przepływu krwi. Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne ICG za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego (tutaj, systemu domowej roboty) w geometrii odbicia¹¹.
   7. Wstrzyknąć domięśniowo mikrotkanki do trzech miejsc mięśnia gracilis wokół nacięcia tętnicy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 23.
   8. Po operacji utrzymuj mysz w cieple za pomocą podgrzewanej podkładki w klatce rekonwalescencji. Wstrzyknąć podskórnie meloksykam w celu złagodzenia bólu i monitorować w sposób ciągły aż do przebudzenia.
   9. Po 28 dniach monitoruj skuteczność terapeutyczną kończyny leczonej mikrotkankami 3D za pomocą obrazowania fluorescencyjnego¹¹.
      Uwaga: Wstrzyknąć podskórnie meloksykam, aby złagodzić ból, gdy u myszy wystąpiła spontaniczna amputacja kończyny.
   10. Eutanazja myszy dwutlenkiem węgla po zakończeniu eksperymentów.
       UWAGA: W tym przypadku eutanazja z użyciem dwutlenku węgla została przeprowadzona zgodnie ze ścisłym protokołem zatwierdzonym przez Komitet Etyki Zwierząt w Centrum Analiz Biomedycznych Uniwersytetu Tsinghua.

3. Montaż układu mikrotkankowego do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

1. Montaż matrycy mikrokriożelowej do hodowli komórek na chipie
   1. Zmodyfikować projekt w sekcji 1.1 zgodnie z konwencjonalnymi wymiarami płytki wielodołkowej, tj. dla formatu 384-dołkowego zaprojektować układ 16 × 24 dołków (rząd po kolumnie), każdy o średnicy 2 mm i odstępach od środka do środka wynoszący 4,5 mm.
   2. Grawerować laserowo na arkuszu PMMA o grubości 500 μm, jak opisano w rozdziale 1.1.
   3. Wytworzyć mikrokriożele zgodnie z opisem w sekcji 1.2 przy użyciu 384-ciotecznego układu matrycowego otrzymanego w kroku 3.1.2. Ta matryca zawierająca mikrokriożel jest oznaczona jako układ mikrokriożelowy.
   4. Umyj chip układu mikrokriożelu 50 ml 0,1 M NaBH₄, aby ugasić wszelkie pozostałości nieusieciowanego aldehydu, a następnie kilkakrotnie płukać 50 ml wody dejonizowanej 3 razy, za każdym razem po 2 godziny.
   5. Wylać wodę, zamrozić chip układu mikrokriożelu w temperaturze -20 °C przez 4 do 16 godzin przed liofilizacją zgodnie z krokiem 1.2.7.
   6. Zmodyfikuj projekt macierzy wielodołkowej 384 w kroku 3.1.1, aby zawierał 16 × 24 dołków, każdy o średnicy 3 mm i odstępach między środkami, wynoszący 4,5 mm.
   7. Usuń jedną stronę nośnika z arkusza ultracienkiej (10 μm) biokompatybilnej dwustronnej taśmy klejącej i przyklej ją z jednej strony kawałka arkusza PMMA o grubości 3 mm. Wygraweruj laserowo wzór z kroku 3.1.4 na tym arkuszu PMMA o grubości 3 mm zgodnie z sekcją 1.1. Ta tablica jest oznaczona jako tablica zbiornika.
   8. Dopasuj układ macierzy mikrokriożelowej do układu układu układu zbiornika i ściśle przylegaj do siebie, aby złożyć układ macierzy mikrokriożelu 3D do hodowli komórek na chipie. Sterylizować promieniowaniem ultrafioletowym przez 1 godzinę.
   9. Przechowuj chipy 3D mikrokriożelu w próżni w temperaturze pokojowej do dalszych eksperymentów.
2. Badania przesiewowe leków na matrycach mikrotkankowych 3D
   1. Napełnij mokre pudełko 25 ml sterylnej wody dejonizowanej, aby służyła jako komora wilgotnościowa do hodowli komórek. Podgrzać w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 do} temperatury 37 °C.
   2. Pobrać komórki niedrobnokomórkowego raka płuca (NCI-H460) i komórki raka wątrobowokomórkowego (HepG2) z płytek do hodowli tkankowych zgodnie ze standardowym protokołem i ponownie zawiesić w pożywce hodowlanej do końcowej gęstości 1,0 x 10⁶ komórek/ml. Dokładnie wymieszaj.
      UWAGA: W przypadku NCI-H460 stosuje się RPM1640 z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Użyj DMEM z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny dla HepG2.
   3. Wyjmij komorę wilgotnościową z inkubatora. Użyj pęsety, aby ostrożnie umieścić zmontowany chip 3D do mikrokriożelu z kroku 3.1.9 w komorze wilgotnościowej. Uważaj, aby nie zmoczyć mikrokriożeli wodą w komorze.
   4. Dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową, a następnie porcjować 3 μl zawiesiny komórek bezpośrednio na mikrokriożel do każdej studzienki.
      UWAGA: Końcówka pipety powinna lekko dotykać powierzchni mikrokriożelu przed wydaleniem zawiesiny komórek. Komórki są automatycznie ładowane do mikrokriożelu przez absorpcję. Nie rozsiewaj komórek w dołkach obwodowych.
   5. Dodaj 10 μl pożywki do każdego dołka po wysianiu komórek w mikrokriożelu za pomocą wielokanałowej pipety, takiej jak 96-kanałowy regulator cieczy. Pożywka jest również dodawana do studzienek obwodowych.
      UWAGA: Stosować RPM1640 pożywki z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny dla komórek H460. Stosować pożywki DMEM z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny dla komórek HepaG2.
   6. Hodować obciążony komórkami chip macierzy mikrokriożelowej w komorze wilgotnościowej przez 24 godziny w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C, aby utworzyć matrycę mikrotkanek 3D.
   7. Rozpuść doksorubicynę i IMMLG-8439⁹ w dimetylosulfotlenku (DMSO), tworząc roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM. Rozcieńczyć leki pożywką hodowlaną, aby uzyskać 10-krotny gradient stężenia rozcieńczenia od 2 nM do 200 μM.
   8. Do każdej studzienki dodać 10 μl roztworów leków. Użyj 0,1% DMSO (rozcieńczonego w podłożu) jako kontrolę. Inkubować układ mikrotkanek 3D załadowany lekiem w nawilżonym inkubatorze 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
   9. Dodać 4 μl roztworu podstawowego resazuryny do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Umieść matrycę mikrotkanek 3D w czytniku mikropłytek i wykryj fluorescencję rezyzuryny metabolizowanej przez żywe komórki przy długości fali światła wzbudzenia 560 nm i długości fali światła emisyjnego 590 nm.
   10. Odejmij sygnał linii bazowej rezazuryny ze wszystkich studzienek przed dalszym przetwarzaniem danych. Obliczyć frakcję żywotności komórek w każdym studzience, dzieląc jego sygnał fluorescencji przez średni sygnał fluorescencji studzienek kontrolnych.
   11. Wykreślić krzywą dawka-odpowiedź w oprogramowaniu do wykreślania z frakcją żywotności komórki jako osią Y i logarytmem o podstawie 10 stężenia leku jako osią X. Interpolować 50% stężenie inhibicji (IC50) na frakcję żywotności komórek wynoszącą 0,5.

Results

Produkcja i charakterystyka mikrokriożeli do tworzenia mikrotkanek 3D.

Zgodnie z tym protokołem, mikrokriożele zostały wytworzone w celu utworzenia mikrotkanek 3D i indywidualnych mikrokriożeli lub układów mikrokriożeli i zostały zastosowane odpowiednio do terapii regeneracyjnej i badań przesiewowych leków (Rysunek 1). Chipy Microstencil array wykonane z PMMA zostały zastosowane jako mikrofor...

Discussion

Medycyna regeneracyjna i modele in vitro do badań przesiewowych leków to dwa ważne zastosowania w inżynierii tkankowej ^5,6,7,8,9. Chociaż te dwie aplikacje mają bardzo różne potrzeby, ich wspólną płaszczyzną jest potrzeba bardziej biomimetycznych warunków hodowli w celu poprawy funkcji komórek¹⁹. Tylko dzięki poprawie funkcji k...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Żelatyna	sigma	G7041	Wszystkie inne odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), chyba że wskazano inaczej.
Aldehyd glutarowy	J& K	902042	Stosowany jako środek sieciujący w przygotowaniu materiału.
Szkiełko nakrywkowe szklane (24 x 50 mm)	CITOGLASS, Chiny	10212450C	Do zeskrobywania roztworu prekursora na chipy matrycy mikroszablonów.
Sód  borowodorek, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	Do wypłukiwania pozostałego aldehydu glutarowego po żelowaniu.
Słoik próżniowy	asperts, Chiny	VC8130	Do przechowywania mikrożeli w próżni.
Płyty z polimetakrylanu metylu (PMMA)	Sunjin Electronics Co., Ltd, Chiny		Zwykłe arkusze PMMA.
System laserowy Rayjet	Rayjet, Australia	Rayjet 50 C30	Do grawerowania arkuszy PMMA w celu formowania dołków.
Środek do czyszczenia plazmy	Mycro Technologies, USA	PDC-32G	Aby PMMA był hifofilny.
Liofilizator	Boyikang, Chiny	SC21CL	Do liofilizacji materiałów.
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)	Zhongkekeao, Chiny	DA0065	Do barwienia mikrożeli.
Chlorowodorek doksorubicyny	ENERGY CHEMICAL, Chiny	A01E0801360010	Do badania lekooporności komórek w mikrożelu 2D lub 3D.
Test żywy/martwy	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japonia)	CS01-10	Do rozróżniania żywych i martwych komórek.
Miano komórki-Blue	Promega (Wisconsin, Stany Zjednoczone).	G8080	Do testowania żywotności ogniw.
Sitko do komórek	BD Biosciences, USA	352360	Do zbierania mikrożeli.
D-Lucyferyna	SYNCHEM (Niemcy)	s039	Do sczepiania komórek.
Skaningowy mikroskop elektronowy	FEI, USA	Quanta 200	Do charakteryzowania morfologii mikrożeli.
Mechaniczna maszyna wytrzymałościowa	Bose, USA	3230	Do pomiaru cech mechanicznych.
Programowalna pompa strzykawkowa	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	Do testowania injactabiliy.
Cyfrowy miernik siły	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., Chiny	H-50	Aby przetestować injactabiliy.
System sterylizacji tlenkiem etylenu	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	Do sterylizacji mikrożeli gazowym tlenkiem etylenu.
Czytnik mikropłytek	Urządzenia molekularne, USA	M5	Do pomiaru intensywności fluorescencji w mikroukładzie.
Mikroskop konfokalny	Nikon, Japonia	A1Rsi	Do obserwacji rozmieszczenia komórek w 3D.
Ksenogen  System obrazowania Lumina II	Caliper Life Sciences, USA	IVIS	Do śledzenia komórek u zwierząt.
Płynna praca stataion	Morelowy wzór, amerykańska	pipeta S	Do wysokiego obciążenia zawiesiny średniej lub komórkowej.