Artykuł metodologiczny

Skutki narażenia na działanie formaldehydu na szczurzy model atopowego zapalenia skóry wywołanego leczeniem kapsaicyną u noworodków

DOI:

10.3791/55987

⸱

27 września 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Research Institute & Department of Physiology, College of Medicine, Korea University, 2Department of Pharmaceutics and Biotechnology, College of Medical Engineering, Konyang University, 3Division of Biological Science and Technology, Science and Technology College, Yonsei University Wonju Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metody leczenia noworodków kapsaicyną w celu wywołania atopowego zapalenia skóry u szczurów oraz ekspozycję na odparowany formaldehyd, aby zbadać wpływ inhalacji formaldehydu na atopowe zapalenie skóry.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopowe zapalenie skóry to przewlekle nawracająca egzema świądowa, która występuje na całym świecie, szczególnie w krajach rozwiniętych. Wiadomo, że złożone interakcje między czynnikami genetycznymi i środowiskowymi odgrywają ważną rolę w patofizjologii atopowego zapalenia skóry. Wciąż jednak brakuje nam szczegółowego obrazu patogenezy tej choroby. Dlatego tak ważne jest opracowanie odpowiednich modeli zwierzęcych w celu wyjaśnienia postępu atopowego zapalenia skóry. Co więcej, badanie wpływu czynników środowiskowych, takich jak zanieczyszczenia powietrza, na atopowe zapalenie skóry poszerza wiedzę na temat tej choroby. W tym miejscu opisujemy metodę wywoływania atopowego zapalenia skóry u szczurów za pomocą leczenia kapsaicyną u noworodków oraz protokół ekspozycji szczurów na stałe stężenie formaldehydu w celu ujawnienia wpływu na rozwój atopowego zapalenia skóry w okresie niemowlęcym i młodzieńczym. Protokoły te zostały z powodzeniem zastosowane w kilku eksperymentach i mogą być stosowane do innych substancji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać wpływ inhalacji formaldehydu (FA) na postęp atopowego zapalenia skóry (AD), ustaliliśmy protokół indukcji AD i opracowaliśmy konwencjonalną komorę krążenia do przewlekłego narażenia na FA.

AD to przewlekła choroba zapalna skóry, przypisywana złożonym interakcjom między predyspozycjami genetycznymi a wyzwalaczami środowiskowymi1,2. Do badania AD w stanie przedklinicznym wymagany jest odpowiedni model zwierzęcy. Jest to szczególnie istotne przy wyjaśnianiu patogenezy choroby Alzheimera pod wpływem czynników środowiskowych. Ponadto, aby lepiej zbadać wpływ czynników środowiskowych na postęp choroby Alzheimera, konieczne jest oddzielenie poszczególnych czynników środowiskowych i ilościowe określenie stopnia narażenia.

Pokazaliśmy nowy szczurzy model choroby Alzheimera wywołanej leczeniem noworodków kapsaicyną. Ten model AD3 ma pewne zalety w porównaniu z innymi modelami AD, takimi jak modele AD indukowane przez uczulenie naskórne, genetycznie modyfikowane modele AD i spontaniczne modele myszy AD4. Po pierwsze, w modelu tym objawy podobne do choroby Alzheimera pojawiają się w wieku 3 tygodni, co odpowiada chorobie Alzheimera u niemowląt i jest wcześniejsze niż w przypadku innych spontanicznych mysich modeli choroby Alzheimera, takich jak mysz NC/Nga. W niektórych przypadkach, w przeciwieństwie do genetycznie modyfikowanych modeli AD, objawy modeli AD ustępują i nawracają spontanicznie w ciągu 20 tygodni. Co więcej, proces indukcji objawów podobnych do AZS w modelu jest łatwiejszy niż w modelu uczulenia naskórnego, który w perspektywie procesu indukcji jest bardziej zbliżony do alergicznego kontaktowego zapalenia skóry.

Wprowadziliśmy nowy protokół ekspozycji na FA na modelu zwierzęcym, używając komory ze szkła akrylowego i konwencjonalnego regulatora tlenu medycznego5 do badania wpływu inhalacji FA na rozwój AD w okresie niemowlęcym i młodzieńczym. Reduktor pozwolił nam wystawić zwierzęta na działanie stałego stężenia gazu poprzez regulację natężenia przepływu i stężenia roztworu. Wcześniejsze badania opisywały kilka sposobów ekspozycji FA na modele zwierzęce. Xu i wsp. opisali metodę ekspozycji, w której roztwór FA został bezpośrednio nałożony na skórę6. Inne niedawne badanie dotyczyło protokołu ekspozycji na gaz FA przy użyciu specjalistycznego generatora lotnych rozpuszczalników, model 49127. W porównaniu z metodami poprzednich badań, nowa metoda jest łatwiejsza w wyposażeniu i może być stosowana do innych rozwiązań oprócz FA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Międzynarodowy Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Koreańskiego Uniwersytetu Medycznego College of Medicine. 6 tygodni po urodzeniu eksperymentatorzy mogą wywołać entanazję i pobrać różne próbki, takie jak skóra i surowica szczurów.

1. Indukcja AD przez leczenie noworodków kapsaicyną

  1. Aby przygotować roztwór kapsaicyny o stężeniu 5 mg/ml, dodaj 50 mg kapsaicyny do 1 ml Tween 80 i 1 ml 100% etanolu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  2. Dodaj 8 ml soli fizjologicznej do stożkowej probówki. Energicznie potrząsaj probówką, aż nie będą widoczne żadne oddzielone warstwy
  3. Wstrzyknąć roztwór kapsaicyny (10 μl/g) do tkanki podskórnej, w linię środkową i tylną stronę szyi nowonarodzonego szczura Sprague-Dawley.
    1. Kapsaicynę należy dostarczyć w okresie od 12 do 48 godzin po urodzeniu (KRYTYCZNE).
      UWAGA: Jeśli wstrzyknięcie opóźni się o więcej niż kilka dni, zapalenie skóry nie rozwinie się lub będzie utrzymywało się tylko przez kilka tygodni. Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt wczesne, może wystąpić niewydolność oddechowa z powodu silnego bólu.
    2. Aby zapobiec zatrzymaniu oddechu u nowonarodzonych szczurów w wyniku wstrzyknięcia kapsaicyny, należy popchnąć klatkę piersiową noworodków, aby zachęcić ich do oddychania lub trzymać noworodki w komorze tlenowej, dopóki oddychanie nie stanie się normalne. Ponieważ ból wywołany kapsaicyną może zniechęcać do oddychania, dodanie znieczulenia ogólnego może pogorszyć trudności w oddychaniu. Dlatego eksperymentatorzy nie powinni stosować środków znieczulających w celu zwiększenia przeżywalności szczurów.

2. Ocena świądu i zapalenia skóry w szczurzym modelu AD

  1. Pomiar świądu poprzez zliczanie spontanicznego drapania
    1. Przygotuj plastikowe komory (20 cm x 30 cm x 20 cm) wyposażone w lustro, aby umożliwić pełne zakrycie do oglądania oraz otwory, aby umożliwić szczurom oddychanie.
    2. Odpowiednio skonfiguruj i dostosuj cyfrową kamerę wideo, aby jednocześnie nagrywać widoki lustrzane i widoki z przodu szczurów.
    3. Umieść szczury w plastikowej komorze i przykryj sufit komory ciężkim przedmiotem, aby zapobiec otwarciu.
    4. Nagrywaj spontaniczne zachowania szczurów przez 1 godzinę, odtwarzaj klipy wideo i policz liczbę zachowań związanych z drapaniem.
  2. Ocena zmian skórnych za pomocą systemu punktacji
    1. Umieść szczura w komorze indukcyjnej.
    2. Ustaw przepływomierz tlenu na natężenie przepływu 2 l/min i wyreguluj parownik izofluranu na 3% w celu znieczulenia.
    3. Zidentyfikuj zakres i nasilenie zapalenia skóry w uszach i innych częściach szczura.
    4. Zdefiniuj wielkość jednostki dla rozległości zmian skórnych jako 0,25cm2 i nasilenie zmian skórnych, postępując zgodnie z tabelą 1: wskaźnik nasilenia; stopień oceny zapalenia skóry poprzez pomnożenie zakresu i nasilenia (patrz ocena zapalenia skóry w Rysunek 1B).

3. Narażenie zwierząt na działanie gazowych FA

  1. Przygotowanie komory inhalacyjnej
    1. Przygotuj pudełko ze szkła akrylowego (55 cm x 40 cm x 35 cm), które ma dwa wyloty po przeciwnych stronach.
    2. ostrożność. W celu cyrkulacji gazu FA należy umieścić wylot wyżej niż wlot i sprawić, aby rozmiar wylotu był większy niż wlot.
    3. ostrożność. W celu pomiaru wewnętrznego stężenia gazu, po drugiej stronie wylotów, wywierć trzy małe przejścia, które można zamknąć.
    4. Podłącz rurki do obu wylotów. Umieść rurkę wylotową w okapie cyrkulacyjnym lub na zewnątrz budynku w celu emisji gazu, a drugą rurkę wylotową podłącz do regulatora tlenu medycznego.
    5. Umieść konwencjonalną klatkę dla szczurów w pudełku ze szkła akrylowego.
    6. Szczury należy umieszczać w klatce od tygodnia po urodzeniu przez 5 tygodni (2 godziny dziennie i 5 dni w tygodniu).
    7. Uszczelnij pudełko ze szkła akrylowego tak szczelnie, jak to możliwe, aby zapobiec wyciekowi gazu.
      UWAGA: Aby zapewnić szczelne uszczelnienie, pokrywa komory powinna zawierać gumę. Nałożyć folię spożywczą, aby owinąć komorę, aby uzyskać szczelne uszczelnienie.
  2. Wytwarzanie gazowego FA za pomocą medycznego regulatora tlenu
    1. Rozpuścić 5 g FA w 1 l wody.
    2. Umieść 0.5% roztwór FA w butelce nawilżacza regulatora tlenu medycznego.
    3. Po podłączeniu rurki dopływowej do reduktora należy włączyć regulator i ustawić natężenie przepływu na 5 L/min.
    4. Dostosuj stężenie roztworu i natężenie przepływu, aby określić stężenie gazu w komorze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobne do AD zapalenie skóry u szczurzego modelu AD leczonego kapsaicyną w wieku 7 tygodni jest przedstawione w Rysunek 1A. Solidne zachowanie drapania modelu szczura z AD leczonego kapsaicyną pokazano na filmie 1. Leczenie kapsaicyną u noworodków wywołało zapalenie skóry i nasilenie drapania u szczurów w wieku 3 tygodni, a objawy podobne do AD utrzymywały się przez kilka tygodni (Ryc. 1B, C). Chociaż stopień był ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół indukcji objawów podobnych do choroby Alzheimera u szczurów może być zaadaptowany do badania patofizjologii choroby Alzheimera i wykorzystany jako narzędzie przesiewowe do testów narkotykowych. Przyrząd do ekspozycji gazowego FA na szczury leczone kapsaicyną może być zastosowany do oceny skutków narażenia na różne gazy na różnych modelach zwierzęcych.

Model AD leczony kapsaicyną u noworodków opiera się na prostszej procedurze niż inne modele atopowe, takie jak model lecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez program badawczy Public Welfare & Safety przez National Research Foundation of Korea (NRF) finansowane przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (NRF-2014M3C8A5030612) i wspierane przez The Chung Yang, Cha Young Sun, M.D. i Jang Hi Joo Yeu Sa Memorial Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Medyczny regulator tlenuYuyao Jiahua Producent medycznynie wpłynie na wyniki
Producent rurkinie wpłynie na wyniki
Komora akrylowaTaejin Producent akrylunie wpłynie na wyniki
Plastikowa komoraTaejin Producent akrylunie wpłynie na wyniki
Paraformaldehyd, proszekProducent Sigma158127nie wpłynie na wyniki
Producent folii WrapUniwrapnie wpłynie na wyniki
Producent kapsaicynySigmaM2028nie wpłynie na wyniki
Tween 80Producent SigmaP4780nie wpłynie na wyniki
ProducentSonyHDR-CX380ynie będzie miał wpływu na wyniki wpływać na wyniki
IsofluraneJW producent farmaceutycznynie wpłynie na wyniki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geha, R. S. Allergy and hypersensitivity. Nature versus nurture in allergy and hypersensitivity. Curr Opin Immunol. 15 (6), 603-608 (2003).
  2. Novak, N., Bieber, T., Leung, D. Y. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. The J Allergy Clin Immunol. 112 (Suppl 6), S128-S139 (2003).
  3. Back, S. K., et al. Chronically relapsing pruritic dermatitis in the rats treated as neonate with capsaicin; a potential rat model of human atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 67 (2), 111-119 (2012).
  4. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129 (1), 31-40 (2009).
  5. Han, R. T., et al. Formaldehyde-Induced Aggravation of Pruritus and Dermatitis Is Associated with the Elevated Expression of Th1 Cytokines in a Rat Model of Atopic Dermatitis. PLOS ONE. 11 (12), e0168466(2016).
  6. Xu, B., Aoyama, K., Takeuchi, M., Matsushita, T., Takeuchi, T. Expression of cytokine mRNAs in mice cutaneously exposed to formaldehyde. Immunol Lett. 84 (1), 49-55 (2002).
  7. Kim, J. Y., Jeong, M. S., Park, K. Y., Seo, S. J. Aggravation of atopic dermatitis-like symptoms by consecutive low concentration of formaldehyde exposure in NC/Nga mice. Exp Dermatol. 22 (3), 219-221 (2013).
  8. Laske, N., Niggemann, B. Does the severity of atopic dermatitis correlate with serum IgE levels? Pediatr Allergy Immunol. 15 (1), 86-88 (2004).
  9. Fujii, Y., Takeuchi, H., Sakuma, S., Sengoku, T., Takakura, S. Characterization of a 2,4-dinitrochlorobenzene-induced chronic dermatitis model in rats. Skin Pharmacol Physiol. 22 (5), 240-247 (2009).
  10. Sugimoto, T., Xiao, C., Ichikawa, H. Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res. 807 (1-2), 147-154 (1998).
  11. Saito, A., et al. Characterization of skin inflammation induced by repeated exposure of toluene, xylene, and formaldehyde in mice. Environ Toxicol. 26 (3), 224-232 (2011).
  12. Jung, W. W., et al. Formaldehyde exposure induces airway inflammation by increasing eosinophil infiltrations through the regulation of reactive oxygen species production. Environ Toixcol Pharmacol. 24 (2), 174-182 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspozycja na formaldehydzmiany sk rnezachowanie drapaniasurowicze IgEekspresja IL 4ekspresja IL 13zaostrzenie wi du

Powiązane artykuły