Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55988

⸱

19 czerwca 2017

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj proponujemy protokół chondrogenicznego różnicowania od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.

Streszczenie

Ludzka chrząstka stawowa nie ma zdolności do samonaprawy. Zwyrodnienie chrząstki leczy się zatem nie za pomocą leczenia leczniczego, ale zachowawczego. Obecnie prowadzone są prace nad regeneracją uszkodzonej chrząstki za pomocą ekspandowanych chondrocytów ex vivo lub mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (BMSC). Jednak ograniczona żywotność i niestabilność tych komórek ogranicza ich zastosowanie w odbudowie chrząstki. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) zyskały uwagę naukowców jako nowa alternatywa dla zastosowań regeneracyjnych. Dzięki nieograniczonej zdolności do samoodnawiania się i wielomocy, hiPSC zostały wyróżnione jako nowe zastępcze źródło komórek do naprawy chrząstki. Jednak uzyskanie dużej ilości wysokiej jakości granulek chondrogennych jest dużym wyzwaniem dla ich zastosowania klinicznego. W tym badaniu wykorzystaliśmy komórki wyrostka pochodzące z ciała embrionoidalnego (EB) do różnicowania chondrogennego. Pomyślną chondrogenezę potwierdzono za pomocą PCR i barwienia błękitem alcjanowym, błękitem toluidynowym oraz przeciwciałami przeciwko kolagenowi typu I i II (odpowiednio COL1A1 i COL2A1). Przedstawiamy szczegółową metodę różnicowania iPSC pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi pępowinowej (CBMC-hiPSC) w granulki chondrogenne.

Wprowadzenie

Użycie hiPSC stanowi nową strategię badań przesiewowych leków i badań mechanistycznych różnych chorób. Z perspektywy regeneracyjnej hiPSC są również potencjalnym źródłem wymiany uszkodzonych tkanek, które mają ograniczoną zdolność gojenia, takich jak chrząstka stawowa1,2.

Regeneracja rodzimej chrząstki stawowej była wyzwaniem od kilkudziesięciu lat. Chrząstka stawowa to miękka, biała tkanka, która pokrywa koniec kości, chroniąc je przed tarciem. Ma jednak ograniczoną zdolność regeneracji po uszkodzeniu, co sprawia, że samodzielna naprawa jest prawie niemożliwa. W związku z tym badania ukierunkowane na regenerację chrząstki trwają już od kilkudziesięciu lat.

Poprzednio, różnicowanie in vitro do linii chondrogennej było zwykle przeprowadzane za pomocą BMSC lub natywnych chondrocytów wyizolowanych ze stawu kolanowego3. Ze względu na swój potencjał chondrogeneczny, BMSC i natywne chondrocyty mają wiele zalet wspierających ich zastosowanie w chondrogenezie. Jednak ze względu na ograniczoną ekspansję i niestabilny fenotyp, komórki te napotykają kilka ograniczeń w rekonstrukcji ubytków chrząstki stawowej. W warunkach hodowli in vitro komórki te mają tendencję do utraty własnych cech po 3-4 pasażach, co ostatecznie wpływa na ich zdolności różnicowania4. Również w przypadku natywnych chondrocytów dodatkowe uszkodzenie stawu kolanowego jest nieuniknione przy pozyskiwaniu tych komórek.

W przeciwieństwie do BMSC lub natywnych chondrocytów, hiPSC mogą się rozwijać in vitro w nieskończoność. Przy odpowiednich warunkach hodowli hiPSC mają ogromny potencjał jako źródło zastępcze dla różnicowania chondrogennego. Trudno jest jednak zmienić wewnętrzne cechy hiPSCs5. Co więcej, potrzeba kilku skomplikowanych etapów in vitro, aby skierować los hiPSC do określonego typu komórek. Pomimo tych powikłań, stosowanie hiPSC jest nadal zalecane ze względu na ich wysoką zdolność do samoodnawiania się i zdolność do różnicowania się w docelowe komórki, w tym chondrocyty6.

Różnicowanie chondrogenne odbywa się zazwyczaj za pomocą trójwymiarowych systemów hodowli, takich jak hodowla granulek lub hodowla mikromas, przy użyciu komórek progenitorowych podobnych do MSC. W przypadku stosowania hiPSC protokół generowania komórek progenitorowych podobnych do MSC różni się od istniejących protokołów. Niektóre grupy wykorzystują jednowarstwową hodowlę hiPSC do bezpośredniej konwersji fenotypu na komórki podobne do MSC7. Jednak większość badań wykorzystuje EB do generowania komórek wzrostu, które przypominają MSCs8,9,10,11.

Różne rodzaje czynników wzrostu są używane do indukowania chondrogenezy. Zwykle stosuje się białka z rodziny BMP i TGFβ, pojedynczo lub w połączeniu. Zróżnicowanie zostało również wywołane przez inne czynniki, takie jak GDF5, FGF2 i IGF112,13,14,15. Wykazano, że TGFβ1 stymuluje chondrogenezę w sposób zależny od dawki w MSCs16. W porównaniu z innym izotypem, TGFβ3, TGFβ1 indukuje chondrogenezę poprzez zwiększenie kondensacji komórek mezenchymalnych przed chrząstką. TGFβ3 indukuje chondrogenezę poprzez znaczne zwiększenie proliferacji komórek mezenchymalnych17. Jednak TGFβ3 jest częściej używany przez badaczy niż TGFβ17,10,18,19. BMP2 zwiększa ekspresję genów związanych ze składnikami macierzy chondrogennej w ludzkich chondrocytach stawowych w warunkach in vitro20. BMP2 zwiększa ekspresję genów krytycznych dla tworzenia chrząstki w MSCs w połączeniu z białkami TGFβ21. Wykazano również, że BMP2 synergistycznie wzmacnia działanie TGFβ3 poprzez szlaki Smad i MAPK22.

W tym badaniu, CBMC-hiPSC zostały zagregowane do EB za pomocą pożywki EB na szalce Petriego o niskim stopniu przyczepienia. Komórki przerostu indukowano poprzez przymocowanie EB do naczynia pokrytego żelatyną. Różnicowanie chondrogenne za pomocą komórek odrastających przeprowadzono za pomocą hodowli osadów. Leczenie zarówno BMP2, jak i TGFβ3 skutecznie zagęściło komórki i indukowało akumulację białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w celu utworzenia osadu chondrogennego. Badanie to sugeruje prosty, ale skuteczny protokół różnicowania chondrogennego z wykorzystaniem CBMC-hiPSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC12TISI0861). CBMC używane do przeprogramowania zostały pozyskane bezpośrednio z Banku Krwi Pępowinowej Szpitala St. Mary's Hospital w Seulu.

1. Różnicowanie chondrogenne od iPSC

  1. Generacja CBMC-iPSC
    1. Wygeneruj CBMC-hiPSC za pomocą protokołu pokazanego w naszym poprzednim work23.
    2. Zebrać komórki krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i policzyć je za pomocą hemocytometru.
    3. Przygotować 3 x 105 komórek i odwirować je przez 5 minut przy 515 x g i RT. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml pożywki z krwinkami.
    4. Przenieść komórki do dołka na niepowlekanej płytce 24-dołkowej i dodać mieszaninę wirusa Sendai, postępując zgodnie z zaleceniami producenta.
    5. Odwirować płytkę przez 30 minut w temperaturze 1,150 x g i temperaturze 30 °C.
    6. Po odwirowaniu inkubować komórki przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
    7. Następnego dnia przenieś transdukowane komórki do studzienki pokrytej matrycą. Odwirować płytkę o sile 1 150 x g przez 30 minut w temperaturze 30 °C.
    8. Po odwirowaniu usunąć supernatant, dodać 1 ml pożywki iPSC i utrzymać komórki O/N w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
    9. Utrzymać przyłączone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże codziennie, zastępując je nowym podłożem iPSC.
      UWAGA: Kolonie pojawią się w dniach 14-21 po transdukcji.
  2. Generowanie EB
    1. Utrzymuj hiPSC na poziomie 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże codziennie, zastępując je świeżym podłożem Essential 8 (E8).
    2. Przygotuj 2 x 106 hiPSC w pokrytym witronektyną, 100-milimetrowym naczyniu w pożywce E8.
    3. Usunąć pożywkę E8 z naczynia hodowlanego i przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
    4. Dodać 1 ml 1 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 minuty.
    5. Zbierz komórki z 3 ml pożywki E8 i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 250 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 minuty.
    6. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki E8.
    7. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj 2 x 106 komórek na każdą 100 mm szalkę Petriego. Ponownie zawiesić przygotowane komórki w 10-mililitrowej mieszaninie pożywki E8 i EB (1:1) z inhibitorem 10 μM kinazy związanej z rho (ROCK).
    8. Inkubować komórki O/N do agregacji w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .
    9. Następnego dnia zebrać zagregowane EB przez pipetowanie. Odwirować komórki przy 250 x g przez 1 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić EB w 10 ml świeżej pożywki E8.
    10. Powiększaj wygenerowane EB przez 5 dni, wykonując codzienne zmiany za pomocą świeżej pożywki E8. W celu dalszego dojrzewania zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę E7. Utrzymuj EB na poziomie 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 5 dni, wykonując codzienne zmiany pożywki za pomocą świeżej pożywki E7.
      UWAGA: Pożywka E7 to pożywka E8 bez FGF2.
  3. Indukcja komórek wzrostu z EB
    1. Dodać 6 ml 1% żelatyny do naczynia o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
    2. Usuń żelatynę i całkowicie osusz naczynie przez 2-3 godziny przed użyciem.
    3. Przenieś EB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pozwól, aby EB osiadły na dnie stożkowej rurki. Usunąć supernatant bez naruszania EBs.
    4. Ponownie zawiesić EB w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przenieś EB do pokrytego żelatyną naczynia o średnicy 100 mm. Dodać 10 μM inhibitora ROCK.
    5. Inkubować i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień bez dodawania inhibitora ROCK.
  4. Tworzenie się osadów chondropennych
    1. Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia i trzykrotnie umyć komórki PBS.
    2. Nałożyć 1 ml 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 minuty.
    3. Zbierz komórki za pomocą 5 ml DMEM z 20% FBS i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować komórki przez 2 minuty przy 250 x g i RT. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM z 20% FBS.
    5. Przefiltruj i odrzuć grudki komórek za pomocą sitka do komórek 40 μm i zbierz pojedyncze komórki. Policz pojedyncze komórki za pomocą hemocytometru.
    6. Odwirować komórki przez 2 minuty przy 250 x g i RT. Usunąć supernatant i wysiać 3 x 105 komórek na granulkę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 300 μl pożywki do różnicowania chondrogennego (CDM).
    7. W celu uzyskania osadu należy odwirowywać komórki przez 5 minut przy 680 x g i RT.
      UWAGA: Granulki są utrzymywane w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml podczas różnicowania granulek chondrogennych.
    8. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    9. Zmieniaj CDM co 2-3 dni. W ciągu 3 dni granulki będą wykazywać spłaszczoną, sferoidalną morfologię. Utrzymuj pelety przez 21 dni w temperaturze 37°C i 5% CO2 .

2. Charakterystyka chondrogenicznych osadów przez barwienie

  1. Osadzanie chondrogenne
    1. Przed zatopieniem przygotować i rozpuść parafinę w temperaturze 58 °C.
    2. Utrwal granulki w 1 ml 4% paraformaldehydu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w probówce o pojemności 1,5 ml.
      Uwaga: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny. Unikać kontaktu z oczami, skórą lub błonami śluzowymi. Zminimalizuj narażenie i unikaj inhalacji podczas przygotowywania go.
    3. Umieść jedną warstwę gazy na kasecie i przenieś utrwalone granulki za pomocą pipety. Przykryj granulkę, składając gazę i zamknij pokrywę kasety.
    4. Rozpocznij odwodnienie w 100 ml 70% etanolu (EtOH) dwa razy po 10 minut. Odwodnić granulki poprzez sekwencyjne 10-minutowe płukanie w 80% i 95% EtOH.
    5. Przenieś granulki do 100% EtOH na 10 minut. Powtórz trzy razy ze świeżym EtOH.
    6. W celu "oczyszczenia" należy wymienić roztwór na 100 ml mieszaniny EtOH i ksylenu w proporcji 1:1, a następnie mieszaninę EtOH i ksylenu w proporcji 1:2 na 10 minut. Usuń pozostały EtOH, inkubując granulki dwukrotnie w 100% ksylenie, po 10 minut każdy.
    7. W celu infiltracji parafiny inkubować granulki w sekwencyjnych mieszaninach ksylenu i parafiny. Przeprowadzić cały proces infiltracji parafiny w temperaturze 58 °C. Inkubować granulki w 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w proporcji 2:1 przez 30 minut.
    8. Zamień roztwór na 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w stosunku 1:1 i inkubuj przez 30 minut.
    9. Zamień roztwór na 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w stosunku 1:2 i inkubuj przez 30 minut.
    10. W celu końcowej infiltracji przenieść granulki do pierwszej kąpieli 100% parafiny i inkubować przez 2 godziny.
    11. Przenieść granulki do drugiej kąpieli 100% parafiny i inkubować O/N w temperaturze 58 °C.
    12. Następnego dnia delikatnie przenieś granulki do formy za pomocą pęsety. Dodaj parafinę do formy z dozownika parafiny. Zestalać parafinę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    13. Pokrój sekcje na kawałki z prędkością 7 μm i przenieś je na szkiełko. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc i przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do użycia.
  2. Przygotowanie preparatów
    1. Odparafinować szkiełka, przesuwając je przez 100 ml 100%, 90%, 80% i 70% EtOH sekwencyjnie przez 5 minut każda.
    2. Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 5 minut.
  3. Barwienie błękitem alcyjskim
    1. Inkubować szkiełka w 50 ml 1% roztworu błękitu alcyjanowego przez 30 min.
      UWAGA: Błękit alcian rozcieńcza się w 3% roztworze kwasu octowego. Dostosuj pH do 2,5 za pomocą kwasu octowego.
    2. Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 2 minuty.
    3. Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej (DW) i przebarwiaj je roztworem do trwałej czerwieni jądrowej przez 2 minuty.
    4. Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 1 minutę.
    5. 2.3.5)Przejdź do odwadniania i montażu zjeżdżalni w kroku 2.6.
  4. Barwienie błękitem toluidynowym
    1. Inkubować szkiełka w 50 ml roztworu błękitu toluidynowego przez 4 minuty.
    2. Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 5 minut.
    3. Przejdź do odwadniania i montażu zjeżdżalni w kroku 2.6.
  5. Barwienie immunohistochemiczne
    1. Inkubować szkiełka w 3% H2O2przez 15 minut w celu zablokowania endogennej peroksydazy.
    2. Na szkiełka nanieść 200 μl pierwszorzędowego przeciwciała (anty-COL1A1 i -COL2A1) rozcieńczonego w stosunku 1:100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5% normalnej surowicy koziej (NGS) i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
    3. Następnego dnia umieść szkiełka w szklanym słoiku i umyj je 50 ml TBS zawierającego 0,1% polisorbatu 20 (TBST) trzy razy po 5 minut każde.
    4. Na szkiełka nanieść 200 μl przeciwciała drugorzędowego (kozie przeciwciało anty-królicze IgG, rozcieńczone w stosunku 1:200 w TBS zawierającym 1% BSA i 5% NGS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut.
    5. Umieść szkiełka w szklanym słoiku i umyj je trzy razy po 50 ml każde, po 5 minut.
    6. W celu wzmocnienia sygnału nanieść sprzężony z HRP roztwór streptawidyny na szkiełka i inkubować przez 10 minut.
    7. Umieść szkiełka w szklanym słoiku i umyj je trzy razy po 50 ml każde, po 5 minut.
    8. Wymieszać roztwór substratu peroksydazy DAB, nanieść 200 μl roztworu na każde szkiełko i inkubować przez 1 minutę.
    9. Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 5 minut.
    10. Barwienie przeciwstawne hematoksyliną Mayera przez 1 min.
    11. Umyj szkiełka za pomocą DW.
    12. Przejdź do odwadniania i montażu zjeżdżalni w kroku 2.6.
  6. Odwodnienie i montaż
    1. Odwodnić szkiełka, przesuwając je sekwencyjnie przez 100 ml 70%, 80%, 90% i 100% EtOH każda, po 30 s każda.
    2. Zanurz szkiełka w dwóch zmianach ksylenu na 1 minutę każda.
    3. Dodaj 50 μl roztworu montażowego do szkiełek nakrywkowych i umieść szkiełka na wierzchu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu wytworzono pellety chondrogenne z CBMC-hiPSCs poprzez indukcję komórek przerostu (outgrowth cells) z ciałek embrionoidalnych (EBs). Różnicowanie chondrogenne indukowano przy użyciu CBMC-hiPSCs o potwierdzonym wysokim stopniu pluripotencji11. Uproszczony schemat naszego protokołu przedstawiono na Rysunku 1A. Przed różnicowaniem kolonie iPSC poddano ekspansji (Rysunek 1B). Zekspandowane ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten z powodzeniem wygenerował hiPSC z CBMC. Przeprogramowaliśmy CBMC na hiPSC za pomocą wektora wirusowego Sendai zawierającego czynniki Yamanaka24. Trzy przypadki wykorzystano do różnicowania, a wszystkie eksperymenty z powodzeniem wygenerowały chondrogenne granulki przy użyciu tego protokołu. W licznych badaniach opisano protokoły różnicowania hiPSC w chondrocyty 25,26,27,28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z projektu badawczo-rozwojowego Korea Healthcare Technology, Ministerstwa Zdrowia, Opieki Społecznej i Spraw Rodzinnych, Republiki Korei (HI16C2177).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wyroby z tworzywa sztucznego
100 mm NaczynieTPP93100
Płytka 6-dołkowaTPP92006
50 ml Rurka rogowaSPL50050
15 ml Rurka rogowaSPL50015
10 ml Pipeta jednorazowaFalcon7551
5 ml Jednorazowa pipetaFalcon7543
12-dołkowa płytkaTPP92012
NazwaCompanyNumer katalogowyOpis
E8 Medium Materiały
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057E8 Medium (500 mL)
Wodorowęglan soduLife Technologies25080-094E8 Medium (stężenie: 543 μ g/mL)
Selenin soduSigma AldrichS5261E8 Medium  (Stężenie: 14 ng/ml)
Ludzka transfferynaSigma AldrichT3705E8 Medium (stężenie: 10,7 μ g/mL)
Basic FGF2Peprotech100-18BE8 Średni  (Stężenie: 100 ng/ml)
Human InsulinLife Technologies12585-014E8 Pożywka (stężenie: 20 μ g/mL)
Ludzkie TGF i beta; 1Peprotech100-21E8 Medium (stężenie: 2 ng/mL)
Kwas askorbinowySigmaAldrich A8960E8 Medium  (Konk.: 64 i mu; g/mL)
DPBSLife Technologies14190-144
VitronectinLife TechnologiesA14700
ROCK InhibitorSigma AldrichY0503
NazwaFirmaNumer katalogowyOpis
Materiały do kontroli jakości< / mocny>
18 mm Szkło osłonoweSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnowacjaBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
Albumina surowicy bydlęcejVector LabSP-5050
Przeciwciało anty-SSEA4MilliporeMAB4304
Przeciwciało anty-Oct4Santa CruzSC9081
Przeciwciało anty-TRA-1-60MilliporeMAB4360
Przeciwciało anty-Sox2Biolegend630801
Przeciwciało anty-TRA-1-81 PrzeciwciałoMilliporeMAB4381
Przeciwciało anty-Klf4Abcamab151733
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L)Sonda molekularnaA11029
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)Sonda molekularnaA11037
Sonda molekularnaDAPID1306
Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciuInvitrogenP36934
4% ParaformaldyhydeTech & InnowacjaBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Albumina surowicy bydlęcejWektor LabSP-5050
Przeciwciało antykolagenowe IIabcam ab347121:100
Alcian blueSigma AldrichA3157-10G
Fast GreenFCF Sigma AldrichF7252-25G
Safranin OSigma Aldrich090m0039v
Nuclear fast redAmericanmastertechSTNFR100 
ksylenDuksan115 
EtanolDuksan64-17-5
Roztwór hematoksyliny Mayeradla czystego przemysłu chemicznegoLAK7534
DAPVECTOR LABORATORIESSK-4100
Szkło ślizgowe, powlekaneHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
ChloroformSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EthanolDuksan64-17-5
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA RevertAidThermo ScientficK1622
NazwaFirmaNumer katalogowy Opis
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEMLife Technologies11885Składnik podłoża chondrogennego (500 ml)
Penicilina StreptomycynaLife TechnologiesP4333Składnik podłoża chondrogennego (stężenie: 1%)
Kwas askorbinowySigma AldrichA8960Składnik pożywki chondrogennej (stężenie: 64 μ g/ml) 
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Life Technologies11140-050Składnik podłoża chondrogennego (Konc.: 100 mM)
rhBMP-2R& D355-BM-050Składnik podłoża chondrogennego (stężenie: 100 ng / ml)
Rekombinowany Hman TGF-beta3R& D243-B3-002Składnik podłoża chondrogennego (Stężenie: 10 ng / ml)
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028Składnik podłoża chondrogennego (Stężenie: 1%)
ITS+ PremiksBD354352Składnik podłoża chondrogennego (Konc.: 1%)
Deksametazon-Rozpuszczalny w wodzie Sigma AldrichD2915-100MGSkładnik podłoża chondrogennego (Konc.:10-7 M)
GlutaMAX SuplementLife Technologies35050-061Składnik podłoża chondrogennego (Konc.: 1%)
Roztwór pirogronianu soduSigma AldrichS8636Składnik podłoża chondrogennego (stężenie: 1%)
L-ProlinaSigma AldrichP5607-25GPożywka chondrogenna składnik (40 μ g/ml)

Bibliografia

  1. van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future--lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
  2. Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
  3. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  4. Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
  5. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
  6. Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
  7. Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
  8. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  9. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  10. Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
  11. Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16(2017).
  12. Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
  13. Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
  14. Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086(2013).
  15. Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
  16. Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
  17. Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
  18. Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184(2016).
  19. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144(2015).
  20. Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
  21. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
  22. Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
  24. Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459(2016).
  25. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  26. Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
  27. Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498(2008).
  28. Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
  29. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  30. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
  31. Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
  32. Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
  33. Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
  34. Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
  35. Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
  36. Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786(2016).
  37. Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
  38. Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
  39. Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
  40. Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213(2008).
  41. Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
  42. Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
  43. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

iPSC z krwi pępowinowejróżnicowanie w ciała embrionalnepożywka do różnicowania chondrogenicznegobarwienie błęknitem Alcianembarwienie błękitem toluidynowymkolagen typu IIPCR w czasie rzeczywistymzatapianie w parafinieliczenie komór w komorze countingowej
Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.