Artykuł metodologiczny

Ilościowa lokalizacja białka Golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/55996

⸱

10 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 2Bioinformatics Institute, 3School of Computing, National University of Singapore

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjna lokalizacja mieszkańców Golgi jest kluczowa dla zrozumienia funkcji komórkowych Golgiego. Jednak konwencjonalna mikroskopia optyczna nie jest w stanie rozstrzygnąć struktury sub-Golgiego. Tutaj opisujemy protokół dla konwencjonalnej metody superrozdzielczości opartej na mikroskopii, mającej na celu ilościowe określenie sub-Golgiego lokalizacji białka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleks Golgiego składa się z seryjnie ułożonych membranowych cistern, które można dalej klasyfikować na obszary podgolgiego, w tym sieć cis-Golgiego, medialną, trans-Golgiego i trans-Golgiego. Funkcje komórkowe Golgiego determinuje charakterystyczny rozkład jego białek rezydentskich. Rozdzielczość przestrzenna konwencjonalnej mikroskopii świetlnej jest zbyt niska, by rozróżnić struktury sub-Golgiego lub cisternae. Dlatego immuno-złota mikroskopia elektronowa jest metodą wyboru do lokalizacji białka na poziomie sub-Golgiego. Jednak technika i przyrząd wykraczają poza możliwości większości laboratoriów biologii komórkowej. Opisujemy tutaj naszą niedawno opracowaną metodę superrozdzielczości zwaną lokalizacją białek Golgiego za pomocą centrów masy obrazowania (GLIM), mającej na celu systematyczną i ilościową lokalizację białka Golgiego. GLIM opiera się na standardowych protokołach znakowania fluorescencyjnego oraz konwencjonalnych mikroskopach szerokokątnych lub konfokalnych. Obejmuje kalibrację aberracji przesunięcia chromatycznego układu mikroskopowego, akwizycję obrazu oraz analizę po akwizycji. Sub-Golgiego lokalizacja białka testowego wyraża się ilościowo jako iloraz lokalizacji. Istnieją cztery główne zalety GLIM; jest szybki, oparty na konwencjonalnych metodach i narzędziach, wynik lokalizacji jest ilościowy, a w praktyce zapewnia rozdzielczość ~ 30 nm wzdłuż osi Golgiego. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół GLIM do lokalizacji testowego białka Golgiego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleks Golgiego odgrywa istotną rolę w przewozie białek i lipidów (dalej cargo i wydzielniczych) w komórkach ssaków 1,2,3. W Golgim ładunki są nie tylko sortowane do różnych przedziałów podkomórkowych, ale także modyfikowane przez różne rodzaje glikozylacji. Kompleks Golgiego u ssaków składa się z licznych bocznie połączonych stosów Golgiego, które zazwyczaj składają się z 4–11 ściśle przylegających i płaskich worków błonowych zwanych cisternae. Szeregowo ułożone cisterny Golgiego są dalej klasyfikowane, od jednego końca do drugiego, jako cis, środkowe i trans-cisternee. Po stronie poprzecznej stosu Golgiego pęcherzyk błonowy rozwija się w sieć błonową rurkowo-siatkowatą zwaną siecią trans-Golgiego (TGN)4. W szlaku wydzielniowym ładunki pochodzące z siatkówki endoplazmatycznej (ER) trafiają do stosu Golgiego po stronie cis-side, a następnie kolejno przechodzą przez warstwy przyśrodkowe i transcisterne. Ładunki ostatecznie opuszczają Golgiego na przejściu Golgiego lub TGN, kierując się do błony plazmatycznej, endosomów lub ziaren wydzielniczych.

Molekularne i komórkowe mechanizmy przejścia ładunków przez stos Golgiego oraz jak Golgi utrzymuje swoją strukturę cysternalną pozostają tajemnicą i obecnie są przedmiotem gorącej debaty1. Jedną z trudności w tej dziedzinie jest to, że cisternae Golgiego można rozróżnić tylko pod mikroskopią elektronową (EM), ponieważ rozdzielczość mikroskopu optycznego (~ 200 nm) jest niewystarczająca do rozdzielenia pojedynczych cisternae Golgiego (< 100 nm zarówno w grubości cysterny, jak i odległości). Dlatego sub-Golgiego lokalizacja białek rezydentnych i ładunków tranzytujących jest konwencjonalnie określana przez immuno-złoty EM. Jednak immuno-gold EM jest bardzo wymagający technicznie i przekracza możliwości większości laboratoriów biologii komórki. Chociaż rozdzielczość EM może być poniżej nanometrów, rozdzielczość zapewniana przez immuno-złotą EM jest znacznie ograniczona przez rozmiar kompleksu przeciwciał (pierwotnego plus przeciwciało wtórne) oraz cząstki złota, a może być gorsza niż 20 nm. Ponadto obrazy EM są uzyskiwane z cienkich przekrojów 2D zamiast z trójwymiarowego globalnego widoku Golgiego, co może prowadzić do błędnych wniosków w zależności od względnej pozycji i orientacji sekcji5 2D. Na przykład badanie pojedynczego przekroju EM nie jest w stanie wiarygodnie odróżnić pęcherzyka od ortogonalnego widoku tubuli, ponieważ obie mogą wykazywać identyczne profile błon okrągłych. Niedawne pojawienie się technik mikroskopii superrozdzielczej, takich jak mikroskopia iluminacji 3D strukturalnej (3D-SIM), stymulowane redukcje emisji (STED), mikroskopia lokalizacyjna fotoaktywowana (PALM) oraz stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), umożliwia rozróżnienie struktur sub-Golgiego pod mikroskopami świetlnymi6. Jednak istnieją co najmniej cztery wady, które mogą znacząco ograniczyć ich zastosowanie w badaniach biologicznych komórek Golgiego. 1) Obecne techniki superrozdzielczości wymagają kosztownej i specjalnej konfiguracji sprzętowej, która wykracza poza większość laboratoriów biologii komórkowej. 2) Dla niektórych technik superrozdzielczości potrzebne są specjalne protokoły znakowania fluorescencji. 3) Chociaż w najlepszych warunkach techniki te deklarują rozdzielczość przestrzenną 20-110 nm, praktyczna rozdzielczość uzyskana w rzeczywistych próbkach może być znacznie gorsza. 4) W porównaniu z konwencjonalną mikroskopią, te techniki superrozdzielczości nadal mają trudności z prowadzeniem obrazowania wielokolorowego, 3D lub żywych komórek, zarówno pojedynczo, jak i w kombinacji. Prawdopodobnie najważniejsze jest to, że zarówno immuno-złota EM, jak i techniki mikroskopii superrozdzielczej dostarczają danych jakościowych, a nie ilościowych.

Próbując częściowo rozwiązać wspomniane powyżej problemy, niedawno opracowaliśmy konwencjonalną metodę opartą na mikroskopii świetlnej, nazwaną lokalizacją białka Golgiego za pomocą centrów masy obrazowania (GLIM), która systematycznie i ilościowo lokalizuje białko Golgiego z rozdzielczością równą immuno-złotemu EM7. W tej metodzie Golgi w hodowanych komórkach ssaków jest rozpraszany jako mini-stacki Golgiego przez leczenie nocodazolem, lekiem depolimeryzującym mikrotubule. Szeroko zakrojone badania wykazały, że mini-stacki Golgiego indukowane nokodazolem (dalej mini-stacki Golgiego) bardzo przypominają rodzime stacki Golgiego zarówno pod względem organizacji, jak i funkcji komórkowych 8,9,10,11. Iloraz lokalizacji (LQ) białka testowego można uzyskać za pomocą GLIM i oznacza ilościową lokalizację sub-Golgiego. Można porównać wartości numeryczne LQ i dostępna jest baza danych LQ z ponad 25 markerami Golgiego.

W GLIM mini-stacki Golgiego są potrójnie znakowane przez endogenne lub egzogennie ekspresowane GM130, GalT-mCherry oraz białko testowe (x). GM130 i GalT-mCherry, czyli markery cis- i trans-Golgiego odpowiednio12,13, stanowią punkty odniesienia. Potrójna fluorescencja, czerwona (R), zielona (G) i dalekoczerwona (B), jest sztucznie wyświetlana jako czerwono, zielona i niebieska. Do uzyskania rozdzielczości subpikselowej przyjmuje się środek masy fluorescencyjnej (dalej środek). Oś Golgiego definiowana jest jako wektor od środka GM130 do osi GalT-mCherry. Mini-stos Golgiego jest modelowany jako cylindryczna struktura o nieskończonej symetrii obrotowej wokół osi Golgiego. Dlatego mini-stos Golgiego można dalej modelować jako jednowymiarową strukturę wzdłuż osi Golgiego. LQ białka testowego x definiuje się jako dx/d1, gdzie dx to odległość od środka x do GM130, natomiast d1 to odległość od środka GalT-mCherry do GM130. Jeśli środek x jest poza osią, do obliczeń używa się jego odległości aksialnej projekcji. Zmienne, w tym oś Golgiego, kąt osiowy, dx, d1, kąt α i kąt β, dla GLIM są schematycznie zilustrowane na Rysunku 1. LQ jest niezależny od kąta osiowego Golgiego, choć mini-stacki Golgiego orientują się losowo w komórce.

Mini-stosy Golgiego na obrazach wydają się niejednorodne. Opracowaliśmy trzy kryteria wyboru analizowalnych mini-stosów Golgiego dla GLIM. 1) Kryterium stosunku sygnału do szumu, w którym stosunek całkowitej intensywności mini-stacka Golgiego do odchylenia standardowego (SD) tła wynosi ≥ 30 w każdym kanale. Kryterium to ma zapewnić dokładność pozycjonowania środka masy, która zależy od stosunku sygnału do szumu mini-stosów Golgiego. 2) Kryterium kąta osiowego lub odległości, które wymaga d1≥ 70 nm. d1 maleje wraz ze wzrostem kąta osiowego Golgiego. Gdy kąt osiowy zbliża się do 90° lub pionowy, mini-stos staje się nierozwiązywalny, gdy d1 zbliża się do zera. d1≥ 70 nm może skutecznie wykluczyć niemal pionowe mini-stosy Golgiego. 3) Kryterium koliniowości, w którym albo |tan α| lub |tan β| to ≤ 0,3. To kryterium zapewnia, że trzy centra mini-stosu są wystarczająco współliniowe dla naszego jednowymiarowego modelu mini-stosu Golgiego. Wszystkie mikroskopy świetlne cierpią na aberrację chromatyczną, która może poważnie zniekształcać względne położenie czerwonych, zielonych i dalekoczerwonych centrów fluorescencji. Chromatyczna aberracja systemów mikroskopowych jest eksperymentalnie kalibrowana poprzez obrazowanie kulek o średnicy 110 nm, które są potrójnie oznakowane przez czerwoną, zieloną i dalekoczerwoną fluorescencję. Dla każdego obrazu koralika środek czerwieni definiuje się jako rzeczywistą pozycję koralika, a przesunięcia chromatyczne środkowego zielonego i dalekoczerwonego są dopasowywane przez funkcje wielomianów pierwszego rzędu. Centra mini-stosów Golgiego są poddawane funkcjom wielomianowym, aby skorygować przesunięcia chromatyczne w zielonym i dalekoczerwonym kanale.

Dzięki GLIM możemy osiągnąć rozdzielczość ~ 30 nm wzdłuż osi Golgiego w warunkach standardowych. Co ważne, zapewnia systematyczną metodę ilościowego mapowania dowolnego białka Golgiego. GLIM można wykonać za pomocą konwencjonalnych mikroskopów, takich jak mikroskopy szerokokątowe lub konfokalne, przy użyciu powszechnych protokołów znakowania fluorescencyjnego. Obrazowanie i przetwarzanie danych może zająć nawet godzinę. Dzięki GLIM bezpośrednio zademonstrowaliśmy stopniowe przejście ładunku sekretoryjnego z cis-strony na poprzecznąGolgi 7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Poniżej znajduje się krok po kroku protokół GLIM do określania LQ tyrozyloproteinowej sulfotransferazy 1 (TPST1) oznaczonej EGFP, enzymu rezydentnego w Golgiem, w komórkach HeLa.

1. Przygotowanie mini-stosów Golgiego z oznakowaniem fluorescencyjnym

  1. Przygotuj szklane okładki
    1. Zawartość 0,3 mL sterylnego Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) do dołku z płytką 24-dołkową w okapu do hodowli tkankowej.
    2. Wytrzyj kawałek szklanej pokrywki Φ 12 mm No.1.5 miękką bibułką pokrytą 70% etanolem, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni szklanej pokrywki. Użyj ostrych pęset, aby na krótko namoczyć pokrywkę w 70% etanolu, przelać ją do 24-dołkowej płyty i zanurzyć na dnie studni zawierającej sterylny DMEM.
      UWAGA: Szklane pokrywki są konwencjonalnie sterylizowane przez płomienie. Jednak pokrywki pod takim zabiegiem łatwo pękają podczas dalszej obróbki. Moczenie w 70% etanolu skutecznie sterylizuje szklane pokrywy bez ich uszkodzenia.
    3. Po zakryciu pokrywki pozostawić płytkę na 24 dołki w inkubatorzeCO2 o temperaturze 37 °C aż do użycia.
  2. Komórki nasienne
    1. Hodować komórki HeLa (dalej komórki) w kolbie T-25 w DMEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydła (FBS) (dalej kompletne medium) w inkubatorzeCO2 o temperaturze 37 °C z 5%CO2. Antybiotyki nie są tu konieczne.
    2. Gdy komórki osiągną ~ 80% konfluentności, aspiruj pożywkę hodowlową. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby i inkubuj komórki w inkubatorzeCO2 o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Dodaj 1 mL kompletnego medium do kolby i delikatnie spłukuj komórki ze ścianki przez pipetowanie.
    3. Przenieś odłączone komórki do sterylnej rurki wirującej i obracaj w 500 x g przez 2 minuty, aby rozpylić komórki. Aspiruj supernatant i zawiesz pellet komórkowy w 1 mL kompletnego medium.
    4. Aspiruj podłoże w dołku z płytą 24-dołkową zawierającą sterylny szklany pokrywak i nasiona ~ 1 x 105 komórek w dołku. Uzupełnij objętość studni pełnym medium do 0,5 mL. Inkubować w inkubatorzeCO2 o temperaturze 37 °C dostarczanym z 5% CO2. Hodować komórki do ~ 80% konfluentności.
  3. Komórki transfekcyjne
    UWAGA: Dobrze rozproszone komórki są korzystne do obrazowania rozproszonych mini-stacków Golgiego.
    1. Transfekcyjne ~ 80% komórek zbiegających się z plazmidami DNA o masie 80 ng GalT-mCherry7 i 320 ng TPST1-EGFP (patrz Tabela materiałów) wykorzystując odczynnik transfekcyjny zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Inkubuj w inkubatorzeCO2 o temperaturze 37 °C. Zmień podłoże po 4-6 godzinach inkubacji. Komórki są gotowe ~ 12 godzin później.
  4. Leczenie nocodazolem do generowania mini-stacków Golgiego
    1. Przygotuj roztwór wywaru nocodazolu (33 mM), rozpuszczając 10 mg proszku nocodazolu w 1 ml dimetylosulfoxidu. Zachowaj roztwór bulionowy i przechowuj w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.
    2. Rozcieńcz 1 μL roztworu nocodazolu (33 mM) w 1 mL 37 °C w pełnym medium (końcowe stężenie 33 μM). Wiruj z maksymalną prędkością, aby usunąć cząstki stałe.
    3. Aspiruj podłoże w dołku i dodaj 0,5 mL 33 μM nocodazolu zawierającego kompletne medium. Inkubuj komórki w inkubatorzeCO2 o temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Przejdź do znakowania immunofluorescencji (sekcja 1.5).
  5. Znakowanie immunofluorescencyjne
    UWAGA: Trzymaj komórki w ciemności, aby uniknąć fotobielenia GalT-mCherry i TPST1-EGFP.
    1. Przygotuj odczynniki do znakowania immunofluorescencji
      1. Aby przygotować 4% roztwór paraformaldehydu, rozpuścić 4% (w/v) proszku paradehydu w gorącej soli buforowanej fosforanem (PBS) i przefiltrować roztwór przez filtr 0,45 μm. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C.
        UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i rakotwórczy, może powodować podrażnienia skóry. Noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE).
      2. Aby przygotować bufor rozcieńczający fluorescencję (FDB), zmieszaj 5% (v/v) FBS oraz 2% (w/v) albuminy surowicy bydłej (BSA) w 1x PBS. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,45 μm i przechowuj go w temperaturze -20 °C.
      3. Rozpuszcz 5,35 g proszkuNH 4Cl w wodzie o pojemności 1 L, aby przygotować 100 mM NH4Cl i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.
      4. Rozpuszcz 10% (w/v) proszku saponiny w wodzie, aby przygotować 10% saponinę, podaj aliquot i przechowuj roztwór w temperaturze -20 °C.
    2. Fiksacja
      1. Przepłucz dołek raz 0,5 mL 1x roztworem PBS i dodaj 0,5 mL 4% roztworu paraformaldehydu. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz studnię dwukrotnie 0,5 mL 1x PBS i dwa razy 0,5 mL 100 mM NH4Cl. Przepłukaj studnię dwa razy 0,5 mL 1x PBS. Komórki można przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C przez noc w ciemności.
    3. Znakowanie fluorescencyjne
      1. Rozcieńcz pierwotne przeciwciało anty-GM130 o pojemności 1 μL w 500 μL FDB zawierającym 0,1% saponiny. Odwróć pokrywkę płytki 24-dołkowej i nałóż na pokrywkę mieszankę przeciwciał pierwotnych 10 μL.
      2. Użyj ostrych pęset, aby wyciągnąć i przenieść szklaną pokrywkę na kroplę mieszaniny przeciwciał, upewniając się, że strona komórki styka się z mieszaniną. Inkubuj komórki z pierwotną mieszaniną przeciwciał przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Pokrywkę z pokrywką można umieścić w nawilżonej plastikowej torbie w ciemności.
      3. Użyj ostrych pęset, aby wyciągnąć i przenieść pokrywkę do dołka z uniesioną stroną komórki i przepłucz ją w 0,5 mL 1x PBS przez trzy razy w ≥ 30 minut. Potrząsanie nie jest potrzebne.
      4. Rozcieńcz 1 μL fluoroforem sprzężony z jarzeloczerwonym fluoroforem dla kóz (przeciwciało wtórne) w 500 μL FDB zawierającym 0,1% saponiny.
      5. Umyj i wyczyść odwrotną stronę pokrywki płytki z 24 dołkami. Nałóż 10 μL mieszanki przeciwciał wtórnych na powiek. Powtórz kroki 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Montaż
      1. Przygotuj medium montażowe, mieszając 1 g gliceroli, 2,2 g polialkoholu winylowego (MW ~ 31 000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) oraz 8,8 mL H2O. Rozpuszcz mieszankę w kąpieli wodnej o temperaturze 60 °C, czasem z wirowaniem. Przechowuj roztwór w temperaturze -20 °C.
      2. Rozmroź medium montażowe i przelej 10 μL na szklany szkieł. Nałóż pokrywkę (strona komórki w dół) na opadek materiału montażowego. Inkubuj szkiełko w temperaturze 37 °C przez 30 minut lub w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby utwardzić podłoże montażowe. Zabezpiecz pokrywkę bezbarwnym lakierem do paznokci i przechowuj szkiełko w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie kulek fluorescencjonalnych do korekty przesunięcia chromatycznego

  1. Czyszczenie pokrywek
    1. Ostrożnie umieść kawałek szklanej pokrywki o średnicy 25 mm No.1.5 na plastikowym stojaku.
    2. Przenieś stojak z pokrywką do zlewki 400 mL wypełnionej 300 mL 1 M NaOH i podaj sonikator w wannie (35 W) przez 15 minut. Krótko opłucz stojak w zlewce 400 mL wypełnionej 300 mL wodą dejonizowaną. Przełóż stojak do zlewki 400 mL wypełnionej 300 mL 99% etanolem i sonikować w sonikatorze w wannie na 15 minut. Krótko opłucz stojak w zlewce 400 mL wypełnionej 300 mL wodą dejonizowaną.
    3. Powtórz krok 2.1.2 jeszcze dwa razy.
    4. Przepłucz stojak z pokrywką w 300 mL dejonizowanej wodzie w zlewce 400 mL przez 10 minut. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Przenieś kratkę do piekarnika 60 °C i susz pokrywkę przez 1 godzinę. Przechowuj wysuszoną pokrywkę w bezkurzowej misce Petriego.
  2. Unieruchomienie fluorescencjowych kulek na szklanej pokrywce
    1. Rozcieńcz 110 nm wielokolorowe fluorescencyjne kulki 80-krotnie w 1x PBS zawierającym 0,1 μg/μL BSA. Krótko przewijcie rurkę, aby rozproszyć kruszywa kulek. Rozprowadz 60 μL rozcieńczone kulki na czystą szklaną pokrywkę Φ 25 mm No.1.5 (patrz sekcja 2.1) za pomocą końcówki pipety. Susz pokrywkę w suszarce podłączonej do pompy próżniowej w ciemności i montuj pokrywę na szklanym ślizgu w medium mocującym 50 μL (patrz krok 1.5.4.2).

3. Pozyskiwanie obrazów

UWAGA: GLIM wymaga obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu (SNR) do precyzyjnych obliczeń środka masy. Obraz można uzyskać za pomocą konwencjonalnych mikroskopów, takich jak laserowy skanujący konfokal, obracający się dysk konfokalny czy mikroskop szerokokątny. Można użyć mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w soczewki planapochromatyczne oraz niskoszumowy czujnik obrazu, taki jak urządzenie sprzężone z naładowaniem (CCD) oraz naukowy półprzewodnik komplementarny metalowo-tlenkowy (sCMOS). Parametry matrycy obrazu są regulowane, aby zapewnić niski szum odczytu i wysoki zakres dynamiczny. Mikroskop musi być wyposażony w optymalną konfigurację filtrów fluorescencyjnych dla zielonego, mCherry i fluoroforu dalekoczerwonym oraz musi mieć pomijalne zakłócenia fluorescencji. Idealnie system obrazowania osiąga częstotliwość próbkowania Nyquista na osiach x, y i z, co zazwyczaj wymaga, aby rozmiary x, y i z woksela były mniejsze odpowiednio niż 100, 100 i 200 nm. Rozmiary x i y woksela są zawsze równe i nazywane są pixel_size. pixel_size można obliczyć, dzieląc rozmiar matrycy aparatu przez powiększenie systemu.

  1. Wielokolorowe koraliki obrazowe
    1. Na początku i końcu każdej sesji obrazowania zrób wielokolorowe koraliki w zielonym, czerwonym i far-czerwonym kanale.
      UWAGA: Tutaj obrazy zostały wykonane za pomocą konwencjonalnego szerokokątnego mikroskopu epifluorescencyjnego (odwróconego) wyposażonego w obiektyw planapochromatyczny 100X NA 1.4, stopień zmotoryzowany, 200-watowe źródło światła metalowohalogenkowe oraz 16-bitową kamerę sCMOS. Długości fal dla filtra wzbudzającego (pasmo przepustowe), lustra dichroicznego (długoprzepustowe) oraz filtra emisyjnego (pasmowe) sześcianu filtra zielonego kanału to 465 - 495, 505 oraz 515 - 555 nm; te dla sześcianu filtra czerwonego to 528 - 553, 565 oraz 578-633 nm; a te dla sześcianu filtra kanałowego z dalekim kanałem to 590 - 650, 660 oraz 663 - 738 nm. Podczas akwizycji rozmiar woksela wzdłuż osi x, y i z wynosi odpowiednio 64, 64 i 200 nm.
    2. Znajdź pole widzenia z dobrą gęstością kulek.
    3. Pobieraj stosy obrazów 3D w zielonym, czerwonym i dalekoczerwonym kanale (odpowiednio kanałG, kanałR,kanał B). Weź 3 sekcje powyżej i poniżej najlepszej płaszczyzny ogniskowej (7 sekcji na stos). Zachowaj te trzy stosy jako trzy pliki TIFF.
      UWAGA: Czas naświetlania dla każdego kanału jest empirycznie określany, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny, uniknąć nasycenia pikseli i zminimalizować fotoblaaching. Inne parametry, takie jak filtry oraz rozmiary x, y i z woksela, są wybierane zgodnie z omówieniem powyżej.
  2. Obraz mini-stacków Golgiego
    1. Użyj preparatów transfekowanych i znakowanych fluorescencją TPST1-EGFP i GalT-mCherry (sekcja 1.5), aby znaleźć komórki wyrażające TPST1-EGFP oraz niski lub średni poziom GalT-mCherry. Pobieraj stosy obrazów 3D zgodnie z krokiem 3.1.3.

4. Analiza obrazu

  1. Zdobądź centra fluorescencyjnych koralików
    1. W ImageJ otwórz zestaw obrazów koralików składających się z trzech plików TIFF (File>Image>Open).
    2. Średnio 3 kolejne sekcje wokół najlepiej ostrego fragmentu w kanaleR według projektu Image>Stacks>Z. Wprowadź numer sekcji "Start slice " i "Stop slice", a spośród opcji "typ projekcji wybierz "Average Intensity".
    3. Narysuj obszary zainteresowania (ROI), które nie zawierają koralików na obrazie, używając "wyborów wielokątów". W "Analizuj>Zestaw pomiarów zaznacz tylko "Średnia wartość szarości" oraz "Odchylenie standardowe". Następnie wykonaj "Analizuj>Mierz", aby uzyskać średnią i SD ROI.
    4. Oblicz intensywność tła jako "średnia+6×SD". Odejmij obraz wraz z odpowiadającymi wartościami intensywności tła za pomocą "Proces>Matematyka>Odejmuj", wpisz wartość intensywności tła odpowiadającą temu kanałowi.
    5. Powtórz kroki 4.1.2 do 4.1.4 dla stosów obrazów kanałuG i kanałuB, używając tego samego fragmentu startu i stop oraz tego samego zwrotu z inwestycji w tle. Należy zauważyć, że zwrot z inwestycji użyty w kroku 4.1.3 można skopiować na obrazy kanałuG ikanału B.
    6. Połącz trzy obrazy odjęte przez tło (Obraz>Kolor>Merge Channels), wybierając kanałR jako czerwony, kanałG jako zielony, akanał B jako niebieski. Uzyskany zostanie pojedynczy obraz złożony składający się z trzech kanałów.
    7. Uruchom menedżera ROI (Analiza>Narzędzia>Menedżer ROI). Narysuj kwadratowy zwrot z inwestycji wokół pojedynczych koralików, upewniając się, że w każdym ROI jest tylko jeden koralik. Dodaj zwrot z inwestycji do menedżera ROI, naciskając "t" na klawiaturze. Powtórz ten proces i dodaj jak najwięcej zwrotów z inwestycji.
    8. W "Analizuj>Ustali pomiary" sprawdź tylko "Środek masy".
    9. Wybierz kanałR, w Menedżerze ROI, kliknij "Mierz", aby uzyskać centrum; w oknie "Wynik" wyświetlone będą dwie kolumny odpowiadające współrzędnym x i y środkow ROI. Skopiuj i wklej te dwie kolumny do arkusza kalkulacyjnego.
    10. Powtórz krok 4.1.9 dla kanałówG iB.
    11. Ułóż współrzędne ośrodków w jednym arkuszu kalkulacyjnym w następującej kolejności: xR,y R, xG, yG, xB i yB. Zapisz arkusz kalkulacyjny w formacie ".csv" jako "beads.csv". Nie zostawiaj miejsca w nazwie pliku.
  2. Wybierz i zmierz mini-stacki Golgiego
    1. Zainstaluj dwa makra (załączone w materiałach uzupełniających) w ImageJ: "Macro-Golgi ROI inspection" oraz "Macro-Output 3 channels data" od Plugins>Install". Usuń menedżera zwrotu z inwestycji i okno wyników.
    2. Otwórz zestaw obrazów mini-stack Golgiego składających się z trzech plików TIFF (File>Image>Open).
    3. Powtórz kroki 4.1.2 - 4.1.5 i zachowaj trzy zdjęcia odejmowane przez tło na później. Nagraj tło SD dla kanałówR, kanałuG iB odpowiednio jako SDR, SDG iSD B, do późniejszego użytku.
    4. Zdubluj trzy obrazy odejmowane przez tło wygenerowane w kroku 4.2.3 (Ctrl+Shift+D).
    5. W "Process>Image Calculator" najpierw dodaj kanałG odejmowany przez tło do obrazówkanału R . Dodaj powstały obraz do obrazu kanałuB odejmowanego przez tło. Aby uzyskać wynikowy obraz, w "Obraz>Dostosuj>Próg" wybierz "set", aby wprowadzić "1" jako "Najniższy poziom progu". Po naciśnięciu "Apply" powstaje czarno-biały obraz binarny.
    6. W "Analizuj>Analizuj cząstki" wpisz zakres rozmiarów dla "Rozmiar (piksel^2)". Wprowadź "50-infinity". Zaznacz "Wyklucza krawędzie" i "Dodaj do Menedżera". ROI zawierające mini-stacki Golgiego są teraz dodawane do menedżera ROI.
      UWAGA: Zakres rozmiarów musi być empirycznie określony, aby wykluczyć szumy, które są zazwyczaj małe.
    7. Połącz trzy obrazy odejmowane przez tło (Obraz>Kolor>Kanały Merge) z kroku 4.2.3, wybierając kanałR jako czerwony, kanałG jako zielony, akanał B jako niebieski. Generowany jest pojedynczy obraz złożony z trzech kanałów.
    8. Uruchom makro "Macro-Golgi ROI inspection" wybierając "Plugins> Macro-Golgi ROI inspection". W interaktywnym oknie dialogowym wizualnie sprawdź każdy zwrot z inwestycji, aby go zachować lub odrzucić. Wybierz ROI, które zawierają pojedynczy obiekt we wszystkich trzech kanałach.
      UWAGA: Po uruchomieniu tego narzędzia odrzucone zwroty z inwestycji są eliminowane przez menedżera ROI.
    9. W "Analizuj>Zestaw pomiarów" sprawdź tylko "Powierzchnię", "Średnią wartość szarości" i "Środek masy". Pobierz dane, uruchamiając narzędzie makro "Macro-Output 3 channels data" (Plugins> Macro-Output 3 kanały).
      UWAGA: Obszary, średnie intensywności oraz centra (x i y) zwrotów z inwestycji (x i y) w kanaleR, kanaleG iB są wyświetlane w oknie "Wynik".
    10. Skopiuj współrzędne x i y centrów do arkusza kalkulacyjnego i ułóż je w następującej kolejności: xR,y R, xG, yG, xB i yB. Zapisz arkusz kalkulacyjny jako plik ".csv" (ministacki.csv). Nie zostawiaj miejsca w nazwie pliku. Przechodzimy do korekty przesunięcia chromatycznego centrów (sekcja 4.3) i obliczenia LQ (sekcja 4.4).
  3. Korekta przesunięcia chromatycznego centrów
    1. Zainstaluj Matlab Compiler Runtime (MCR).
    2. Zainstaluj następujące pliki w dedykowanym folderze roboczym: my_train.exe i my_test.exe. Skopiuj i wklej pliki "beads.csv" oraz "ministacks.csv" do tego samego folderu.
    3. Uruchom "Wiersz poleceń" w Windows i przejdź do folderu roboczego, wpisując następującą komendę " cd path_of_working_folder".
    4. Wygeneruj plik kalibracyjny z przesunięciem chromatycznym, używając środkow kulek. Wpisz następujące polecenie "my_train.exe beads.csv calibration.mat 1". W folderze roboczym tworzony jest plik o nazwie "calibration.mat". Ignoruj inne wygenerowane pliki.
    5. Popraw przesunięcie chromatyczne środków mini-stosów Golgiego, wpisując następujące polecenie "my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv calibration.mat 1".
      UWAGA: W folderze roboczym tworzony jest plik o nazwie "corrected_ministacks.csv". Zawiera chromatycznie korygowane współrzędne środków, które są ułożone w rzędzie xG,y G, xB iy B. Ignoruj inne tworzone pliki. Należy zauważyć, że kanał czerwony jest definiowany jako wolny od aberracji chromatycznej, dlategox, R i yR są tym samym co surowe dane.
  4. Obliczanie LQ
    1. Uruchom oprogramowanie do analizy danych i skopiuj i wklej, w poniższej kolejności, średnie wartości szarości, obszary, tło SD uzyskane z kroku 4.2.3 (umieść je w wierszu 1) oraz chromatycznie skorygowane współrzędne x i y mini-stosów Golgiego w kanaleR do arkusza roboczego jako kolumny od A do E. Podobnie, przesyłaj odpowiadające dane dla kanałuG ikanału B odpowiednio do kolumn F do J i K do O.
    2. Dodaj osiem nowych kolumn od P do W, nazwanych "zintegrowana intensywność kanału R", "zintegrowana intensywność kanału G", "zintegrowana intensywność kanału B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) i LQ.
      1. Kliknij prawym przyciskiem myszy na górę odpowiedniej kolumny i wybierz "Ustaw wartości kolumn", aby obliczyć wartości każdej kolumny. Dla kolumny P wpisz "Col(A)Col(B)"; dla kolumny Q wpisz "Col(F)Col(G)"; dla kolumny R wprowadź "Col(K)Col(L)"; dla kolumny S wprowadź "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))", gdzie "pixel_size" to rozmiar piksela w nm; dla kolumny T wprowadź "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; dla kolumny U wpisz "Abs(Tan(Acos(((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))))))"; dla kolumny V wpisz "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2)/(2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D), Col(E), Col(E), Col(N), Col(O))))))"; dla kolumny W wpisz "Col(T)/Col(S)".
    3. Przefiltruj mini-stosy Golgiego według trzech kryteriów opisanych we wstępie.
      1. W oprogramowaniu do analizy danych przejdź do "Worksheet>Worksheet Query" i wybierz zmienne kolumnowe do testu "If". Przypisz następujące aliasy: I1, I2, I3, d1, A i B dla kolumn "intensywność zintegrowana kanału R", "intensywność zintegrowana kanału G", "intensywność zintegrowana kanału B", d1, ABS(tan a) i ABS(tan b), odpowiednio. W polu "If condition" wpisz "I1>=30*cell(1,3) AND I2>=30*cell(1,8) AND I3>=30*cell(1,13) AND d1>=70 AND (A<=0.3 lub B<=0.3)".
      2. Wybierz "Extract to New Worksheet", kliknij "Apply". Kolumny od A-W analizowalnych mini-stosów Golgiego są wyodrębniane do nowego arkusza.
    4. W nowym arkuszu kliknij prawym przyciskiem myszy na górę kolumny W, wybierz "Statystyki w kolumnie>Otwórz dialog". Sprawdź "N sum", "Średnia", "SE od średniej", "Histogramy". Następnie prezentowana jest analiza statystyczna LQ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowoczesny mikroskop świetlny klasy badawczej wyposażony w soczewkę planową apochromatyczną, taki jak ten używany w naszym laboratorium, wykazuje minimalne aberrację chromatyczną (Rysunek 2A). Jednak dokładna analiza wielokolorowego obrazu fluorescencyjnego koralika może ujawnić przesunięcia różnych kolorów tego samego koralika (Rysunek 2B). Definiujemy, że czerwony kanał jest wolny od aberracji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej lokalizacja białka Golgiego pod mikroskopem świetlnym była głównie mierzona przez stopień korelacji lub nakładania obrazu białka z obrazem markera Golgiego o znanej lokalizacji 15,16,17. Powstała korelacja lub współczynnik nakładania się odzwierciedla, jak blisko przestrzennie znajduje się białko testujące do markera Golgiego. Istnieją co najmniej trzy zastrzeżenia dotyczące tego podejścia. Po pierwsze, korelacja lub w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować D. Stephensowi (Uniwersytet w Bristolu, Bristol, Wielka Brytania) za plazmid DNA TPST1-EGFP, a także Lakshmi Narasimhan Govindarajan za pomoc w optymalizacji oprogramowania. Prace te były wspierane grantami od National Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), Ministerstwa Edukacji (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 i RG132/15 oraz AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) dla L.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kulki fluorescencji. Nazwa handlowa: koraliki TetraSpeckInvitrogenT7279Jako wielokolorowe koraliki do kalibracji przesunięcia chromatycznego mikroskopu
Szklana pokrywka i Phi; 12 mm (nr 1,5)MenzelCB00120RAC
Szklana pokrywka i Phi; 25 mm (nr 1,5)Menzel
DMEMCapriconDMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBSGE HycloneSV30160.03
NocodazolMerck487928
Czynnik transfekcyjny. Nazwa handlowa: Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Medium transfekcyjne. Nazwa handlowa: OptiMEMInvitrogen31985070
TPST1-EGFPAddgene66617Dar od D. Stephensa (Uniwersytet w Bristolu, Bristol, Wielka Brytania)
GalT-mCherryStworzone w naszym laboratorium
ParaformaldehydMerck1.04005.1000
SaponinSigma-Aldrich47036
poli (alkohol winylowy) (Mw ~31 000). Nazwa handlowa: Mowiol-488CALBIOCHEM475904
BSASigma-AldrichA9647
Mysz anty-GM130BD Biosciences610823Główne przeciwciało dla człowieka GM130
IgG u kozy sprzężone fluorescencyjne o sprzęcie dalekoczerwonym. Nazwa handlowa: Alexa Fluor 647 sprzężony kozy antymyszy IgGInvitrogenA-21235Przeciwciało wtórne sprzężone z fluorescencją w dalekiej czerwieni

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215(2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558(2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lokalizacja bia ek w aparacie Golgiegometoda GLIMobrazowanie fluorescencyjnekorekcja przesuni cia chromatycznegoanaliza rodka masymini stosy Golgiegoiloraz lokalizacjimikroskopia szerokopolowamikroskopia konfokalnaprotok analizy obrazu

Powiązane artykuły