Artykuł metodologiczny

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

DOI:

10.3791/55999

⸱

12 listopada 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysics of the Czech Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokalne mikropromieniowanie za pomocą laserów stanowi użyteczne narzędzie do badań procesów związanych z naprawą DNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy metodologiczne podejście do analizy kinetyki białek w uszkodzeniach DNA w czasie lub interakcji białko-białko na miejscowo napromieniowanej chromatynie. Pokazujemy również, jak rozpoznawać poszczególne fazy cyklu komórkowego za pomocą systemu komórkowego Fucci do badania kinetyki białek zależnych od cyklu komórkowego w uszkodzeniach DNA. Przedstawiono również opis metodologiczny zastosowania dwóch laserów UV (355 nm i 405 nm) do wywoływania różnych typów uszkodzeń DNA. Tylko komórki naświetlane laserem diodowym o długości fali 405 nm normalnie przechodziły mitozę i były pozbawione dimerów cyklobutanu pirymidyny (CPD). Pokazujemy również, w jaki sposób mikronapromieniowane komórki mogą zostać utrwalone w danym punkcie czasowym w celu przeprowadzenia immunodetekcji interesujących nas endogennych białek. W badaniach naprawy DNA dodatkowo opisujemy zastosowanie metod biofizycznych, w tym FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) i FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) w komórkach z spontanicznie występującymi ogniskami uszkodzenia DNA. Pokazujemy również zastosowanie FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) w badaniach eksperymentalnych oddziaływań białko-białko.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenia DNA prowadzą do pojawienia się uszkodzeń DNA składających się z dimerów pirymidyny cyklobutanu (CPD), 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny oraz jedno- lub dwuniciowych pęknięć1,2. γ-promienie są formą promieniowania jonizującego o największej energii i wysokiej penetracji, dlatego to źródło promieniowania jest szeroko stosowane w radioterapii3. Z drugiej strony, eksperymentalnie wywołane uszkodzenie DNA spowodowane przez lasery UV naśladuje naturalną ekspozycję na światło UV. Mikronaświetlanie promieniowaniem UVA, jako metoda mikroskopowa, stanowi eksperymentalne narzędzie do badania uszkodzeń DNA w poszczególnych żywych komórkach. Mikronapromienianie zastosowano po raz pierwszy 40 lat temu w celu ujawnienia organizacji regionów chromosomowych4,5. Technika ta jest w dużym stopniu zależna od właściwości funkcjonalnych mikroskopów konfokalnych lub od ograniczeń technicznych nowoczesnej nanoskopii. Aby wywołać uszkodzenia DNA, komórki mogą być wstępnie uwrażliwione przez 5' bromodeoksyurydynę (BrdU) lub Hoechst 33342 przed naświetlaniem UV. Bártová i wsp.6 wcześniej opisywał etap presensytyzacji, a ostatnio zoptymalizowaliśmy tę technikę mikronaświetlania, aby uniknąć śmierci komórki lub apoptozy. Na przykład zastosowanie lasera UV o długości fali 405 nm (bez presensytyzacji Hoechst 33342) prowadzi do indukcji 53BP1-dodatnich pęknięć dwuniciowych (DSB) kosztem dimerów cyklobutanowo-pirymidynowych (CPD). Z drugiej strony, etapy presensytyzacji w połączeniu z mikronaświetlaniem UV indukują jednocześnie bardzo wysokie poziomy CPD i DSB7,8. Metodologia ta jest trudna do zastosowania do badania pojedynczego szlaku naprawy DNA.

Dzięki mikronapromienianiu możliwe jest analizowanie rekrutacji białek, kinetyki i interakcji w uszkodzeniach DNA w żywych komórkach. Przykład tej metody został opublikowany przez Luijsterburga i wsp.9 dla białka heterochromatyny 1β, a ostatnio po raz pierwszy wykazaliśmy, że czynnik pluripotencji Oct4 i białko związane z ciałami Cajala, coilin, są rekrutowane do zmian DNA wywołanych promieniowaniem UV6,10. Kinetykę białek w tych uszkodzeniach DNA można również badać za pomocą technik FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)11,12,13 lub FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)14,15. Metody te mają potencjał, aby ujawnić prostą dyfuzję białek w uszkodzeniach DNA lub interakcjach białko-białko. Użytecznym narzędziem do dodatkowej charakterystyki białek jest FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) lub jego połączenie z technologią FRET (FRET-FLIM)16. Metody te umożliwiają badanie procesów zachodzących w żywych komórkach, w których stabilnie lub przejściowo dochodzi do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania, oznaczonego cząsteczką fluorescencyjną17. Tutaj pokazano przykład wykładniczego czasu rozpadu (τ) dla białka p53 znakowanego GFP i jego partnera interakcji, 53BP1 znakowanego mCherry, odgrywającego ważną rolę w odpowiedzi na uszkodzenie DNA18,19. Parametr τ, czyli czas życia fluorochromu dostarczony przez obliczenia FLIM, jest specyficzny dla danego barwnika fluorescencyjnego, jego zdolności wiązania i środowiska komórkowego. Dlatego ta metoda może nam pokazać różnice między subpopulacjami białek, ich zdolności wiązania i właściwości funkcjonalne po, na przykład, uszkodzeniu DNA.

Tutaj przedstawiono zarys metodologicznych podejść zaawansowanych technik mikroskopowych, które są używane w naszym laboratorium do badania specyficznej dla czasu rekrutacji białek, kinetyki, dyfuzji i interakcji białko-białko w miejscu mikronapromieniowanej chromatyny. Przedstawiono metodologię krok po kroku indukcji lokalnych zmian DNA w żywych komórkach oraz opis metodologii przydatnych do badań zdarzeń związanych z uszkodzeniem DNA w lokalnie indukowanych zmianach DNA wywołanych przez lasery UV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla linii komórkowych

  1. Linie komórkowe pochodzące z HeLa
    UWAGA: Użyj komórek raka szyjki macicy HeLa: albo komórki HeLa stabilnie eksprymujące histon H2B oznaczone GFP, albo komórki HeLa-Fucci eksprymujące RFP-Cdt1 w fazach G1 i wczesnej S oraz GFP-gemininę w fazach S / G2-M (Rysunek 1).
    1. Do hodowli wszystkich linii komórkowych pochodzących z HeLa należy użyć zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę 2-3 razy w tygodniu.
    2. Usuń pożywkę hodowlaną i przepłucz komórki za pomocą 1x PBS, aby wyeliminować wszelkie ślady surowicy zawierającej inhibitor trypsyny. Wykonaj ten krok w okapie zabezpieczającym biologicznie w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA, aby pokryć warstwę komórkową i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C. Trypsynizować komórki, aż warstwa komórkowa zostanie rozproszona (zwykle 3 - 5 minut).
    4. Dodać 3 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej, aby dezaktywować trypsynę-EDTA, i rozprowadzić pożywkę, delikatnie pipetując kilka razy.
      UWAGA: Ta procedura musi być wykonywana w okapie zagrożenia biologicznego, aby chronić operatora przed zanieczyszczeniami i utrzymać optymalne warunki hodowli komórek.
    5. Liczenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory Bürker. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 1 × 105 komórek/ml i odpipetować 5 ml do nowego naczynia. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC), linia komórkowa D3
    1. Hodowla mESC na szalkach do hodowli komórkowych pokrytych 0,2% żelatyną i pożywką podtrzymującą mESC. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie pożywki uprawowej/konserwacyjnej mESC w porcjach o pojemności 50 ml i przechowywanie jej w temperaturze 2 - 8 °C przez okres do 2 tygodni. Pożywka mESC zawiera 75 ml FBS komórek ES, 5 ml penicyliny G i streptomycyny, 5 ml aminokwasów endogennych (10 mM) (stężenie końcowe 0,1 mM), 50 μl mysiego czynnika inhibitora białaczki (mLIF; 100 μg/ml) (stężenie końcowe 10 ng/ml), 430 μl MTG (1-tioglicerol; rozcieńczenie 1:100 w DMEM) (końcowe stężenie 100 μM) i pożywkę DMEM o wysokiej zawartości glukozy do 500 ml.
    2. Odessać pożywkę hodowlaną mESC z naczynia hodowlanego i przepłukać komórki raz 1x PBS.
    3. Dodać 0,5 ml trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki zaczną odłączać się od naczynia. Następnie dezaktywuj trypsynę, przemywając komórki 2 ml pożywki hodowlanej mESC uzupełnionej 15% płodową surowicą bydlęcą.
    4. Użyj pipety, aby usunąć pozostałe komórki z szalki hodowlanej.
      UWAGA: Ważne jest, aby uzyskać pojedyncze komórki, ponieważ grudki komórek sprzyjają różnicowaniu komórek.
    5. Podziel komórki w stosunku 1:10 na zżelowane szalki z pożywką konserwacyjną mESC.
      UWAGA: Jeśli gęstość komórek mESC jest zbyt niska, nie rosną one dobrze; Jeśli gęstość jest zbyt duża, promowane jest różnicowanie.
    6. Upewnij się, że mESC są utrzymywane w stanie niezróżnicowanym, wykonując pasaż mESC co drugi dzień poprzez podzielenie komórek z jednej szalki Petriego na cztery nowe szalki. Zbadaj kolonie mESC za pomocą odwróconego mikroskopu pod powiększeniem 100x lub 200x, a jeśli istnieją dowody na spontaniczne różnicowanie komórek mES, wykonaj Western blot, aby ocenić wyczerpanie białka Oct4.
      UWAGA: Przy optymalnym pasażowaniu komórek można zmniejszyć spontaniczne różnicowanie mESC in vitro.

2. Transfekcja komórek

  1. Komórki nasienne 48 godzin przed eksperymentami na siatkowych szalkach mikroskopowych (średnica 35 mm) w celu znalezienia mikronapromieniowanych komórek zgodnie z ich współrzędnymi na szalce Petriego.
    UWAGA: Jest to przykład, w którym pierwszym etapem eksperymentalnym jest mikronapromienianie, a drugim barwienie immunologiczne (Rysunek 2A).
    1. Do wysiewu należy użyć stężenia 5 × 104 komórek/ml dla linii komórkowych pochodzących z HeLa (lub 1 × 104 komórek/ml dla komórek D3 mES). Użyj do 2 ml kompletnego podłoża na naczynie. Podczas hodowli i mikronaświetlania utrzymuj komórki w termostacie lub komorze hodowlanej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Nie używaj większej koncentracji komórek. Szczególnie w przypadku gęsto upakowanych kolonii mESC D3 wysoka gęstość komórek uniemożliwia identyfikację lokalnie napromieniowanych komórek po barwieniu immunologicznym.
  2. Przygotować plazmidowe DNA i odczynnik do transfekcji do wyboru w następujący sposób. Przygotować roztwór A przy użyciu 2 - 3 μg wybranego plazmidowego DNA (szczegóły w Tabeli Materiałów) i 150 μL 1x PBS. Przygotować roztwór B, używając 3,5 μl odczynnika do transfekcji w 150 μl 1 × PBS. Upewnij się, że każdy roztwór jest dobrze wymieszany, ostrożnie pipetując.
    UWAGA: Optymalny stosunek DNA i odczynnika do transfekcji musi być empirycznie określony dla każdej linii komórkowej i pojedynczego plazmidu.
  3. W 24 godziny przed obserwacją doświadczalną przejściowo transfekowanych żywych komórek, połączyć roztwór A i roztwór B bez wirowania. Połączone roztwory inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 minut. Kroplami rozprowadzić tę kompletną mieszaninę transfekcji (300 μl, jak opisano w ppkt 2.2) w sposób kroplowy na warstwie komórek rosnących w naczyniu mikroskopowym.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4–6 godzin, a następnie zastąpić mieszaninę transfekcji świeżą pożywką. Hoduj komórki w standardowych warunkach.
    UWAGA: W przypadku korzystania z lasera o długości fali 405 nm nie należy wstępnie uczulać komórek żadnym odczynnikiem, ale w przypadku korzystania z lasera o długości fali 355 nm należy przeprowadzić wstępne uczulenie komórek za pomocą 10 μM 5-bromo-2'-deoksy-urydyny (BrdU) 7,8. Czas wstępnego uczulenia zależy od typu komórki i długości cyklu komórkowego. W przypadku komórek HeLa należy dodać BrdU 16 do 20 godzin przed miejscowym mikronapromienianiem. W przypadku mESC dodać BrdU 6 do 8 godzin przed mikronapromienianiem.

3. Indukcja miejscowych zmian DNA i mikroskopia konfokalna

  1. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu i zapisz pozycję wybranych komórek na szalce; współrzędne komórek będą potrzebne do dalszej analizy (Rysunek 2Aa-c).
  2. Znajdź transfekowaną komórkę (komórki) w kwadracie oznaczonym cyfrą lub literą (Rysunek 2Ad-f, strzałki w Ad pokazują lokalizację komórki powiększonej w panelach Ae i Af ). Uzyskaj obraz komórki (komórek) za pomocą mikroskopii jasnego pola i uzyskaj obraz fluorescencyjny w celu zidentyfikowania pozycji zarówno komórki (komórek), jak i oznaczonego kwadratu (Rysunek 2A).
  3. Do akwizycji obrazu przed naświetlaniem należy użyć lasera ze światłem białym (WLL) (470-670 nm w krokach co 1 nm) podłączonego do mikroskopu konfokalnego (lub innego dostępnego lasera podłączonego do mikroskopu konfokalnego).
  4. Użyj następujących ustawień: rozdzielczość 512 × 512 pikseli, rozmiar piksela 64 nm, 400 Hz, tryb dwukierunkowy (skanowanie w dwóch kierunkach), średnia linii ustawiona na 8, powiększenie od 8x do 12x.
    UWAGA: Średnia liniowa reprezentuje określoną liczbę skanów; Ten sam wiersz jest skanowany wiele razy przed przejściem do następnego wiersza. Powtarzające się skany wszystkich linii tworzą ostateczną klatkę obrazu.
  5. Do obserwacji i akwizycji obrazu użyj obiektywu olejowego 63× o aperturze numerycznej 1,4 i sekwencyjnie rejestruj obrazy fluorescencyjne. Wyeliminuj przesłuchy między dwoma fluorochromami, korzystając z trybu skanowania sekwencyjnego odpowiedniego oprogramowania.
    UWAGA: Wszystkie programy mikroskopowe umożliwiają ustawienie tak zwanego trybu skanowania sekwencyjnego. Operator może wybrać, czy informacje o fluorochromach mają być pozyskiwane jednocześnie (np. we fluorescencji czerwono-zielono-niebieskiej), czy, jak wspomniano tutaj, indywidualnie (sekwencyjnie), fluorochrom po fluorochromie. Należy wziąć pod uwagę ogólne informacje, że maksymalne wzbudzenie/emisja dla GFP wynosi 395/509 nm, a maksymalne wzbudzenie/emisja dla mCherry wynosi 587/610 nm (patrz fluorochromy użyte tutaj w Rysunek 2B). Na podstawie tych informacji dobierz odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji dla żądanych fluorochromów. Dobór filtrów i procedury skanowania muszą być zoptymalizowane dla każdego mikroskopu konfokalnego.
  6. Do indukcji zmian w DNA należy użyć trybu skanowania 64 linii, wyłączyć WLL (w trybie "akwizycji"), włączyć zewnętrzne źródło UV (przyciskiem "Laser UV"), ustawić obszar zainteresowania (ROI) (w trybie "akwizycji") i ustawić laser 355 nm na 100% mocy lub alternatywnie użyć źródła laserowego 405 nm.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, moc lasera jest regulowana za pomocą odpowiedniego przycisku regulacji lasera w trybie akwizycji obrazu.
  7. Do miejscowego mikronapromieniowania należy używać laserów, które emitują promieniowanie w bliskim spektrum UVA. W przypadku mikronapromieniowania ROI w jądrze i przechwytywania obrazu, należy ustawić tło na zero w trybie akwizycji obrazu, aby regulować intensywność lasera poza ROI; jeśli komórka zostanie prawidłowo napromieniowana, sygnał GFP-histonu H2B zniknie, a na przykład białko PCNA znakowane mCherry zostanie zrekrutowane do zmian w DNA natychmiast po napromieniowaniu (Rysunek 2B i Wideo 1).
    UWAGA: Uszkodzenie DNA wywołane w ROI jednego przekroju konfokalnego pojawia się również w projekcji trójwymiarowej (3D) (patrz obrót 3D i projekcje x-y, x-z, y-z w Rysunek 2C i Wideo 2). Opisy pełnych parametrów technicznych dla laserów 355 nm i 405 nm znajdują się w Stixová i wsp.7
  8. Po napromieniowaniu ROI wyłącz zewnętrzne źródło UV, wyłącz ROI, włącz WLL, zmień skanowanie linii na 8 i znajdź inną komórkę do napromieniowania. Aby wybrać zwrot z inwestycji, użyj odpowiedniego przycisku w trybie akwizycji obrazu oprogramowania.
    UWAGA: mCherry-PCNA ma maksymalny szczyt akumulacji w uszkodzeniach DNA między 2 a 20 minutami (Figura 2B). Aby zweryfikować wynik na poziomie białek egzogennych, należy przystąpić do barwienia immunofluorescencyjnego bezpośrednio po miejscowym mikronapromieniowaniu. Wybierz przedział czasu naświetlania w zależności od zainteresowania.
  9. Sprawdzić, czy w większości mikronapromienianych komórek można wykryć nagromadzenie białek egzogennych. W tej weryfikacji użyj kryteriów podanych w poniższych krokach.
    1. Sprawdź, czy nie ma nadekspresji białka egzogennego w przejściowo transfekowanych komórkach. Jako możliwe rozwiązanie wybierz komórki ze słabą ekspresją białka fluorescencyjnego (np. mCherry-PCNA lub mCherry-53BP1).
    2. Oceń fototoksyczność ekspozycji na dor wykorzystanego do akwizycji obrazu.
      UWAGA: W celu przeprowadzenia testów fototoksyczności, wystaw transfekowane komórki na długotrwałe promieniowanie laserowe i sprawdź, czy komórki przechodzą do mitozy, jak pokazano na Rysunek 3A-B. Jako możliwe rozwiązanie można skrócić czas skanowania i liczbę warstw konfokalnych na komórkę, zoptymalizować skanowanie 3D poprzez wybór optymalnego kroku osiowego (zalecane jest 0,3 μm) i ustawić moc lasera na minimum. Alternatywnie, fototoksyczność można wyeliminować za pomocą Trolox (kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy, rozpuszczalny w wodzie analog witaminy E) rozpuszczony w podłożu uprawowym. W przypadku eksperymentów związanych z uszkodzeniem DNA nie zaleca się stosowania leku Trolox ze względu na jego działanie ochronne przed promieniowaniem UV.
    3. W przypadku napromieniania laserem o długości fali 355 nm należy sprawdzić, czy BrdU jest wystarczająco włączone przy użyciu odpowiedniego przeciwciała wykrywającego BrdU z zestawu do włączenia BrdU (patrz Tabela materiałów). Ponieważ BrdU jest włączany do DNA podczas fazy S cyklu komórkowego, większość komórek musi przejść przez fazę S podczas presensytyzacji. Jako możliwe rozwiązanie rozważ długość cyklu komórkowego, która jest specyficzna dla typu komórki.
    4. Przeanalizuj, czy interesujące nas białka naprawy DNA mają zdolność rozpoznawania uszkodzeń DNA w określonych fazach cyklu komórkowego. Możliwe rozwiązanie: Aby sprawdzić, czy rekrutacja wybranych białek do zmian DNA jest ograniczona do określonych faz cyklu komórkowego (G1/S/G2), należy użyć komórek HeLa-Fucci. Komórki te wyrażają RFP-Cdt1 w fazach G1 i wczesnych fazach S oraz gemininę znakowaną GFP w fazach cyklu komórkowego S / G2-M 22 (Rysunek 1) .
    5. Aby uniknąć apoptozy, śmierci komórki, wybierz odpowiednie źródło lasera i ustawienie mocy lasera23. Należy pamiętać, że napromieniowane komórki powinny przejść do mitozy (Rysunek 3A-B, Wideo 3).
      UWAGA: Niepożądaną apoptozę można wykryć za pomocą dodatniego załącznika V, kaspazy 3 lub rozszczepienia laminy B. Na poziomie morfologicznym widoczne będzie oderwanie komórek i tworzenie ciał apoptotycznych.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Przepłukać krótko warstwę komórkową (rosnącą w naczyniach mikroskopowych) 1 × PBS, a po wypłukaniu utrwalić komórki za pomocą 4% formaldehydu przez 10 minut (dla linii komórkowych pochodzących z HeLa) lub 20 minut (dla komórek D3 ES) w temperaturze pokojowej. Opłucz naczynie 1 × PBS.
    ostrożność: Formaldehyd powoduje poważne uszkodzenie oczu, może powodować reakcję alergiczną skóry, a także jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym; Dlatego wszystkie etapy eksperymentalne z formaldehydem należy wykonywać w okapie kuchennym.
    UWAGA: Aby uniknąć niepotrzebnego wybielania sygnałów fluorescencyjnych, należy przechowywać naczynie w ciemnej komorze w czasie inkubacji niezbędnym do barwienia immunofluorescencyjnego.
  2. Przepuszczalność komórek 0,1% Triton X-100 rozpuszczonego wH2Oprzez 8 min, a następnie inkubacja komórek przez 12 min z 1× PBS zawierającym 0,1% saponiny i 0,1% Triton X-100. Po inkubacji umyć komórki w 1× PBS dwa razy przez 15 minut.
  3. Inkubuj komórki z 1% BSA w 1× PBS przez 60 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie wybranych przeciwciał. Myć komórki w 1× PBS przez 15 minut po inkubacji.
  4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1:100 (lub 1:200) (ten krok musi być zoptymalizowany dla poszczególnych przeciwciał) w 1% BSA w 1 × PBS, używając 25 μl tego roztworu na szalkę, i przykryć komórki szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować komórki z roztworem zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Następnego dnia przemyj komórki w 1 × PBS dwa razy przez 5 minut.
  6. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:100 (lub alternatywnie 1:200) w 1% BSA w 1 × PBS, używając 100 μl tego roztworu na szalkę, i przykryć komórki szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować komórki z roztworem zawierającym przeciwciało drugorzędowe przez 60 minut. Po inkubacji umyć komórki w 1 × PBS trzy razy przez 5 minut.
  7. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z kroplą medium montażowego i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci lub klejem, aby zapobiec wysuszeniu i przesuwaniu się podczas obserwacji mikroskopowej. Przechowywać naczynie w ciemności w temperaturze 4 °C.

5. Mikroskopia obrazu fluorescencji w czasie życia (FLIM)

  1. Uruchom oprogramowanie FLIM. Otwórz "Pakiet aplikacji" oprogramowania i przełącz go w tryb "FLIM". Upewnij się, że DOR działa w trybie impulsowym.
    UWAGA: Operator musi przełączyć przycisk sprzętowy, aby przejść do trybu impulsowego.
  2. Umieścić naczynie zawierające zabarwione komórki (barwione w sekcji 4) na stoliku mikroskopowym w tym samym położeniu, co podczas miejscowego mikronapromieniania i odnaleźć napromieniowane komórki zgodnie z kratkami na szalce Petriego. Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Użyj następujących ustawień: 1024 × 1024 pikseli, 400 Hz, tryb dwukierunkowy, 16 linii, powiększenie od 8x do 12x.
  3. Przed rozpoczęciem pomiaru FLIM wykonaj wstępny test, aby pokazać zapis rozkładu wykładniczego w czasie rzeczywistym, klikając "Setup FLIM" i "Acquisition" i naciskając "Run FLIM test". Zoptymalizuj parametry FLIM dla próbki, oceniając dwa główne parametry w następujący sposób.
    1. Zoptymalizuj częstotliwość powtarzania DOR z długością fali wzbudzenia dostosowaną do czasu życia próbki (patrz uwaga poniżej). W oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego wyreguluj intensywność lasera za pomocą odpowiedniego przycisku, który ogólnie nazywa się "ustawieniem regulacji lasera" w menu "akwizycja obrazu". Następnie oblicz krzywą rozpadu (lub histogram pokazujący wszystkie liczby fotonów) za pomocą oprogramowania FLIM (patrz Rysunek 4A-B).
      UWAGA: Użyj WLL w trybie impulsowym do wzbudzenia. Oprogramowanie musi być wyposażone w picker impulsów dla WLL, który umożliwia wybór częstotliwości powtarzania (80, 40, 20 lub 10 MHz). Długość fali wzbudzenia w przypadku donora fluorescencji, GFP, wynosi 488 nm. Krzywa zaniku jest rejestrowana za pomocą przestrzeni roboczej oprogramowania FLIM. Parametr (τD, τDA) pokazuje wykładnicze czasy zaniku (np. czas życia fluorochromu); parametr (A) reprezentuje amplitudę rozpadu fluorochromu (patrz przykłady danych FLIM dla p53 oznaczonego GFP i 53BP1 oznaczonego mCherry w Rysunek 4A-B).
    2. Sprawdź częstotliwość zliczania powtórzeń za pomocą narzędzia do akwizycji oprogramowania (wybierz tryb częstotliwości powtarzania). Zaznacz najjaśniejsze piksele w próbce; Krzywa dla najjaśniejszego piksela musi być niższa niż 10% całkowitej intensywności fluorescencji.
  4. Kliknij "Pomiar" i naciśnij "Uruchom FLIM".

6. Czas życia dawcy przy użyciu skryptu FLIM i obliczanie wydajności FRET

  1. Uruchom oprogramowanie FRET-FLIM i otwórz obszar roboczy "Darczyńca".
  2. Wybierz w menu zakładkę "Analiza"/"Obrazowanie" i uruchom skrypt FLIM, klikając "Start". Aby uzyskać optymalne ustawienia FRET-FLIM, należy używać dobrze znanych oddziałujących partnerów białkowych.
    UWAGA: Wydajność FRET-FLIM dla dobrze znanych współpracujących partnerów GFP-p53 i mCherry-53BP1 wynosiła (34,1 ± 2,3)% (Rysunek 4C).
  3. Używaj tylko kanału emisji Donora (kanał 1 lub 2) i naciśnij "Oblicz szybki FLIM".
    UWAGA: Zarówno obraz, jak i wykres zostaną zaktualizowane.
  4. W oprogramowaniu FRET-FLIM należy ręcznie ustawić skalę intensywności (0 - 4000 zliczeń) i skalę żywotności (0 - 5 ns) w oprogramowaniu. Dzięki takiemu podejściu zwizualizuj interesującą Cię komórkę i ustaw pomiar FRET-FLIM.
    UWAGA: To ustawienie eliminuje różnice w intensywności fluorescencji między poszczególnymi komórkami w populacji komórek.
  5. W formularzu rozpadu wybierz model dopasowania.
    UWAGA: Zalecamy n-wykładniczą rekonwolucję i wybór parametru modelu "n". Optymalne dopasowanie ma następujące kryteria: dopasowana krzywa dobrze nakłada się na krzywą zaniku, a wartość χ2- jest równa 1 (Rysunek 4B).
  6. Wybierz "Próg"/"Użyj progu" i ustaw próg na 75. Rozpocznij "Wstępne dopasowanie".
    UWAGA: Oprogramowanie SPT64 oblicza średni czas życia dawcy w przypadku braku FRET ("Amplitude weighted mean lifetime", τAv.Amp)

7. Wydajność FRET przy użyciu skryptu FLIM-FRET

  1. Wybierz obszar roboczy Dawca/Akceptant, a następnie otwórz "Analiza"| "Obrazowanie"| "Dożywotni obraz FRET".
  2. Wybierz tylko Dawcę jako aktywny kanał i dostosuj Binning pikseli w zależności od liczby fotonów/pikseli. Następnie uruchom tryb oprogramowania o nazwie "Oblicz FastFLIM". Jeśli liczba fotonów/pikseli na obrazie jest niska, zwiększ liczbę pikseli do 4 punktów.
  3. Ustaw intensywność na 0 - 200 zliczeń, a czas życia na 0 - 5 ns.
  4. Aktywuj opcję "Użyj progu" i wprowadź próg 75.
  5. Ustaw model dopasowania na "Multi-Exp. Dawca", wprowadź parametr modelu "n", wprowadź τAv.Amp (krok 6.6) jako τD i aktywuj "Wstępne dopasowanie".
  6. Ustaw parametry BkgrDec, ShiftIRF i BkgrIRF na stałe wartościS, usuwając znacznik.
    UWAGA: Ustaw większość parametrów tak, aby pozostała stała w jak największym stopniu. Takie podejście zmniejsza fluktuacje statystyczne. W takim przypadku nie naciskaj ponownie przycisku "Początkowe dopasowanie". Opisy wymienionych parametrów są następujące: IRF = Instrument Response Function, BkgrDec = Tło z dopasowania wykładniczego, ShiftIRF = Przesunięcie IRF z wykładniczego dopasowania rekonwolucyjnego, BkgrIRF = Tło IRF z wykładniczego dopasowania rekonwolucyjnego. Wszystkie trzy parametry są obliczane i można je ustalić za pomocą oprogramowania w celu dalszej analizy.
  7. Naciśnij "Oblicz FRET"; obliczany jest obraz FRET (wykreślany w obszarze obrazu FLIM) i histogram wydajności FRET, a następnie wykreślany jest histogram odległości FRET (Rysunek 4C). Po zakończeniu analizy obrazu naciśnij "Zapisz wynik".
    UWAGA: Podczas eksperymentów FRET należy wziąć pod uwagę, że białka fluorescencyjne wykazują odwracalne przejścia między stanami fluorescencyjnymi (jasnymi) i niefluorescencyjnymi (ciemnymi). Ta cecha nazywa się "mruganiem", a zjawisko to wpływa na wydajność FRET (wyjaśnienie tego efektu zostało dostarczone przez Vogerla i wsp.24).

8. Analiza FRAP

  1. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu, znajdź transfekowane komórki wyrażające interesujące Cię białko znakowane fluorescencyjnie i wykonaj akwizycję obrazu za pomocą mikroskopii jasnego pola ze standardową lampą mikroskopową (patrz Rysunek 2Aa-b) i tryby mikroskopii fluorescencyjnej.
    1. Do akwizycji obrazu należy użyć lasera światła białego (WLL) podłączonego do mikroskopu konfokalnego (lub wybranego lasera, w zależności od wybranego fluorochromu). Użyj następujących ustawień: 512 × 512 pikseli, 1000 Hz, tryb dwukierunkowy, średnia liniowa 1, powiększenie od 8x do 12x.
    2. Zdobądź co najmniej 15 obrazów wstępnego wybielania (przy ~10% mocy lasera) i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w menu akwizycji obrazu.
  2. Do eksperymentów z fotowybielaniem użyj lasera argonowego (488 nm). Zastosuj następujące ustawienia: rozdzielczość klatki 512 × 512 pikseli, 1000 Hz, tryb dwukierunkowy, powiększenie od 8x do 10x.
    UWAGA: Fluorochromy, w tym GFP, mCherry i RFP, mogą być wzbudzane przez laser argonowy pracujący przy 488 nm lub 514 nm.
  3. Użyj trybu oprogramowania FRAP wybranego mikroskopu. Podczas fotowybielania ustaw moc lasera argonowego na maksimum za pomocą przycisku regulacji lasera. Akwizycja obrazu odbywa się w odstępach co 0,256 s, przy 10% mocy lasera.
    UWAGA: W przypadku etapów wybielania należy użyć standardowego trybu akwizycji obrazu wybranego mikroskopu konfokalnego.
    1. Monitoruj czas odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (do 45-50 s po zabiegu wybielania).
      UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 4D, czas rekonwalescencji po fotowybielaniu dla 53BP1 znakowanego mCherry jest wyraźny w przypadku spontanicznych zmian DNA i ognisk wywołanych promieniowaniem UVA. mCherry-53BP1 w zmianach UVA szybko się regenerował w porównaniu z akumulacjami mCherry-53BP1 w spontanicznie występujących ogniskach naprawy DNA; patrz Rysunek 4D i Foltankova et al.25
  4. Eksportuj dane z oprogramowania mikroskopu (lub wybranego oprogramowania) do arkusza kalkulacyjnego i wykonaj analizę statystyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z zaawansowanej mikroskopii konfokalnej, zaobserwowaliśmy nagromadzenie białek 53BP1 i mCherry-PCNA oznaczonych mCherry w uszkodzeniach DNA. Analizy przeprowadzono metodą miejscowego mikronapromieniania żywych komórek. Aby rozpoznać wzorce dystrybucji jądrowej białek związanych z naprawą DNA w poszczególnych fazach cyklu komórkowego, użyliśmy systemu komórkowego Fucci, za pomocą którego możliwe jest określenie faz G1, wczesnego S i G2 cyklu komórkowego (Rys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki mikroskopowe stanowią podstawowe narzędzia w laboratoriach badawczych. W niniejszej pracy przedstawiono krótki opis metod stosowanych do badania rekrutacji i kinetyki białek w uszkodzeniach DNA. Zwróciliśmy szczególną uwagę na nasze doświadczenia eksperymentalne w dziedzinie miejscowego mikronapromieniania żywych komórek i omawiamy badanie kinetyki białek za pomocą FRAP i interakcji białko-białko w uszkodzeniach DNA za pomocą akceptorowo-wybielającego FRET28 i jego zaawansowanej modyfikac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Agencję Grantową Republiki Czeskiej, projekt P302-12-G157. Eksperymenty były również wspierane przez Czesko-Norweski Program Badawczy CZ09, który jest nadzorowany przez fundusze norweskie, oraz przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej (numer grantu: 7F14369).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cell culting
HeLaATCCCCL-2TM
ES-D3 [D3]ATCCCRL-11632TM
Komórkihttp://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEMPAN-BiotechP03-0710
DMEM wysoka glukozaSigma-AldrichD6429-500ML
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyCloneSV30180.03
ES Cell FBSGibco16141-079
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco11140-035
mLIF (czynnik inhibitora białaczki myszy)Merck MilliporeESG1107
MTG (1-tioglicerol)Sigma-AldrichM6145-25ML
Roztwór penicyliny-streptomycynyBioseraXC-A4122/100
Trypsyna - EDTABioseraXC-T1717/100rozcieńczyć 1 i razy; PBS w stosunku 1:6
Naczynia do hodowli komórek nunclonSigma-AldrichP7866hodowla mESC Komórki D3
i mikro;-Dish 35m+A15:I35m Grid-500Ibidi GmbH81166naczynie mikroskopowe
0,2% ŻelatynaSigma-AldrichG1890-100Grozcieńczyć w wodzie destylowanej i autoklawowane
NazwaCompanyNumer katalogowy<strong>Komentarze
Transfekcja komórek
GFP-p53 plazmidAddgene12091
mCherry-PCNA plazmidhojny prezent od Cristiny Cardoso, Technische Universitä t Darmstadt
mCherry-53BP1 plazmidAddgene19835
MetafeceteneBiontex Laboratories GmbHT020– 2.0
10 i razy; PBSThermo Fisher ScientificAM9625do użytku transfekcyjnego 1 i razy; PBS rozcieńczony w wodzie wolnej od nukleaz
5-bromo-2'-deoksy-urydynaSigma-Aldrich11296736001
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskopia konfokalna
Mikroskop Leica TCS SP5Leica Microsystems
Leica TCS SP8Leica Microsystems
Laser światła białegoLeica Microsystems
355-nm laserCoherent Inc.moc lasera 80 mW
Laser 405 nmLeica Microsystems50 mW
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Barwienie immunofluorescencyjne
KrytkoVWR International Ltd631-1580
4% paraformaldehydAffymetrix19943 1 LT
Triton X100MP Biomedicals2194854
Saponina z kory quillajaSigma-AldrichS4521
BSASigma-AldrichA2153
53BP1AbcamAB21083przeciwciało
pierwszorzędoweAlexaFluore 647Thermo Fisher ScientificA27040przeciwciało wtórne
VectashieldVector Laboratories LtdPodłoże montażoweH-1000
HeLa-Fucci Mikroskop Moc lasera

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858(2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281(2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39(2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593(2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikoirradiacjaFRAPFLIMFRETsystem Fuccilasery UVcykl kom rkowy

Powiązane artykuły