Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56002

⸱

6 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Medical University Innsbruck, 2Department of Internal Medicine V (Hematology & Oncology), Medical University Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Department of Pediatrics, Medical University Graz

W tym artykule

Podsumowanie

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Streszczenie

Obecność niepełnego chimeryzmu jest zauważana u dużego odsetka pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego z powodu talasemii większej lub niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. Obserwacja ta ma ogromne implikacje, ponieważ kolejne strategie immunomodulacji terapeutycznej mogą poprawić wyniki kliniczne. Konwencjonalnie, analiza oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy krótkich powtórzeń tandemowych jest stosowana do identyfikacji chimeryzmu w komórkach krwi pochodzących od dawcy. Jednak ta metoda jest ograniczona do komórek jądrzastych i nie może rozróżnić zdysocjowanych linii jednokomórkowych. Zastosowaliśmy analizę krótkich powtórzeń tandemowych do krwiotwórczych komórek progenitorowych posortowanych cytometrią przepływową i porównaliśmy to z analizą krótkich powtórzeń tandemowych uzyskanych z wybranej jednostki tworzącej pęknięcia - kolonii erytroidalnych, pobranych ze szpiku kostnego. Dzięki tej metodzie jesteśmy w stanie wykazać różną proliferację i różnicowanie komórek dawcy w przedziale erytroidalnym. Technika ta kwalifikuje się do pełnego monitorowania chimeryzmu w warunkach przeszczepu komórek macierzystych, a tym samym może być stosowana w przyszłych badaniach klinicznych, badaniach nad komórkami macierzystymi i projektowaniu prób terapii genowej.

Wprowadzenie

Allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) jest jedynym dostępnym sposobem leczenia różnych wrodzonych zaburzeń genetycznych układu krwiotwórczego, osiągając wskaźniki przeżycia wolne od choroby na poziomie ponad 90% dla pacjentów z wysokim upośledzeniem i ograniczonym życiem1. Skuteczność tego ważnego narzędzia terapeutycznego została zoptymalizowana poprzez ograniczenie toksyczności schematów przed i po przeszczepie2, ale także poprzez interwencje mające na celu utrzymanie stabilnej funkcji przeszczepu, która jest określana ilościowo przez ścisłe monitorowanie komórek pochodzących od dawcy3,4,5.

Ogólnie rzecz biorąc, całkowity chimeryzm (CC) oznacza całkowite zastąpienie kompartmentu limfohematopoetycznego przez komórki pochodzące od dawcy, podczas gdy termin mieszany chimeryzm (MC) jest używany, gdy komórki pochodzące od dawcy i biorcy są jednocześnie obecne w różnych proporcjach. Chimeryzm rozdwojony (SC) oznacza współistnienie chimeryzmu mieszanego obserwowanego w liniach jednokomórkowych, takich jak przedział erytroidalny. Szybkie określenie statusu chimeryzmu po HSCT ma kluczowe znaczenie, ponieważ może pomóc w identyfikacji pacjentów podatnych na nawrót choroby i zainicjowaniu kolejnych strategii immunomodulacyjnych, takich jak infuzje limfocytów dawcy lub zmniejszenie terapii immunosupresyjnych6.

Opracowano kilka metod monitorowania wszczepienia po HSCT. Izotypowanie immunoglobulin i analiza cytogenetyki mają słabą czułość i ograniczoną zdolność do wykrywania polimorfizmu7,8. Wprowadzenie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) może zwiększyć czułość w monitorowaniu chimeryzmu po HSCT, ale jest ograniczone do niedopasowanych płciowo przeszczepów allogenicznych9. Obecnie reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest najbardziej rozpowszechnioną metodą stosowaną do wykrywania chimeryzmu i opiera się na konwencjonalnej elektroforezie w żelu agarozowo-akrylowym o zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych (VNTR) lub krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Rutynowo stosowany ilościowy PCR jest w stanie wykryć bardzo mały odsetek pozostałych komórek dawcy po HSCT. Głównym ograniczeniem dotychczasowych badań jest to, że wykrywanie MC ogranicza się prawie wyłącznie do obecności komórek jądrzastych, a nie dojrzałych erytrocytów, czyli komórek, które są funkcjonalnie kluczowe dla pacjentów dotkniętych hemoglobinopatiami. U pacjentów z różnymi grupami krwi warto pamiętać, że analiza cytofluorometryczna jest w stanie zidentyfikować chimeryzm w czerwonych krwinkach poprzez wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenom erytrocytów ABO i C, c, D, E i e10,11. Innym, ale bardzo interesującym sposobem oceny chimeryzmu w linii erytroidalnej jest połączenie sortowania progenitorów erytroidalnych metodą cytometrii przepływowej i selekcji różnych typów progenitorów erytroidalnych poprzez hodowlę w testach klonogennych, a następnie analizę STR12. Podejście to jest w stanie określić ilościowo względne proporcje chimeryzmu dawca kontra biorca w przedziale erytroidalnym i może być wykorzystane w strategii utrzymania przeszczepu szpiku kostnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja komórek hematopoetycznych szpiku kostnego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

  1. Barwienie próbki
    1. Przed rozpoczęciem procesu należy zebrać i przygotować następujące przedmioty:
      1. Pożywka gradientowa do przygotowania komórek jednojądrzastych (GM), probówki stożkowe 50 ml
      2. Rurki przepływowe 12 x 75 mm do barwienia komórek
      3. Bufor barwiący: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 3% płodowa surowica cielęca (FCS)
      4. Pipety
      5. Przeciwciała blokujące i barwiące FC (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Dzięki tej kombinacji fluorochromu przenikanie do innych kanałów jest znikome, ale możliwa jest również każda inna odpowiednia kombinacja fluorochromu.
      6. Koraliki kompensacyjne (w razie potrzeby)
      7. Bufor zawiesiny: Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
      8. Błękit trypanowy i hemocytometr
      9. Probówki do pobierania komórek: do pobierania posortowanych komórek można użyć dowolnej bogatej pożywki z probówkami o wysokiej zawartości surowicy (zawierającej 1 ml FCS + 25 mM HEPES).
      10. Próbka szpiku kostnego: zazwyczaj wymagana jest świadoma zgoda na biopsję szpiku kostnego z grzebienia biodrowego tylnej części kości biodrowej. Próbka szpiku kostnego jest następnie przechowywana w strzykawkach zawierających heparynę w temperaturze pokojowej do czasu barwienia. Poniższe kroki protokołu są wykonywane zgodnie z wytycznymi Komisji Etycznej ds. Badań Naukowych na Ludziach w Instytucji ds. Dobrostanu Człowieka.
    2. Wygeneruj jednokomórkową zawiesinę próbki szpiku kostnego. Dodać 3 ml GM do probówki wirówkowej. Ostrożnie nałożyć 4 ml zawiesiny jednokomórkowej na roztwór GM. Wirować przy 550 g przez 30 minut w temperaturze 20 ° Celsjusza (C) (hamulec jest wyłączony). Narysuj górną warstwę zawierającą osocze i płytki krwi za pomocą sterylnej pipety, pozostawiając nienaruszoną warstwę komórek jednojądrzastych na granicy faz. Przenieść warstwę komórek jednojądrzastych do sterylnej probówki wirówkowej za pomocą sterylnej pipety.
    3. Po przemyciu 5 ml buforu barwiącego, ponownie zawiesić komórki w 2 ml buforze zawiesinowym i oznaczyć stężenie komórek. Umieścić 5 μl zawiesiny komórek w probówce z zakrętką. Dodać 95 μl 0,2% niebieskiej plamy trypanowej. Dokładnie wymieszaj. Odstawić na 5 minut w temperaturze pokojowej. Napełnij hemocytometr jak do liczenia komórek. Pod mikroskopem obserwuj, czy niezdolne do życia komórki są wybarwione i policz żywe komórki.
    4. Odwirować komórki w stężeniu 250 g przez 10 minut w temperaturze 20 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym w stężeniu do 1 x 10,6 na 100 μl.
    5. Blok FcR za pomocą 2,5 μg Fc Block na 1 x 106 komórek na lodzie przez 10 - 15 min.
    6. Dodać odpowiednią kombinację 10 μg mAb do barwienia 1 x 106 komórek i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4°C w ciemności, a następnie przejść do etapu przemywania z 3 ml buforu barwiącego. W celu prawidłowej kompensacji, małe podwielokrotności komórek (lub najlepiej kulki kompensacyjne) są barwione pojedynczymi przeciwciałami; Jedna podwielokrotność pozostaje niepoplamiona.
    7. Dostosuj stężenie do 20 x 106 komórek/ml.
    8. Skonfiguruj i zoptymalizuj sorter komórek. Proces konfiguracji cytometru przepływowego i oprogramowania jest ustandaryzowany na podstawie szczegółowej instrukcji dostarczonej przez firmę i musi być wykonywany przez odpowiednio przeszkolony personel.
  2. Sortowanie w sortowniku komórek
    1. Przygotować probówki zbiorcze z kroku 1.1.1.9.
    2. Skonfiguruj szablon, który zawiera wykres dwóch zmiennych, aby wyświetlić punktowy do przodu (FSC) i punktowy boczny (SSC).
    3. Uruchom komórki i dostosuj FSC/SSC, aby umieścić interesującą populację na skali
    4. Nagrać probówkę kontroli ujemnej.
    5. Uruchomić pojedyncze probówki kontroli dodatniej; zapisać dane dla każdej probówki.
    6. Obliczanie wynagrodzenia jest ręczne lub automatyczne za pomocą funkcji zapewnianej przez oprogramowanie do akwizycji.
    7. Pobrać próbkę eksperymentalną i umieścić ją na dwuwymiarowym wykresie kropkowym FSC/SSC (Rysunek 1A), aby uwzględnić zarówno komórki limfocytarne, jak i szpikowe. Wyklucz dublety i agregaty, porównując różne sygnały FSC (tj. wysokość, szerokość i obszar) (Rysunek 1B). Wizualizuj komórki singletowe na dwuwymiarowym wykresie kropkowym wyświetlającym CD45 i CD36 ( Rysunek 1C). Zdarzenia dodatnie dla CD45 to leukocyty (w tym ich przodki), te ujemne dla CD45 i dodatnie dla CD36 to erytroidalne komórki progenitorowe. Użyj narzędzi do bramkowania, aby zdefiniować CD36 + (w razie potrzeby komórki te można dalej podzielić na komórki o wysokiej i niskiej ekspresji CD36) i komórki CD45 +. Wizualizuj zdarzenia CD45+ na innym wykresie kropkowym wyświetlającym parametry CD34 i SSC. Użyj narzędzi do bramkowania, aby zdefiniować komórki CD34+ (progenitory leukocytów) i wysokie komórki SSC (komórki szpikowe na różnych etapach różnicowania).
    8. Po ustaleniu bramek można je wybrać do sortowania do zewnętrznych probówek zbiorczych.
    9. Sortować w temperaturze 4 °C aż do uzyskania wymaganej liczby komórek
    10. Wykonaj analizę po sortowaniu, aby określić czystość posortowanych populacji komórek (Rysunek 1E, 1F).

2. Test klonogeniczny

  1. Przygotowanie odczynników
    Przed rozpoczęciem procesu należy zebrać i przygotować następujące przedmioty:
    1. Pipety, płytki 100 mm
    2. Błękit trypanowy i hemocytometr
    3. Rekombinowaną ludzką erytropoetynę (EPO) rozpuszczoną w stężeniu 500 j./ml w sterylnym PBS zawierającym co najmniej 0,1% albuminy surowicy ludzkiej. Podzielić ten roztwór na małe porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć powtarzających się zamrażania i rozmrażania.
    4. Przygotuj kompletną modyfikowaną pożywkę Dulbecco firmy Iscove (IMDM) o końcowych stężeniach 5% FCS, 2 mM glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny (PS). Dodać ludzką rekombinowaną erytropoetynę (EPO) w różnych stężeniach w oddzielnych studzienkach do kompletnego podłoża IMDM: 3 jednostki EPO/studzienkę, 6 jednostek EPO/studzienkę i 12 jednostek EPO/studzienkę (odpowiednio 1 x, 2 x, 4 x EPO).
  2. Przygotowanie komórek szpiku kostnego
    1. 10 ml próbki szpiku kostnego rozcieńczonej 20 ml PBS powoli nakłada się warstwami na 15 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, zachowując wyraźną granicę faz między dwiema fazami i w sterylnych warunkach. Następnie odwirować stożkowe probówki o pojemności 15 ml przy 550 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) z przyspieszeniem ustawionym na 9 i opóźnieniem ustawionym na 0 (lub Hamulec wyłączony).
    2. Po odwirowaniu usunąć interfejs do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodać PBS do końcowej objętości 50 ml.
    3. Po odwirowaniu z 250 g przez 10 minut w temperaturze 10 °C usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu IMDM w stężeniu około 0,5 x10,6 komórek/ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej do mikroprobówki, wymieszać z tą samą objętością roztworu błękitu trypanowego (0,4%) i policzyć za pomocą hemocytometru.
    4. Opcjonalnie: ogniwa CD34+ są wzbogacane poprzez magnetyczne sortowanie ogniw za pomocą kulek Milteny CD34 zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Główną zaletą tego etapu wzbogacania jest wykrycie jakości hematopoetycznych komórek macierzystych, które są hodowane na półstałej matrycy z dodatkiem czynnika komórek macierzystych o stężeniu 50 ng/ml (SCF), czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów o stężeniu 20 ng/ml (GM-CSF), interleukiny-3 o stężeniu 20 ng/ml (IL-3), interleukiny-6 o stężeniu 20 ng/ml (IL-6), czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów o stężeniu 20 ng/ml (G-CSF), i 3 różne stężenia EPO, jak w 1.4.
    5. Rozcieńczyć komórki do 0,1 - 0,15 x 106 komórek jednojądrzastych/ml lub 2 x 103 komórek CD34+/ml, dodając kompletną pożywkę IMDM uzupełnioną EPO i przenieść 300 μl do 3 ml pożywki Methocult H4434. Po wymieszaniu i krótkiej inkubacji przez 5 minut rozlać płytkę trzy razy po 1,1 ml na szalce o średnicy 35 mm. Dwie z tych naczyń hodowlanych wraz z trzecią - wypełnioną wodą - umieszcza się na płytkach o średnicy 100 mm.
    6. Komórki hoduje się w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 14 dni.
  3. Analiza kolonii
    1. Kolonie są oceniane zgodnie z ich morfologią za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu w naczyniu hodowlanym oznaczonym siatką punktacji. Na potrzeby naszego testu jednostki tworzące kolonie (CFU) są klasyfikowane w 4 kategoriach: wielopotencjalne komórki progenitorowe (CFU-GEMM), komórki progenitorowe granulocytów-makrofagów (CFU-GM), jednostki tworzące pęknięcia-erytroidy (BFU-E) i jednostki tworzące kolonie-erytroidy (CFU-E). Zapoznaj się z instrukcjami producenta w celu dalszej podklasyfikacji kolonii.
    2. W celu dalszej analizy komórki z płytki testowej CFU są odzyskiwane oddzielnie zgodnie z 4 kategoriami przez zawieszenie w 4 ml PBS o temperaturze pokojowej zawierającej 2% FCS/IMDM. Po odwirowaniu w temperaturze 400 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, komórki są ponownie zawieszane w PBS, zliczane i przetwarzane w celu ekstrakcji DNA.

3. Analiza chimeryzmu

  1. Izolacja DNA
    1. Granulować komórki przez odwirowanie z prędkością 400 g przez 10 minut.
    2. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z krwi (zestaw do ekstrakcji krwi QIAmp DNA). Wstępnie podgrzać bufor elucyjny (AE) w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć wydajność eluowanego DNA.
    3. Zmierz stężenie DNA za pomocą fotometru widmowego Nanodrop ND-1000. Do dalszej analizy wykorzystuje się próbki o OD 260/280 między 1,8 - 2,0.
    4. Rozcieńczyć DNA za pomocą H2O wolnego od DNAaz do 0,1 ng/μL w całkowitej objętości 50 μL.
  2. Analiza STR
    1. Ustaw reakcję PCR, mieszając mieszaninę reakcyjną, polimerazę DNA AmplTaq Gold i zestaw starterów Profiler Plus z 20 μl genomowego DNA (0,1 ng/μL) zgodnie z instrukcją (zestaw starterów zawiera nieznakowane startery w buforze do amplifikacji loci STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 i D7S820, i marker płci amelogenina). Uwzględnij wodę wolną od nukleaz jako kontrolę ujemną i 9947A jako kontrolę pozytywną. Uwzględniono również DNA sprzed przeszczepu zarówno od dawcy, jak i biorcy.
    2. Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu gradientu mastercyklera Eppendorf w następujących warunkach: 95 °C przez 11 minut, 28 cykli amplifikacji po 95 °C przez 1 minutę, 59 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1 minutę, a następnie 60°C przez 45 minut.
    3. Skonfiguruj reakcję analizy fragmentów, dodając 12 μl Hi-Di Formamid i 0,5 μl GeneScan 500 ROX Size Standard (wszystkie Applied Biosystems) do 1 μl produktu PCR. Na pierwszym i ostatnim stanowisku potrzebna jest drabinka alleliczna (Genotyper AmpFlSTR Blue, Green II i Yellow, Applied Biosystems).
    4. Rozpocznij elektroforezę i akwizycję za pomocą przyrządu do elektroforezy.
    5. Analizuj loci, allele i wysokości pików próbek i kontroli za pomocą oprogramowania13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Separacja progenitorów limfohematopoetycznych za pomocą sortowania komórek FACS

Przedstawiamy tutaj wyniki sortowania populacji komórek niezbędnych do późniejszej analizy STR. Komórki szpiku kostnego barwiono przeciwciałami anty-CD45 sprzężonymi z V450, anty-CD36 sprzężonymi z FITC oraz anty-CD34 sprzężonymi z APC. Populacją docelową są megakariocytowo-erytroblastyczne komórki progenitorowe (MEP), czyli jądrowe ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem niniejszego badania jest przedstawienie słuchaczom kombinacji dwóch podejść do analizy chimeryzmu dawcy/biorcy w erytroidalnych progenitorach po HSCT u pacjentów leczonych z powodu hemoglobinopatii: 1.) aktywowane fluorescencją sortowanie komórek progenitorowych hematopoetycznych w próbkach szpiku kostnego, a następnie analiza krótkich powtórzeń tandemowych i 2.) Wzrost komórek szpiku kostnego w jednostkach tworzących kolonie, klasyfikacja kolonii w różnych typach progenitorów, a następnie analiza krótkich powtórze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ficoll-PaqueGE Opieka zdrowotnaGE17-1440-02 Usuń RBC
Probówki stożkowe 50 mlFalcon14-432-22Przygotowanie próbki
Rurki przepływowe 12 x 75 mmSortowanie Falcon352002FACS
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco10010023PBS
Surowica cielęca płoduInvitrogen Inc.16000-044FCS (inaktywowany termicznie)
CD34 APCBD Bioscience561209FACS-Ab
CD36 FITCBD Bioscience555454FACS-Ab
CD45 V450BD Bioscience642275FACS-Ab
Trypan niebieskiGibco15250061
HemocytometrInvitrogen Inc.C10227Automatyczne zliczanie komórek
Hank' s Zrównoważony roztwór soliGibco14025092Bufor zawiesinowy w analizie FACS
HEPESGibco15630080Składnik bufora zawiesinowego
FcRBD Bioscience564220Blok FCR
FACS Aria IBD Bioscience23-11539-00Sortownik FACS
Rekombinowana  ludzka erytropoetynaAffimetrix eBioscience14-8992-80EPO
Isocove" s Zmodyfikowany Dulbecco" s MediumGibco12440053IMDM
L-GlutaminaInvitrogen25030-081Składnik pożywki
hodowlanej Kulki magnetyczne CD34+Milteny Biotech130-046-702CD34+ oczyszczanie
Rekombinant  ludzki G-CSFGibcoPHC2031Test CFU
Rekombinant  ludzki SCFGibcoCTP2113Test CFU
Rekombinant  ludzki GM-CSFGibcoPHC2015Test CFU
Rekombinowany  ludzki IL-3BD Bioscience554604Test CFU
Rekombinowany  ludzki IL-6BD Bioscience550071Test CFU
Methocult H4434 MediumStemcell Technologies4444Test CFU
QiAmp DNA Zestaw do ekstrakcji krwiQiagen51306Izolacja DNA
Nanodrop Fotometr widmowy ND-1000Thermo ScientificND 1000Kwantyfikacja DNA
Wolne od DNAazy H2OThermo ScientificFEREN0521Preparat DNA
AmplTaq Gold AppliedBioscienceN8080240PCR
Eppendorf mastercycler gradientEppendorf6321000019PCR 
Hi-Di FormamidApplied Bioscience4311320PCR
GeneScan 500 ROX Rozmiar StandardowyApplied Bioscience4310361PCR
3130 Analizator genetycznyApplied Bioscience313001RPCR

Bibliografia

  1. Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
  2. Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825(2012).
  3. Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
  4. Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
  5. Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
  6. Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
  7. Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
  8. McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
  9. Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
  10. Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
  11. Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
  12. Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
  13. Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
  14. Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
  15. Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sortowanie kom rek metod cytometrii przep ywowejanaliza kr tkich powt rze tandemowychmononuklearne kom rki szpiku kostnegotest jednostek kolonogennychbramkowanie kom rek CD36 CD45ekstrakcja DNA i analiza PCRtechnika monitorowania chimeryzmuengraftment u pacjent w z hemoglobinopatiami
Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.