Artykuł metodologiczny

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

DOI:

10.3791/56011

⸱

28 lipca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka wiążące RNA (RBP) decydują o losie RNA. Uczestniczą we wszystkich szlakach biogenezy RNA, a zwłaszcza przyczyniają się do potranskrypcyjnej regulacji genów (PTGR) informacyjnych RNA (mRNA). W ciągu ostatnich kilku lat udało się wyizolować szereg proteomów związanych z mRNA z linii komórkowych drożdży i ssaków dzięki zastosowaniu nowatorskiej metody zwanej "wychwytywaniem interaktomii mRNA", która pozwala na identyfikację białek wiążących mRNA (mRBP) bezpośrednio ze środowiska fizjologicznego. Metoda polega na sieciowaniu in vivo w ultrafiolecie (UV), ściąganiu i oczyszczaniu przekaźnikowych kompleksów rybonukleoproteinowych (mRNP) za pomocą kulek oligo(dT), a następnie identyfikacji usieciowanych białek za pomocą spektrometrii mas (MS). Całkiem niedawno, stosując tę samą metodę, zgłoszono jednocześnie kilka proteomów związanych z roślinnym mRNA z różnych źródeł tkanek Arabidopsis: etiolowanych siewek, tkanki liści, protoplastów mezofilu liści i hodowanych komórek korzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę wychwytywania interaktomii mRNA dla protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana, typu komórki, który służy jako wszechstronne narzędzie do eksperymentów obejmujących różne testy komórkowe. Warunki optymalnej wydajności białka obejmują ilość tkanki wyjściowej i czas trwania promieniowania UV. W proteomie związanym z mRNA uzyskanym w eksperymencie na średnią skalę (107 komórek) stwierdzono, że RBP, u których zauważono, że mają zdolność wiązania RNA, są nadreprezentowane i zidentyfikowano wiele nowych RBP. Eksperyment można rozszerzyć (10-9 komórek), a zoptymalizowaną metodę można zastosować do innych typów i gatunków komórek roślinnych w celu szerokiej izolacji, skatalogowania i porównania proteomów związanych z mRNA w roślinach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukarionty używają wielu szlaków regulacyjnych biogenezy RNA do utrzymania komórkowych procesów biologicznych. Wśród znanych typów RNA, mRNA jest bardzo zróżnicowane i posiada zdolność kodowania białek i ich izoform1. Szlak PTGR kieruje losami pre-mRNAs2,3. RBP z różnych rodzin genów kontrolują regulację RNA, a w PTGR specyficzne mRBP kierują mRNA przez bezpośrednie interakcje fizyczne, tworząc funkcjonalne mRNP. Dlatego identyfikacja i charakterystyka mRBP i ich mRNP ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji komórkowego metabolizmu mRNA2. W ciągu ostatnich trzech dekad różne metody in vitro – w tym testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej RNA (REMSA), systematyczna ewolucja ligandów za pomocą testów wzbogacania wykładniczego (SELEX) opartych na konstruktach pochodzących z biblioteki, RNA Bind-n-Seq (RBNS), znakowane radioaktywnie lub ilościowe testy wiązania fluorescencji RNA, krystalografia rentgenowska i spektroskopia NMR4,5,6,7,8,9 – są szeroko stosowane w badaniach RBP, głównie z komórek ssaków. Wyniki tych badań RBP ssaków można przeszukiwać za pośrednictwem bazy danych białek wiążących RNA (RBPDB), która gromadzi opublikowane obserwacje10.

Chociaż te podejścia in vitro są potężnymi narzędziami, określają związane motywy RNA z danej puli sekwencji RNA i dlatego mają ograniczoną zdolność do odkrywania nowych docelowych RNA. To samo dotyczy strategii obliczeniowych do przewidywania RBP w całym genomie, które opierają się na zachowaniu sekwencji i struktury białka15. Aby temu zaradzić, opracowano nową metodę eksperymentalną, która pozwala na identyfikację motywów RNA, z którymi wchodzi w interakcję RBP, a także na określenie dokładnej lokalizacji wiązania. Ta metoda, zwana "sieciowaniem i immunoprecypitacją" (CLIP), składa się z sieciowania in vivo UV, a następnie immunoprecypitacji11. Wczesne badania wykazały, że fotoaktywacja nukleotydów DNA i RNA może zachodzić przy wzbudzeniu fal UV o długości fali większej niż 245 nm. Reakcja przez tymidynę wydaje się być faworyzowana (ranga w kolejności zmniejszonej fotoreaktywności: dT ≥ dC > rU > rC, dA, dG)12. Wykorzystując światło UV o długości fali 254 nm (UV-C), zaobserwowano, że wiązania kowalencyjne między nukleotydami RNA a resztą białkową powstają, gdy znajdują się w zakresie zaledwie kilku angstremów (A). Zjawisko to nazywa się zatem sieciowaniem RNA i RBP "o zerowej długości". Po tym może nastąpić rygorystyczna procedura oczyszczania z niewielkim tłem13,14.

Strategia uzupełniająca CLIP polega na połączeniu sieciowania in vivo UV z identyfikacją białek w celu opisania krajobrazu RBP. Wiele takich proteomów związanych z mRNA w całym genomie zostało wyizolowanych z komórek drożdży, embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i ludzkich linii komórkowych (tj. HEK293 i HeLa) przy użyciu tego nowatorskiego podejścia eksperymentalnego, zwanego "przechwytywaniem interaktomii mRNA"18,19,20,21. Metoda składa się z sieciowania UV in vivo, a następnie oczyszczania mRNP i proteomiki opartej na MS. Stosując tę strategię, odkryto wiele nowych RBP zawierających niekanoniczne RBD i stało się jasne, że więcej białek ma zdolność wiązania RNA, niż wcześniej sądzono15,16,17. Zastosowanie tej metody pozwala na nowe zastosowania i możliwość odpowiedzi na nowe pytania biologiczne podczas badania RBP. Na przykład w niedawnym badaniu zbadano zachowanie proteomu związanego z mRNA (rdzeń proteomu RBP) między komórkami drożdżowymi i ludzkimi22.

Stwierdzono już, że roślinne RBP są zaangażowane we wzrost i rozwój (np. w posttranskrypcyjną regulację czasu kwitnienia, zegara okołodobowego i ekspresji genów w mitochondriach i chloroplastach)24,25,26,27,28,29. Ponadto uważa się, że pełnią one funkcje w procesach komórkowych reagujących na stresy abiotyczne (np. zimno, susza, zasolenie i kwas abscysynowy (ABA))31,32,33,34. W genomie Arabidopsis thaliana znajduje się ponad 200 przewidywanych genów RBP, opartych na motywach sekwencji domeny RNA recognition motif (RRM) i K homology (KH); W ryżu odnotowano około 250 35,36. Warto zauważyć, że wiele przewidywanych RBP wydaje się być unikalnych dla roślin (np. brak ortologów metazoan dla około 50% przewidywanych RBP Arabidopsis zawierających domenę RRM)35, co sugeruje, że wiele z nich może pełnić nowe funkcje. Funkcje większości przewidywanych RBP pozostają niescharakteryzowane23.

Ostatnio zgłoszono izolację proteomów związanych z mRNA z siewek Arabidopsis etiolowanych, tkanek liści, hodowanych komórek korzeniowych i protoplastów mezofilu liści za pomocą wychwytywania interaktomii mRNA38,39. Badania te wskazują na duży potencjał systematycznego katalogowania funkcjonalnych RBP w roślinach w najbliższej przyszłości. W tym miejscu przedstawiamy protokół wychwytywania interaktomii mRNA z protoplastów roślinnych (tj. komórek bez ścian komórkowych). Protoplasty mezofilu liści Arabidopsis thaliana są głównym typem komórek liściowych. Wyizolowane protoplasty umożliwiają optymalny dostęp światła UV do komórek. Ten typ komórek może być używany w testach, które przejściowo eksprymują białka w celu charakterystyki funkcjonalnej40,41. Co więcej, protoplasting został zastosowany do kilku innych typów i gatunków komórek roślinnych42,43,44 (np. Petersson et al., 2009; Bargmann i Birnbaum, 2010; oraz Hong i in., 2012).

Metoda obejmuje w sumie 11 kroków (Rysunek 1A). Protoplasty mezofilu liści rzodkiewnika są najpierw izolowane (etap 1), a następnie naświetlane promieniami UV w celu utworzenia usieciowanych mRNP (etap 2). Gdy protoplasty są lizowane w warunkach denaturacji (etap 3), usieciowane mRNP są uwalniane w buforze do lizy/wiązania i ściągane w dół przez kulki oligo-d (T) 25 (etap 4). Po kilku rundach rygorystycznego mycia mRNP są oczyszczane i poddawane dalszej analizie. Zdenaturowane peptydy mRBP są trawione przez proteinazę K przed oczyszczeniem usieciowanych mRNA, a jakość RNA jest weryfikowana za pomocą qRT-PCR (kroki 5 i 6). Po traktowaniu RNazy i koncentracji białka (krok 7), jakość białka jest kontrolowana za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE) i barwienia srebrem (krok 8). Różnicę we wzorcach prążków białkowych można łatwo zwizualizować między próbką usieciowaną (CL) a próbką nieusieciowaną (non-CL; ujemna próbka kontrolna z protoplastów, która nie jest poddawana promieniowaniu UV). Identyfikacja białek odbywa się za pomocą proteomiki opartej na stwardnieniu rozsianym. Białka z próbki CL są rozdzielane za pomocą jednowymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (1D-PAGE) w celu usunięcia ewentualnego zanieczyszczenia tła, są "trawione w żelu" do krótkich peptydów za pomocą trypsyny i oczyszczane (etap 9). Nanochromatografia cieczowa z odwróconymi fazami sprzężona ze spektrometrią mas (nano-LC-MS) pozwala na określenie ilości ostatecznych białek w proteomie związanym z mRNA (krok 10). Na koniec zidentyfikowane mRBP są charakteryzowane i katalogowane za pomocą analizy bioinformatycznej (krok 11).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja protoplastów z liści rzodkiewnika

UWAGA: Protoplasty mezofilu liści rzodkiewnika są zasadniczo izolowane, jak opisali Yoo et al., 2007, z kilkoma modyfikacjami40.

  1. Wzrost roślin
    1. Namocz około 200 nasion ekotypu Arabidopsis thaliana Col-0 w wysterylizowanej wodzie przez 2 dni w temperaturze 4 °C w ciemności w celu rozwarstwienia.
      UWAGA: Ta liczba nasion jest wystarczająca dla jednej próbki innej niż CL i jednej próbki CL (patrz krok 1.3).
    2. Przygotuj doniczki z 50% (v/v) mieszaniną gleby i wermikulitu i namocz doniczki w wodzie destylowanej na tacy, aby zwilżyć glebę.
    3. Zasiej i rozprowadź rozwarstwione nasiona na mokrej glebie. Nie przykrywaj nasion dodatkową ziemią, ponieważ nasiona rzodkiewnika potrzebują światła do kiełkowania.
      UWAGA: Warunki wzrostu roślin to 12-godzinny cykl świetlny/12-godzinny ciemny w temperaturze 23 °C, o natężeniu światła 100 μmol m-2 s-1, w pomieszczeniu do wzrostu przez 5 tygodni przed kwitnieniem. Można również użyć 4-tygodniowych roślin40.
      UWAGA: Wszystkie opisane materiały i odczynniki od kroku 1.2.1 do kroku 3.2.3 dotyczą dwóch próbek (tj. jednej próbki innej niż CL (próbki kontrolnej, która nie jest poddawana promieniowaniu UV-C) i jednej próbki CL (próbki badawczej poddanej promieniowaniu UV-C)).
  2. Przygotowanie izotonicznego roztworu enzymatycznego
    1. Przygotować 80 ml pierwszorzędowego roztworu enzymu izotonicznego (400 mM mannitolu, 20 mM KCl i 20 mM buforu MES (pH 5,7)) i natychmiast podgrzewać roztwór w inkubatorze o temperaturze 60 °C przez 10 minut.
    2. Dodać 1,2 g celulazy R10 (w/v 1,5%) i 0,32 g proszku Macerozyme R10 (w/v 0,4%) do ciepłego roztworu pierwszorzędowego enzymu izotonicznego.
    3. Ostrożnie wprowadzić proszek enzymatyczny do roztworu, delikatnie mieszając. Szybko podgrzewać roztwór w inkubatorze o temperaturze 60 °C przez 10 minut, aż roztwór enzymu stanie się klarowny, jasnobrązowy.
    4. Schłodzić roztwór na lodzie przez 3 minuty i dodać do roztworu 800 μl 1 M CaCl2 i 800 μl 10% (w/v) BSA.
    5. Homogenizować roztwór, pipetując i filtrując przez filtr 0,22 μm. Podwielokrotność tego końcowego izotonicznego roztworu enzymatycznego podzielić na dwie duże płytki Petriego (150 mm x 20 mm).
  3. Przygotowanie pasków liści rzodkiewnika pospolitego
    UWAGA: Zaleca się 150 liści na każdą szalkę Petriego dla jednej próbki innej niż CL lub jednej próbki CL.
    1. Wybierz i pokrój łącznie 300 w pełni rozwiniętych liści prawdziwych 2lub 3par (średnio: 3 - 4 na rozetę) na paski liści o grubości od 0,5 do 1 mm za pomocą nowej i ostrej żyletki.
    2. Przenieść paski i natychmiast zanurzyć je w roztworze enzymów izotonicznych.
      UWAGA: Aby uniknąć kontaktu ze światłem, zawsze przykrywaj szalki Petriego folią aluminiową. Nie miażdż liści. Upewnij się, że wszystkie paski są zanurzone w roztworze i nie unoszą się na powierzchni.
  4. Izolacja protoplastów mezofilu liści Arabidopsis
    1. Umieścić pokryte folią aluminiową szalki Petriego w eksykatorach próżniowych i infiltrować paski liści pod próżnią przez 30 minut. Następnie inkubować szalki Petriego w ciemności bez wstrząsania w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny.
    2. Delikatnie i krótko potrząśnij ręcznie naczyniami poziomo, próbując całkowicie uwolnić protoplasty do roztworu enzymu.
  5. Zbieranie i liczenie protoplastów
    1. Przefiltrować zawiesinę protoplastów przez siatkę nylonową o grubości od 35 do 75 μm. Porcję filtratu z każdej próbki rozdzielić na dwie probówki okrągłodenne o pojemności 50 ml (około 20 ml filtratu w każdej probówce).
    2. Przepłukać każdą szalkę Petriego 10 ml buforu W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl i 2 mM buforu MES (pH 5,7)) w celu przeniesienia reszty protoplastów do roztworu enzymu. Dodać ten 10 ml filtrat z każdej próbki do probówek. Przykryj rurki folią aluminiową i trzymaj je na lodzie.
    3. Wirować wszystkie cztery probówki przez 5 minut przy 100 x g, aby otoczkować protoplasty. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić granulki protoplastów w każdej probówce z 10 ml buforu W5.
      UWAGA: Podczas ponownego zawieszania granulek protoplastu delikatnie odwróć probówkę do góry nogami i delikatnie obracaj probówkę ręcznie, aż granulki znikną. Nie pipetować granulki bezpośrednio, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
    4. Powtórzyć krok 1.5.3 raz i połączyć zawiesinę protoplastów z dwóch probówek z każdej próbki w jedną probówkę okrągłodenną o pojemności 50 ml. Trzymaj probówki na lodzie.
    5. Policz protoplasty za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: Każde 20 komórek w 25 kostkach równa się 2 x 105 protoplastów/ml. Z 150 liści powinno wyrosnąć około 1 x 107 komórek. Modulować, aby uzyskać równą całkowitą liczbę protoplastów w próbkach innych niż CL i CL.
    6. Trzymaj protoplasty na lodzie przez 30 minut. Następnie obracaj probówki przez 5 minut w temperaturze 100 x g. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś protoplasty w każdej probówce z 20 ml roztworu MMg (400 mM mannitolu, 15 mM MgCl2 i 4 mM buforu MES (pH 5,7)).

2. Sieciowanie mRNA-białko in vivo za pomocą promieniowania UV

UWAGA: Probówkę z próbką bez CL trzymaj na lodzie. Próbka CL musi być natychmiast napromieniowana promieniami UV.

  1. Przenieść zawiesinę protoplastów zawierającą 1 x 107 komórek z probówki z próbką CL na nową, dużą szalkę Petriego (150 mm x 20 mm) i dodać 30 ml lodowatego roztworu MMg w celu pokrycia powierzchni płytki. Rozprowadzić komórki w całym buforze MMg, delikatnie pipetując. Szalkę Petriego bez górnej pokrywy należy natychmiast umieścić w aparacie sieciującym UV.
    UWAGA: Wysokość między lampą UV a szalką Petriego wynosi 8 cm.
  2. Naświetlić próbkę światłem UV o długości fali 254 nm i natężeniu promieniowania UV 0,00875 W/cm2 przez 1 min, 3 minuty lub 5 minut. Po napromieniowaniu szybko podzielić zawiesinę protoplastów na dwie nowe probówki okrągłodenne o pojemności 50 ml. Umyj dno naczynia dodatkowymi 5 ml lodowatego roztworu MMg, aby zebrać pozostałą część protoplastów i dodać tę zawiesinę komórek do tych dwóch probówek.
    UWAGA: Jako warunek optymalny wybrano 1 min. Wyjaśnienie można znaleźć w Reprezentatywnych wynikach.

3. Liza protoplastów w warunkach denaturacji

  1. Przygotowanie granulek protoplastów do lizy
    1. Obracać probówkę z próbką inną niż CL razem z dwiema probówkami z próbką CL z etapu 2 przy 100 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant. Umieść probówkę z osadem protoplastów próbki innej niż CL z powrotem na lodzie.
    2. Dodać 10 ml lodowatego roztworu MMg do każdej probówki z próbką CL, delikatnie zawiesić granulki i połączyć je z powrotem w jedną probówkę okrągłodenną o pojemności 50 ml. Wirować probówkę o masie 100 x g przez 5 minut. Po usunięciu supernatantu należy przechowywać osad protoplastu z probówki z próbką CL na lodzie.
  2. Liza protoplastów i homogenizujący lizat protoplastów
    1. Dodać 9 ml lodowatego buforu do lizy/wiązania (500 mM LiCl, 0,5% (w/v) dodecylowo-siarczanowego litu (LiDS), 5 mM ditiotreitolu (DTT), 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 1 mM EDTA (pH 8,0)) do osadu komórkowego każdej próbki. Z grubsza zgrubnie zmodyfikować protoplasty, pipetując w górę i w dół około 20 razy, aż zawiesina stanie się jednorodnie jasnozielona.
    2. Przepuścić lizat protoplastu dwa razy przez szklaną strzykawkę o pojemności 50 ml z wąską igłą (0,9 x 25 mm2) w celu homogenizacji. Inkubować lizat na lodzie przez 10 minut. Lizaty należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do 3 tygodni.

4. Ściąganie i oczyszczanie mRNP za pomocą koralików oligo-d(T)25

UWAGA: Wszystkie poniższe opisane materiały i odczynniki, od kroku 4.1 do kroku 4.4, są przeznaczone tylko dla jednej próbki (tj. jednej próbki bez CL lub jednej próbki CL). Lizat protoplastów musi być natychmiast dodany do probówek zawierających kulki po odrzuceniu buforu do lizy/wiązania supernatantu perełkowego.

  1. Przygotowanie kulek magnetycznych oligo-d(T)25 do wychwytu oligo(dT)
    1. Rozmrozić zamrożony lizat protoplastów w temperaturze pokojowej. Gdy lizat zostanie całkowicie rozmrożony, trzymaj probówkę z lizatem na lodzie.
    2. Porcję 1,8 ml kulek magnetycznych oligo-d(T)25 (5 mg/ml) do 6 nowych okrągłodennych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml na lodzie. W każdej probówce przemyć zawiesinę kulek jednorodnie 600 μl buforu do lizy/wiązania, krótko pipetując w górę i w dół i delikatnie obracając w temperaturze 4 °C przez 2 minuty. Trzymaj koraliki na lodzie.
  2. wiążący
    1. Umieść wszystkie 6 probówek zawierających kulki w stojaku magnetycznym w temperaturze 4 °C na 3 minuty, co spowoduje magnetyczne wychwycenie kulek i usunięcie zawiesiny.
      UWAGA: Po umieszczeniu probówek w stojaku magnetycznym poczekaj, aż koraliki zostaną całkowicie przechwycone, co najmniej 3 minuty.
    2. Odrzucić supernatant i natychmiast wsypać 9 ml lizatu protoplastów do tych 6 probówek. Dobrze wymieszać pipetując, aż pojawi się jednorodna brązowa zawiesina i inkubować kulki w lizacie protoplastów w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, delikatnie obracając.
      UWAGA: Zalecany czas inkubacji wynosi od 30 min do 1 h.
  3. mycie
    1. Umieść probówki z powrotem w stojaku magnetycznym w temperaturze 4 °C na 3 minuty. Gdy wszystkie kulki zostaną zebrane z boku probówek, zebrać lizat protoplastu do 6 nowych okrągłodennych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i tymczasowo przechowywać je w temperaturze 4 °C. Nie wyrzucaj natychmiast lizatu protoplastów; przechowywać lizat w temperaturze 4 °C.
    2. Dodaj 1,5 ml lodowatego buforu do płukania 1 (500 mM LiCl, 0,1% (w/v) LiDS, 5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 1 mM EDTA (pH 8,0)) do kulek w każdej probówce. Ponownie zawieś koraliki i delikatnie obracaj przez 1 minutę. Umieścić probówki z powrotem w stojaku magnetycznym w temperaturze 4 °C na 3 minuty i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok mycia z buforem do płukania raz.
    3. Powtórz tę samą procedurę tego etapu płukania dwukrotnie, używając 1,5 ml lodowatego buforu do płukania 2 (500 mM LiCl, 5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 1 mM EDTA (pH 8,0)) i raz używając 1,5 ml lodowatego buforu o niskiej zawartości soli (200 mM LiCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 1 mM EDTA (pH 8,0)).
      UWAGA: Jeśli mRNP zostały skutecznie wyizolowane z lizatu protoplastów, wokół granulki kulki w próbce CL powinna być widoczna "aureola" podczas etapu płukania z buforem płuczącym 2 (Rysunek 1B).
  4. Elucji
    1. Dodać 500 μl buforu elucyjnego (20 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 1 mM EDTA (pH 8,0)) do kulek w każdej probówce. Delikatnie zawiesić kulki i inkubować w temperaturze 50 °C przez 3 minuty, aby uwolnić RNA z poli(A)-ogoniastym. Delikatnie zawiesić kulki jeden raz, pipetując. Umieść probówki z powrotem w stojaku magnetycznym w temperaturze 4 °C na 5 minut.
    2. Przenieś i połącz wszystkie eluenty (łącznie około 3 ml) do czystej, sterylnej probówki o stożkowym dnie o pojemności 15 ml bez RNaz na lodzie.
      UWAGA: Jakość i ilość RNA można natychmiast określić za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Stężenie RNA w każdej próbce wynosi około 10 ng/μl, przy stosunku A260/A280 wynoszącym 1,9. Stosunek A260/A280 powinien wynosić od 1,6 do 2,0, ponieważ izolowane RNA z wieloma ogonami mają zwykle czystość większą niż 70%. Jeśli stężenie RNA jest zbyt niskie, zwiększ liczbę początkowych protoplastów do maksymalnie 109. Próbki można zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze 80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
    3. Powtórz kroki od 4.2 do kroku 4.4 przez dodatkowe dwie rundy i ponownie użyj kulek oligo-d(T)25 do zubożenia poli(A)-ogoniastych RNA z lizatu protoplastów.
      UWAGA: Po trzech rundach procedury ściągania powinno być łącznie 9 ml eluentu na każdą próbkę inną niż CL lub CL. Wszystkie prace należy wykonywać w temperaturze 4 °C, aby uniknąć degradacji RNA. Wykonaj krok 4.5 lub krok 4.6, aby ponownie użyć lub zregenerować koraliki.
  5. Przygotowanie ponownie wykorzystanych kulek oligo-d(T)25
    1. Przemyć kulki dwukrotnie 1 ml lodowatego buforu elucyjnego i raz 1 ml lodowatego buforu do lizy/wiązania, aby dostosować stężenie soli LiCl z powrotem do 500 mM.
    2. Postępuj zgodnie z krokiem 4.1, odrzuć supernatant, przenieś zmagazynowany lizat protoplastów do każdej probówki i powtórz całą procedurę od kroku 4.2 do kroku 4.4 przez dodatkowe dwie rundy.
  6. Regeneracja kulek oligo-d(T)25
    UWAGA: Koraliki można przechowywać i używać do innego eksperymentu (maksymalne ponowne użycie to trzy razy).
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 4.4, dodaj 1 ml 0,1 M NaOH do kulek i inkubuj, obracając w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Każdą probówkę przemyć dwa razy 1 ml buforu do przemywania 1 i trzykrotnie 1x PBS (pH 7,4) zawierającym 0,1% Tween-20 w celu zrównoważenia. Przechowuj kulki z każdej probówki w 300 μl sterylnego, wolnego od RNaz 1x PBS (pH 7,4) zawierającego 0,1% Tween-20 w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: Koraliki użyte do próbek Arabidopsis CL w tym eksperymencie mogą być użyte tylko do tych samych próbek roślin następnym razem.

5. Leczenie proteinazą K i oczyszczanie mRNA

  1. Leczenie proteinazą K
    1. Dodać 8 μl roztworu proteinazy K (2 μg/μl) do 1 ml eluentu z każdej próbki, aby strawić białka usieciowane promieniami UV. Krótko wir.
  2. Oczyszczanie mRNA
    1. Inkubować eluent w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Oczyszczać RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA w celu usunięcia pozostałości zanieczyszczeń.
      UWAGA: Po oczyszczeniu RNA są gotowe do testu jakości RNA za pomocą testu qRT-PCR.
      UWAGA: Inne zestawy, takie jak mini zestaw RNA i odczynnik TRIzol, mogą być również używane14.

6. Test qRT-PCR

  1. Odwrotna transkrypcja
    1. Osiągnij wydajną syntezę pierwszej nici cDNA przy użyciu systemu odwrotnej transkrypcji, z 1 μg RNA jako matrycą. Rozcieńczyć próbkę do 5 ng/μl wodą wolną od nukleaz.
  2. Kwantyfikacja cDNA za pomocą qRT-PCR
    1. Amplifikacja i kwantyfikacja cDNA za pomocą głównej mieszanki qPCR i cyklera PCR w czasie rzeczywistym, z 10 ng cDNA jako matrycą. Użyj następującego programu PCR: 95 °C przez 10 minut (etap 1, jeden cykl) i 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę (etap 2, 40 cykli).
      UWAGA: Użytym tutaj genem referencyjnym był endogenny gen kontroli wewnętrznej, UBQ10 (AT4G05320). Startery qRT-PCR dla rRNA UBQ10 i 18S zostały opisane odpowiednio w Li et al., 2014 i Durut et al., 201445,46. Sekwencje podkładu są wymienione w tabeli materiałów.

7. Leczenie RNazą i stężenie mRBP

  1. Leczenie RNazy
    1. Dodać około 100 j. koktajlu RNazy zawierającego RNazę A i RNazę T1 do 8 ml eluentu. Dołączyć próbkę kontroli ujemnej do koktajlu RNazy, w którym eluent zastępuje się wodą wolną od nukleaz. Krótko wirować i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Stężenie mRBP
    1. Po roztrawieniu RNazy zagęścić eluent za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących. Objętość końcowa wynosi 75 μl, przy czym całkowita wydajność białka wynosi około 2 μg z każdej próbki po zagęszczeniu. Umieścić próbki w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

8. SDS-PAGE i barwienie srebrem

  1. STRONA SDS
    1. Zmieszać 25 μl stężonego eluentu (próbka CL) lub próbki kontrolnej (próbka inna niż CL) z 15 μl 2x barwnika ładującego. Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut i umieścić ją w żelu SDS-PAGE zawierającym 5% żelu układającego w stosy i 12% żelu rozdzielczego, w tym marker białkowy.
    2. Zagęścić białka pod napięciem 60 V przez 40 minut i rozdzielić pod napięciem 160 V przez około 1 godzinę, aż barwnik ładujący dotrze do końca żelu rozdzielczego.
  2. Test barwienia srebrem
    1. Żel SDS-PAGE należy myć dwukrotnie ultraczystą wodą przez 5 minut za każdym razem. Wykonaj barwienie srebrze białek za pomocą dostępnego w handlu zestawu do barwienia srebra.
      UWAGA: Paseczki białkowe muszą być pokazane w ciągu 5 minut. Jeśli prążki są widoczne dłużej niż 5 minut przy bardzo jasnym kolorze, sugeruje się zwiększenie liczby początkowych protoplastów do maksimum 109.

9. Trawienie trypsyny w pasmach białkowych i oczyszczanie peptydów

  1. Trypsyna digest
    UWAGA: Uruchom drugi żel 1D-PAGE, pobierając kolejne 25 μl stężonego roztworu mRBP z każdej próbki w celu identyfikacji mRBP; Nie można stosować żeli barwionych srebrem, ponieważ nie są one zgodne z analizą SM.
    1. Po uruchomieniu żelu 1D-PAGE utrwal żel w roztworze utrwalającym (50% (v/v) metanolu i 10% (v/v) kwasu octowego) przez 1 godzinę. Żel należy zabarwić w roztworze barwnika (0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% (v/v) metanolu i 10% (v/v) kwasu octowego) przez 20 minut, delikatnie wstrząsając. Żel należy odbarwić w roztworze odbarwiającym (40% (v/v) metanolu i 10% (v/v) kwasu octowego) przez 1 godzinę. Po odbarwieniu należy przechowywać żel w 5% (v/v) kwasie octowym.
      UWAGA: Podczas odbarwiania nowy roztwór odbarwiający można wymieniać, aż tło zostanie całkowicie odbarwione.
    2. Wytnij interesujące Cię pasma z żelu. Pokrój pasma dalej na kawałki o wielkości około 1 mm3 w celu uzyskania optymalnego trawienia trypsyny i ekstrakcji peptydów. Uwodnić kawałki żelu 50 μl 100 mM wodorowęglanu amonu (NH4HCO3) przez 10 minut. Całkowicie przykryj kawałki żelu.
      1. Ostrożnie usunąć roztwór nawilżający i odwodnić kawałki żelu acetonitrylem (CH3CN) przez 10 minut. Ostrożnie usunąć roztwór acetonitrylu.
      2. Powtórz proces od nawodnienia do odwodnienia dwa razy. Na koniec usuń roztwór acetonitrylu.
        UWAGA: Czas działania żelu zależy od celu eksperymentu. Długi czas pracy pozwala na dobrą separację białek, dzięki czemu wybarwione specyficzne pasma żelu można wyciąć do dalszej analizy. Jeśli celem jest zachowanie białek i usunięcie zanieczyszczeń, wystarczy krótki czas pracy.
    3. Dodać 500 μl 6,6 mM roztworu DTT i inkubować kawałki żelu przez 10 minut. Usunąć roztwór DTT i dwukrotnie przemyć kawałki żelu 500 μl 95% (v/v) roztworu acetonitrylu.
      1. Po umyciu usunąć roztwór acetonitrylu i inkubować kawałki żelu z 500 μl 55 mM roztworu kwasu jodooctowego (IAA) przez 10 minut w ciemności.
      2. Po inkubacji usunąć roztwór i ponownie przemyć kawałki żelu 500 μl 95% (v/v) roztworu acetonitrylu. Wysuszyć kawałki żelu.
    4. Całkowicie zanurz kawałki żelu w 25 μl buforu wytrawiającego (50 mM NH4HCO3, 5 mM CaCl2 i 6 ng/μL trypsyny) i trzymaj na lodzie przez 45 minut, aby trypsyna mogła przeniknąć do żelu. Inkubować kawałki żelu przez noc w temperaturze 37 °C w celu roztrawienia enzymatycznego.
  2. Oczyszczanie peptydów
    1. Dodać 80 μl 50 mM NH4HCO3 do kawałków żelu w buforze wytrawiającym i kilkakrotnie wirować, aby wyekstrahować peptydy tryptyczne. Zbierz ekstrakt. Powtórzyć ten etap ekstrakcji dwukrotnie z 80 μl 50% (v/v)CH3CN i 5% (v/v) kwasu mrówkowego (FA).
      UWAGA: Całkowity ekstrakt końcowy powinien wynosić około 240 μL.
    2. Zebrać i zagęścić ekstrakty w około 10 μl przez zagęszczenie próżniowe lub liofilizację i dodać 25 μl 0,1% (v/v) wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego (TFA). Próbki należy odsalać za pomocą kolumn μ-C18, zgodnie z protokołem producenta.
    3. Eluować peptydy za pomocą 4 - 10 μl 60% (w/v)CH3CN i 0,1% (v/v) FA. Liofilizować (liofilizować) peptydy i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

10. Nano-LC-MS

  1. Nanochromatografia cieczowa z odwróconymi fazami
    UWAGA: Wykonaj analizę LC-MS za pomocą spektrometru mas, który jest sprzężony w trybie online z przyrządem do chromatografii cieczowej. Ten instrument powinien być wyposażony w kolumnę C18 (cząstka 2 μm, rozmiar porów 100 A i wymiar 50 μm x 15 cm).
    1. Zawiesić liofilizowane peptydy w 16 μl roztworu (2% (v/v)CH3CN i 0,1% (v/v) FA). Wstrzyknąć i załadować 5 μl roztworu peptydowego o natężeniu przepływu 5 μl/min na kolumnę C18 (wielkość cząstek 3 μm, wielkość porów 100 A, nanoviper i wymiary 75 μm x 2 cm).
    2. 10.1.2. Rozdzielić peptydy w 95-minutowym gradinie przy natężeniu przepływu 300 nL/min. Podczas tego gradientu separacji zwiększ fazę ruchomą B z 4% do 10%, z 10% do 25% i z 25% do 45% odpowiednio w ciągu 5 minut, 50 minut i 18 minut. Na koniec gwałtownie zwiększ ruchomą fazę B do 95% w ciągu 1 minuty. Po każdym 95-minutowym gradiencie separacji zastosuj naturalny etap płukania zawierający 10-minutowy gradient od 4% do 95% w ciągu 5 minut
      UWAGA: Faza ruchoma A to 99,9%H2Oi 0,1% (v/v) FA, a faza ruchoma B to 19,92%H2O, 80% (w/v) CH3CN i 0,08% (v/v) FA.
  2. Test spektrometrii mas
    1. Eksploatować spektrometr mas w trybie zależnym od danych w zakresie mas od 400 do 1 600 m/z.
    2. Wybierz do dziesięciu najbardziej intensywnych jonów w MS1, aby wygenerować widma fragmentacji. Ustaw rozdzielczość na 70 000 pełnej szerokości przy połowie maksimum (FWHM) dla MS1 i 17 000 dla MS2, z celem automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) wynoszącym 3 000 000 i 1 000 000 jonów oraz maksymalnym czasem wstrzykiwania jonów (IT) wynoszącym odpowiednio 256 i 64 ms dla MS1 i MS2.
    3. Ustaw wykluczenie dynamiczne na 10 s, aby uniknąć powtarzającej się fragmentacji najobficiej występujących jonów.
      UWAGA: W tym przypadku jony z jednym lub więcej niż sześcioma ładunkami są wykluczone dla MS2.
  3. Proteomika jakościowa: identyfikacja peptydów i białek
    1. Analizuj widma fragmentacji za pomocą oprogramowania takiego jak Peaks studio software47,48,49.
      UWAGA: Dostępne są również inne pakiety oprogramowania do identyfikacji peptydów, takie jak NovoHMM30 i PepNovo37 do sekwencjonowania de novo oraz SEQUEST54 i Mascot55 do przeszukiwania baz danych.
    2. Połącz widma o tej samej masie (różnica < 2 ppm) i czasie retencji (< 2 min) i zachowaj tylko widma o progu jakości wyższym niż 0,65, aby przeszukać bazę danych Swiss-Prot (wersja: grudzień 2013) w poszukiwaniu zestawu taksonomii do modelowania rośliny Arabidopsis thaliana. Należy użyć następujących parametrów wyszukiwania: tolerancja masy prekursora wynosząca 10 ppm przy zastosowaniu masy monoizotopowej; tolerancja masy odłamka 20 mmU; trypsyna jako enzym trawienny, z maksymalnie 2 pominiętymi cięciami; karbamidometyloacja cysteiny jako ustalona modyfikacja; utlenianie metioniny jako zmienna modyfikacja; i maksymalnie 3 zmienne modyfikacje potranslacyjne na peptyd. Po identyfikacji ręcznie ustaw progi punktacji dla wiarygodnej identyfikacji peptydów i białek, tak aby uzyskać wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) <5%.
  4. Proteomika ilościowa: analiza statystyczna danych ze spektrometrii mas
    1. Użyj LC-MS (np. Progeneza) do bezznacznikowej kwantyfikacji danych proteomicznych.
      UWAGA: Obszary pików peptydu MS1 (lub intensywność) są powiązane z peptydami zidentyfikowanymi przez oprogramowanie studyjne na podstawie ich masy, z tolerowanym błędem na poziomie maksymalnie 10 ppm.
      UWAGA: To oprogramowanie oblicza obfitość peptydu, integrując obszary pików wszystkich stanów ładunku od 2+ do 8+. Dane ilościowe są powiązane z identyfikacją peptydu PEAKS za pomocą wewnętrznego skryptu (masowe dopasowanie z tolerowanym błędem przy maksymalnie 10 ppm).
    2. Obliczyć średnie logarytmiczno-krotne zmiany (CL/non-CL) dla każdego peptydu. Pogrupuj zmiany fałdowania unikalnych peptydów według białka.
      UWAGA: W każdej grupie końcowa zmiana fałdowania białka jest równa średniej zmianie fałdowania jego peptydów.
    3. Oblicz wartość p za pomocą testu t Studenta dla każdej grupy, aby ocenić istotność statystyczną. Zastosuj pakiet oprogramowania R (wersja 3.3.0), aby skorygować wartości p dla FDR wszystkich grup przy użyciu metody Benjaminiego-Hochberga (BH).
    4. Narysuj wykres wulkanu za pomocą pakietu funkcji "kalibruj" (wersja 1.7.2) zgodnego z pakietem oprogramowania R (wersja 3.3.0).
      UWAGA: W tym przypadku wartości p skorygowane o -log10 (-log10 (przym. wartość p)) są funkcją log2-krotnych zmian wszystkich zidentyfikowanych białek. Białka są traktowane jako dodatnie trafienia w proteomie związanym z mRNA, jeśli ich zmiany log2-krotne są większe niż 2, z lub bez znaczenia.

11. Katalog zidentyfikowanego proteomu związanego z mRNA

  1. Sklasyfikuj zidentyfikowane białka z kroku 10 do trzech kategorii na podstawie pozycji "funkcje molekularne i proces biologiczny" za pośrednictwem bazy danych Gene Ontology (GO) oraz "rodzina i domena" za pośrednictwem bazy danych InterPro.
  2. Ponieważ kategoria I, czyli "białka rybosomalne", zawierają wszystkie wykryte białka rybosomalne, zdefiniuj białka z kategorii II lub "główne RBP" jako zawierające adnotowane domeny białkowe, które oddziałują z RNA lub łączą się z wiązaniem RNA ze znanymi lub nieznanymi funkcjami w biologii RNA.
  3. Ponieważ białka o znanych lub nieznanych funkcjach w biologii RNA bez adnotowanych domen wiążących RNA są umieszczane w kategorii III lub "kandydujących RBP", zdefiniuj enzymy z kategorii III na podstawie adnotacji z bazy danych IntEnz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaobserwowaliśmy charakterystyczne halo, które otacza granulkę kulki w próbce CL, w kroku płukania 4.3 z buforem płukania 2 (Rysunek 1B). Chociaż nie zostało to zbadane, zjawisko to można prawdopodobnie wyjaśnić interferencją usieciowanych kompleksów mRNP z agregacją kulek podczas wychwytywania magnetycznego, powodując tworzenie się bardziej rozproszonego agregatu. Oznacza to, że przechwytywanie koralików oligo-d(T)25 było skuteczne14...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z powodzeniem zastosowaliśmy wychwytywanie interaktomii mRNA, opracowane dla komórek drożdży i ludzi, do protoplastów mezofilu liści roślin. Komórki mezofilu liści są głównym rodzajem tkanki naziemnej w liściach roślin. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje ona sieciowanie in vivo do odkrywania białek ze środowiska fizjologicznego.

W niniejszym protokole przedstawiamy przede wszystkim szereg zoptymalizowanych warunków eksperymentalnych (np. liczbę protoplastów do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy laboratorium prof. Jorisa Winderickxa, który dostarczył urządzenie do sieciowania UV wyposażone w konwencjonalną lampę UV. K. G. jest wspierany przez fundusz badawczy KU Leuven i dziękuje za wsparcie z grantu FWO G065713N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
0,8 M MannitolSigmaM1902-500GPierwszorzędowy roztwór enzymu izotonicznego i
Roztwór MMg
2 M KClMERCKArt. 4935Pierwszorzędowy roztwór enzymu izotonicznego &
Bufor W5
0,2 M MES (pH 5,7)
(kwas 4-morfolinoetanosulfonowy)		Sigma-aldrichM2933Pierwszorzędowy izotoniczny roztwór enzymatyczny
bufor W5 i
roztwór MMg,
Filtracja Sterylizacja
Celulaza R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.CELULAZA
" ONOZUKA"
R-10, 10 g		Końcowy izotoniczny roztwór enzymatyczny
Macerozyme R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.MACEROZYME R-10, 10gKońcowy roztwór enzymu izotonicznego
10% (w/v) BSA
(albumina surowicy bydlęcej)		Sigma-aldrichA7906-100GKońcowy roztwór enzymu izotonicznego i
Filtracja Sterylizacja
1 M CaCl2Chem-Lab NVCL00.0317.1000Końcowy izotoniczny roztwór enzymatyczny
bufor W5 i
Bufor mineralizacyjny
1 M NaClFisher ChemicalS/3160/60W5 Bufor
2 M MgCl2SigmaM8266-100GMMg roztwór
1 M LiCl
(chlorek litu)		Acros199885000Bufor do lizy/wiązania,
Bufor do płukania 1,
Bufor do płukania 2 &
Bufor o niskiej zawartości soli
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)		Sigma-aldrichL4632-25GBufor do lizy/wiązania,
Bufor do płukania 1 i
Filtracja Sterylizacja
1 M DTT
(Dithiothreitol)		Thermo Fisher Scientific
Bufor do płukania 1 &
Bufor płuczący 2		307866Bufor do lizy/wiązania,
1 M Tris-HCl (pH 7,5) (Tris(hydroksymetylo)aminometan, Kwas solny SG (HCl))Acros &
Fisher Chemical		167620010 &
H/1200/PB15		Bufor do lizy/wiązania,
Bufor do płukania 1,
Bufor do płukania 2,
Bufor o niskiej zawartości soli i
Bufor elucyjny
0,5 M EDTA (pH 8,0) (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Sigma-aldrichED-500GBufor do lizy/wiązania,
Bufor do płukania 1,
Bufor do przemywania 2,
Bufor o niskiej zawartości soli i
Bufor elucyjny
Tween 20MERCK8.22184.0500Regeneracja kulek oligo-d(T)25
0,1 M NaOHVWR PROLABO CHEMICALS28244.295Regeneracja kulek oligo-d(T)25
1x PBS (pH 7,4)
(sól fizjologiczna buforowana fosforanem)
zawierający
(NaCl; Kcl; Na2HPO4; KH2PO4)		Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		Regeneracja kulek oligo-d(T)25
Roztwór proteinazy K (2 μ g/μ L)Thermo Fisher Scientific11789020Trawienie białek
Barwnik ładującyInvitrogenLC5925SDS-PAGE
qPCR master mixTest PromegaA6001qRT-PCR
Koktajl RNazaThermo Fisher ScientificAM2286Trawienie RNA
MetanolSigma-aldrich322415Utrwalanie żelu i odbarwienie żelu
Kwas octowySigma-aldrich537020Utrwalanie i odbarwianie żelu
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Fisher Scientific20278Barwienie żelem
1 M NH4HCO3
(wodorowęglan amonu)
 		Sigma-aldrich09830-500GŻel nawilżający &
Bufor do wytrawiania
CH3CN
(Acetonitryl)		Sigma-aldrich34851-100MLOdwodnienie żelu i
Roztwór do rozpuszczania peptydów
IAA
(Kwas jodooctowy)		Sigma-aldrichI4386-10GŚrodek alkilujący
TFA
(kwas trifluorooctowy)		Sigma-aldrich302031-10X1MLRoztwór do rozpuszczania peptydów
FA
(Kwas mrówkowy)		Sigma-aldrich06554-5GEkstrakcja peptydów
Roztwór trypsyny (6 ng/μ L)PromegaV5280Bufor trawienny
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>EQUIPMENT
SoilPeltracomLP2DWzrost roślin
Wermikulit 3Sibli AS05VERMICULIETSzalka Petriego do wzrostu roślin
(150 x 20 mm)Sarstedt82.1184.500Nośnik do zawiesiny protoplastów
0,22 μ m filtrMilliporeSE2M229104Homogenizacja końcowego izotonicznego roztworu enzymu
RazorbladeAgar ScientificT585Paski liści rozety
35-75 μ m siatka nylonowaSEFAR NITEX74010Filtracja zawiesiny Protoplast
50 ml rurki z okrągłym dnemSigma-aldrichT1918-10EANośnik do zawiesiny protoplastów
Hemocytometr
(Bü rker hemocytometr)		MARIENFELD650030sieciowania UV do zliczania komórek protoplastowych

(HL-2000 HybriLinker)		UVP, LLCUVP95003101in vivo

(Sankyo-Denki G8T5)		SANKYO
DENKI		SD G8T5in vivo Szklana strzykawka sieciująca
UV 50 mlFORTUNA OptimaZ314560Homogenizacja lizatu protoplastów
Wąska igła (0,9 x 25 mm)Becton Dickinson microlance 32021-04Homogenizacja lizatu protoplastów
Rotator Model L26Labinco BV26110912Inkubacja próbki przez rotację
kulek magnetycznych Oligo-d(T)25
(5 mg/mL)		New England BioLabsS1419SmRNP i wiązanie mRNA i i pull-down
Stojak magnetycznyInvitrogenCS15000wiązanie i ściąganie mRNP i mRNA
Filtry odśrodkowe
(filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4)		EMD MiliporeUFC800308stężenie mRBP
Pierce Silver StainKit Thermo Fisher Scientific24612barwienia srebrem

(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		oczyszczania 1064100300molekularnego RNA STRATEC
(spektrofotometr NanoDrop 1000)Thermo Fisher ScientificND-1000Jakość i ilość RNA
Cykler Real-Time PCR
(cykler StepOne Real-Time PCR)		Thermo Fisher Scientific4376600kwantyfikacja cDNA
i kolumny mikro;-C18
(końcówka Millipore Zip i mikro;-C18 kolumny)		Sigma-aldrich720046-960EAOczyszczanie peptydów
Spektrometr masowy
(Q Exactive Hybrid Quadrupol-Orbitrap Mass Spectrometer)		Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRProteomika oparta na spektrometrii
mas Przyrząd do chromatografii cieczowej (przyrząd do ultra-wysokowydajnej chromatografii cieczowej Ultimate 3000 (UHPLC))Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANOProteomika oparta na spektrometrii mas
Kolumna C18
(kolumna Easy Spray Pepmap RSLC C18)		Thermo Fisher ScientificES800Proteomika oparta na spektrometrii
mas Prekolumna C18
(Acclaim Pepmap 100 C18 prekolumna)		Thermo Fisher Scientific160321Proteomika oparta na spektrometrii mas
Nazwa FirmaNumer katalogowyUwagi
Startery do testu qRT-PCRSekwencje
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		Fw: AACTTTGGTGGTGTGTGTGTGTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
Aparat do Lampa UV sieciująca UV Zestaw do oczyszczania RNA do Spektrofotometr do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
  2. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  3. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
  4. Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
  5. Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
  6. Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
  7. Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
  8. Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
  9. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  10. Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, Database issue D301-D308 (2011).
  11. Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
  12. Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
  13. Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
  14. Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
  15. Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
  16. Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
  17. Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
  18. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  19. Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  20. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  21. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
  22. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
  23. Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
  24. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
  25. Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
  26. Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
  27. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
  28. Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986(2013).
  29. Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
  30. Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
  31. Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
  32. Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
  33. Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
  34. Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
  35. Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
  36. Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
  37. Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
  38. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
  39. Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  40. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  41. Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
  42. Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
  43. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
  44. Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
  45. Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
  46. Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
  47. Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
  48. Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
  49. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587(2012).
  50. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
  51. Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
  52. Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
  53. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
  54. Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
  55. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sieciowanie UVkuleczki z Oligo dTspektrometria masbia ka wi ce RNAArabidopsis thalianaregulacja potranskrypcyjnaanaliza proteomicznalizaza kom rek

Powiązane artykuły