Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białka wiążące RNA (RBP) decydują o losie RNA. Uczestniczą we wszystkich szlakach biogenezy RNA, a zwłaszcza przyczyniają się do potranskrypcyjnej regulacji genów (PTGR) informacyjnych RNA (mRNA). W ciągu ostatnich kilku lat udało się wyizolować szereg proteomów związanych z mRNA z linii komórkowych drożdży i ssaków dzięki zastosowaniu nowatorskiej metody zwanej "wychwytywaniem interaktomii mRNA", która pozwala na identyfikację białek wiążących mRNA (mRBP) bezpośrednio ze środowiska fizjologicznego. Metoda polega na sieciowaniu in vivo w ultrafiolecie (UV), ściąganiu i oczyszczaniu przekaźnikowych kompleksów rybonukleoproteinowych (mRNP) za pomocą kulek oligo(dT), a następnie identyfikacji usieciowanych białek za pomocą spektrometrii mas (MS). Całkiem niedawno, stosując tę samą metodę, zgłoszono jednocześnie kilka proteomów związanych z roślinnym mRNA z różnych źródeł tkanek Arabidopsis: etiolowanych siewek, tkanki liści, protoplastów mezofilu liści i hodowanych komórek korzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę wychwytywania interaktomii mRNA dla protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana, typu komórki, który służy jako wszechstronne narzędzie do eksperymentów obejmujących różne testy komórkowe. Warunki optymalnej wydajności białka obejmują ilość tkanki wyjściowej i czas trwania promieniowania UV. W proteomie związanym z mRNA uzyskanym w eksperymencie na średnią skalę (107 komórek) stwierdzono, że RBP, u których zauważono, że mają zdolność wiązania RNA, są nadreprezentowane i zidentyfikowano wiele nowych RBP. Eksperyment można rozszerzyć (10-9 komórek), a zoptymalizowaną metodę można zastosować do innych typów i gatunków komórek roślinnych w celu szerokiej izolacji, skatalogowania i porównania proteomów związanych z mRNA w roślinach.
Wprowadzenie
Eukarionty używają wielu szlaków regulacyjnych biogenezy RNA do utrzymania komórkowych procesów biologicznych. Wśród znanych typów RNA, mRNA jest bardzo zróżnicowane i posiada zdolność kodowania białek i ich izoform1. Szlak PTGR kieruje losami pre-mRNAs2,3. RBP z różnych rodzin genów kontrolują regulację RNA, a w PTGR specyficzne mRBP kierują mRNA przez bezpośrednie interakcje fizyczne, tworząc funkcjonalne mRNP. Dlatego identyfikacja i charakterystyka mRBP i ich mRNP ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji komórkowego metabolizmu mRNA2. W ciągu ostatnich....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Izolacja protoplastów z liści rzodkiewnika
UWAGA: Protoplasty mezofilu liści rzodkiewnika są zasadniczo izolowane, jak opisali Yoo et al., 2007, z kilkoma modyfikacjami40.
- Wzrost roślin
- Namocz około 200 nasion ekotypu Arabidopsis thaliana Col-0 w wysterylizowanej wodzie przez 2 dni w temperaturze 4 °C w ciemności w celu rozwarstwienia.
UWAGA: Ta liczba nasion jest wystarczająca dla jednej próbki innej niż CL i jednej próbki CL (patrz krok 1.3). - Przygotuj doniczki z 50% (v/v) mieszaniną gleby i wermikulitu i nam....
- Namocz około 200 nasion ekotypu Arabidopsis thaliana Col-0 w wysterylizowanej wodzie przez 2 dni w temperaturze 4 °C w ciemności w celu rozwarstwienia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W kroku płukania 4.3 z użyciem buforu do płukania 2 zaobserwowaliśmy charakterystyczną aureolę otaczającą osad kulek w próbce CL (Rycyna 1B). Choć zjawisko to nie zostało przebadane, można je prawdopodobnie wyjaśnić interferencją sieciowanych kompleksów mRNP z agregacją kulek podczas wychwytu magnetycznego, co prowadzi do powstania bardziej rozproszonego agregatu. Wskazuje to na skuteczność wychwytu za pomocą kulek z oligo-d(T)251.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Z powodzeniem zastosowaliśmy wychwytywanie interaktomii mRNA, opracowane dla komórek drożdży i ludzi, do protoplastów mezofilu liści roślin. Komórki mezofilu liści są głównym rodzajem tkanki naziemnej w liściach roślin. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje ona sieciowanie in vivo do odkrywania białek ze środowiska fizjologicznego.
W niniejszym protokole przedstawiamy przede wszystkim szereg zoptymalizowanych warunków eksperymentalnych (np. liczbę protoplastów do .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy laboratorium prof. Jorisa Winderickxa, który dostarczył urządzenie do sieciowania UV wyposażone w konwencjonalną lampę UV. K. G. jest wspierany przez fundusz badawczy KU Leuven i dziękuje za wsparcie z grantu FWO G065713N.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| 0,8 M Mannitol | Sigma | M1902-500G | Pierwszorzędowy roztwór enzymu izotonicznego i Roztwór MMg |
| 2 M KCl | MERCK | Art. 4935 | Pierwszorzędowy roztwór enzymu izotonicznego & Bufor W5 |
| 0,2 M MES (pH 5,7) (kwas 4-morfolinoetanosulfonowy) | Sigma-aldrich | M2933 | Pierwszorzędowy izotoniczny roztwór enzymatyczny bufor W5 i roztwór MMg, Filtracja Sterylizacja |
| Celulaza R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | CELULAZA " ONOZUKA" R-10, 10 g | Końcowy izotoniczny roztwór enzymatyczny |
| Macerozyme R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | MACEROZYME R-10, 10g | Końcowy roztwór enzymu izotonicznego |
| 10% (w/v) BSA (albumina surowicy bydlęcej) | Sigma-aldrich | A7906-100G | Końcowy roztwór enzymu izotonicznego i Filtracja Sterylizacja |
| 1 M CaCl2 | Chem-Lab NV | CL00.0317.1000 | Końcowy izotoniczny roztwór enzymatyczny bufor W5 i Bufor mineralizacyjny |
| 1 M NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | W5 Bufor |
| 2 M MgCl2 | Sigma | M8266-100G | MMg roztwór |
| 1 M LiCl (chlorek litu) | Acros | 199885000 | Bufor do lizy/wiązania, Bufor do płukania 1, Bufor do płukania 2 & Bufor o niskiej zawartości soli |
| 5% (w/v) LiDS (Lithium Dodecyl Sulphate) | Sigma-aldrich | L4632-25G | Bufor do lizy/wiązania, Bufor do płukania 1 i Filtracja Sterylizacja |
| 1 M DTT (Dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific Bufor do płukania 1 & Bufor płuczący 2 | 307866 | Bufor do lizy/wiązania, |
| 1 M Tris-HCl (pH 7,5) (Tris(hydroksymetylo)aminometan, Kwas solny SG (HCl)) | Acros & Fisher Chemical | 167620010 & H/1200/PB15 | Bufor do lizy/wiązania, Bufor do płukania 1, Bufor do płukania 2, Bufor o niskiej zawartości soli i Bufor elucyjny |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) (kwas etylenodiaminotetraoctowy) | Sigma-aldrich | ED-500G | Bufor do lizy/wiązania, Bufor do płukania 1, Bufor do przemywania 2, Bufor o niskiej zawartości soli i Bufor elucyjny |
| Tween 20 | MERCK | 8.22184.0500 | Regeneracja kulek oligo-d(T)25 |
| 0,1 M NaOH | VWR PROLABO CHEMICALS | 28244.295 | Regeneracja kulek oligo-d(T)25 |
| 1x PBS (pH 7,4) (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) zawierający (NaCl; Kcl; Na2HPO4; KH2PO4) | Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC | S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230 | Regeneracja kulek oligo-d(T)25 |
| Roztwór proteinazy K (2 μ g/μ L) | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Trawienie białek |
| Barwnik ładujący | Invitrogen | LC5925 | SDS-PAGE |
| qPCR master mix | Test Promega | A6001 | qRT-PCR |
| Koktajl RNaza | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Trawienie RNA |
| Metanol | Sigma-aldrich | 322415 | Utrwalanie żelu i odbarwienie żelu |
| Kwas octowy | Sigma-aldrich | 537020 | Utrwalanie i odbarwianie żelu |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Fisher Scientific | 20278 | Barwienie żelem |
| 1 M NH4HCO3 (wodorowęglan amonu) | Sigma-aldrich | 09830-500G | Żel nawilżający & Bufor do wytrawiania |
| CH3CN (Acetonitryl) | Sigma-aldrich | 34851-100ML | Odwodnienie żelu i Roztwór do rozpuszczania peptydów |
| IAA (Kwas jodooctowy) | Sigma-aldrich | I4386-10G | Środek alkilujący |
| TFA (kwas trifluorooctowy) | Sigma-aldrich | 302031-10X1ML | Roztwór do rozpuszczania peptydów |
| FA (Kwas mrówkowy) | Sigma-aldrich | 06554-5G | Ekstrakcja peptydów |
| Roztwór trypsyny (6 ng/μ L) | Promega | V5280 | Bufor trawienny |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| >EQUIPMENT | |||
| Soil | Peltracom | LP2D | Wzrost roślin |
| Wermikulit 3 | Sibli AS | 05VERMICULIET | Szalka Petriego do wzrostu roślin |
| (150 x 20 mm) | Sarstedt | 82.1184.500 | Nośnik do zawiesiny protoplastów |
| 0,22 μ m filtr | Millipore | SE2M229104 | Homogenizacja końcowego izotonicznego roztworu enzymu |
| Razorblade | Agar Scientific | T585 | Paski liści rozety |
| 35-75 μ m siatka nylonowa | SEFAR NITEX | 74010 | Filtracja zawiesiny Protoplast |
| 50 ml rurki z okrągłym dnem | Sigma-aldrich | T1918-10EA | Nośnik do zawiesiny protoplastów |
| Hemocytometr (Bü rker hemocytometr) | MARIENFELD | 650030 | sieciowania UV do zliczania komórek protoplastowych |
(HL-2000 HybriLinker) | UVP, LLC | UVP95003101 | in vivo |
(Sankyo-Denki G8T5) | SANKYO DENKI | SD G8T5 | in vivo Szklana strzykawka sieciująca |
| UV 50 ml | FORTUNA Optima | Z314560 | Homogenizacja lizatu protoplastów |
| Wąska igła (0,9 x 25 mm) | Becton Dickinson microlance 3 | 2021-04 | Homogenizacja lizatu protoplastów |
| Rotator Model L26 | Labinco BV | 26110912 | Inkubacja próbki przez rotację |
| kulek magnetycznych Oligo-d(T)25 (5 mg/mL) | New England BioLabs | S1419S | mRNP i wiązanie mRNA i i pull-down |
| Stojak magnetyczny | Invitrogen | CS15000 | wiązanie i ściąganie mRNP i mRNA |
| Filtry odśrodkowe (filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4) | EMD Milipore | UFC800308 | stężenie mRBP |
| Pierce Silver Stain | Kit Thermo Fisher Scientific | 24612 | barwienia srebrem |
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit) | oczyszczania 1064100300 | molekularnego RNA STRATEC | |
| (spektrofotometr NanoDrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Jakość i ilość RNA |
| Cykler Real-Time PCR (cykler StepOne Real-Time PCR) | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | kwantyfikacja cDNA |
| i kolumny mikro;-C18 (końcówka Millipore Zip i mikro;-C18 kolumny) | Sigma-aldrich | 720046-960EA | Oczyszczanie peptydów |
| Spektrometr masowy (Q Exactive Hybrid Quadrupol-Orbitrap Mass Spectrometer) | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Proteomika oparta na spektrometrii |
| mas Przyrząd do chromatografii cieczowej (przyrząd do ultra-wysokowydajnej chromatografii cieczowej Ultimate 3000 (UHPLC)) | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | Proteomika oparta na spektrometrii mas |
| Kolumna C18 (kolumna Easy Spray Pepmap RSLC C18) | Thermo Fisher Scientific | ES800 | Proteomika oparta na spektrometrii |
| mas Prekolumna C18 (Acclaim Pepmap 100 C18 prekolumna) | Thermo Fisher Scientific | 160321 | Proteomika oparta na spektrometrii mas |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Startery do testu qRT-PCR | Sekwencje | ||
| UBQ10 mRNA (Li et al., 2014) | Fw: AACTTTGGTGGTGTGTGTGTGTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA | ||
| 18S rRNA (Durut et al., 2014) | Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA |
Bibliografia
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
