Artykuł metodologiczny

Genotypowanie polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1 metodą topnienia w wysokiej rozdzielczości: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genów choroby Alzheimera

DOI:

10.3791/56012

⸱

18 lipca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debré Hospital, 2Faculty of Medicine, LRN EA 4682, University of Reims Champagne-Ardenne, 3Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 4Faculty of Medicine, EA 3797, University of Reims Champagne-Ardenne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy innowacyjną metodę określania polimorfizmów długości receptora dopełniacza 1 (CR1) do wykorzystania w wielu zastosowaniach, szczególnie w ocenie podatności na choroby takie jak choroba Alzheimera (AD). Metoda ta może być przydatna do lepszego zrozumienia roli izoform CR1 w patogenezie choroby Alzheimera.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptor dopełniacza 1 (CR1), transbłonowa glikoproteina, która odgrywa kluczową rolę we wrodzonym układzie odpornościowym, ulega ekspresji na wielu typach komórek, ale szczególnie na czerwonych krwinkach (RBC). Jako receptor dla składników dopełniacza C3b i C4b, CR1 reguluje aktywację kaskady dopełniacza i promuje fagocytozę kompleksów immunologicznych i resztek komórkowych, a także peptydu amyloidu beta (Aβ) w chorobie Alzheimera (AD). Kilka badań potwierdziło polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) związane z chorobą Alzheimera, a także zmienność liczby kopii (CNV) w genie CR1. W tym miejscu opisujemy innowacyjną metodę wyznaczania polimorfizmu długości receptora CR1. Receptor obejmuje trzy domeny, zwane długimi powtórzeniami homologicznymi (LHR)-LHR-A, LHR-C i LHR-D-oraz domenę n, LHR-B, gdzie n jest liczbą całkowitą z zakresu od 0 do 3. Wykorzystując pojedynczą parę specyficznych starterów, materiał genetyczny jest używany do amplifikacji pierwszego fragmentu domeny LHR-B (wariant amplikonu B) i drugiego fragmentu domeny LHR-C (niezmienniczy amplikon). Wariant amplikon B i niezmienniczy amplikon wykazują różnice w pięciu nukleotydach poza obszarami hybrydyzacji wspomnianych starterów. Liczbę amplikonów wariantowych B i amplikonów niezmienniczych dedukuje się za pomocą narzędzia ilościowego (krzywe topnienia o wysokiej rozdzielczości (HRM)), a stosunek amplikonu wariantowego B do amplikonu niezmienniczego różni się w zależności od polimorfizmu długości CR1. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z metodą fenotypu kanonicznego, ponieważ nie wymaga świeżego materiału i jest tańsza, szybsza, a zatem ma zastosowanie do większych populacji. Tym samym zastosowanie tej metody powinno być pomocne w lepszym zrozumieniu roli izoform CR1 w patogenezie chorób takich jak AZS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AD, najczęstsza przyczyna demencji, dotyka ponad 30 milionów ludzi na całym świecie i stanowi poważny problem zdrowia publicznego1. Klinicznie AD charakteryzuje się zaburzeniami neuropoznawczymi prowadzącymi do postępującej utraty autonomii2. AD charakteryzuje się dwoma neuropatologicznymi cechami charakterystycznymi, a mianowicie zewnątrzkomórkowymi złogami amyloidu i wewnątrzkomórkowymi splątkami neurofibrylarnymi3.

Tradycyjnie, w zależności od wieku wystąpienia choroby, AD dzieli się na dwie formy. Pierwszym z nich jest choroba Alzheimera o wczesnym początku (EOAD), której początek występuje najczęściej przed 65 rokiem życia; ta forma stanowi mniej niż 5% przypadków AD. Jest to rzadka, autosomalnie dominująca postać choroby Alzheimera, która powoduje w pełni penetrujące mutacje w genach białka prekursorowego amyloidu (APP)4, presenilina 1 (PSEN1)5, czy presenilina 2 (PSEN2)6. Po drugie, bardziej powszechna postać choroby (>90% przypadków choroby Alzheimera) nazywana jest "sporadyczną" chorobą Alzheimera o późnym początku (LOAD) i najczęściej występuje u osób w wieku 65 lat lub starszych. Wynika to z wielu genetycznych i środowiskowych czynników ryzyka7. W LOAD allel 4 genu apolipoproteiny E (APOE) jest głównym genetycznym czynnikiem ryzyka8,9. Ponadto ponad 20 loci genów zostało zidentyfikowanych w badaniach asocjacyjnych całego genomu (GWAS) jako związanych z ryzykiem choroby Alzheimera, z których jednym jest gen receptora 1 (CR1) składnika dopełniacza (3b/4b) (CR1) 10, zlokalizowany na chromosomie 1q32 w klastrze białek związanych z dopełniaczem. Gen CR1 koduje białko receptora dopełniacza typu 1 (CR1), składnik regulatorów aktywności dopełniacza.

CR1 (receptor C3b/C4b, CD35), transbłonowa glikoproteina o sile około 200 kDa11, wiąże się z białkami dopełniacza C3b, C4b, C3bi, C1q, lektyną wiążącą mannan (MBL) i fikoliną class12. Funkcja biologiczna CR1 różni się w zależności od typów komórek, w których ulega ekspresji. U ludzi 90% całkowitego krążącego CR1 znajduje się w czerwonych krwinkach (RBC)13. Obecny na powierzchni erytrocytów, CR1 wiąże się z mikroorganizmami lub kompleksami immunologicznymi opsonizowanymi C3b lub C4b, ułatwiając ich usuwanie z krążenia. Kompleksy związane z CR1 są rzeczywiście przenoszone do fagocytów, gdy erytrocyty przechodzą przez wątrobę i śledzionę11,14. Ograniczając odkładanie się C3b i C4b, CR1 może zapobiegać nadmiernej aktywacji dopełniacza. Dlatego ekspresja CR1 na krwinkach czerwonych jest uważana za niezbędny element ochrony tkanek, takich jak mózgowy układ nerwowy, przed odkładaniem się kompleksu immunologicznego i wynikającymi z tego chorobami. Wiadomo również, że CR1 na krwinkach czerwonych odgrywa ważną rolę w infekcjach chorobotwórczych15,16. Ponadto CR1, jako kluczowy gracz w odporności wrodzonej, bierze udział w regulacji kaskady dopełniacza oraz w transporcie i klirensie kompleksów immunologicznych. CR1 wywiera tę aktywność poprzez wiązanie fragmentów C3b i C4b oraz dysocjację klasycznych i alternatywnych konwertaz (dysocjacja C2a od kompleksu C4b2a i dysocjacja C3b od kompleksu C3bBb). Jako kofaktor czynnika proteazy seryny I (FI) w osoczu, CR1 hamuje klasyczne i alternatywne szlaki dopełniacza poprzez zwiększenie rozszczepienia C4b i C3b przez FI, właściwość znaną jako aktywność kofaktora (CA), oraz poprzez hamowanie pętli amplifikacji C3, co z kolei zapobiega dalszej aktywacji dopełniacza. Rogers i współpracownicy dostarczają dowodów na to, że peptyd Aβ może wiązać i aktywować szlak dopełniacza przy braku przeciwciał17 i sugerują, że peptyd Aβ jest usuwany z krążenia poprzez zależne od dopełniacza przyleganie do CR1 wyrażonego na krwinkach czerwonych18.

CR1 wykazuje trzy typy polimorfizmów: polimorfizmy strukturalne lub długość, polimorfizmy gęstości i polimorfizmy grup krwi Knopsa11,19. Polimorfizm strukturalny jest związany ze zmianą liczby długich powtórzeń homologicznych (LHR) i w ten sposób definiuje cztery izoformy. W rzeczywistości domena zewnątrzkomórkowa białka CR1 składa się z serii powtarzających się jednostek, zwanych krótkimi powtórzeniami konsensusu (SCR) lub powtórzeniami kontrolnymi dopełniacza (CCP). Te SCR wykazano z kwasu dezoksyrybonukleinowego dopełniacza (cDNA) kodującego CR1. SCR są ułożone w tandemowe grupy po siedem, znane jako LHR. CR1 jest ułożony w cztery LHR, oznaczone jako LHR-A, -B, -C i -D, powstałe w wyniku duplikacji jednostki z siedmioma SCR19,20,21.

W rosnącej kolejności częstotliwości, te izoformy CR1 określone przez Western blot (WB) to CR1*1 (A/F) (szybka migracja w elektroforezie żelowej), CR1*2 (B/S) (powolna migracja w elektroforezie żelowej), CR1*3 (C/F') i CR1*4 (D). Dwa najczęstsze izoformy, CR1*1 (A/F) i CR1*2 (B/S), składają się odpowiednio z czterech i pięciu LHR, podczas gdy CR1*3 (C/F') i CR1*4 (D) składają się odpowiednio z 3 i 6 LHR. Najpowszechniejsza izoforma (CR1*1), składająca się z 30 SCR, zawiera trzy miejsca wiązania C4b (SCR 1-3; 8-10 i 15-17) i dwa miejsca wiązania C3b (SCR 8-10 i 15-17), podczas gdy SCR 22-28 wiążą C1q, fikoliny i MBL12,20,21,22,23,24,25. Tak więc CR1*2 zawiera jedno dodatkowe miejsce wiązania C3b/C4b w porównaniu z CR1*1. Rysunek 1 ilustruje struktury, nomenklatury i masy cząsteczkowe czterech różnych izoform CR1.

Polimorfizm gęstości odpowiada stabilnemu fenotypowi, który reprezentuje poziom konstytutywnej ekspresji CR1 na krwinkach czerwonych. U zdrowych osób rasy kaukaskiej wykazano, że liczba cząsteczek CR1 na RBC może różnić się nawet dziesięciokrotnie (od 150 do 1200 cząsteczek na komórkę)26. Erytrocyty czerwone fenotypu Helgeson mają bardzo niską gęstość CR1, która okazała się niższa niż 150 cząsteczek na komórkę27,28. Gęstość CR1 na krwinkach czerwonych jest genetycznie związana z autosomalnym kodominującym układem biallelicznym w genie CR1, skorelowanym z polimorfizmem długości fragmentu restrykcyjnego HindIII (RFLP)29. Jednopunktowa mutacja w Intronie 27 genu CR1, pomiędzy eksonami kodującymi drugi SCR w LHR-D, powoduje powstanie polimorficznego miejsca HindIII w tym regionie30. Genomowe fragmenty HindIII o masie 7,4 i 6,9 kDa identyfikują allele związane odpowiednio z wysoką (allel H) lub niską (allel L) gęstością CR1 na krwinkach czerwonych. Nie stwierdzono jednak korelacji między gęstością CR1 na krwinkach czerwonych a polimorfizmami HindIII w niektórych populacjach Afryki Zachodniej31,32. Mechanizm łączący regulację gęstości CR1 z niekodującym polimorfizmem HindIII pozostaje nieznany. Wśród kilku polimorfizmów, Q981H w SCR16 i P1786R w SCR28 stwierdzono, że są powiązane z gęstością CR1 na RBCs30,33.

Polimorfizm Knops (KN), zgodnie z międzynarodową nomenklaturą, jest 22. systemem grup krwi indeksowanym przez Międzynarodowe Towarzystwo Transfuzji Krwi. Zawiera 9 specyficzności antygenowych wyrażanych przez CR1 na krwinkach czerwonych, w tym trzy antytetyczne pary antygenowe, KN1/KN2, KN3/KN6 i KN4/KN7, a także 3 izolowane antygeny, KN5, KN8, KN9. Antygeny KN1, KN3, KN4 i KN5 są antygenami układu KN o wysokiej częstotliwości (tj. ulegającymi ekspresji u ponad 99% populacji ogólnej). Jednak rola tego polimorfizmu w AD pozostaje do ustalenia13.

Protokół opisany w tej pracy został zaprojektowany w celu określenia genotypów polimorfizmu długości CR1 związanych z podatnością na kilka chorób, takich jak AD, toczeń rumieniowaty układowy i malaria. Nasza metoda wyznaczania polimorfizmu długości CR1 wykorzystuje liczbę LHR-B składających się na izoformy CR1 oraz różnice sekwencji między LHR-B i LHR-C (rysunek 2).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pobierania i obchodzenia się z ludzką krwią został sprawdzony i zatwierdzony przez regionalną komisję etyki (CPP Est II), a numer protokołu to 2011-A00594-37.

UWAGA: Poniższy protokół opisuje postępowanie z ludzką krwią. Podczas utylizacji materiałów niebezpiecznych biologicznie należy postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Należy nosić laboratoryjny sprzęt ochronny, taki jak fartuchy i rękawice laboratoryjne. Schemat blokowy opisujący protokół jest wyświetlany w Rysunek 3.

1. Ekstrakcja DNA z krwi i płynów ustrojowych

  1. Odpipetować 20 μl proteinazy K (15 μg/μl) na dno probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodać 200 μl próbki do probówki o pojemności 1,5 ml. Użyj do 200 μl krwi pełnej, osocza, surowicy, kożucha lub płynów ustrojowych lub do 5 x 106 limfocytów w 200 μl PBS.
  3. Dodać 200 μl buforu do lizy do próbki. Mieszać przez wirowanie pulsacyjne przez 15 sekund.
  4. Inkubować w temperaturze 56 °C przez 10 minut w łaźni wodnej.
  5. Krótko odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml, aby usunąć krople z wnętrza pokrywki.
  6. Dodać 200 μl etanolu (96-100%) do próbki i ponownie mieszać przez wirowanie impulsowe przez 15 s. Po wymieszaniu należy na krótko odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml, aby usunąć krople z wnętrza pokrywki.
  7. Ostrożnie nanieść mieszaninę z kroku 1.6 na kolumnę membranową (w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml). Nie zwilżając obręczy, zamknij nakrętkę i odwiruj przy 6 000 x g przez 1 min. Umieścić kolumnę membranową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić probówkę zawierającą filtrat.
  8. Ostrożnie otworzyć kolumnę membranową i dodać 500 μl buforu myjącego 1 bez zwilżania obręczy. Zamknąć nakrętkę i odwirować przy 6 000 x g przez 1 min. Umieścić kolumnę membranową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić probówkę zawierającą filtrat.
  9. Ostrożnie otworzyć kolumnę membranową i dodać 500 μl buforu myjącego 2 bez zwilżania obrzeża. Zamknij nakrętkę i odwiruj z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty.
  10. Umieścić kolumnę membranową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić probówkę zbiorczą wraz z filtratem. Wirować przy 20 000 x g przez 1 min.
  11. Umieścić kolumnę membranową w czystej probówce o pojemności 1,5 ml i wyrzucić probówkę zbiorczą zawierającą filtrat.
  12. Ostrożnie otwórz kolumnę membranową i dodaj 200 μl wody destylowanej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie wirować przy 6 000 x g przez 1 minutę.
  13. Przystąpić do etapu oznaczania stężenia DNA lub zamrozić próbki DNA w temperaturze -20 °C

2. Oznaczanie stężenia DNA

UWAGA: Zobacz Rysunek 4.

  1. Naciśnij 1, aby wybrać tryb DNA na spektrofotometrze. Wybierz ścieżkę o długości 5 mm za pomocą strzałek w lewo i w prawo. Wybierz współczynnik rozcieńczenia równy 1 za pomocą strzałek w lewo i w prawo.
  2. Wybierz jednostkę (μg/ml) za pomocą strzałek w lewo i w prawo. Wybierz współczynnik 50 za pomocą strzałek w lewo i w prawo. Naciśnij przycisk OK.
  3. Wlej 10 μl wody destylowanej do kuwety. Umieść kuwetę w spektrofotometrze. Naciśnij przycisk OA/100%T.
  4. Pobrać pipetą 10 μl próbki DNA (rozcieńczenie 1:4 w wodzie destylowanej) do kuwety. Umieść kuwetę w spektrofotometrze. Naciśnij zielony przycisk (odczyt/start). Zwróć uwagę na stężenie.
  5. Zamrażać próbkę DNA w temperaturze -20 °C.

3. Protokół HRM-PCR

  1. Rozmrozić próbki DNA. Rozcieńczyć próbki DNA w probówkach o pojemności 1,5 ml wodą, aby dostosować je do stężenia 10 ng/μl
    UWAGA: Całkowita objętość rozcieńczonego DNA powinna wynosić od 2 μl do 10 μl.
  2. Rozmrozić roztwory podkładu. Rozcieńczyć roztwory starterów w probówkach o pojemności 1,5 ml wodą, aby dostosować je do tego samego stężenia 6 μM.
    UWAGA: Sekwencje starterów i warunki reakcji przedstawiono w tabeli 1.

figure-protocol-1
Tabela 1: Startery i parametry stosowane w analizie topnienia w wysokiej rozdzielczości.

  1. Rozmrozić roztwory zestawu HRM-PCR i ostrożnie wymieszać przez wirowanie, aby zapewnić odzyskanie całej zawartości. Przed ich otwarciem krótko odwirować trzy fiolki zawierające mieszaninę enzymatyczną z barwnikiem wiążącym DNA, MgCl2 i wodą. Przechowuj je w temperaturze pokojowej.
  2. W probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej przygotuj mieszaninę PCR do jednej reakcji o objętości 20 μl, dodając następujące składniki w kolejności podanej poniżej:
    1. 10 μl mieszaniny enzymatycznej z barwnikiem wiążącym DNA;
    2. 2 μl z 25 mM MgCl2;
    3. 1 μL startera 1,6 μM (stężenie końcowe: 300 nM);
    4. 1 μl startera 2, 6 μM (stężenie końcowe: 300 nM); oraz
    5. 5 μL wody.
      UWAGA: Aby przygotować mieszaninę PCR do więcej niż jednej reakcji, pomnóż powyższe objętości przez liczbę reakcji, które mają być przeprowadzone, plus jedną dodatkową reakcję.
  3. Dokładnie wymieszaj, wirując.
  4. Odpipetować 19 μl mieszanki PCR, przygotowanej powyżej, do każdego dołka białej płytki wielodołkowej.
  5. Dodać 1 μl matrycy DNA o dostosowanym stężeniu, przygotowanej w kroku 3.1.
    UWAGA: W przypadku reakcji kontrolnych należy zawsze przeprowadzać kontrolę ujemną z próbkami. Aby przygotować kontrolę ujemną, zastąp matrycę DNA wodą.
  6. Uszczelnij białą płytkę wielodołkową folią uszczelniającą.
  7. Umieścić białą płytkę wielodołkową w wirówce i zrównoważyć ją odpowiednią przeciwwagą (tj. inną płytką wielodołkową). Wirować przez 1 minutę przy 1 500 x g w standardowej wirówce z kubełkiem obrotowym zawierającej rotor do płytek wielodołkowych z odpowiednimi adapterami.
  8. Załaduj białą płytkę wielodołkową do instrumentu HRM-PCR.
  9. Rozpocznij program HRM-PCR z następującymi warunkami PCR:

    Denaturacja: 95 °C przez 10 min; 1 cykl.
    Wzmocnienie: 95 °C przez 10 s, 62 °C przez 15 s i 72 °C przez 20 s; 47 cykli.
    Krzywa topnienia: 95 °C; szybkość narastania: 0,02 °C/s; 25 akwizycji na °C; 1 cykl.
    Chłodzenie: 40 °C przez 30 s; szybkość narastania 2,2 °C/s; 1 cykl.

4. Analiza HRM w celu określenia polimorfizmu długości CR1

UWAGA: Opisana metodologia (Rysunek 5) jest specyficzna dla naszego oprogramowania (patrz Spis materiałów), chociaż mogą być używane inne pakiety oprogramowania.

  1. Otwórz oprogramowanie do skanowania genów, aby przeprowadzić analizę skanowania polimorfizmu długości CR1.
  2. Otwórz eksperyment zawierający program amplifikacji i program krzywej topnienia.
  3. Kliknij opcję Edytor próbek na pasku modułu, a następnie wybierz przepływ pracy Skanowanie.
  4. Określ właściwości próbek (tj. nazwę, kontrolę nieznaną lub ujemną).
  5. Kliknij opcję Analiza na pasku modułu.
  6. Z listy Create New Analysis (Utwórz nową analizę) wybierz opcję Gene Scanning (Skanowanie genów).
  7. Kliknij kartę Normalizacja, aby znormalizować krzywe topnienia.
  8. Kliknij kartę Przesunięcie temperatury, aby zresetować oś temperatury (oś x) krzywych topnienia.
    UWAGA: Dolny wykres przedstawia krzywe topnienia, które są zarówno znormalizowane, jak i przesunięte pod względem temperatury.
  9. Kliknij przycisk Oblicz, aby przeanalizować wyniki i określić grupowanie.
  10. Kliknij kartę Wykres różnicowy w obszarze wykresów, aby wyświetlić krzywe topnienia znormalizowanej i przesuniętej oraz wykres różnicy znormalizowanej i przesuniętej temperatury.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 6A przedstawia fenotypowanie polimorfizmu długości CR1 przez WB. Rysunek 6B i C wyświetla krzywe, które są uzyskiwane podczas analizy HRM-PCR, umożliwiając określenie polimorfizmu długości CR1. Analiza krzywych fuzji za pomocą oprogramowania po stopieniu w wysokiej rozdzielczości amplikonów pochodzących z PCR z genomowego DNA osób z różnymi izoformami CR1 tworzy krzywe, które dyskryminują osoby według ich allotypowych fenotypów ekspresji CR1.

Rysunek 6B przedstawia pierwszy tryb prezentacji, zwany "Znormalizowane i przesunięte krzywe topnienia", podczas gdy Rysunek 6C pokazuje drugi tryb prezentacji, zwany "Znormalizowany i przesunięty temperaturowo wykres różnicowy."

Profile krzywych są rozmieszczone zgodnie z grupami, które reprezentują fenotypy wyświetlane w Rysunek 6A: (CR1*3, CR1*1); (CR1*1, CR1*2); CR1*1; CR1*2; oraz (CR1*2, CR1*4). Umożliwia to genotypowanie polimorfizmu długości CR1 przy użyciu tej nowej metody biologii molekularnej.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie struktury i polimorfizmów białka receptora dopełniacza 1. Każde krótkie powtórzenie konsensusu (SCR) lub białko kontrolne dopełniacza (CCP) jest reprezentowane przez okrąg. SCR są pogrupowane w powtarzalne struktury wyższego rzędu zwane LHR. Od domeny zewnątrzkomórkowej do błony komórkowej LHR to: LHR-A, -B, -C, -D i -S (dodatkowe lub dodatkowe LHR). W najczęstszej izoformie CR1 (CR1*1) miejsce wiązania C4b/aktywność przyspieszająca rozpad (DAA) znajduje się w LHR-A (SCR 1-3, zielone kółka), miejsce wiązania C3b/C4b/aktywność kofaktora (CA) znajduje się w 3 N-końcowych SCR LHR-B (SCR 8-10, czerwone kółka) i LHR-C (SCR 15-17, fioletowe kółka), a miejsce wiązania dla C1q/MBL i fikoliny znajduje się w LHR-D (SCR 22-28, niebieskie kółka). Struktury homologiczne są zabarwione identycznie. Izoforma CR1*2 (S) przedstawia dodatkowy LHR (LHR-S), a zatem zawiera dodatkowe miejsce wiązania C3b/C4b. KDa, kilodalton. NRC, warunki niezredukowane. RC, zmniejszone warunki. TM, domena transbłonowa. Rysunek ten został zaadaptowany z Brouwers et al.36 za zgodą Nature Publishing Group. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie struktury izoformy CR1 z pozycjami amplikonów sekwencji uzyskanymi przez HRM-PCR. Każde pole reprezentuje SCR. SCR są pogrupowane w LHR: LHR-A, -B, -C i -D. Struktury homologiczne są zabarwione identycznie. Izoformy CR1*2 i CR1*4 prezentują dodatkowe LHR (LHR-B) i tym samym zawierają dodatkowy obszar amplikonu (amplikon B, na czerwono). CR1*3 nie ma LHR-B i zawiera mniejszą powierzchnię amplikonu (brak amplikonu B). Różnice nukleotydów między amplikonem B (196 pz) a amplikonem niezmienniczym (197 pz) są przedstawione odpowiednio na czerwono i niebiesko. Różnice w stosunku: (amplikon B, w kolorze czerwonym / niezmienny amplikon, w kolorze niebieskim) między każdą izoformą CR1 są określane za pomocą HRM-PCR, co umożliwia genotypowanie. Sekwencje starterów CN3 i CN3re są podkreślone. TM, domena transbłonowa. CYT, ogon cytoplazmatyczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat blokowy protokołu genotypowania polimorfizmu długości CR1 z próbek ludzkiej krwi. Zbierz próbkę ludzkiego DNA. Wyodrębnij DNA, aby uzyskać próbkę krwi DNA. Oznaczyć stężenie DNA i rozcieńczyć, aby uzyskać stężenie DNA na poziomie 10 ng/μl. Użyj HRM-PCR, aby uzyskać genotyp polimorfizmu długości CR1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Zrzuty ekranu spektrofotometru użytego do określenia stężenia DNA. Naciśnij 1 (A), aby wybrać tryb DNA na spektrofotometrze. Wybierz ścieżkę o długości 5 mm (B) za pomocą strzałek w lewo i w prawo (C). Wybierz jednostkę (μg/ml) (D) za pomocą strzałek w lewo i w prawo (C). Wybierz współczynnik rozcieńczenia 1 (E) za pomocą strzałek w lewo i w prawo (C). Wybierz współczynnik 50 (F) za pomocą strzałek w lewo i w prawo. Naciśnij OK (G). Wlej 10 μl wody destylowanej do kuwety. Umieść kuwetę w spektrofotometrze (H). Naciśnij przycisk OA/100%T (I). Pobrać pipetą 10 μl próbki DNA (rozcieńczenie 1/4 w wodzie destylowanej) do kuwety. Umieść kuwetę w spektrofotometrze (K). Naciśnij zielony przycisk (odczyt/start) (L). Zwróć uwagę na stężenie (M). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zrzuty ekranu interfejsu graficznego oprogramowania użytego w kroku 4 protokołu. (A) Otwórz oprogramowanie do skanowania genów. (B) Program amplifikacji i program krzywej topnienia. (C) Kliknij Edytor próbek na pasku modułów. (D) Wybierz opcję Scanning (Skanowanie). (E) Określ właściwości próbek. (f) Kliknij Analiza na pasku modułu. (G) Kliknij zakładkę Normalizacja, aby znormalizować krzywe topnienia. (H) Kliknij na zakładkę Przesunięcie temperatury, aby wyświetlić krzywe topnienia, które są zarówno znormalizowane, jak i przesunięte temperaturowo. (I) Kliknij przycisk Oblicz, aby przeanalizować wyniki i określić grupowanie. (J) Kliknij kartę Wykres różnicowy, aby wyświetlić znormalizowane i przesunięte krzywe topnienia oraz wykres różnicy znormalizowanej i przesuniętej temperaturowo. (K) Grupowanie kolorystyczne próbek według genotypów długości CR1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Fenotypowanie polimorfizmów długości CR1 obserwowanych w WB i odpowiadające im krzywe profilu uzyskane metodą HRM-PCR. (A) Fenotypowanie polimorfizmów długości CR1 przy użyciu WB. (B) i (C) Genotypowanie polimorfizmów długości CR1 za pomocą analizy HRM-PCR. Analiza krzywej HRM amplikonów PCR uzyskanych z genomowego DNA osób wykazujących różne izoformy CR1 doprowadziła do identyfikacji specyficznych profili krzywych: (CR1*3, CR1*1) (fioletowy); (CR1*1, CR1*2) (niebieski); CR1*1 (zielony); CR1*2 (czerwony); i (CR1*2, CR1*4) (szary). Odpowiadają one allelom polimorfizmu długości CR1. Jak pokazują dwa tryby prezentacji - "Znormalizowane i przesunięte krzywe topnienia" (B) oraz "Znormalizowany i przesunięty temperaturowo wykres różnicowy" (C) - profile krzywych są rozłożone zgodnie z (CR1*3, CR1*1); (CR1*1, CR1*2); CR1*1; CR1*2; i (CR1*2, CR1*4). Rysunek ten został zaadaptowany z Mahmoudi et al.38 za zgodą Elsevier. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy szeroko dostępną metodologię badania polimorfizmów długości CR1. Techniki biologii molekularnej dotyczące amplifikacji lub hybrydyzacji segmentowej nigdy nie były w stanie dać zadowalających wyników, które pozwoliłyby na określenie polimorfizmów długości CR1 u wszystkich osobników. Dzieje się tak ze względu na powtarzalną strukturę genu CR1 (tj. wysoce powtarzalne SCR CR1). Opisana tutaj metoda biologii molekularnej wykorzystuje ilościowy rozkład LHR-B w cząsteczce CR1. Cząsteczka CR1 zawiera n domen LHR-B, gdzie n jest liczbą z zakresu od 0 do 3 i tylko jedną domenę LHR-C, jak opisano i zilustrowano na rysunku 2. Ilościowe wykrywanie domeny B umożliwia doskonałe rozróżnienie jednej dodatkowej lub brakującej domeny B.

Z wyekstrahowanego materiału genetycznego pierwszy fragment DNA z LHR-B jest amplifikowany metodą PCR przy użyciu pojedynczej pary specyficznych starterów, reprezentujących charakterystyczny wariant LHR-B zwany "wariantem amplikonu B". Drugi fragment DNA, zwany "niezmiennym amplikonem" i należący do LHR-C, jest również amplifikowany. Ten drugi fragment DNA jest fragmentem LHR-C, ale można również użyć innego niezmienniczego fragmentu LHR-A lub -D.

Dwa fragmenty DNA, wariant amplikonu B i niezmienny amplikon, są amplifikowane przez te same startery i wykazują pięć różnic w sekwencjach nukleotydowych. Cecha ta umożliwia w kolejnym kroku określenie liczby wariantów amplikonów B i liczby niezmiennych amplikonów za pomocą dostosowanego do tego celu ilościowego narzędzia biologii molekularnej, HRM. Stosunek liczby amplikonów B do niezmienniczego amplikonu (stosunek: amplikon B / niezmienniczy amplikon) zmienia się w zależności od długości cząsteczki CR1. Rzeczywiście, CR1*4 wyświetla 3 jednostki amplikonu B na 1 niezmienniczy amplikon, CR1*2 wyświetla 2 jednostki amplikonu B na 1 niezmienniczy amplikon, CR1*1 wyświetla 1 amplikon B na 1 niezmienniczy amplikon, a CR1*3 wyświetla 0 jednostek amplikonu B na 1 niezmienniczy amplikon (rysunek 2). Tak więc ta metoda HRM-PCR umożliwia genotypowanie polimorfizmu długości CR1.

Niemniej jednak, na początku badania, technika ta wymaga wykorzystania osób referencyjnych, których fenotypy CR1 są już znane (tj. wcześniej ustalone przez WB), aby móc ustalić genotypowanie CR1 zgodnie z profilem referencyjnym krzywych uzyskanych metodą HRM-PCR. Dostępne są dwa typy reprezentacji, a mianowicie "Znormalizowane i przesunięte krzywe topnienia" oraz "Znormalizowany i przesunięty temperaturowo wykres różnicowy". Wykazują one wyraźne grupy profili krzywych pokolorowanych zgodnie z fenotypowaniem polimorfizmu długości CR1 uzyskanym przez WB (Rysunek 6). Począwszy od kroku "Znormalizowane i przesunięte krzywe topnienia", nasza metoda umożliwia rozróżnienie odrębnych grup krzywych odpowiadających izoformom CR1, pogrupowanych według koloru. Jednak "Znormalizowany i przesunięty temperaturowo wykres różnicowy", który odpowiada innej reprezentacji matematycznej, pozwala na łatwiejszą wizualizację odrębnych grup krzywych. Chociaż oprogramowanie producenta było rutynowo używane w tym badaniu, inne oprogramowanie (takie jak uANALYSE) może być używane jako program do ekstrakcji danych do analizy krzywych.

Do tej pory technika analizy WB jest oryginalną techniką, która umożliwia identyfikację różnych polimorfizmów długości CR1 na poziomie białka. Jednak ta technika ma szereg wad. W szczególności analizę białek za pomocą WB można przeprowadzić dopiero po ekstrakcji błon komórkowych. W związku z tym jest to skomplikowane i bardzo czasochłonne. Co więcej, technika ta wymaga pobrania próbki świeżej krwi w odpowiednich warunkach na początku zabiegu, aby osiągnąć użyteczne wyniki. Wręcz przeciwnie, HRM-PCR wykonywany na DNA umożliwia wykorzystanie nawet suchych plam krwi lub próbek po długotrwałym przechowywaniu. HMR-PCR wymaga specjalistycznego przyrządu do topienia DNA, dedykowanego instrumentu lub termocyklera o pojemności HMR z oprogramowaniem HRM. Wykrywanie SNP zależy od kilku czynników: i) SNP zawarte w dużych fragmentach PCR są trudniejsze do wykrycia niż te same SNP w małych fragmentach PCR; ii) SNP należące do klas III i IV są trudniejsze do wykrycia niż te z klas I i II34; oraz iii) SNP, które są otoczone symetrią podstawy najbliższego sąsiada (np. 5'-G(G/C) C-3') nie mogą być sortowane przez topnienie, niezależnie od mocy rozdzielczości platformy HMR. Przydatne może być przetestowanie przewidywanych fragmentów PCR zawierających SNP będący przedmiotem zainteresowania za pomocą oprogramowania uMELT35 w celu oceny ważności testu. Wreszcie, HMR-PCR jest metodą analogiczną, co oznacza, że podobieństwo krzywych topnienia między odniesieniem a matrycą niekoniecznie oznacza, że sekwencja szablonu jest identyczna z odniesieniem, ponieważ sekwencja szablonu może różnić się od odniesienia, ale termodynamicznie równoważna. Ograniczenia te nie dotyczą jednak opisywanej tu metody, która opiera się na stopieniu mieszaniny amplikonów różniących się pod względem 5 sekwencji nukleotydowych.

Ponadto opisana tutaj technika, oparta na analizie HRM, ma wiele zalet. Po pierwsze, polimorfizmy długości CR1 są oznaczane szybciej, ponieważ wyniki uzyskuje się w ciągu około 2 godzin od przeprowadzenia ekstrakcji materiału genetycznego. I odwrotnie, tradycyjne techniki biochemiczne oparte na analizie białek WB wymagają etapów, które są stosunkowo długie: elektroforezy ekstraktów błony komórkowej przez żel akrylamidowy, etapu przenoszenia białek do membrany nitrocelulozowej lub polifluorku winylidenu (PVDF) oraz etapu identyfikacji izoform cząsteczki CR1 za pomocą immunochemiluminescencji. Po drugie, technika HRM-PCR ma również tę zaletę, że nie jest zbyt droga, co jest szczególnie ważne w przypadku metody, która może być stosowana u wielu osób (tj. na dużą skalę) w celu określenia ich podatności na rozwój patologii, takich jak choroba Alzheimera, toczeń czy malaria.

Ostatnio my i inni wykazaliśmy, że izoforma CR1*2, która zawiera jedno dodatkowe miejsce wiązania C3b/C4b, była związana z AD 36,37,38. W naszym wcześniej opublikowanym badaniu polimorfizmy długości CR1 na poziomie genu i białka były spójne u 98,9% badanych38. Niezgodne wyniki uzyskane przy porównaniu polimorfizmów długości uzyskanych metodą HRM-PCR z polimorfizmami uzyskanymi metodą WB odpowiadały osobom z profilem genotypu (CR1*1, CR1*2) określonym przez HRM (gen), ale wykazującym ekspresję tylko izoformy CR1*1 na powierzchni erytrocytów zgodnie z WB (białko). W naszym badaniu brak ekspresji izoformy CR1 * 2 (osoby z cichym allelem) był powtarzalny, gdy WB wykonywano z dłuższym czasem ekspozycji i można go wytłumaczyć istnieniem cichego allelu CR1 (CR1 * 2), opisanego w literaturze przez Helgesona39. Niemniej jednak potrzebne są dalsze badania na większych populacjach, aby potwierdzić tę hipotezę.

Należy zauważyć, że prywatne SNP (SNP występujące tylko w małej grupie rodzinnej lub nawet u pojedynczej osoby) prowadziły do odrębnych profili krzywych, które powinny być rozszyfrowane za pomocą referencyjnego określania fenotypu (WB), ale nie można ich mylić z profilem kanonicznym, aby uniknąć błędnej interpretacji genotypu polimorfizmu długości CR1.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wynalazcami patentu należącego do Uniwersytetu Szampanii-Ardenów w Reims (URCA) (numer patentu WO 2015166194)

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom Plateforme Régionale de Biologie Innovante, personelowi Zakładu Immunologii oraz personelowi Oddziału Chorób Wewnętrznych i Geriatrii, którzy przyczynili się do optymalizacji i walidacji protokołu. Praca ta została sfinansowana przez Szpital Uniwersytecki w Reims (grant nr AOL11UF9156). Dziękujemy również Fionie Ecarnot (EA3920, Szpital Uniwersytecki w Besançon, Francja) za pomoc redakcyjną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ochrona fartucha
SensiCareBezpudrowe rękawice nitrylowe do loduMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802ochrona próbki
Pipeta Eppendorf Reference 2, 0,5-10 i mikro; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, FrancjaPipetapipetowania próbek
4920000024 Eppendorf Reference 2, 20-100 i mikro; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4920000059pipetowanie próbek Pipeta
Eppendorf Reference 2, 100-1000 i mikro; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4920000083pipetowanie próbek
TipOne 10µ L Stopniowana, końcówka filtraStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, NiemcyS1121-3810pipetowanie próbek
TipOne 1-100µ L fazowana, końcówka filtraStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, NiemcyS1120-1840pipetowanie próbek
ART 1000E Końcówka barierowaThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja2079Epipetowanie próbek
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, Eppendorf QualityEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja0030120086mix
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francja51306Bufor do ekstrakcji DNA
ALQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francja19075Bufor do lizy
QIAamp Mini Spin ColumnQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francja1011706wiążący DNA
AW1Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francja19081Bufor płuczący
Bufor AW2Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francja19072Bufor płuczący
Spektrofotometr DNABiowave Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, Anglia80-3004-70Koncentracja DNA 
Wirówka Mikro 200Hettich Zentrifugen, D-78532, Niemcy0002020-02-00wirówka
Multipette  E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4987000010dystrybucja
Light Cycler 480 multiwell plate 96, białyRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcy04729692001miejsce reakcji
Folia uszczelniająca Light Cycler 480Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcy04429757001zasięg
Wirówka Heraeus Megafuge 11RThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja75004412wirówka
LightCycler 480 Instrument II, 96-wellRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcy05015278001wysokiej rozdzielczości topnienie polimerazy reakcja łańcuchowa
LightCycler 480 High Resolution Melting MasterRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcy04909631001odczynniki
reakcyjneoprogramowanie light cycler 480 SW 1.5.1Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Niemcyoprogramowanie używane do analizy danych polimorfizmu HRM PCR CR1
Starter CN3: 5'ggccttagacttcctgc 3'EurogentecBiologics Division, B-4102 Seraing, Belgiaodczynnik reakcyjny
Starter CN3re: 5'gttgacaaaattggcggcttcg 3'EurogentecBiologics Division, B-4102 Seraing, Belgiareakcja Odczynnik
laboratoryjnego do Bufor

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer's Disease International. , (2015).
  2. McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
  3. Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T. Neuropathological alterations in Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006189(2011).
  4. Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
  5. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
  6. Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
  7. Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
  8. Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
  9. Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer's disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
  10. Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
  11. Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
  12. Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
  13. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  14. Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
  15. Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
  16. Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
  17. Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
  18. Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
  19. Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
  20. Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
  21. Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
  22. Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
  23. Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
  24. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  25. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  26. Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
  27. Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
  28. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
  29. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
  30. Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
  31. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
  32. Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
  33. Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
  34. Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
  35. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  36. Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
  37. Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
  38. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
  39. Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Complement Receptor 1 GenotypingAlzheimer s Disease SusceptibilityLength Polymorphism AnalysisDNA Isolation ProtocolHRM PCR TechniquePrimer Dilution MethodMulti well Plate CentrifugationMelting Curve AnalysisDisease Association Studies

Powiązane artykuły