Ten artykuł opisuje, jak przeprowadzić obejście krążeniowo-oddechowe u myszy. Ten nowatorski model ułatwi badanie mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem narządów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obejście krążeniowo-oddechowe w modelu mysim: nowatorskie podejście
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ponieważ przedłużone krążenie krążeniowo-oddechowe staje się coraz bardziej istotne podczas interwencji kardiologicznych, pojawia się coraz większe zapotrzebowanie kliniczne na optymalizację procedur i minimalizację uszkodzeń narządów wynikających z przedłużonego krążenia pozaustrojowego. Celem niniejszej pracy było zademonstrowanie w pełni funkcjonalnego i klinicznie istotnego modelu krążenia pozaustrojowego u myszy. Informujemy o konstrukcji urządzenia, optymalizacji obwodu perfuzyjnego i technikach mikrochirurgicznych. Model ten jest modelem ostrym, który nie jest kompatybilny z przeżyciem ze względu na konieczność wielokrotnego pobierania krwi. Ze względu na szereg narzędzi dostępnych dla myszy (np. markery, nokauty itp.), model ten ułatwi badania nad molekularnymi mechanizmami uszkodzenia narządów i wpływem krążenia pozaustrojowego w odniesieniu do innych chorób współistniejących.
Wprowadzenie
Od czasu wprowadzenia do kliniki krążenia pozaustrojowego (CPB), odgrywa ono istotną rolę w kardiochirurgii1. We współczesnej kardiochirurgii wydłużony czas CPB jest niezbędny do wykonywania rozległych rekonstrukcji aorty i zabiegów łączonych. Chociaż postęp technologiczny jest ogromny, stosowanie krążenia pozaustrojowego wiąże się z śród- i pooperacyjnymi uszkodzeniami narządów ogólnoustrojowych i miejscowych2,3.
Duże modele zwierzęce zostały opracowane w celu zbadania roli CPB w procesach fizjologicznych4,5. Chociaż modele te dostarczyły informacji na temat niektórych powikłań związanych z CPB, są one niezwykle kosztowne, a narzędzia molekularne (np. przeciwciała) są bardzo ograniczone. Opracowano bardziej opłacalną alternatywę dla małych zwierząt. Od czasu ich opracowania przeprowadzono wiele badań mających na celu optymalizację modelu CPB u szczurów i królików5,6,7,8,9. Modele te stanowią dobrą podstawę do pomiarów patofizjologicznych procesów chorobowych; Jednak są one nadal niewystarczające do zbadania immunologii komórkowej i humoralnej ze względu na brak odpowiednich przeciwciał i odczynników. Osłabia to ich rolę w tej dziedzinie badań.
Niedawno opracowaliśmy mysi model CPB. Ze względu na szeroką gamę odczynników specyficznych dla myszy i genetycznie modyfikowanych myszy, modele mysie są na ogół modelem wybieranym do badań fizjologicznych, molekularnych i immunologicznych10,11. Dlatego nasz model ułatwi badanie CPB w odniesieniu do różnych chorób współistniejących, ponieważ dostępnych jest wiele szczepów myszy z klinicznie istotnymi chorobami12,13. W związku z tym w niniejszym artykule szczegółowo opisano, jak wykonać CPB u myszy. Parametry tlenowe i hemodynamiczne są ściśle monitorowane po głębokim zatrzymaniu oddechu i krążenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (TierSchG) i zostały zatwierdzone przez lokalny komitet ds. ochrony zwierząt (Krajowy Urząd Ochrony Konsumentów i Bezpieczeństwa Żywności Dolnej Saksonii, Protokół TSA 14/1556). Minimalna waga myszy odpowiedniej dla tego modelu to 25 g.
1. Przygotowania przedoperacyjne
UWAGA: Wszystkie procedury są przeprowadzane w czystych, niesterylnych warunkach, przy użyciu autoklawowanych narzędzi.
- Umieść 50-60 pustych włókien propylenu o długości 8 cm równolegle w rurce i połącz za pomocą adaptera T po obu stronach. Wypełnij przestrzeń między pustymi włóknami a zewnętrzną gałęzią adaptera T klejem.
- Odczekaj co najmniej 24 godziny, aż klej stwardnieje. Odetnij puste włókna wystające z adaptera T za pomocą standardowego mikrotomu i przeciągnij silikonową rurkę do miejsc połączeń.
- Wprowadzić metalową igłę 27 G (z branule 26G) do kaniuli poliuretanowej 2 Fr. Użyj ostrza chirurgicznego i mikronożyczek pod mikroskopem (powiększenie 8-12x), aby wykonać trzy do czterech okien o długości około 0,15 cm każda w dystalnej jednej trzeciej kaniuli, aby zapewnić optymalny przepływ powrotny do żyły.
- Po zakończeniu usuń przewód. Użyj bawełnianych wacików do rozwarstwienia i wycofania struktur. Użyj wacików z gazy (5 x 5 cm2), aby wchłonąć nadmiar płynu, aby zapobiec odwodnieniu tkanek.
- Przygotować objętość gruntowania. Na zakończenie dodać 30 j.m. heparyny na ml roztworu gruntującego i 2,5% v/v 8,4% roztworu NaHCO3 do buforowania. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Napełnij obwód CPB (tj. pompę, pułapkę powietrzną, rurkę i obie kaniule) roztworem zalewowym o stężeniu 850 μl przez kaniulę żylną. Po napełnieniu utrzymuj CPB w obiegu, aż zwierzę będzie gotowe do kaniulacji.
2. Znieczulenie zwierząt
- Aby podać znieczulenie, umieść zwierzę w komorze indukcyjnej pod 2,5% v/v mieszaniny izofluranu i tlenu. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, oceniając odruch wycofania pedału, odruch szczypania ogona i odruch mrugania oczami. Zastosuj weterynaryjną maść do oczu, aby uniknąć wysuszenia oczu.
- Umieść zwierzę na podkładce grzewczej z funkcją regulacji temperatury. Zmierz temperaturę ciała za pomocą sondy włożonej doodbytniczo i podłączonej do systemu akwizycji danych.
- Po uzyskaniu pełnego znieczulenia należy zaintubować zwierzę ustnie i tchawiczo za pomocą plastikowego braunula o pojemności 20 G, wprowadzając go doustnie i wpychając do tchawicy pod kontrolą wzrokową. Rozpocznij wentylację mechaniczną za pomocą parownika izofluranu podłączonego do wentylatora myszy. W zależności od wagi zwierzęcia wyreguluj wentylację tak, aby uzyskać objętość oddechową 250 - 350 μl.
- Aby zapewnić całkowitą analgezję, należy wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karprofenu o masie ciała zwierzęcia. Zaleca się, aby stężenie izofluranu w tlenie wynosiło od 1,3 do 2,5%. Stężenie izofluranu można regulować ręcznie w zależności od etapu zabiegu.
3. Zabiegi chirurgiczne
- Po uzyskaniu pełnego znieczulenia i intubacji należy wykonać nacięcie skóry w linii środkowej szyi ostrymi cienkimi nożyczkami, rozdzielić mięśnie w sposób i odsłonić prawą żyłę szyjną i lewą tętnicę szyjną. Podczas przygotowania należy koagulować małe naczynia za pomocą koagulatora weterynaryjnego połączonego z kleszczami bipolarnymi, aby zapewnić minimalną utratę krwi.
- Po przygotowaniu naczyń szyjnych należy podwiązać czaszkowo dystalny odcinek lewej tętnicy szyjnej wspólnej do jej rozwidlenia za pomocą 8-0 szwy jedwabne.
- Podłącz dystalny koniec kaniuli 27 G do rurki dopływu tętniczego za pomocą silikonowego łącznika (0,5 mm ID, 1 mm OD), miejsce 8-0 Jedwabny szew zawiązuje węzły w bliższym odcinku tętnicy i wprowadza końcówkę kaniuli do tętnicy szyjnej.
- Po prawidłowym umieszczeniu końcówki kaniuli, należy przesunąć końcówkę kaniuli tak, aby leżała 3 - 4 mm proksymalnie do łuku aorty. Zamocuj końcówkę kaniuli, zabezpieczając 8-0 jedwabne węzły.
- Za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych wykonaj i ostre rozwarstwienie, odsłonij prawą żyłę szyjną poprzez przygotowanie tkanki bocznie do mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego, blisko obojczyka i umieść 8-0 jedwabny węzeł na dystalnym końcu i 8-0 pętli na bliższym końcu.
- Po podwiązaniu dystalnego końca żyły szyjnej umieść końcówkę kaniuli żylnej w prawej żyle szyjnej i przejdź w kierunku prawego przedsionka i zabezpiecz węzłem jedwabnym. Aby uzyskać optymalny powrót żylny, może być konieczne przesunięcie końcówki żylnej do prawej komory.
- Po osiągnięciu prawidłowej pozycji kaniuli należy przeprowadzić heparynizację ogólnoustrojową, dodając 2,5 j.m. heparyny na gram masy ciała zwierzęcia poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie dożylne do żyły szyjnej.
- W celu inwazyjnego monitorowania ciśnienia w czasie rzeczywistym kanniulacja lewej tętnicy udowej. Odsłoń obszar pachwiny i delikatnie oddziel wspólną tętnicę udową od żyły udowej i nerwu udowego pod 25-krotnym powiększeniem.
- Podwiązać dystalną część tętnicy udowej. Tymczasowo zatkaj część proksymalną węzłem ślizgowym i wykonaj małe nacięcie na przedniej ścianie za pomocą mikrokleszczy.
- Następnie należy wprowadzić kaniulę poliuretanową 1 Fr do tętnicy udowej i zabezpieczyć ją jedwabnym szwem 10-0. Ta kaniula służy do pobierania próbek krwi do analizy gazometrii.
- Po pomyślnym umieszczeniu kaniul tętniczych i żylnych należy rozpocząć krążenie pozaustrojowe poprzez włączenie pompy. Czas od intubacji do rozpoczęcia CPB wynosi około 45 minut. Zacznij od natężenia przepływu 0,5 ml/min, w zależności od pomiarów ciśnienia ogólnoustrojowego, i zwiększ przepływ krwi w ciągu 2 minut do pełnego przepływu (4 - 6 ml/min), zwiększając prędkość pompy.
- Pod pełnym nadzorem należy wykonać górną sternotomię ostrymi nożyczkami, zaczynając od manubracji i idąc 5 mm w kierunku ogonowym. Natychmiast skoaguluj krawędzie mostka, aby uniknąć krwawienia. Odsłoń łuk aorty, pociągając prawą tętnicę szyjną w kierunku czaszki.
- Aby uzyskać optymalną kontrolę, należy obwodowo uwolnić łuk aorty od grasicy i otaczającej tkanki, aby ułatwić zaciskanie. Miejsce 8-0 jedwabna pętla wokół aorty wstępującej. Aby umieścić zacisk krzyżowy do kardioplegii, pociągnij jedwabną pętlę w kierunku czaszki, aby lepiej odsłonić aortę wstępującą.
4. Krążeniowo-oddechowe obejście i gazometria krwi
- Do gazometrii krwi (BGA) należy użyć szklanych rurek kapilarnych, aby pobrać 60 - 90 μl krwi tętniczej przez cewnik do tętnicy udowej.
- Użyj małego zacisku na silikonowej rurce i odłącz rurkę od cewnika. Powoli zwolnij nacisk na zacisk, aby umożliwić kontrolowane napełnianie rurki kapilarnej.
- Ponownie przymocuj silikonową rurkę do cewnika. Włożyć rurki kapilarne do analizatora parametrów krytycznych krwi w celu pomiarów w następujących punktach czasowych:
10 min po uruchomieniu CPB z wentylacją (BGA1)
po 25 minutach CPB i 15 minutach zatrzymania oddechu (BGA2)
po 40 minutach CPB i 30 minutach zatrzymania oddechu (BGA3)
po 55 minutach CPB, 45 minutach oddechowych i 20 minutach zatrzymania krążenia (BGA4)
- Przy stabilnym przepływie CPB zainicjuj zatrzymanie oddechu poprzez zatrzymanie wentylacji.
- Po zakończeniu wentylacji należy ustawić podkładkę rozgrzewającą na 28 ºC i rozpocząć miejscowe schładzanie zwierzęcia do temperatury ciała 28 ºC w ciągu pierwszych 20 minut od zatrzymania oddechu za pomocą gazy nasączonej zimną solą fizjologiczną.
- Po osiągnięciu temperatury ciała 28 ºC i po łącznie 30 minutach zatrzymania oddechu należy podać 0,3 ml 7,45% roztworu KCl do obwodu CPB, aby zainicjować kardioplegię.
- Aby zacisnąć krzyżowo aortę, pociągnij wcześniej umieszczoną jedwabną pętlę (krok 3.10) w kierunku czaszki, aby uzyskać lepszą ekspozycję i umieść zacisk mikro-serrefine na wstępującej części aorty.
- Wykonaj łącznie 60 minut zatrzymania oddechu i 30 minut zatrzymania krążenia. Usuń zacisk mikro-serrefine z aorty wstępującej, aby zainicjować reperfuzję serca. W tym samym czasie należy ponownie przewietrzyć i ogrzać zwierzę do temperatury 37 °C.
- Po zakończeniu reperfuzji i osiągnięciu przez zwierzę normotermii należy przerwać CPB poprzez wyłączenie pompy i kontynuować monitorowanie pomiarów fizjologicznych (np. temperatury ciała, EKG i inwazyjnego ciśnienia krwi) przez 20 minut.
- Pod koniec eksperymentu wykrwawić zwierzę w pełnym znieczuleniu (5% izofluranu) i pobrać krew oraz narządy do dalszej analizy14.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół opisuje obwód perfuzyjny, procedury chirurgiczne oraz monitorowanie parametrów fizjologicznych podczas CPB u myszy. W przypadku wykonania procedury przez odpowiednio wykwalifikowanego mikrochirurga, wyniki są uzyskiwane w sposób spójny i powtarzalny.
Aby utrzymać odpowiednią perfuzję tkanek, średnie ciśnienie tętnicze jest stale utrzymywane w przedziale od 40 do 60 mmHg poprzez regulację przepływu krwi w CPB o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy w pełni funkcjonalny, klinicznie istotny model CPB u myszy. Biorąc pod uwagę, że ponad trzydzieści szczepów myszy ma choroby sercowo-naczyniowe, nasz model może być punktem wyjścia do opracowania nowych prospektywnych protokołów związanych z CPB. Co więcej, ze względu na mnogość odczynników specyficznych dla myszy i myszy z nokautem, model ten może nie tylko zastąpić obecny szczurzy model CPB, ale ułatwi analizę mechanizmów molekularnych zaangażowanych w uszkodzenia narządów związane z CPB. Do tej pory CPB ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN: 8609189 | objętość gruntowania, 1:1 z Tetraspan |
| Tetraspan 6% roztwór HES | B. Braun Melsungen AG | PZN: | objętość 05565416 gruntowania, 1:1 ze Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 j.m./ml roztworu gruntującego |
| NaHCO3 8,4% roztwór | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% w roztworze gruntującym |
| KCL 7,45 % roztwór | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 0,1 ml na kardioplegię |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/m.c. |
| 1 Fr Cewnik PU | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | tętnica szyjna |
| 2 Fr Cewnik PU | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | żyła szyjna |
| Vasofix Bezpieczny cewnik 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | intubacja ustno-tchawicza |
| 8-0 Jedwabny szew pleciony | Ashaway Line & Sznurek Mfg. Co., USA | 75290 | ligatura |
| Isoflurane | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | narkoza |
| CLINITUBES naczynia włosowate | krwi Radiomed GmbH | 51750132 | pobieranie próbek krwi 60 - 95 mikrolitrów |
| Nożyczki sprężynowe - ostrza 6 mm | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instrumenty |
| Nożyczki sprężynowe - ostrza 2 mm | Narzędzia do nauki GmbH | 15000-03 | instrumenty |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instrumenty |
| Dumont #55 Kleszcze | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instrumenty |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instrumenty |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | Instrumentów |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instrumenty |
| Wentylator MiniVent dla myszy (Model 845) | Aparat Harvard | 73-0044 | wentylacja mechaniczna |
| Parownik izofluranowy Dr | ä gerwerk AG & Co. KGaA | znieczulenie 1,3 - 2,5% | |
| Urządzenie do akwizycji danych PowerLab 4/35 | ADInstruments Ltd, Nowa Zelandia | PL3504 | ciśnienie inwazyjne, EKG, temperatura |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | analiza gazometrii | |
| Myszy NMRI | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | samiec, 30 - 35 g, 12 tygodni, trzymane co najmniej 1 tydzień przed eksperymentem |
Bibliografia
- Edmunds, L. Cardiopulmonary Bypass after 50 Years. N. Engl. J. Med. 351 (16), 1601-1603 (2004).
- Goto, T., Maekawa, K. Cerebral dysfunction after coronary artery bypass surgery. J. Anesth. 28 (2), 242-248 (2014).
- Uysal, S., Reich, D. L. Neurocognitive outcomes of cardiac surgery. J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 27 (5), 958-971 (2013).
- Ballaux, P. K., Gourlay, T., Ratnatunga, C. P., Taylor, K. M. A literature review of cardiopulmonary bypass models for rats. Perfusion. 14 (6), 411-417 (1999).
- Jungwirth, B., de Lange, F. Animal models of cardiopulmonary bypass: development, applications, and impact. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 14 (2), 136-140 (2010).
- Günzinger, R., et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol. 102 (6), 508-517 (2007).
- Waterbury, T., Clark, T. J., Niles, S., Farivar, R. S. Rat model of cardiopulmonary bypass for deep hypothermic circulatory arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (6), 1549-1551 (2011).
- Schnoering, H., et al. A newly developed miniaturized heart-lung machine-expression of inflammation in a small animal model. Artif. Organs. 34 (11), 911-917 (2010).
- Kim, J., et al. The responses of tissues from the brain, heart, kidney, and liver to resuscitation following prolonged cardiac arrest by examining mitochondrial respiration in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016, (2016).
- Shappell, S. B., Gurpinar, T., Lechago, J., Suki, W. N., Truong, L. D. Chronic obstructive uropathy in severe combined immunodeficient (SCID) mice: lymphocyte infiltration is not required for progressive tubulointerstitial injury. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (6), 1008-1017 (1998).
- Majzoub, J. A., Muglia, L. J. Knockout mice. N. Engl. J. Med. , 904-907 (1996).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ. Res. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc. Pathol. 15 (6), 318-330 (2006).
- Iurascu-Gagea, M., Craig, S. Euthanasia and necropsy. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster, and other rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press (Elsevier). 117-141 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
