Artykuł metodologiczny

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

DOI:

10.3791/56021

⸱

14 września 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnienie śródbłonkowych komórek progenitorowych (EPC) we krwi obwodowej i ich udział w waskulogenezie zostało po raz pierwszy zgłoszone przez Asharę i współpracowników1. Później inni udokumentowali istnienie podobnych typów EPC pochodzących ze szpiku kostnego2,3. Niedawno Yoder i Ingram wykazali, że EPC pochodzące z krwi pępowinowej mają wyższy potencjał proliferacyjny w porównaniu z tymi wyizolowanymi z dorosłej krwi obwodowej 4,5,6. Oprócz udziału w waskulogenezie poporodowej, EPC okazały się również obiecujące jako źródło komórek do tworzenia inżynierii tkankowej konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca7,8. Istnieją różne protokoły izolacji, z których niektóre obejmują sortowanie komórek jednojądrzastych (MNC) pochodzących ze źródeł wymienionych wcześniej za pomocą markerów śródbłonka i hematopoetycznych lub hodowlę tych MNC za pomocą specjalistycznej pożywki do wzrostu śródbłonka, lub kombinację tych technik9. W tym miejscu przedstawiono protokół izolacji i hodowli EPC przy użyciu specjalistycznej pożywki śródbłonkowej uzupełnionej czynnikami wzrostu, bez użycia immunosortingu, a następnie charakterystykę izolowanych komórek za pomocą Western blotting i barwienia immunologicznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilku badaczy badało cechy i potencjał ludzkich EPCs5,10,11,12,13. EPC można opisać jako krążące komórki, które mają zdolność przylegania do tkanki śródbłonka w miejscach niedotlenienia, niedokrwienia, urazu lub powstawania guza i przyczyniają się do tworzenia nowych struktur naczyniowych4,14. Ich zaobserwowany udział w neowaskularyzacji, w postaci poporodowej waskulogenezy, doprowadził do zrozumienia patofizjologii tych komórek i ich wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych4,15,16. Wykazano, że liczba EPC u danej osoby jest skorelowana z patologią sercowo-naczyniową9,15,16,17,18,19,20. Inne badania również zróżnicowały EPC w fenotyp podobny do fibroblastów zastawki i zasugerowały, że komórki te mogą być wykorzystane do inżynierii tkankowej zastawek serca7,21.

Poszczególne cząsteczki na powierzchni komórki potrzebne do wyizolowania EPC nie zostały wyraźnie zidentyfikowane z powodu rozbieżności między badaniami4. Adhezja MNC do określonej matrycy, z ekspozycją na różne warunki hodowli, została przeprowadzona przez kilka grup1,17,22,23, co sugeruje, że domniemane EPC mogą wykazywać różne właściwości fenotypowe. Właściwości te obejmują brak zdolności fagocytotycznych, tworzenie się rurki w Matrigel i wychwyt lipoprotein o niskiej gęstości Dil-acetylowane. Wysoki potencjał klonogenny i proliferacyjny to dwie właściwości, dzięki którym EPC mogą być hierarchizowane5. EPC mogą również tworzyć kanaliki in vitro w korozji z ludzkimi płodowymi fibroblastami płuc4. Wiadomo, że komórki te wyrażają markery powierzchni komórek śródbłonka i dzielą niektóre markery krwiotwórcze13,24,25. Dodatnio wyrażone markery, które są powszechnie akceptowane do fenotypowania EPC, to CD31, CD34, receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 2 (VEGFR2), czynnik von Willebranda (vWF), CD133, c-Kit i kadheryna śródbłonka naczyniowego (VE-kadheryna)4,18. Komórki, które wykazują współekspresję CD90, CD45, CD14, CD115 lub aktyny alfa-mięśni gładkich (α-SMA) nie są uważane za EPC ze względu na ich ograniczony potencjał proliferacyjny, zdolność do fagocytozy bakterii i niezdolność do tworzenia ludzkich naczyń de novo in vivo4,7. W artykule przedstawiono zmodyfikowany protokół izolacji śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej bez konieczności stosowania jakichkolwiek protokołów sortowania komórek. W tym artykule użyliśmy CD31, CD34 i VEGFR2 jako markerów dodatnich, z α-SMA jako wskaźnikiem ujemnym.

W tym artykule proponujemy metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych śródbłonka z krwi pępowinowej bez sortowania komórek za pomocą specjalistycznego podłoża do wzrostu śródbłonka uzupełnionego czynnikami wzrostu (EGM). To NWZ zawiera czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF), które zwiększają przeżywalność, proliferację i migrację komórek śródbłonka26. Zawiera również kwas askorbinowy, który jest odpowiedzialny za utrzymanie morfologii komórek kostki brukowej; insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (IGF-1), który zapewnia funkcję angiogenną i migracyjną; oraz heparyna, która powoduje poprawę długoterminowej stabilności czynników wzrostu w klasie Medium26. Inne czynniki wzrostu dodawane do pożywki do hodowli komórek śródbłonka obejmują suplementację naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), który pomaga w stymulowaniu proliferacji i różnicowania komórek, oraz hydrokortyzonem, który uwrażliwia komórki na EGF26. Pokazujemy, że zastosowanie tej specyficznej pożywki wzrostowej daje większą liczbę EPC w porównaniu z śródbłonkowym podłożem podstawowym (EBM) lub zmodyfikowanym podłożem orła Dulbecco (DMEM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone za zgodą University of Arkansas Institutional Review Board (numer zatwierdzenia 16-04-722). Jednostki krwi pępowinowej pobrano w roztworze dekstrozy fosforanowej cytrynianowej (CPD) w Banku Krwi Pępowinowej w Arkansas, a jednostki, które nie spełniały wymogu przechowywania, zostały przekazane do badań. Jednostki krwi pępowinowej zostały dostarczone kurierem do laboratorium w ciągu 24 godzin od pobrania w temperaturze otoczenia.

1. Izolacja komórek progenitorowych śródbłonka z krwi pępowinowej

  1. Przygotowanie odczynników.
    1. Przygotować NWZ, dodając śródbłonkowe podłoże podstawowe (EBM) do 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) uzupełnionej 20 ng/ml insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF), 1 μg/ml kwasu askorbinowego, 5 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (rhEGF), 22,5 μg/ml heparyny i 0,5 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) wraz z 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów B (rhFGF-B), 0,2 μg/ml hydrokortyzonu i 2% penicylina-streptomycyna-glutamina. Wysterylizuj pożywkę hodowlaną za pomocą membranowego filtra próżniowego z polieterosulfonu (PES) o grubości 0,2 μm.
    2. Przygotować roztwór kolagenu szczurzego ogona I o stężeniu 50 μg/ml przy użyciu 0,02 N kwasu octowego. Wysterylizuj ten roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
    3. Wstępnie pokryj 6-dołkowe płytki 2 ml przygotowanego roztworu kolagenu ze szczurzego ogona I dla każdej studzienki. Umieścić je w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę przed siewem.
    4. Rozcieńczyć około 25 ml krwi pępowinowej zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) w stężeniu 1:1.
    5. Przygotować bufor do testu strącania radioimmunologicznego (RIPA) przy użyciu 150 mM chlorku sodu, 1% Triton X-100, 0,5% deoksycholanu sodu, 1 mM β-glicerofosforanu, 0,1% SDS i 50 mM Tris (pH 8,0).
  2. Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych.
    1. Przed izolacją ogrzać wszystkie przygotowane odczynniki w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 20 ml odczynnika o gradiencie gęstości do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    3. Ostrożnie umieścić 20 ml rozcieńczonej krwi pępowinowej w probówce wirówkowej zawierającej pożywkę o gradiencie gęstości, nie przerywając tej warstwy, kierując pipetę w stronę bocznych ścianek probówki.
    4. Oddziel składniki krwi na podstawie ich gęstości (Rysunek 1) przez wirowanie przy 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przy wyłączonych hamulcach wirnika wirówki. Nie naruszaj różnych warstw.
    5. Usuń warstwę plazmy, ostrożnie pipetując ją z probówki, nie naruszając innych warstw komórek, aż końcówka pipety będzie w stanie dotrzeć do warstwy MNC (patrz Rysunek 1). Wyrzuć usunięte osocze.
      UWAGA: Używając końcówek pipet do usuwania plazmy, pozostaw niewielką warstwę plazmy nad warstwą MNC (Rysunek 1), aby zmniejszyć zakłócenia.
    6. Za pomocą strzykawki umieszczonej na igle o rozmiarze 18 należy zebrać kożuchową powłokę zawierającą MNC i przenieść ją do świeżej probówki wirówkowej.
    7. Dodać równą objętość EBM do zebranych MNC. Odwirować te probówki przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: Osad komórkowy będzie wyglądał na czerwony z powodu obecności czerwonych krwinek/erytrocytów.
    8. Dodać 5 ml roztworu chlorku amonu, aby zlizować czerwone krwinki. Inkubować tę probówkę na lodzie przez 5 - 10 minut, od czasu do czasu wstrząsając.
      UWAGA: Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby nie przekroczyć czasu trwania, ponieważ może to być szkodliwe dla korporacji wielonarodowych.
    9. Odwirować probówki o sile 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Jeśli erytrocyty utrzymują się, powtarzaj kroki 1.2.8 i 1.2.9, aż nie zaobserwuje się czerwonego koloru w osadzie.
    10. Ponownie zawiesić osad w przygotowanym NWZ i użyć hemocytometru do policzenia MNC.
    11. Odessać 6-dołkową płytkę pokrytą kolagenem z ogona szczura I (z kroku 1.1.3) i trzykrotnie przemyć studzienki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).
    12. Wysiewaj osad MNC zawieszony ponownie w EGM na płytce kolagenowej w stężeniu 1 x 107 MNC w każdym dołku. Umieścić go w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    13. Po 24 godzinach odessać pożywkę i raz umyć studzienki EGM. Dodać 3 ml pożywki EGM do każdej studzienki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    14. Uzupełniaj talerz świeżą pożywką EGM codziennie przez 7 dni. Po upływie 7 dni należy zmieniać medium NWZ co drugi dzień.
    15. Korzystając z mikroskopu jasnego pola, codziennie rób zdjęcia 6-dołkowej płytki, aby śledzić postęp kolonii komórek śródbłonka. Zaznacz płytkę, na której powstają kolonie, aby śledzić ich wzrost.
      UWAGA: Zwykle potrzeba od 5 do 9 dni, aby kolonie pojawiły się w kulturze.
  3. Ekspansja śródbłonkowych komórek progenitorowych.
    1. Pokryć kolbę hodowlaną T-25 kolagenem z ogona szczura I (50 μg/ml) i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 60 minut. Przed wysiewem komórek należy odessać i umyć kolbę do hodowli komórek T-25 trzykrotnie 1x PBS.
    2. Trypsynizuj kolonie komórek śródbłonka, gdy osiągną wielkość około 3 mm, używając 150 μl 0,05% roztworu trypsyny-EDTA w każdym dołku. Umieścić 6-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 2 - 3 minuty.
    3. Delikatnie postukaj w płytkę 6-dołkową, aby usunąć przyczepione komórki. Natychmiast dodać 2 ml EGM i odzyskać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz początkową gęstość wysiewu.
    5. Wirować probówki wirówkowe o pojemności 15 ml o masie 400 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w EGM i wysiać kolbę T-25 z ~500 000 komórek. Oznaczyć tę kolbę jako przejście 1 i umieścić kolbę T-25 z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      UWAGA: Ogniwa można posiać w EBM i DMEM w celu porównania wzrostu z EGM.
    6. W przypadku dalszych pasaży, gdy kolba osiągnie 90% konfluencji, należy postępować zgodnie z krokami 1.3.1 - 1.3.5 i ponownie zasiać komórki w odległości 104 komórek/cm2 w kolbach do hodowli komórkowych T-75 lub T-175. Przejdź do charakterystyki izolowanych komórek (kroki 2 i 3).

2. Charakterystyka izolowanych komórek za pomocą Western Blotting

  1. Dodaj 50 - 100 μl buforu do lizy przy każdym pasażu, postępując zgodnie z etapami ekspansji, aby scharakteryzować izolowane komórki. Zbierz białka z około 500 000 lub więcej komórek.
  2. Energicznie pipetuj w górę i w dół, aby rozerwać komórki i uwolnić białka. Zebrać i przenieść bufor do probówki mikrowirówkowej.
  3. Odwirować probówkę do mikrowirówki o masie 500 x g i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Oznaczyć i przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
  4. Określ ilościowo ilość białek w każdej probówce za pomocą testu Bradforda lub BCA27,28,29.
  5. Przeprowadź Western blotting przy użyciu standardowych procedur27,28,29. Przeanalizuj 5 μg białka całkowitego pod kątem ekspresji CD31, CD34, VEGFR2 i α-SMA. Użyj α-tubuliny do normalizacji danych.

3. Immunofluorescencja pośrednia

  1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm zanurzyć w 50% etanolu i wysuszyć. Pozostaw czyste szkiełka nakrywkowe na noc w 12-dołkowej płytce w kapturze bezpieczeństwa biologicznego z włączoną lampą UV, aby je wysterylizować.
  2. Pokryj szkiełka nakrywkowe 50 μg/ml kolagenu I ze szczurzego ogona i przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 60 minut.
  3. Odessać kolagen i dodać 1 ml 1x PBS do 12-dołkowej płytki, aby umyć szkiełka nakrywkowe. Zassać 1x PBS i powtórzyć dwukrotnie.
  4. Wysiewaj 250 000 kultur EPC w każdym dołku i umieść je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na co najmniej 3 dni przed przeprowadzeniem barwienia immunologicznego.
  5. Umyj płytkę 3 razy za pomocą 1x PBS. Dodaj 1 ml lodowatego metanolu do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby utrwalić komórki.
  6. Barwienie immunologiczne należy przeprowadzić przy użyciu standardowego protokołu27,28,29. Stosować przeciwciała w ich odpowiednich rozcieńczeniach (np. CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1:100) i VEGFR2 (1:50)).
  7. Zrób zdjęcia immunologicznie wybarwionych szkiełek nakrywkowych za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i ekspansja komórek progenitorowych śródbłonka:
Dostarczony jest schemat (Rysunek 1) przedstawiający cały protokół. Różne warstwy składników krwi obserwowano po odwirowaniu w gradiencie gęstości ludzkiej krwi pępowinowej z podłożem o gradiencie gęstości. Po wysianiu MNC na płytki traktowane kolagenem, po raz pierwszy zaobserwowano rozrost kolonii między 5 a 7 dniem (Rysunek 2A). Kolonie te nadal rosły i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak wspomniano wcześniej, przylegające EPC mają morfologię kostki brukowej. Nasze izolowane MNC rozwijały się od wrzecionowatej kolonii komórkowej (ryc. 2A-2D) we wczesnych stadiach do kolonii brukowej (ryc. 2E-2F) w ciągu dziesięciu dni w hodowli. EPC zostały oznaczone w różny sposób przez różne grupy badawcze, a mianowicie jako późne komórki progenitorowe śródbłonka10, komórki tworzące kolonie śródbłonk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu nr. CMMI-1452943 oraz przez University of Arkansas Honors College. Chcielibyśmy również podziękować Bankowi Krwi Pępowinowej w Arkansas za udostępnienie nam jednostek krwi pępowinowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A) Do izolacji i hodowli
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Ten produkt zawiera wszystkie czynniki wzrostu potrzebne do wytworzenia płodowej
surowicy bydlęcejThermofisher Scientific26140079
Pencillin-Streptomycyna-Glutamina (100x)Thermofisher Scientific10378016
Ficoll-PaqueGE Heatlhcare17-1440-02
Zbilansowany roztwór soli HankaThermofisher Scientific14170-112
Technologie komórek macierzystychchlorku amonu7850
1x Bufor fosforanowy Sól fizjologicznaThermofisher Scientific14190250
Rat Tail I KolagenCorning354236
Lodowaty kwas octowyAmresco0714-500ML
0,05% Trypsyna-EDTAThermofisher Scientific25300054
bufor HEPESThermofisher Scientific15630080
Dulbecco's Modified Eagle's MediumThermofisher Scientific10566-016
B) Przeciwciała i lizaty komórkowe
CD31 Abcamab283641:250 rozcieńczenie  dla Western blotting
CD34Santa Cruz Biotechnologysc-70451:100 rozcieńczenie dla Western blotting
α-SMAabcamab56941:100 rozcieńczenie dla Western blotting
α-tubulinaabcamab72911:2,500 rozcieńczenie dla Western blotting
VEGFR2abcamsc504Rozcieńczenie 1:100 do Western blot
Ludzki lizat komórek śródbłonka żyły pępowinowejSanta Cruz Biotechnologysc24709 
komórek śródmiąższowych zastawkiPierwotna linia komórkowa wyhodowana z własnego laboratorium i poddana lizie z buforem RIPA
< silny>C) Western blot i barwienie immunologiczne
10x Bufor Tris/Glycine/SDSBiorad161-0772Używany jako bufor do biegania
10x Bufor Tris/GlycineBiorad161-0771Używany jako bufor transferowy
Membrana transferowa Immobilon-FLMerck MilliporeIPFL0010Jest to membrana transferowa PVDF, która ma 45 &mikro; m wielkości porów i jest wymieniony w protokole jako membrana western blot
4x bufor do próbek LaemmliBiorad161-0747
2-merkaptoetanolBiorad161-0710
10% Criterion TGX żel prefabrykowanyBiorad5671033
Prolong Gold antifadeThermofisher ScientificP36930Służy do montażu immunologicznie barwionych szkiełek nakrywkowych do długotrwałego przechowywania
MetanolVWR AnalyticalBDH1135-4LP
pożywki wzrostu śródbłonka Lizat

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  2. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
  3. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
  4. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  5. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  6. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  7. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
  8. Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
  9. Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
  10. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
  11. Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
  12. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  13. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
  14. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692(2012).
  15. Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
  16. Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
  17. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
  18. Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
  19. Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
  20. Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
  21. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
  22. Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
  23. Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
  24. Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
  25. Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
  26. Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
  27. Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330(2016).
  28. Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
  29. Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
  30. Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rekwirowanie w gradiencie g sto cipo ywka wzrostowa dla kom rek r db onkaanaliza Western blotcharakterystyka immunobarwieniapowlekanie kolageneminkubacja hodowli kom rkowychtworzenie kolonii

Powiązane artykuły