Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Kilku badaczy badało cechy i potencjał ludzkich EPCs^{5,10,11,12,13}. EPC można opisać jako krążące komórki, które mają zdolność przylegania do tkanki śródbłonka w miejscach niedotlenienia, niedokrwienia, urazu lub powstawania guza i przyczyniają się do tworzenia nowych struktur naczyniowych^4,14. Ich zaobserwowany udział w neowaskularyzacji, w postaci poporodowej waskulogenezy, doprowadził do zrozumienia patofizjologii tych komórek i ich wykorzystania w zastosowaniach terapeutycznych^4,15,16. Wykazano, że liczba EPC u danej osoby jest skorelowana z patologią sercowo-naczyniową^{9,15,16,17,18,19,20}. Inne badania również zróżnicowały EPC w fenotyp podobny do fibroblastów zastawki i zasugerowały, że komórki te mogą być wykorzystane do inżynierii tkankowej zastawek serca^7,21.

Poszczególne cząsteczki na powierzchni komórki potrzebne do wyizolowania EPC nie zostały wyraźnie zidentyfikowane z powodu rozbieżności między badaniami⁴. Adhezja MNC do określonej matrycy, z ekspozycją na różne warunki hodowli, została przeprowadzona przez kilka grup^1,17,22,23, co sugeruje, że domniemane EPC mogą wykazywać różne właściwości fenotypowe. Właściwości te obejmują brak zdolności fagocytotycznych, tworzenie się rurki w Matrigel i wychwyt lipoprotein o niskiej gęstości Dil-acetylowane. Wysoki potencjał klonogenny i proliferacyjny to dwie właściwości, dzięki którym EPC mogą być hierarchizowane⁵. EPC mogą również tworzyć kanaliki in vitro w korozji z ludzkimi płodowymi fibroblastami płuc⁴. Wiadomo, że komórki te wyrażają markery powierzchni komórek śródbłonka i dzielą niektóre markery krwiotwórcze^13,24,25. Dodatnio wyrażone markery, które są powszechnie akceptowane do fenotypowania EPC, to CD31, CD34, receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 2 (VEGFR2), czynnik von Willebranda (vWF), CD133, c-Kit i kadheryna śródbłonka naczyniowego (VE-kadheryna)^4,18. Komórki, które wykazują współekspresję CD90, CD45, CD14, CD115 lub aktyny alfa-mięśni gładkich (α-SMA) nie są uważane za EPC ze względu na ich ograniczony potencjał proliferacyjny, zdolność do fagocytozy bakterii i niezdolność do tworzenia ludzkich naczyń de novo in vivo^4,7. W artykule przedstawiono zmodyfikowany protokół izolacji śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej bez konieczności stosowania jakichkolwiek protokołów sortowania komórek. W tym artykule użyliśmy CD31, CD34 i VEGFR2 jako markerów dodatnich, z α-SMA jako wskaźnikiem ujemnym.

W tym artykule proponujemy metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych śródbłonka z krwi pępowinowej bez sortowania komórek za pomocą specjalistycznego podłoża do wzrostu śródbłonka uzupełnionego czynnikami wzrostu (EGM). To NWZ zawiera czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF), które zwiększają przeżywalność, proliferację i migrację komórek śródbłonka²⁶. Zawiera również kwas askorbinowy, który jest odpowiedzialny za utrzymanie morfologii komórek kostki brukowej; insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (IGF-1), który zapewnia funkcję angiogenną i migracyjną; oraz heparyna, która powoduje poprawę długoterminowej stabilności czynników wzrostu w klasie Medium26. Inne czynniki wzrostu dodawane do pożywki do hodowli komórek śródbłonka obejmują suplementację naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), który pomaga w stymulowaniu proliferacji i różnicowania komórek, oraz hydrokortyzonem, który uwrażliwia komórki na EGF²⁶. Pokazujemy, że zastosowanie tej specyficznej pożywki wzrostowej daje większą liczbę EPC w porównaniu z śródbłonkowym podłożem podstawowym (EBM) lub zmodyfikowanym podłożem orła Dulbecco (DMEM).

To badanie zostało przeprowadzone za zgodą University of Arkansas Institutional Review Board (numer zatwierdzenia 16-04-722). Jednostki krwi pępowinowej pobrano w roztworze dekstrozy fosforanowej cytrynianowej (CPD) w Banku Krwi Pępowinowej w Arkansas, a jednostki, które nie spełniały wymogu przechowywania, zostały przekazane do badań. Jednostki krwi pępowinowej zostały dostarczone kurierem do laboratorium w ciągu 24 godzin od pobrania w temperaturze otoczenia.

1. Izolacja komórek progenitorowych śródbłonka z krwi pępowinowej

1. Przygotowanie odczynników.
   1. Przygotować NWZ, dodając śródbłonkowe podłoże podstawowe (EBM) do 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) uzupełnionej 20 ng/ml insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF), 1 μg/ml kwasu askorbinowego, 5 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (rhEGF), 22,5 μg/ml heparyny i 0,5 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) wraz z 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów B (rhFGF-B), 0,2 μg/ml hydrokortyzonu i 2% penicylina-streptomycyna-glutamina. Wysterylizuj pożywkę hodowlaną za pomocą membranowego filtra próżniowego z polieterosulfonu (PES) o grubości 0,2 μm.
   2. Przygotować roztwór kolagenu szczurzego ogona I o stężeniu 50 μg/ml przy użyciu 0,02 N kwasu octowego. Wysterylizuj ten roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
   3. Wstępnie pokryj 6-dołkowe płytki 2 ml przygotowanego roztworu kolagenu ze szczurzego ogona I dla każdej studzienki. Umieścić je w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę przed siewem.
   4. Rozcieńczyć około 25 ml krwi pępowinowej zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) w stężeniu 1:1.
   5. Przygotować bufor do testu strącania radioimmunologicznego (RIPA) przy użyciu 150 mM chlorku sodu, 1% Triton X-100, 0,5% deoksycholanu sodu, 1 mM β-glicerofosforanu, 0,1% SDS i 50 mM Tris (pH 8,0).
2. Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych.
   1. Przed izolacją ogrzać wszystkie przygotowane odczynniki w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C.
   2. Dodać 20 ml odczynnika o gradiencie gęstości do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   3. Ostrożnie umieścić 20 ml rozcieńczonej krwi pępowinowej w probówce wirówkowej zawierającej pożywkę o gradiencie gęstości, nie przerywając tej warstwy, kierując pipetę w stronę bocznych ścianek probówki.
   4. Oddziel składniki krwi na podstawie ich gęstości (Rysunek 1) przez wirowanie przy 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przy wyłączonych hamulcach wirnika wirówki. Nie naruszaj różnych warstw.
   5. Usuń warstwę plazmy, ostrożnie pipetując ją z probówki, nie naruszając innych warstw komórek, aż końcówka pipety będzie w stanie dotrzeć do warstwy MNC (patrz Rysunek 1). Wyrzuć usunięte osocze.
      UWAGA: Używając końcówek pipet do usuwania plazmy, pozostaw niewielką warstwę plazmy nad warstwą MNC (Rysunek 1), aby zmniejszyć zakłócenia.
   6. Za pomocą strzykawki umieszczonej na igle o rozmiarze 18 należy zebrać kożuchową powłokę zawierającą MNC i przenieść ją do świeżej probówki wirówkowej.
   7. Dodać równą objętość EBM do zebranych MNC. Odwirować te probówki przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: Osad komórkowy będzie wyglądał na czerwony z powodu obecności czerwonych krwinek/erytrocytów.
   8. Dodać 5 ml roztworu chlorku amonu, aby zlizować czerwone krwinki. Inkubować tę probówkę na lodzie przez 5 - 10 minut, od czasu do czasu wstrząsając.
      UWAGA: Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby nie przekroczyć czasu trwania, ponieważ może to być szkodliwe dla korporacji wielonarodowych.
   9. Odwirować probówki o sile 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Jeśli erytrocyty utrzymują się, powtarzaj kroki 1.2.8 i 1.2.9, aż nie zaobserwuje się czerwonego koloru w osadzie.
   10. Ponownie zawiesić osad w przygotowanym NWZ i użyć hemocytometru do policzenia MNC.
   11. Odessać 6-dołkową płytkę pokrytą kolagenem z ogona szczura I (z kroku 1.1.3) i trzykrotnie przemyć studzienki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).
   12. Wysiewaj osad MNC zawieszony ponownie w EGM na płytce kolagenowej w stężeniu 1 x 10⁷ MNC w każdym dołku. Umieścić go w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   13. Po 24 godzinach odessać pożywkę i raz umyć studzienki EGM. Dodać 3 ml pożywki EGM do każdej studzienki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   14. Uzupełniaj talerz świeżą pożywką EGM codziennie przez 7 dni. Po upływie 7 dni należy zmieniać medium NWZ co drugi dzień.
   15. Korzystając z mikroskopu jasnego pola, codziennie rób zdjęcia 6-dołkowej płytki, aby śledzić postęp kolonii komórek śródbłonka. Zaznacz płytkę, na której powstają kolonie, aby śledzić ich wzrost.
       UWAGA: Zwykle potrzeba od 5 do 9 dni, aby kolonie pojawiły się w kulturze.
3. Ekspansja śródbłonkowych komórek progenitorowych.
   1. Pokryć kolbę hodowlaną T-25 kolagenem z ogona szczura I (50 μg/ml) i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na co najmniej 60 minut. Przed wysiewem komórek należy odessać i umyć kolbę do hodowli komórek T-25 trzykrotnie 1x PBS.
   2. Trypsynizuj kolonie komórek śródbłonka, gdy osiągną wielkość około 3 mm, używając 150 μl 0,05% roztworu trypsyny-EDTA w każdym dołku. Umieścić 6-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 2 - 3 minuty.
   3. Delikatnie postukaj w płytkę 6-dołkową, aby usunąć przyczepione komórki. Natychmiast dodać 2 ml EGM i odzyskać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
   4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz początkową gęstość wysiewu.
   5. Wirować probówki wirówkowe o pojemności 15 ml o masie 400 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w EGM i wysiać kolbę T-25 z ~500 000 komórek. Oznaczyć tę kolbę jako przejście 1 i umieścić kolbę T-25 z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
      UWAGA: Ogniwa można posiać w EBM i DMEM w celu porównania wzrostu z EGM.
   6. W przypadku dalszych pasaży, gdy kolba osiągnie 90% konfluencji, należy postępować zgodnie z krokami 1.3.1 - 1.3.5 i ponownie zasiać komórki w odległości 10⁴ komórek/^cm2 w kolbach do hodowli komórkowych T-75 lub T-175. Przejdź do charakterystyki izolowanych komórek (kroki 2 i 3).

2. Charakterystyka izolowanych komórek za pomocą Western Blotting

1. Dodaj 50 - 100 μl buforu do lizy przy każdym pasażu, postępując zgodnie z etapami ekspansji, aby scharakteryzować izolowane komórki. Zbierz białka z około 500 000 lub więcej komórek.
2. Energicznie pipetuj w górę i w dół, aby rozerwać komórki i uwolnić białka. Zebrać i przenieść bufor do probówki mikrowirówkowej.
3. Odwirować probówkę do mikrowirówki o masie 500 x g i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Oznaczyć i przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
4. Określ ilościowo ilość białek w każdej probówce za pomocą testu Bradforda lub BCA^27,28,29.
5. Przeprowadź Western blotting przy użyciu standardowych procedur^27,28,29. Przeanalizuj 5 μg białka całkowitego pod kątem ekspresji CD31, CD34, VEGFR2 i α-SMA. Użyj α-tubuliny do normalizacji danych.

3. Immunofluorescencja pośrednia

1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm zanurzyć w 50% etanolu i wysuszyć. Pozostaw czyste szkiełka nakrywkowe na noc w 12-dołkowej płytce w kapturze bezpieczeństwa biologicznego z włączoną lampą UV, aby je wysterylizować.
2. Pokryj szkiełka nakrywkowe 50 μg/ml kolagenu I ze szczurzego ogona i przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na co najmniej 60 minut.
3. Odessać kolagen i dodać 1 ml 1x PBS do 12-dołkowej płytki, aby umyć szkiełka nakrywkowe. Zassać 1x PBS i powtórzyć dwukrotnie.
4. Wysiewaj 250 000 kultur EPC w każdym dołku i umieść je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na co najmniej 3 dni przed przeprowadzeniem barwienia immunologicznego.
5. Umyj płytkę 3 razy za pomocą 1x PBS. Dodaj 1 ml lodowatego metanolu do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby utrwalić komórki.
6. Barwienie immunologiczne należy przeprowadzić przy użyciu standardowego protokołu^27,28,29. Stosować przeciwciała w ich odpowiednich rozcieńczeniach (np. CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1:100) i VEGFR2 (1:50)).
7. Zrób zdjęcia immunologicznie wybarwionych szkiełek nakrywkowych za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Izolacja i ekspansja komórek progenitorowych śródbłonka:
Dostarczony jest schemat (Rysunek 1) przedstawiający cały protokół. Różne warstwy składników krwi obserwowano po odwirowaniu w gradiencie gęstości ludzkiej krwi pępowinowej z podłożem o gradiencie gęstości. Po wysianiu MNC na płytki traktowane kolagenem, po raz pierwszy zaobserwowano rozrost kolonii między 5 a 7 dniem (Rysunek 2A). Kolonie te nadal rosły i miały wrzecionowatą morfologię komórek (Ryc. 2A-2D) we wczesnych stadiach, która później rozwinęła się do morfologii podobnej do bruku (Ryc. 2 E-2F). Rysunek 3A pokazuje całkowitą liczbę komórek w stosunku do czasu w hodowli, a każdy punkt danych reprezentuje skumulowaną liczbę komórek zebranych przy każdym przejściu. Rysunek 3B przedstawia średni czas potrzebny do powstania pierwszej kolonii na 6-dołkowej płytce potraktowanej kolagenem po wysianiu MNC.

Charakterystyka za pomocą Western Blotting:
Rysunek 4A pokazuje reprezentatywne wyniki błony Western blot, która została przetestowana przeciwko różnym przeciwciałom. Nasze wyniki sugerują, że komórki były dodatnie dla CD31 i CD34. Wyrażenie CD31 (Rysunek 4B) i CD34 (Rysunek 4C) wydawała się zmniejszać w kolejnych fragmentach, podczas gdy VEGFR2 (Rysunek 4D) była wyrażana równomiernie w późniejszych fragmentach, przy czym pierwszy fragment miał wyższą ekspresję. Zaobserwowaliśmy również, że EPC nie wyrażały mezenchymalnego markera komórkowego α-SMA (Figura 4E). Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i lizaty komórkowe śródmiąższowych komórek zastawkowych (VIC) zastosowano odpowiednio jako kontrolę pozytywną i negatywną. Wiadomo, że HUVEC wykazują ekspresję CD31, CD34 i VEGFR2, podczas gdy VIC wyrażają α-SMA.

Rysunek 1: Schemat izolacji EPC. Izolację należy rozpocząć od rozcieńczenia krwi pępowinowej HBSS i ostrożnego nałożenia jej warstwami na podłoże o gradiencie gęstości, jak pokazano. Wirowanie w gradiencie gęstości krwi warstwowej przeprowadza się w celu uzyskania odrębnych warstw krwi, która składa się z MNC (kożuchówki), pożywki gradientu gęstości, granulocytów i erytrocytów. Dostarczony obraz podzbioru przedstawia te różne warstwy. MNC są zbierane i ponownie wysiewane na płytce do hodowli komórkowej traktowanej kolagenem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Postęp kolonii komórkowej. (A-E) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu progresji kolonii EPC w czasie. Należy zauważyć, że kolonia ma komórki w kształcie wrzeciona we wczesnych stadiach, przyjmując morfologię bruku. (E) Reprezentatywny obraz EPC hodowanego w kolbie T-75 w pasażu 3. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Krzywe wzrostu EPC. (A) Wykres przedstawia liczbę komórek rosnących w czasie, a każdy z punktów danych oznacza numer komórki zebranej podczas każdego przejścia (P0 - P10) (n = 4). (B) Czas potrzebny do pojawienia się pierwszej kolonii EPC w płytce 6-dołkowej (n = 4). Słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej (SEM). Nie stwierdzono istotności statystycznej przy zastosowaniu jednoczynnikowej analizy ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Western Blotting. (A) Błona Western blot zabarwiona różnymi przeciwciałami. Jako kontrole pozytywne zastosowano lizat HUVEC i lizat VIC. (B) Średnia intensywność prążków CD31 znormalizowanych α-tubuliną. (C) Średnia intensywność prążków CD34 znormalizowana α-tubuliną. (D) Średnia intensywność prążków VEGFR2 znormalizowanych α-tubuliną. (E) Średnie nasilenie prążków α-SMA znormalizowanych α-tubuliną (n = 3 - 6). Słupki błędów oznaczają SEM. Nie stwierdzono istotności statystycznej przy użyciu jednokierunkowej ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Barwienie immunologiczne. Reprezentatywne obrazy EPC hodowanych w EGM przez 7 dni i barwionych immunologicznie w różnych pasażach dla CD31, CD34, VEGFR2 i α-SMA. Podziałka - 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Wykres przedstawia liczbę komórek na jednostkę powierzchni w okresie 7 dni podczas hodowli w EGM, EBM i DMEM. EGM wykazał wyższy wzrost komórek w porównaniu z pożywkami (EBM i DMEM). Dane wykazały istotność statystyczną, z p <0,01, przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA (n = 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 2: Reprezentatywne obrazy EPC hodowanych w EBM przez 7 dni i barwionych immunologicznie dla CD31, CD34, VEGFR2 i α-SMA. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 3: Reprezentatywne obrazy EPC hodowanych w DMEM przez 7 dni i barwionych immunologicznie dla CD31, CD34, VEGFR2 i α-SMA. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.