Wszczepienie guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z ludzkich komórek płaszcza

Podsumowanie

Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest trudnym do leczenia zaburzeniem komórek B i równie trudno jest stworzyć mysi model ksenoprzeszczepu pierwotnego MCL w celu zbadania i opracowania terapii. W tym miejscu opisujemy udane wprowadzenie ksenoprzeszczepów MCL u myszy, aby pomóc zrozumieć ich biologię.

Streszczenie

B limfocyty są kluczowymi graczami w krążeniu komórek odpornościowych i głównie domują i rezydują w narządach limfatycznych. Podczas gdy normalne limfocyty B namnażają się tylko wtedy, gdy są stymulowane przez limfocyty T, onkogenne komórki B przeżywają i rozwijają się autonomicznie w nieokreślonych niszach narządowych. Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest jednym z takich zaburzeń z komórek B, w którym mediana przeżycia pacjentów wynosi 4 - 5 lat. Wymaga to skutecznych mechanizmów, za pomocą których blokowane jest naprowadzanie i wszczepianie tych komórek w celu zwiększenia przeżywalności i długowieczności pacjentów. W związku z tym niezwykle ważne jest opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu w celu zbadania skuteczności terapii MCL poprzez blokowanie mechanizmu naprowadzania in vivo. Od dawna trwają prace nad opracowaniem zwierzęcych biorców ksenotransplantacji komórek ludzkich w celu przetestowania leków na wczesnym etapie, ponieważ odpowiednie przedkliniczne modele myszy mają kluczowe znaczenie dla badań przesiewowych nowych środków terapeutycznych. Ten model zwierzęcy został opracowany w celu uniknięcia odrzucenia przeszczepu u ludzi i ustanowienia modelu dla chorób u ludzi, a także może być niezwykle przydatnym narzędziem do badania progresji choroby różnych typów chłoniaka oraz do przeprowadzania badań przedklinicznych potencjalnych leków na nowotwory hematologiczne, takie jak MCL. Stworzyliśmy mysi model ksenoprzeszczepu, który będzie służył jako doskonałe źródło do badania i opracowywania nowatorskich podejść terapeutycznych w MCL.

Wprowadzenie

Limfocyty z natury odgrywają główną rolę w nadzorze immunologicznym, a transport limfocytów jest kluczowym krokiem w budowaniu odporności swoistej dla antygenu^1,2. Proces ten obejmuje migrację naiwnych limfocytów T z grasicy do krwiobiegu, a stamtąd do wtórnych narządów limfatycznych, w tym węzłów chłonnych, plam Peyera lub śledziony, gdzie spotykają się z pokrewnymi antygenami. Limfocyty B różnicują się w szpiku kostnym i migrują jako komórki naiwne do pęcherzyków wtórnych narządów limfatycznych³. Niektóre z tych limfocytów B wiążą antygen ze swoim receptorem i są aktywowane przez specyficzne limfocyty T. Proliferacja i różnicowanie tych limfocytów B popycha nieaktywowane, naiwne limfocyty B do strefy płaszcza pęcherzyka. Aktywowane komórki mogą następnie różnicować się w limfocyty B pamięci, które patrolują organizm, lub dojrzewać do komórek plazmatycznych wydzielających immunoglobulinę, które migrują do szpiku kostnego⁴.

MCL występuje, gdy naiwne limfocyty B w strefie płaszcza przekształcają się w guz. Te komórki chłoniaka znajdują się w mikrośrodowisku narządów limfatycznych i namnażają się niezależnie od specyficznej kontroli limfocytów T. Jednak na pewnym etapie zagęszczenia uciekają z tej niszy i krążą ponownie w krwiobiegu w poszukiwaniu nisz w innych narządach. Biorąc pod uwagę złożoność cząsteczek adhezyjnych oraz rozwiązłość chemokin i ich receptorów, mechanizm tego transportu komórkowego in vivo jest słabo poznany, co utrudnia terapię. Potrzebne są nowe metody, aby skutecznie zablokować ten proces migracji, aby zapobiec przedostawaniu się komórek B chłoniaka do nowych mikrośrodowisk.

MCL jest jednym z najtrudniejszych do leczenia nowotworów złośliwych komórek B. Rozwój nowotworowego fenotypu MCL jest wynikiem wieloetapowej kaskady, charakteryzującej się nabyciem unikalnych właściwości biologicznych. W momencie rozpoznania u większości pacjentów (70%) występuje już choroba rozsiana, przy czym w większości przypadków występuje pozawęzłowe zajęcie śledziony, szpiku kostnego i/lub przewodu pokarmowego^5,6. U leczonych pacjentów nawroty opornych nowotworów w ciągu kilku lat są powszechne, mimo że konwencjonalna chemioterapia wywołuje wysokie wskaźniki remisji w krótkim okresie^7,8. W tym miejscu przedstawiamy nowy model choroby, który może pomóc w zrozumieniu rozprzestrzeniania się MCL i leżącej u jego podstaw biologii: stworzyliśmy ludzki model ksenoprzeszczepu MCL u myszy, który pochodzi z pierwotnych komórek nowotworowych pacjentów. Mamy nadzieję, że model ten przyczyni się do opracowania strategii terapeutycznych przeciwko rozsiewowi MCL i być może dostarczy nowych perspektyw klinicznych dla optymalnej diagnostyki i leczenia pacjentów z nawrotem choroby.

Protokół

Próbki ludzkiej krwi zostały użyte zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez lokalne komisje etyki i eksperymentów na ludziach Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie.

Procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem Etycznym ds. Opieki nad Zwierzętami w Genewie, Szwajcaria oraz Kantonalnym Biurem Weterynaryjnym (numer autoryzacji: GE/26/15).

1. Przygotowanie pierwotnych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) metodą separacji gradientu gęstości

UWAGA: 3 - 5 ml krwi obwodowej uzyskano od pacjentów z MCL w fazie białaczkowej. Rozpoznanie ustalono na podstawie standardowych kryteriów diagnostycznych cytometrii przepływowej (CD5+, CD23−, CD200+, populacja monoklonalnych komórek B), a następnie potwierdzono obecnością translokacji chromosomowej t (11; 14) i nadekspresja cykliny D1. We wszystkich przypadkach monoklonalne limfocyty B stanowiły >90% całkowitej populacji komórek B. Pozostałe komórki to głównie monocyty i niektóre limfocyty T.

1. Rozcieńczyć (1:1) 5 ml próbki krwi MCL za pomocą 5 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (Rysunek 1A).
2. Przed użyciem kilkakrotnie odwróć gradient gęstości (tabela materiałów), aby zapewnić dokładne wymieszanie.
3. Dodać 5 ml pożywki o gradiencie gęstości do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą aspiratora do pipet.
4. Delikatnie nałożyć rozcieńczoną próbkę krwi na pożywkę o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą aspiratora (stosunek krwi do pożywki gradientowej gęstości powinien wynosić 2:1, np. 10 ml krwi na 5 ml pożywki o gradiencie gęstości). Należy uważać, aby nie mieszać dwóch warstw (Rysunek 1B, C).
5. Odwirować próbkę o masie 400 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonych hamulcach wirówki.
6. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura delikatnie zassać środkową warstwę (białawy, cienki pierścień oznaczony strzałką (Rysunek 1D, E)) zawierającą komórki jednojądrzaste i przenieść je do czystej probówki.
7. Mycie komórek jednojądrzastych
   1. Oszacuj objętość przeniesionej zawiesiny komórkowej i dodaj do niej 3 objętości sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
   2. Wymieszać zawiesinę, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
   3. Odwirować zawiesinę o sile 400 - 500 x g przez 10 - 15 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Odrzucić supernatant w celu uzyskania osadu komórkowego i ponownie powtórzyć etap płukania.
   5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości, np. 1 lub 2 ml PBS.
   6. Policz liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie za pomocą hemocytometru (komora Neubauera).

2. Wzbogacanie komórek B przez negatywny wybór komórek B

1. Rozcieńczyć komórki w PBS do końcowego stężenia 50 x 10⁶ komórek/ml.
2. Przenieś komórki do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Dodaj 100 μl koktajlu przeciwciał z zestawu do wzbogacania limfocytów B do 2 ml zawiesiny komórek i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół (Rysunek 2-1).
3. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Krótko wiruj cząstki magnetyczne dostarczone w zestawie do wzbogacania komórek B przez 30 s (Rysunek 2-2). Dodać 150 μl cząstek magnetycznych do 2 ml próbki.
5. Inkubować próbkę przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Doprowadzić objętość próbki do 2,5 ml za pomocą 1x PBS zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Umieść probówkę w magnesie i inkubuj probówkę przez kolejne 3 - 5 minut (Rysunek 2-3).
7. Podnieś magnes z rurką na miejscu i jednym ciągłym ruchem zdekantuj rurkę tak, aby wzbogacona zawiesina komórek została zebrana w świeżej probówce (Rysunek 2-4). Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie za pomocą hemocytometru, aby uzyskać całkowitą wydajność komórek B.
   UWAGA: Zazwyczaj wydajność wynosi ~10⁵ komórek B / ml dla normalnych komórek B i 5 - 50 x 10⁶ komórek / ml dla MCL.
8. Potwierdzenie czystości wzbogacenia limfocytów B
   1. Weź ~ 50 000 komórek i inkubuj komórki z przeciwciałami anty-CD19/CD20 (rozcieńczenie 1:20) i przeciwciałem anty-CD45 sprzężonym z różnymi fluorochromami (rozcieńczenie 1:10) w temperaturze pokojowej przez 15 - 30 min.
   2. Przemyć 1 ml 1x PBS + 1% BSA, odwirować komórki przy 400 - 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w ~200 μL PBS.
   3. Pobrać próbki komórek za pomocą cytometrii przepływowej i przeanalizować pod kątem czystości komórek B. Czystość wynosi przeważnie >90% według tej metody (Rysunek 3).

3. Rozwój modelu myszy ksenoprzeszczepu

1. Zawiesić ~40 - 60 x 10⁶ komórek w 150 - 200 μL 1x PBS (objętość wymagana do wstrzyknięcia na mysz).
2. Wstrzyknąć dożylnie 150 μl zawiesiny komórkowej (i.v.) do każdej żyły ogonowej 6-7-tygodniowych myszy z niedoborem odporności NOD scid gamma (NSG), niezależnie od płci (Figura 4A).
3. Pozwól myszom rozwinąć ludzkiego chłoniaka przez ~ 10 tygodni.
   UWAGA: Pierwotne ludzkie komórki chłoniaka potrzebują znacznie więcej czasu, aby rozwinąć guz w porównaniu z ludzkimi liniami komórkowymi chłoniaka (~ 3 tygodnie).
4. Kiedy zwierzęta zaczynają wykazywać objawy śmiertelnej choroby, takie jak utrata masy ciała, zmierzwione włosy, zmniejszona aktywność, paraliż kończyn tylnych itp., Poświęć myszy przez uduszenie CO₂, a następnie nakłucie serca w celu uzyskania krwi.
5. Zbierz różne narządy, takie jak szpik kostny, śledziona i wątroba, przeprowadzając sekcję myszy i zbierz krew obwodową, pobierając krew z serca w momencie poświęcenia do analizy przeszczepu guza (Rysunek 4B - F).

4. Analiza chimeryzmu komórek nowotworowych wszczepionych w różne narządy

1. Po pobraniu różnych narządów przetworzyć je przez mechaniczne rozerwanie w celu wytworzenia zawiesin pojedynczych komórek po lizie czerwonych krwinek (RBC) przy użyciu 200 μl 1x buforu potasu chlorku amonu dla krwi i szpiku kostnego, 500 μl dla śledziony i 2 ml dla wątroby.
2. Policz i wybarwij komórki za pomocą przeciwciał specyficznych dla ludzkich limfocytów B, tj. anty-CD19, anty-CD20 i anty-CD45.
   UWAGA: Myszy NSG nie mają komórek B, dlatego do analizy komórki są barwione markerami komórek B specyficznymi dla ludzi.
3. Analizuj komórki pochodzące z każdego narządu za pomocą cytometrii przepływowej, bramkując na komórkach B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
4. Określ ilościowo przeszczepione komórki nowotworowe w różnych narządach pochodzących od myszy, którym wstrzyknięto MCL, na podstawie bramkowanych komórek, jak wskazano w kroku 4.3 (Rysunek 4G) .
   UWAGA: Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów.

Wyniki

W manuskrypcie opisano zoptymalizowany protokół skutecznego opracowania mysiego modelu ksenoprzeszczepu dla engraftmentu komórek MCL. Przygotowanie czystej populacji komórek (w tym przypadku komórek MCL) jest kluczowe dla pomyślnego wytworzenia ksenoprzeszczepów MCL. Rycina 1 przedstawia etapy preparatywne izolacji komórek mononuklearnych z krwi pacjenta z MCL za pomocą separacji gradientem gęstości. Komórki mononuklearne są następnie przetwarzane w celu uzys...

Dyskusja

Badania kliniczne są możliwe dla leków, które są w zaawansowanym stadium rozwoju, ale nie mogą być wykorzystywane do odkrywania leków. Wysiłki mające na celu opracowanie zwierzęcych biorców do ksenotransplantacji komórek ludzkich w celu przetestowania leków na wczesnym etapie rozwoju są już od dawna kontynuowane. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który pozwala uniknąć odrzucenia przeszczepu u człowieka i może ustanowić model dla chorób ludzkich, takich jak MCL. Jest to obecnie najnowocześniejszy model ksenoprz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka Ficoll-paque	GE Healthcare	17-1440-02	do separacji komórek jednojądrzastych
RPMI Medium 1640	Technologie Gibco-Life	61870-010	do rozcieńczania próbki krwi
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	mycie komórek
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A8412	do przygotowania PBS z 1% BSA stosowany w myciu komórek podczas izolacji
CD19-APC700	Beckman Coulter	B49212	ludzki marker komórek B
CD20-APC	Beckman Coulter	A21693	ludzki marker komórek pan-B
CD20-ECD	Beckman Coulter	IM3607	ludzki marker komórek pan-B
CD5-PC 5.5	Beckman Coulter	PN A70203	ludzki marker
CD23-PE	Pharmingen	555711	Białko powierzchniowe komórki zwykle nieobecne w MCL
CD45 KO	Beckman Coulter	B36294	Marker pan-leukocytów
CD200-PE	Pharmingen	552475	Białko powierzchniowe komórki zwykle nieobecne u myszy MCL
NOD scid gamma (NSG)	Charles River Laboratories	5557	użyte do opracowania ksenoprzeszczepów MCL w tym badaniu
Easy sep Zestaw do wzbogacania ludzkich komórek B Technologie	komórek macierzystych	19054	stosowany do wzbogacania komórek B w celu uzyskania czystych komórek do wstrzykiwania myszom
FACS	Beckman Coulter	Navios	używany do charakteryzowania próbki MCL i badania narządów do wszczepienia MCL:
1X bufor potasu chlorku amonu,			bufor do czerwonej krwi (NH4Cl, 8,024 mg / l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA. Na2 i middot; 2H2O 3,722 mg/l )

komórek T