Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wraz z rosnącym zainteresowaniem mikrośrodowiskiem guza, postanowiliśmy opracować metodę szczegółowego określania składników mikrośrodowiska w próbkach pobranych od pacjentów glejaka, najbardziej śmiertelnego i inwazyjnego raka mózgu. Metody ilościowe są nie tylko korzystne dla dokładnego opisu chorych tkanek, ale mogą również potencjalnie przyczynić się do dokładniejszego prognozowania, diagnozowania i opracowywania systemów inżynierii tkankowej i zamienników. W glejaku komórki glejowe, takie jak mikroglej i astrocyty, zostały niezależnie skorelowane ze złym rokowaniem na podstawie oceny patologów. Jednak stan tych komórek i innych składników komórek glejowych nie został dobrze opisany ilościowo. Może to być trudne ze względu na duże procesy, które znaczą te komórki glejowe. Ponadto większość analiz histologicznych koncentruje się na całej próbce tkanki lub tylko w obrębie większości guza, w przeciwieństwie do wyznaczania kwantyfikacji na podstawie regionów w wysoce niejednorodnej tkance. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i ilościowej analizy populacji komórek glejowych w masie guza i sąsiednich regionach resekcji guza od pacjentów z glejakiem. Użyliśmy immunohistochemii chromogennej do identyfikacji populacji komórek glejowych w resekcjach guza u pacjentów oraz ImageJ do analizy procentowego pokrycia barwienia dla każdej populacji glejowej. Dzięki tym technikom jesteśmy w stanie lepiej opisać komórki glejowe we wszystkich regionach mikrośrodowiska guza glejaka.
Wprowadzenie
Glejak wielopostaciowy (GBM), najczęstszy i najbardziej złośliwy nowotwór mózgu, charakteryzuje się wysoce rozproszoną inwazją od pierwotnej masy guza do otaczającego zdrowego miąższu mózgu1,2. Ta rozproszona inwazja sprawia, że guz jest szczególnie trudny do pełnej resekcji, a atakujące komórki rakowe, które pozostają po terapii, są najczęstszą przyczyną nieuniknionego nawrotu2,3,4. Wcześniej stwierdziliśmy, że hamowanie inwazji komórek glejaka rozlanego jest korzystne terapeutycznie5, jednak ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół identyfikuje składniki komórkowe w próbkach zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, co jest typowe dla próbek pacjentów klinicznych przechowywanych w banku. Osadzanie parafiny pozwala na najlepsze utrzymanie morfologii komórek i tkanek, a także ma lepszą trwałość skrawków. Dostęp do próbek wykorzystanych do tej analizy uzyskano za pośrednictwem University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Próbki pacjentów zostały wybrane przez neuropatologa na podstawie ostatecznej diagnozy glejaka (gwiaździaka, IV stopień wg WHO), który przeszedł resekcje guza na Uniwersytecie Wirginii w latach 2010-2013 i zostały pozbawione identyf....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Do niniejszej analizy wybrano dwa obszary zainteresowania w obrębie wyciętych guzów – główną masę guza oraz obszary przyległe, składające się głównie z tkanki zdrowej z rozproszonymi naciekami komórek nowotworowych (Rycina 1A, 1B), które zostały zidentyfikowane przez współpracujących neuropatologów na próbkach pacjentów barwionych hematoksyliną i eozyną. W każdej próbce pacjenta zidentyfikowano pozytywne barwienie astrocytów (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Proponowana przez nas metoda to ilościowe podejście do analizy próbek histologicznych barwionych przy użyciu tradycyjnej immunohistochemii chromogennej. Obecna metodologia tego typu analizy obejmuje podobne protokoły barwienia, po których następuje klasyfikacja przez niezależnych patologów. Metoda ta okazała się niezawodna, jednak w przypadku wielu zastosowań wymagane jest bardziej precyzyjne zrozumienie składu komórkowego, takie jak lepsze zrozumienie heterogeniczności związanej z nowotworami i dokładna rekapitulacja gu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy dziękują doktorom Fahadowi Bafakihowi i Jimowi Mandellowi za pobranie i identyfikację próbek od pacjentów, Garrettowi F. Beeghly'emu za pomoc w immunohistochemii, a także Biorepository and Tissue Research Facility, Cardiovascular Research Center Histology Core oraz Biomolecular Analysis Facility na University of Virginia za pomoc w pozyskiwaniu próbek, immunohistochemii i obrazowaniu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Etanol | |||
| Roztwór demaskujący antygen o wysokim pH | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Surowica | |||
| Anti-ALDH1L1 | ABCAM | ab56777 | |
| Anty-Iba1 | ABCAM | ab5076 | |
| Białko specyficzne dla anty-oligodendrocytów1 | ABCAM | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anty-myszy/królika) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Nadtlenek wodoru | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT Podłoże DAB | Vector Labs | SK-4105 | |
| Barwnik hematoksylinowy | ThermoScientific | 72404 | |
| Nośnik montażowy Histochoice | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
Bibliografia
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., D....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
