Artykuł metodologiczny

Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

DOI:

10.3791/56025

⸱

31 lipca 2017

 , 
1Biomedical Engineering, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z rosnącym zainteresowaniem mikrośrodowiskiem guza, postanowiliśmy opracować metodę szczegółowego określania składników mikrośrodowiska w próbkach pobranych od pacjentów glejaka, najbardziej śmiertelnego i inwazyjnego raka mózgu. Metody ilościowe są nie tylko korzystne dla dokładnego opisu chorych tkanek, ale mogą również potencjalnie przyczynić się do dokładniejszego prognozowania, diagnozowania i opracowywania systemów inżynierii tkankowej i zamienników. W glejaku komórki glejowe, takie jak mikroglej i astrocyty, zostały niezależnie skorelowane ze złym rokowaniem na podstawie oceny patologów. Jednak stan tych komórek i innych składników komórek glejowych nie został dobrze opisany ilościowo. Może to być trudne ze względu na duże procesy, które znaczą te komórki glejowe. Ponadto większość analiz histologicznych koncentruje się na całej próbce tkanki lub tylko w obrębie większości guza, w przeciwieństwie do wyznaczania kwantyfikacji na podstawie regionów w wysoce niejednorodnej tkance. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i ilościowej analizy populacji komórek glejowych w masie guza i sąsiednich regionach resekcji guza od pacjentów z glejakiem. Użyliśmy immunohistochemii chromogennej do identyfikacji populacji komórek glejowych w resekcjach guza u pacjentów oraz ImageJ do analizy procentowego pokrycia barwienia dla każdej populacji glejowej. Dzięki tym technikom jesteśmy w stanie lepiej opisać komórki glejowe we wszystkich regionach mikrośrodowiska guza glejaka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glejak wielopostaciowy (GBM), najczęstszy i najbardziej złośliwy nowotwór mózgu, charakteryzuje się wysoce rozproszoną inwazją od pierwotnej masy guza do otaczającego zdrowego miąższu mózgu1,2. Ta rozproszona inwazja sprawia, że guz jest szczególnie trudny do pełnej resekcji, a atakujące komórki rakowe, które pozostają po terapii, są najczęstszą przyczyną nieuniknionego nawrotu2,3,4. Wcześniej stwierdziliśmy, że hamowanie inwazji komórek glejaka rozlanego jest korzystne terapeutycznie5, jednak niewiele wiadomo o złożonych mechanizmach przyczyniających się do inwazji GBM. Mikrośrodowisko guza, czyli tkanka otaczająca nowotwór, jest zaangażowana w progresję nowotworów w wielu nowotworach6,7. W szczególności mikrośrodowisko guza glejaka jest stosunkowo słabo scharakteryzowane i jest wyjątkowo złożone, składa się z wielu komórek glejowych, takich jak astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty, a także macierzy zewnątrzkomórkowej, czynników rozpuszczalnych i czynników biofizycznych. Eksperymentalnie wykazano, że astrocyty i mikroglej zwiększają progresję i inwazję glejaka8,9,10, ale skład wszystkich komórek glejowych w rodzimym mikrośrodowisku ludzkiego mózgu jest nieznany.

Wcześniej pokazaliśmy, że komponenty mikrośrodowiskowe mogą przewidywać przeżycie pacjenta, analizując ilościowo komponenty komórkowe mikrośrodowiska glejaka i włączając nasze analizy do modelu proporcjonalnego ryzyka11. W tym miejscu opisujemy metodę analizy ilościowej służącą do identyfikacji populacji komórek glejowych w masie guza i sąsiednich regionach resekcji guza od pacjentów z glejakiem. Użyliśmy immunohistochemii chromogennej do identyfikacji populacji komórek glejowych i ImageJ do analizy procentowego pokrycia barwienia dla każdej populacji glejowej. Ocena procentowego pokrycia tworzy prosty pomiar do określania różnic morfologicznych komórek, szczególnie tych dotkniętych interakcjami z komórkami nowotworowymi. Wcześniejsze badania nad ilościowym określaniem barwienia histopatologicznego wykorzystują standardowe barwienie, takie jak hematoksylina i eozyna12 lub Masson's trichrome13, które nie wykorzystują specyficzności barwienia immunohistochemicznego opartego na przeciwciałach. Nasza metoda została opracowana w celu bezpośredniego ilościowego określenia populacji glejowych w resekcjach guza u pacjentów z glejakiem, które zamierzamy wykorzystać do wyjaśnienia złożonego mikrośrodowiska glejaka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół identyfikuje składniki komórkowe w próbkach zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, co jest typowe dla próbek pacjentów klinicznych przechowywanych w banku. Osadzanie parafiny pozwala na najlepsze utrzymanie morfologii komórek i tkanek, a także ma lepszą trwałość skrawków. Dostęp do próbek wykorzystanych do tej analizy uzyskano za pośrednictwem University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Próbki pacjentów zostały wybrane przez neuropatologa na podstawie ostatecznej diagnozy glejaka (gwiaździaka, IV stopień wg WHO), który przeszedł resekcje guza na Uniwersytecie Wirginii w latach 2010-2013 i zostały pozbawione identyfikacji przed tą analizą11.

1. Deparafinizacja i ponowne nawodnienie próbki FFPE

UWAGA: Ta część protokołu jest specyficzna dla próbek FFPE. Podczas gdy próbki zatopione w parafinie mogą być bardziej przydatne do tej analizy ze względu na zachowanie morfologii komórek i tkanek, analizę tę można również przeprowadzić w przypadku zamrożonych skrawków. W przypadku stosowania zamrożonych skrawków tę część można pominąć i przejść bezpośrednio do immunohistochemii chromogennej.

  1. Wykonaj następujące prania przez 5 minut każde: Ksylen, Ksylen, 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 95% etanol, 70% etanol, woda dejonizowana, woda dejonizowana

2. Pobieranie antygenu

UWAGA: Ta część protokołu jest niezbędna do przerwania mostków metylenowych powstałych podczas utrwalania formaliny w próbkach FFPE i odsłonięcia miejsc antygenowych do wiązania przeciwciał.

  1. Rozcieńczyć roztwór demaskujący antygen o wysokim pH na bazie Tris zgodnie z zaleceniem producenta w wodzie destylowanej.
  2. Wykonaj pobieranie antygenu za pośrednictwem ciepła za pomocą kuchenki mikrofalowej. Inne formy odzyskiwania za pośrednictwem ciepła (takie jak szybkowar, parowar do warzyw lub wrząca woda) również wystarczą.
    1. Dodać rozcieńczony roztwór demaskujący do nieszczelnego naczynia nadającego się do kuchenki mikrofalowej. Umieść szkiełka w naczyniu. Umieść szkiełka w kuchence mikrofalowej.
    2. Gotować przez 20 minut na dużej mocy. Monitoruj poziom cieczy pod kątem parowania i w razie potrzeby uzupełniaj wodą destylowaną.
  3. Pozostawić próbki do ostygnięcia w roztworze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

3. Immunohistochemia chromogenna

  1. Obrysuj próbkę tkanki pisakiem hydrofobowym, aby zminimalizować objętość odczynników niezbędnych do pokrycia próbki.
    UWAGA: Upewnij się, że próbki tkanek są nawodnione i nie pozwól im wyschnąć, ponieważ wpłynie to na skuteczność barwienia.
  2. Odpipetować wystarczającą ilość roztworu do przepuszczalności (sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) + 0,01% Triton-X), aby pokryć próbkę tkanki (zwykle około 100 - 200 μl).
  3. Usuń i wyrzuć roztwór, a następnie powtórz krok 3.2.
  4. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (2,5% surowica końska + roztwór permeabilizacyjny).
  5. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym.
    UWAGA: Wszystkie użyte tutaj przeciwciała pierwszorzędowe są rozcieńczane w stosunku 1:200, ale optymalne rozcieńczenia można określić za pomocą seryjnych rozcieńczeń, zaczynając od zalecenia producenta. Szczegółowe informacje na temat przeciwciał stosowanych w tym protokole zostały wcześniej opublikowane11.
  6. Wykryć przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą odczynnika polimerowego peroksydazy chrzanowej odpowiadającego głównemu przeciwciału u zwierzęcia gospodarza, zgodnie z protokołem producenta.
  7. Odpipetować wystarczającą ilość roztworu do przepuszczalności, aby pokryć próbkę tkanki i inkubować przez 5 minut.
  8. Usuń i wyrzuć roztwór, a następnie powtórz krok 3.7.
  9. Inkubować szkiełka w 0,3% H2O2 w 1x TBS przez 15 min.
  10. Opracowywać próbki z substratem peroksydazy diaminobenzydyny (DAB) przez 2 - 10 minut, aż do uzyskania pożądanej intensywności barwienia.
  11. Próbki barwienia przeciwstawnego w celu identyfikacji jąder komórkowych, takich jak hematoksylina, zgodnie z protokołem producenta.
  12. Odwodnić próbki 100% etanolem i ksylenem.
  13. Zamontuj próbki na stałe za pomocą nośników montażowych.

4. Identyfikacja regionów zainteresowania

  1. Preparaty obrazowe w mikroskopii jasnego pola zdolne do wykonywania obrazów o wysokiej rozdzielczości.
    UWAGA: Używaj komponentów komórkowych do obrazowania w rozdzielczości co najmniej 20x.
  2. Przesuń kamerę do określonych obszarów zainteresowania w próbkach tkanek.
  3. Zapisywanie obrazów jako plików TIFF w celu oceny ilościowej.

5. Analiza obrazu

  1. Otwórz obrazy w ImageJ, aby określić ilościowo procentowe pokrycie.
  2. Użyj wtyczki Threshold Colour, aby usunąć fioletowy kolor z jąder barwionych hematoksyliną.
  3. Konwertuj obraz na 8-bitowy.
  4. Dodaj próg bez ciemnego tła.
  5. Przetwarzaj obraz przy użyciu jednego z 17 wstępnie załadowanych filtrów progowych ImageJ (tj. MaxEntropy), tak aby tylko fragmenty barwione DAB były uwzględniane w progu.
    UWAGA: Wybierz optymalny, wstępnie załadowany filtr progowy, który minimalizuje uwzględnianie barwienia tła. Może to zależeć od jakości barwienia i swoistości przeciwciała. Stosować ten sam próg dla wszystkich kontrprób technicznych w każdej próbce pacjenta.
  6. Zastosuj próg.
  7. Zmierz procentową powierzchnię obrazu z progiem.
  8. Średni procent pokrycia obszaru dla wielu regionów w każdej próbie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na potrzeby tej analizy, dwa obszary zainteresowania w obrębie naszych resekcji guza - masa guza pierwotnego i regiony przyległe, głównie składające się ze zdrowej tkanki z rozproszonymi atakującymi komórkami rakowymi (Rysunek 1A, 1B) - zostały zidentyfikowane przez współpracujących neuropatologów na próbkach pacjentów barwionych hematoksyliną i eozyną. W każdej próbce pacjenta zidentyfikowano dodatnie barwienie astrocytów (Figura 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proponowana przez nas metoda to ilościowe podejście do analizy próbek histologicznych barwionych przy użyciu tradycyjnej immunohistochemii chromogennej. Obecna metodologia tego typu analizy obejmuje podobne protokoły barwienia, po których następuje klasyfikacja przez niezależnych patologów. Metoda ta okazała się niezawodna, jednak w przypadku wielu zastosowań wymagane jest bardziej precyzyjne zrozumienie składu komórkowego, takie jak lepsze zrozumienie heterogeniczności związanej z nowotworami i dokładna rekapitulacja gu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują doktorom Fahadowi Bafakihowi i Jimowi Mandellowi za pobranie i identyfikację próbek od pacjentów, Garrettowi F. Beeghly'emu za pomoc w immunohistochemii, a także Biorepository and Tissue Research Facility, Cardiovascular Research Center Histology Core oraz Biomolecular Analysis Facility na University of Virginia za pomoc w pozyskiwaniu próbek, immunohistochemii i obrazowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
XyleneFisher ChemicalX3P
Etanol
Roztwór demaskujący antygen o wysokim pHVector LabsH-3301
TBS
Triton-XAmresco9002-93-1
Surowica
Anti-ALDH1L1 ABCAM ab56777
Anty-Iba1 ABCAM ab5076
Białko specyficzne dla anty-oligodendrocytów1 ABCAM ab53041
ImmPRESS anti-goatVector LabsMP-7405
ImmPRESS Universal (anty-myszy/królika)Vector LabsMP-7500
Nadtlenek wodoruSigma Aldrich216763
ImmPACT Podłoże DABVector LabsSK-4105
Barwnik hematoksylinowyThermoScientific72404
Nośnik montażowy HistochoiceAmrescoH157-475
Aperio ScanscopeLeica Biosystems
Image ScanscopeLeica Biosystems
Super HT PAP PenResearch Products International195506
dla koni

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  3. Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
  4. Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
  5. Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36(2012).
  6. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
  7. Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
  8. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
  9. Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
  10. Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
  11. Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
  12. Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
  13. Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
  14. Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
  15. Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
  16. Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
  17. Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
  18. Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
  19. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
  20. Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
  21. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
  22. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
  23. Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
  24. Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Glioblastoma Tumor MicroenvironmentChromogenic ImmunohistochemistryImageJ AnalysisGlial Cell QuantificationPatient Tumor ResectionsAntigen RetrievalPermeabilization SolutionPrimary AntibodiesDAB SubstrateHematoxylin Counterstain

Powiązane artykuły