Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Summary

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Abstract

Użycie wskaźników wapnia znacznie poszerzyło nasze zrozumienie dynamiki i regulacji neuronów. Nicień Caenorhabditis elegans, ze swoim całkowicie zmapowanym układem nerwowym i przezroczystą anatomią, stanowi idealny model do zrozumienia dynamiki neuronalnej w czasie rzeczywistym przy użyciu wskaźników wapnia. W połączeniu z technologiami mikroprzepływowymi i projektami eksperymentalnymi, badania obrazowania wapnia z wykorzystaniem tych wskaźników są przeprowadzane zarówno u zwierząt poruszających się swobodnie, jak i uwięzionych. Jednak większość wcześniejszych badań wykorzystujących urządzenia do łapania, takie jak chip węchowy opisany w Chronis i wsp., ma urządzenia przeznaczone do stosowania u bardziej powszechnego hermafrodyty, ponieważ rzadziej spotykany samiec jest różny zarówno morfologicznie, jak i strukturalnie. Zaprojektowano i wyprodukowano dostosowany chip węchowy w celu zwiększenia wydajności obrazowania neuronów samców z wykorzystaniem młodych dorosłych zwierząt. Do portu ładowania robaków włączono obrót, aby obrócić zwierzęta i umożliwić rozdzielenie poszczególnych neuronów w dwustronnej parze w obrazowaniu 2D. Robaki są wystawione na kontrolowany przepływ środka zapachowego w urządzeniu mikroprzepływowym, jak opisano w poprzednich badaniach hermafrodytów. Przejściowe stany nieustalone wapnia są następnie analizowane za pomocą oprogramowania open source ImageJ. Opisana w niniejszym dokumencie procedura powinna pozwolić na zwiększenie liczby badań obrazowania wapnia u mężczyzn C. elegans, pogłębiając nasze zrozumienie mechanizmów sygnalizacji neuronalnej specyficznej dla płci.

Introduction

Urządzenia mikroprzepływowe zapewniają zwiększony dostęp do precyzyjnie kontrolowanych środowisk, w których zwierzęta, takie jak nicienie C. elegans, mogą być eksperymentalnie manipulowane¹. Badania te obejmują testy behawioralne, badania obrazowania wapnia, a nawet badania przesiewowe pod kątem określonych fenotypów, co skutkuje dokładniejszymi pomiarami wyników eksperymentalnych^1,2,3,4,5,6. Mikrofluidyka zapewnia ciekłe warunki na małą skalę, w których można przeprowadzać szczegółowe eksperymenty przy użyciu minimalnych ilości odczynników. Nieustannie powstają nowe projekty urządzeń mikroprzepływowych, a zastosowanie każdego z nich jest różne, od aren, które pozwalają na naturalny sinusoidalny ruch C. elegans w testach behawioralnych i badaniach obrazowania neuronalnego, przez urządzenia pułapkowe stosowane w obrazowaniu neuronalnym i badaniach węchowych, po urządzenia, które pozwalają na wysokoprzepustową analizę fenotypową w genetycznych badaniach przesiewowych4^{, 5,6,7}. Po wyprodukowaniu formy wzorcowej, urządzenia mikroprzepływowe są niedrogie w budowie - biorąc pod uwagę możliwość wielokrotnego użycia wzorca - i łatwe w użyciu, co pozwala na szybkie generowanie danych za pomocą badań o wysokiej przepustowości. Wytwarzanie urządzeń z wykorzystaniem polimerów takich jak polidimetylosiloksan (PDMS) pozwala na tworzenie nowych urządzeń w ciągu kilku godzin.

Badania obrazowania wapnia wykorzystują genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) wyrażane w komórkach docelowych do pomiaru dynamiki neuronalnej tych komórek w czasie rzeczywistym8^,9,10,11. Przezroczysta natura C. elegans pozwala na rejestrację poziomów fluorescencyjnych tych białek u żywych zwierząt. Tradycyjnie, GECI opierają się na czujniku GFP-Calmodulin-M13 Peptide (GCaMP) opartym na białku zielonej fluorescencji (GFP), chociaż nowsze badania dostosowały te czujniki, aby umożliwić lepsze proporcje sygnału do szumu i profile wzbudzenia przesunięte ku czerwieni. Po opracowaniu GCaMP3 białka o tych specyfikacjach różniły się, w tym czujniki takie jak GCaMP6s i GCaMP6f (odpowiednio wolne i szybkie wskaźniki fluorescencji), a także peptyd RFP-Calmodulin-M13 (RCaMP), który ma przesunięty ku czerwieni profil aktywacji. Połączenie tych GECI z sekwencjami promotora genów specyficznych dla komórek C. elegans może celować w komórki będące przedmiotem zainteresowania, w szczególności neurony czuciowe^{12,13,14,15,16}.

Chociaż łatwość użycia C. elegans w badaniach mikroprzepływowych jest oczywista, prawie wszystkie badania koncentrowały się na hermafrodytach. Pomimo tego, że samce stanowią tylko 0,01-0,02% populacji typu dzikiego, ich charakterystyka może przynieść bezcenne wnioski. Podczas gdy fizyczny konektom hermafrodytycznego układu nerwowego jest w pełni zmapowany od dziesięcioleci¹⁷, konektom męski pozostaje niekompletny, zwłaszcza w obszarze głowy zwierzęcia¹⁸. Zastosowanie obrazowania wapnia u mężczyzn pomoże w zrozumieniu męskiego układu nerwowego i różnic pojawiających się między obiema płciami. Mniejszy rozmiar dorosłych samców C. elegans zapobiega skutecznemu i niezawodnemu chwytaniu w portach załadunkowych tradycyjnych urządzeń węchowych przeznaczonych dla większych hermafrodytów. Aby temu zaradzić, opracowano zmodyfikowaną wersję Chronis Olfactory Chip¹⁹ z węższym portem ładowania, niższą wysokością kanału i zakrętami w porcie ładowania robaków (które obracają zwierzę), co pozwala na wizualizację obustronnych par neuronów lewo-prawostronnych. Konstrukcja ta pozwala: (1) na skuteczne chwytanie młodych dorosłych samców, (2) bardziej wiarygodną orientację zwierzęcia w celu wizualizacji obu członków obustronnie sparowanych neuronów oraz (3) precyzyjne obrazowanie aktywności neuronalnej w neuronach męskich.

Coraz częściej badania pokazują, że samce C. elegans reagują inaczej niż hermafrodyty na różne askarozydy (ascr) lub feromony nicieni^{20,21,22,23,24}. W związku z tym zrozumienie dynamiki i reprezentacji neuronalnych w męskim konektomie stało się jeszcze bardziej istotne. Samce C. elegans zawierają 87 neuronów specyficznych dla płci, które nie występują w hermafrody25^,26, zmieniając konektom w jeszcze nieokreślony sposób. Możliwość zobrazowania tej unikalnej dynamiki neuronalnej pozwoli nam lepiej zrozumieć reakcje i reprezentacje neuronalne specyficzne dla płci.

Ten protokół opisuje użycie męskiego chipa węchowego do obrazowania neuronalnego męskiej chemosensacji C. elegans. Neuron nocyceptywny ASH niezawodnie reaguje na 1 M glicerolu u mężczyzn, co jest zgodne z poprzednimi badaniami hermafrodytycznymi²⁷. Narażenie na askarozydy może wywołać reakcje, które są różne w zależności od zwierzęcia, co wymaga przetestowania większej liczby zwierząt. Odpowiedź neuronów CEM specyficznych dla mężczyzn została wcześniej wykazana, zarówno przez badania elektrofizjologii, jak i obrazowania wapnia, na zmienną reakcję na askarozyd #3²³.

Protocol

1. Produkcja urządzeń

UWAGA: Zobacz reference¹.

UWAGA: Formy wzorcowe krzemu zostały wyprodukowane przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych do wzorowania fotorezystu SU-8 na krzemowym master^1,7. Fotomaski do wzorowania wafli zostały wydrukowane w rozdzielczości 25 000 dpi. Urządzenie przystosowane do potrzeb mężczyzn posiada projekt Chronis Olfactory Chip¹⁹ ze zmianą portu ładowania robaków, adaptując projekt uzyskany od M. Zimmera (prywatna korespondencja, 2016). W zestawie znajduje się tura, która kontroluje rotację zwierząt. Szerokość kanału portu załadowczego ślimaka jest zwężona do 50 μm. Wszystkie kanały mają wysokość 32 μm. Gdy główna forma krzemowa jest dostępna dla użytkownika, użytkownik może postępować zgodnie z kolejnym protokołem, jak opisano wcześniej¹.

1. Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1.
2. Dokładnie wymieszać za pomocą pipet transferowych.
3. Odgazowywać mieszaninę w eksykatorze próżniowym przez 1 godzinę, aż do usunięcia wszystkich widocznych pęcherzyków.
4. Wlej mieszaninę na silikonową formę wzorcową w naczyniu o średnicy 150 mm, aż osiągnie grubość 5 mm (100 g). Użyj pipety Pasteura, aby usunąć wszelkie pęcherzyki lub kurz, które zostały wprowadzone do mieszaniny.
5. Piec w temperaturze 65°C przez co najmniej 3 godziny lub przez noc.
6. Odetnij PDMS od formy za pomocą skalpela i odetnij oddzielne urządzenia za pomocą żyletki.
7. Przebić otwory wlotowe i wylotowe za pomocą stempla skórnego o średnicy 1 mm.
8. Przepłucz otwory dH₂O, etanolem i ponownie dH₂O, aby usunąć cząstki z stempli. Osuszyć urządzenie w impulsie strumienia powietrza.
9. Wyczyść obie strony kanału i górną stronę urządzenia taśmą samoprzylepną, usuwając kurz i zanieczyszczenia pozostałe na urządzeniu, aby umożliwić pomyślne połączenie.
10. Przymocuj plazmowo urządzenie, kanałem do dołu, do szkła osłonowego nr 1.
    1. Wystaw szkło nakrywkowe i urządzenie (kanałem do góry) na działanie plazmy powietrznej w warunkach pozwalających na prawidłowe połączenie, takich jak 100 W przez 30 s lub 24 W przez 60 s.
       UWAGA: Ustawienia można dostosować, aby poprawić wydajność wiązania. Warunki wiązania plazmowego nie są tak krytyczne, jak prawidłowe czyszczenie, gdy próbuje się poprawić wydajność wiązania. Niedostatecznie oczyszczone urządzenie nie będzie się wiązać, nawet w idealnych warunkach plazmowych.
    2. Odwróć szklankę nakrywkową na stronę kanału urządzenia i dociśnij kciukiem przez 5 sekund.

2. Przygotowanie bufora

1. Rozcieńczyć 1x S Basal (100 mM NaCl i 0,05 M KPO₄, pH 6,0) ze sterylnego 10x bulionu.
2. Rozcieńczyć 1 M tetramizolu do końcowego stężenia 1 mM w 1x S Basal dla wszystkich roztworów buforowych.
3. Dodaj fluoresceinę zarówno do zbiornika "kontroli przepływu", jak i "buforowego".
   1. Stwórz zapas 100 mg/ml fluoresceiny w 1x S Basal.
   2. Rozcieńczyć materiał podstawowy do końcowych stężeń 1 μg/ml w regulatorze przepływu i 0,1 μg/ml w buforze.
4. Twórz bodźce.
   1. Rozcieńczyć glicerol do końcowego stężenia 1 M w 1X S Basal.
   2. Rozcieńczyć ascaroside #3 (ascr#3) do końcowego stężenia 1 μM w 1X S Basal.

3. Konfiguracja urządzenia

UWAGA: Zobacz¹.

Rysunek 1. Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego. (A) Zbiorniki i przewody. Strzykawka o pojemności 30 ml bez tłoka służy jako "zbiornik". Jest on podłączony do zaworu Luer z trzema opcjami przepływu. Jeden wylot jest podłączony do strzykawki o pojemności 3 ml z tłokiem, podczas gdy drugi jest podłączony do igły (pomarańczowej), która jest wkładana do rurki łączącej się z urządzeniem mikroprzepływowym. (B) Ogólna konfiguracja eksperymentu z obrazowaniem mikroprzepływowym. Urządzenie umieszcza się na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, nad soczewkami obiektywu. Bufor "kontroli przepływu" przepływa przez zawór 3-drogowy, który jest sterowany przez jednostkę umieszczoną na półce nad zestawem. Linie zawierające są następnie wstawiane do odpowiednich portów urządzenia. (C) Porty urządzenia mikroprzepływowego. Porty "kontroli przepływu" otaczają inne porty wlotowe: porty "bodźca" i "bufora". Port "wylotowy" to port wysunięty po prawej stronie. Ze względu na lokalizację areny ładowania robaków, port "ładowania robaka" jest najbardziej centralnym portem w urządzeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotuj trzy zbiorniki płynu, podłączając strzykawkę o pojemności 30 lub 60 ml do 3-drogowego zaworu Luer, ze strzykawką 3 ml i igłą przymocowanymi również do zaworu Luer (jak w Rysunek 1A). Podłącz igłę do rurki, która rozciąga się do urządzenia mikroprzepływowego (jak w Rysunek 1A-B).
2. Usuń pęcherzyki powietrza ze zbiornika i przewodów.
3. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml dołączoną rurką z 1x S Basal i włóż ją do portu wylotowego.
4. Delikatnie docisnąć strzykawkę, aż bufor pojawi się w górnej części otworów wlotowych.
5. Podłącz rurkę sterującą przepływem, bufor i rurkę bodźca do odpowiednich otworów wlotowych (jak w Rysunek 1B-C), upewniając się, że krople cieczy są obecne zarówno w otworze portu ładowania, jak i w rurce buforowej, która ma być podłączona.
6. Ponownie delikatnie dociśnij strzykawkę, która jest podłączona do portu wylotowego, aż pojawią się kropelki na wlocie portu ładowania ślimaka.
7. Włóż solidny kołek blokujący do portu ładowania ślimaka.
8. Wyjmij strzykawkę z portu wylotowego i podłącz przewód wylotowy podłączony do odkurzacza domowego (-670 Torr).
9. Sprawdź urządzenie pod kątem pęcherzyków powietrza w kanałach przepływowych, wizualnie i poprzez potwierdzenie wideo za pomocą oprogramowania kompatybilnego z używaną kamerą, takiego jak oprogramowanie typu open source Micro-Manger. Zobacz krok 6, aby uzyskać wskazówki dotyczące korzystania z Micro-Manager.
   1. Jeśli obecne są jakiekolwiek pęcherzyki, poczekaj, aż usuną się lub zostaną wchłonięte przez ścianę PDMS przed załadowaniem jakichkolwiek zwierząt; obecność pęcherzyków zakłóci prawidłowy przepływ płynów przez urządzenie.
10. Za pomocą filtra GFP należy potwierdzić prawidłową dynamikę przepływu w urządzeniu przed załadowaniem ślimaka, uruchamiając zawór 3-drogowy i obserwując przełączanie.
    1. Określ właściwą dynamikę przepływu: obserwuj, jak fluoresceina obecna w roztworach kontrolnych i buforowych przepływu (Rysunek 2D-2E) zmienia się, gdy wartość sterowania przepływem jest zmieniana przez naciśnięcie przycisku sterującego odpowiadającego zaworowi 3-drogowemu w oprogramowaniu regulatora perfuzji (Rysunek 1B).
    2. Po otwarciu Micro-Managera kliknij "Na żywo", aby obserwować obraz urządzenia na żywo. Włącz fluorescencyjne źródło światła, aby obserwować przepływ w urządzeniu (Rysunek 2D-2E).

Ryc. 2: Mikroprzepływowy chip węchowy przystosowany do potrzeb samców. (A) Wzorce przepływu urządzenia, gdy robak jest wystawiony na działanie bufora. Bufor (B) jest pokazany na brązowo, a kontrola przepływu (FC) jest pokazana na żółto, z bodźcem (S) na białym. Port ładowania ślimaka został przystosowany do uwzględnienia krzywej, co pozwala na lepszą kontrolę orientacji ślimaka. (B) Wzorce przepływu urządzenia, gdy robak jest wystawiony na działanie bodźca. Bufor (B) jest pokazany na brązowo, a kontrola przepływu (FC) jest pokazana na żółto, z bodźcem (S) na białym. (C) Pomiary przystosowanego urządzenia w postaci, w jakiej zostało wyprodukowane. Port ładowania ślimaka zakończony jest otworem o średnicy 42 μm, z kanałem o średnicy 50 μm zaprojektowanym dla szerokości męskiej. Zmierzona wysokość kanałów wynosi 32 μm, mimo że w projekcie docelowo było to 25 μm. (D-E) Uwięziony samiec wyrażający p-6::GCaMP3. Promotor -6 nie jest specyficzny dla ASH i można zaobserwować pewną ekspresję w neuronie ASI, chociaż w ASI nie zaobserwowano żadnych stanów przejściowych wapnia. Obraz jest (D) kombinacją jasnego pola i oświetlenia fluorescencyjnego, podczas gdy (E) jest tylko fluorescencyjny. Paski skali oznaczają 42 μm. (F) Neuron ASH reaguje na stymulację 1 M glicerolem z silną aktywnością neuronalną. Niebieski obszar oznacza czas bodźca 1 M glicerolu. Zacieniony obszar oznacza błąd standardowy, gdzie n = 20 impulsów z siedmiu robaków. Czerwone ślady oznaczają reakcje depolaryzacyjne. Osie Y pokazują ΔF/F₀. Podziałka wskazuje 5 s. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Zobacz reference²³.

1. Obrazowanie odpowiedzi ASH na 1 M glicerol.
   1. Umieść około 20 samców C. elegans, które są dodatnie dla ekspresji tablicy p-6::GCaMP3, na płytce agarowej pożywki do wzrostu nicieni (NGM) obsianej trawnikiem OP50 E. coli. Stosować ekspresję fluorescencyjnego GECI i/lub markera do jednoczesnego wstrzykiwania w celu identyfikacji zwierząt z dodatnim wynikiem wstrzyknięcia.
      UWAGA: Zwierzęta z dodatnim wynikiem matrycy będą fluoryzować zgodnie z zastosowanym GECI (tj. zwierzęta wykazujące ekspresję GCaMP będą fluoryzować na zielono pod wpływem stymulacji światłem niebieskim, podczas gdy zwierzęta z dodatnim wynikiem RCaMP będą fluoryzować na czerwono pod wpływem stymulacji światłem zielonym). Markery do jednoczesnego wstrzykiwania mogą obejmować zarówno inne białka fluorescencyjne, takie jak GFP i RFP, jak i markery fenotypowe, takie jak rol-6, lub mogą uratować dominujący fenotyp, taki jak mutacja pha-1²⁸.
      1. W przypadku zbioru bezpośrednio przed testem należy wybrać młode dorosłe samce. W przypadku zbioru w dniu poprzedzającym badanie, należy wybrać samce larw L4.
2. Obrazowanie odpowiedzi CEM na 1 μM ascr#3.
   1. Wybierz około 20 samców L4 C. elegans (fkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; FAZ-1 (E2123TS); HIM-5 (E1490); lite-1 (ce314)), które są dodatnie dla ekspresji markera współiniekcji dsRed.
      UWAGA: ekspresja dsRed w neuronach promieniowych męskiej opowieści jest łatwiejsza do zaobserwowania i potwierdzenia niż ekspresja GCaMP w czterech neuronach CEM.
   2. Odizoluj te samce od hermafrodytów na płytce agarowej NGM obsianej trawnikiem OP50 E. coli przez 5-14 godzin przed wykonaniem eksperymentu obrazowania.
      UWAGA: Samce, które nie są izolowane przez co najmniej 5 godzin, nie reagują behawioralnie na ascr#3 i dlatego mogą wykazywać jeszcze mniej stanów przejściowych wapnia na askarozyd niż obserwowano tutaj.

5. Ładowanie zwierząt

UWAGA: Zobacz refefence¹.

1. Zbierz jednego robaka na nieobsianą płytkę agarową NGM, stosując standardowe techniki konserwacji robaków.
   1. Zbieraj robaki, paląc kilofa (wykonanego ze spłaszczonego drutu platynowego), zbierając bakterie na kilofie i "dźgając" robaka, aby go podnieść. Delikatnie umieść robaka na nowej płytce, pozwalając mu sam się odczołgać.
2. Dodaj około 5 ml 1x S Basal do płytki bez nasion, tak aby płytka została zalana.
3. Wciągnij robaka do strzykawki ładującej (tj. strzykawki 3 ml z dołączoną rurką), która została wstępnie napełniona 1x S Basal.
   1. Należy pamiętać, aby zassać robaka tylko do rurki, a nie do końca do strzykawki.
      UWAGA: Jeśli robak dostanie się do strzykawki, włożenie go z powrotem do rurki jest prawie niemożliwe.
4. Wyłącz podciśnienie, aby zatrzymać przepływ, przekręcając wylotowy zawór Luer.
5. Usuń solidny kołek blokujący port ładowania ślimaka.
6. Przekręć zawór Luer podłączony do portu wylotowego (Rysunek 1B) tak, aby się odpowietrzał.
   UWAGA: Użyj transmisji wideo na żywo podczas ładowania robaka, aby potwierdzić lokalizację i orientację zwierzęcia (kroki 5.8-5.13).
7. Włóż rurkę ładującą ślimaka do portu ładowania ślimaka.
8. Delikatnie docisnąć strzykawkę, aż robak pojawi się w kanale ładowania.
9. Jeśli robak zacznie wchodzić do kanału ogonem do przodu, pociągnij za tłok strzykawki, aby zapobiec przedostawaniu się robaka do kanału.
10. Przełączaj się między przyłożeniem i odwróceniem ciśnienia, aż głowica jako pierwsza wejdzie do kanału.
11. Otwórz próżnię, obracając 3-drogowy zawór Luer podłączony do portu wylotowego, aby otworzyć go na próżnię zamiast atmosfery.
12. Ręcznie wywieraj nacisk, naciskając tłok strzykawki, aby zorientować i umieścić głowicę ślimaka tak, aby była wystawiona na kanał przepływu bufora, ale nie tak daleko, aby głowica mogła się swobodnie poruszać (Rysunek 2D-2E).

6. Bodźce i akwizycja

1. Korzystając z oprogramowania mikroskopowego typu open source, takiego jak Micro-Manager, nagrywaj, przechwytując obrazy jako stos TIFF z prędkością 10 klatek/s przy wzbudzeniu światłem niebieskim (470 nm) przez 30 s.
2. Ustaw ekspozycję w menu głównym na 100 ms.
   1. Otwórz "Multi-D Acq." z menu głównego oprogramowania. Ustaw "liczbę" na "300", a "interwał" na "0". Kliknij "Pobierz!", aby pobrać wideo.
3. Zastosuj 10-sekundowy impuls bodźca 5 s po rozpoczęciu akwizycji. Dostosuj czas trwania stosowania bodźca zgodnie z potrzebami.
   1. Po uzyskaniu 5 s wideo wymień zawór 3-drogowy sterujący buforem sterującym przepływem, aby zastosować bodziec do badanego zwierzęcia. Kliknij skrajny lewy przycisk w oprogramowaniu kontrolera perfuzji (Rysunek 1B).
   2. Po 10 sekundach ekspozycji na bodziec (czas ten może być dostosowany do potrzeb użytkownika), zmień przepływ, ponownie naciskając skrajny lewy przycisk w oprogramowaniu kontrolera perfuzji.
4. Zapisuj w buforze tylko do momentu zakończenia 30-sekundowego okna, aby umożliwić fluorescencji GECI powrót do linii podstawowej.
5. Powtórz według potrzeb. Odczekaj 30 s między zakończeniem akwizycji a rozpoczęciem następnej próby.

7. Analiza obrazu

1. Otwórz stos TIFF za pomocą oprogramowania typu open source, ImageJ, przeciągając plik do okna ImageJ.
2. Kliknij za pomocą kursora i przeciągnij, aby ustawić obszar zainteresowania (ROI) wokół neuronu zainteresowania. Ustaw region tak, aby zawierał somę neuronu będącego przedmiotem zainteresowania (jak w Rysunek 3A).
3. Wykreśl stos z intensywności fluorescencji ROI w stosach, klikając Otwórz -> Obraz -> Stosy -> Kreśl profil osi Z.
4. Kliknij "Lista" w oknie, które się otworzy. Kliknij przycisk Edytuj -> Kopiuj, aby skopiować wartości. Wklej wartości do programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
5. Przeanalizuj fluorescencję tła dla każdego impulsu, przeciągając ROI do regionu robaka, który nie zawiera wyrażenia GCaMP.
6. Wykonaj odejmowanie tła dla każdego impulsu, odejmując wartość fluorescencji tła od wartości intensywności fluorescencji neuronu.
7. Obliczyć ΔF/F₀ dla każdej klatki każdego impulsu.
   1. Oblicz F₀ jako średnią wartość intensywności zwrotu z inwestycji dla pierwszych 1 s akwizycji (np. klatki 1-10).
   2. Oblicz ΔF/F₀, dzieląc wartość odjętą od tła dla ramki zainteresowania przez obliczoną wartość F₀.
8. Powtórz tę czynność dla każdego zobrazowanego neuronu i każdego impulsu bodźca.
9. W przypadku neuronów o spójnych profilach odpowiedzi, takich jak ASH, uśrednij wszystkie impulsy dla każdego neuronu i oblicz SEM (jak w Rysunek 2F).
10. Wykreśl średnią ΔF/F₀ za pomocą SEM w czasie dla każdego neuronu.
    UWAGA: W tym przypadku powszechną praktyką jest dołączanie map cieplnych poszczególnych odpowiedzi neuronalnych w każdej próbie. W neuronach, które nie wykazują stałych zmian w stanach przejściowych wapnia po ekspozycji na bodźce podczas powtarzających się stymulacji lub u różnych osób²³, bardziej odpowiednie może być pokazanie indywidualnych śladów impulsu (jak w Ryc. 4). Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat określania sposobu wyświetlania danych.

Results

Przykład ogólnej konfiguracji urządzenia można zobaczyć w Rysunek 1A-B. Rysunek 1A przedstawia prawidłową konstrukcję i konfigurację zbiornika. Rysunek 1B pokazuje połączenia zbiorników z urządzeniem mikroprzepływowym. Rysunek 1C przedstawia urządzenie mikroprzepływowe z indywidualnymi portami oznaczonymi dla przejrzystości.

Discussion

Przystosowany do samców chip węchowy zawiera skręt w węższy port ładowania, co pozwala na większą kontrolę orientacji i skuteczne chwytanie samców C. elegans. Pozwala to na wizualizację zarówno lewego, jak i prawego członka dwustronnych par neuronów, bez potrzeby układania w stosy. Krzywa ta prowadzi do orientacji od pionu przez 100% czasu u robaków, w których tylko jedna para obustronna jest celowana za pomocą markera fluorescencyjnego, takiego jak ASH (Rysunek 2D-E

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wafel	krzemowy University Wafer	452
SU-8 2035	MicroChem	Y111070-0500L1GL
Developer	MicroChem	Y020100-4000L1PE
Maska waflowa	Cad / Art	Services-Zamówienie	niestandardowe. Wydrukowano w rozdzielczości 25 000 dpi.
Sylgard-184	Ellsworth Kleje	184 SIL ELAST KIT 0,5 kg
1,0 mm Stemple skórne	Acuderm Inc.	P150
Miękkie rurki	Cole-Palmer	EW-06419-01
Twarde rurki	IDEX Zdrowie i Science	1622
Pins	New England Small Tube	NE-1027-12
Kołki blokujące	New England Small Tube	0,415/0,425" OD x .500 Długa	partia PB07027
strzykawki 3 ml	BD	309657
30 ml	Vitality Medical	302832	Używane jako zbiorniki buforowe.
igła ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23, poliprolilen Luer	Component Supply Company	NE-231PL-50
Kranki z przyłączami Luer; 3-drożne; zamek męski; 5 schematów przepływu; niesterylne	Cole-Palmer	EW-30600-07
Fisherfinest Premium Szkło osłonowe	Fisher Scientific	12-548-5M
System sterowania Mercator LF-5 System plazmowy	Mercator	LF-5
Taśma klejąca	Scotch	BSN43575
Series 20 Chamber	Warner Instruments	P-2
Eksykator próżniowy	Bel-Art Scienceware	420250000	Średnica wewnętrzna 24 cm.
Łodzie wagowe	Cole-Palmer	EW-01017-27
Classic Plus Balance	Mettler Toledo	PB1501-S/FACT
Szklane pipety Pasteura	Cole-Palmer	EW-25554-06
Pipety transferowe	Genesee Scientific	30-202
Piekarnik	Sheldon Manufacturing Inc	9120993	Numer modelu: 1500E.
60 mm, bez wentylacji, ostra krawędź szalki Petriego	TriTech Research	T3308
Zeiss Axio Observer.A1
Orca Flash 4.0 Cyfrowy CMOS	Hammamatsu	C11440-22CU
Niebieskie światło fluorescencyjne	Lumencor	SOLA SM6-LCR-SA	24-30V/7.9A DC.
Adapter oświetlenia	Zeiss	423302-0000
Seria 1 i 2 Miniaturowy obojętny zawór odcinający z PTFE Parker		001-0017-900	Zawór 3-drogowy do sterowania przepływem.
ValveLink8.2®	AutoMate Scientific	01-18	Sterownik przełącznika przepływu
Micro Manager	Micro-Manager-Darmowe		oprogramowanie, można pobrać ze strony: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJ	ImageJ-Free		, można pobrać pod adresem: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, klasa bakteriologiczna	Apex	9012-36-6
Peptone	Apex	20-260
CaCl2	VWR	BDH0224-1KG
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-1kg
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Etanol	Sigma-Aldrich	270741-4L
Tetramisole	Sigma-Aldrich	L9756-10(G)	Przechowywać w temperaturze 4 & C.
Fluoresceina	Sigma-Aldrich	FD2000S-250 mg	wrażliwy na światło. Przechowywać w fiolkach fotoochronnych.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L
Ascaroside #3	-		syntetyzowany w laboratorium Schroeder (Cornell University).
NaCl	Genesee Scientific	18-215
KH2PO4	BDH	BDH9268.25
K2HPO4	J.T. Baker	3252-025
ASH GCaMP3 line	-	-	CX10979 (KyEx2865 [p-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Opracowany w laboratorium Bargmann. Udostępnione z biblioteki Albrecht Lab.
Linia CEM GCaMP6	-	-	JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Opracowane przez Robyn Lints. Dostarczone z biblioteki Srinivasan Lab.
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Centrum Genetyki	OP50
"Zbiornik"	-		Aby utworzyć zbiornik: "Strzykawka o pojemności 30 ml" jest podłączona do "Zaworu odcinającego ze złączami Luer; 3-drożny; męski zamek; 5 wzorców przepływu; niesterylny", który jest podłączony do "strzykawki 3 ml" i "igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23", Poliprolilen Luer". "igła ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23, poliprolilen Luer" jest następnie wkładana do "miękkiej rurki" około 1/3 długości igły.