Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56026

⸱

7 września 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Streszczenie

Użycie wskaźników wapnia znacznie poszerzyło nasze zrozumienie dynamiki i regulacji neuronów. Nicień Caenorhabditis elegans, ze swoim całkowicie zmapowanym układem nerwowym i przezroczystą anatomią, stanowi idealny model do zrozumienia dynamiki neuronalnej w czasie rzeczywistym przy użyciu wskaźników wapnia. W połączeniu z technologiami mikroprzepływowymi i projektami eksperymentalnymi, badania obrazowania wapnia z wykorzystaniem tych wskaźników są przeprowadzane zarówno u zwierząt poruszających się swobodnie, jak i uwięzionych. Jednak większość wcześniejszych badań wykorzystujących urządzenia do łapania, takie jak chip węchowy opisany w Chronis i wsp., ma urządzenia przeznaczone do stosowania u bardziej powszechnego hermafrodyty, ponieważ rzadziej spotykany samiec jest różny zarówno morfologicznie, jak i strukturalnie. Zaprojektowano i wyprodukowano dostosowany chip węchowy w celu zwiększenia wydajności obrazowania neuronów samców z wykorzystaniem młodych dorosłych zwierząt. Do portu ładowania robaków włączono obrót, aby obrócić zwierzęta i umożliwić rozdzielenie poszczególnych neuronów w dwustronnej parze w obrazowaniu 2D. Robaki są wystawione na kontrolowany przepływ środka zapachowego w urządzeniu mikroprzepływowym, jak opisano w poprzednich badaniach hermafrodytów. Przejściowe stany nieustalone wapnia są następnie analizowane za pomocą oprogramowania open source ImageJ. Opisana w niniejszym dokumencie procedura powinna pozwolić na zwiększenie liczby badań obrazowania wapnia u mężczyzn C. elegans, pogłębiając nasze zrozumienie mechanizmów sygnalizacji neuronalnej specyficznej dla płci.

Wprowadzenie

Urządzenia mikroprzepływowe zapewniają zwiększony dostęp do precyzyjnie kontrolowanych środowisk, w których zwierzęta, takie jak nicienie C. elegans, mogą być eksperymentalnie manipulowane1. Badania te obejmują testy behawioralne, badania obrazowania wapnia, a nawet badania przesiewowe pod kątem określonych fenotypów, co skutkuje dokładniejszymi pomiarami wyników eksperymentalnych1,2,3,4,5,6. Mikrofluidyka zapewnia ciekłe warunki na małą skalę, w których można przeprowadzać szczegółowe eksperymenty przy użyciu minimalnych ilości odczynników. Nieustannie powstają nowe projekty urządzeń mikroprzepływowych, a zastosowanie każdego z nich jest różne, od aren, które pozwalają na naturalny sinusoidalny ruch C. elegans w testach behawioralnych i badaniach obrazowania neuronalnego, przez urządzenia pułapkowe stosowane w obrazowaniu neuronalnym i badaniach węchowych, po urządzenia, które pozwalają na wysokoprzepustową analizę fenotypową w genetycznych badaniach przesiewowych4, 5,6,7. Po wyprodukowaniu formy wzorcowej, urządzenia mikroprzepływowe są niedrogie w budowie - biorąc pod uwagę możliwość wielokrotnego użycia wzorca - i łatwe w użyciu, co pozwala na szybkie generowanie danych za pomocą badań o wysokiej przepustowości. Wytwarzanie urządzeń z wykorzystaniem polimerów takich jak polidimetylosiloksan (PDMS) pozwala na tworzenie nowych urządzeń w ciągu kilku godzin.

Badania obrazowania wapnia wykorzystują genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) wyrażane w komórkach docelowych do pomiaru dynamiki neuronalnej tych komórek w czasie rzeczywistym8,9,10,11. Przezroczysta natura C. elegans pozwala na rejestrację poziomów fluorescencyjnych tych białek u żywych zwierząt. Tradycyjnie, GECI opierają się na czujniku GFP-Calmodulin-M13 Peptide (GCaMP) opartym na białku zielonej fluorescencji (GFP), chociaż nowsze badania dostosowały te czujniki, aby umożliwić lepsze proporcje sygnału do szumu i profile wzbudzenia przesunięte ku czerwieni. Po opracowaniu GCaMP3 białka o tych specyfikacjach różniły się, w tym czujniki takie jak GCaMP6s i GCaMP6f (odpowiednio wolne i szybkie wskaźniki fluorescencji), a także peptyd RFP-Calmodulin-M13 (RCaMP), który ma przesunięty ku czerwieni profil aktywacji. Połączenie tych GECI z sekwencjami promotora genów specyficznych dla komórek C. elegans może celować w komórki będące przedmiotem zainteresowania, w szczególności neurony czuciowe12,13,14,15,16.

Chociaż łatwość użycia C. elegans w badaniach mikroprzepływowych jest oczywista, prawie wszystkie badania koncentrowały się na hermafrodytach. Pomimo tego, że samce stanowią tylko 0,01-0,02% populacji typu dzikiego, ich charakterystyka może przynieść bezcenne wnioski. Podczas gdy fizyczny konektom hermafrodytycznego układu nerwowego jest w pełni zmapowany od dziesięcioleci17, konektom męski pozostaje niekompletny, zwłaszcza w obszarze głowy zwierzęcia18. Zastosowanie obrazowania wapnia u mężczyzn pomoże w zrozumieniu męskiego układu nerwowego i różnic pojawiających się między obiema płciami. Mniejszy rozmiar dorosłych samców C. elegans zapobiega skutecznemu i niezawodnemu chwytaniu w portach załadunkowych tradycyjnych urządzeń węchowych przeznaczonych dla większych hermafrodytów. Aby temu zaradzić, opracowano zmodyfikowaną wersję Chronis Olfactory Chip19 z węższym portem ładowania, niższą wysokością kanału i zakrętami w porcie ładowania robaków (które obracają zwierzę), co pozwala na wizualizację obustronnych par neuronów lewo-prawostronnych. Konstrukcja ta pozwala: (1) na skuteczne chwytanie młodych dorosłych samców, (2) bardziej wiarygodną orientację zwierzęcia w celu wizualizacji obu członków obustronnie sparowanych neuronów oraz (3) precyzyjne obrazowanie aktywności neuronalnej w neuronach męskich.

Coraz częściej badania pokazują, że samce C. elegans reagują inaczej niż hermafrodyty na różne askarozydy (ascr) lub feromony nicieni20,21,22,23,24. W związku z tym zrozumienie dynamiki i reprezentacji neuronalnych w męskim konektomie stało się jeszcze bardziej istotne. Samce C. elegans zawierają 87 neuronów specyficznych dla płci, które nie występują w hermafrody25,26, zmieniając konektom w jeszcze nieokreślony sposób. Możliwość zobrazowania tej unikalnej dynamiki neuronalnej pozwoli nam lepiej zrozumieć reakcje i reprezentacje neuronalne specyficzne dla płci.

Ten protokół opisuje użycie męskiego chipa węchowego do obrazowania neuronalnego męskiej chemosensacji C. elegans. Neuron nocyceptywny ASH niezawodnie reaguje na 1 M glicerolu u mężczyzn, co jest zgodne z poprzednimi badaniami hermafrodytycznymi27. Narażenie na askarozydy może wywołać reakcje, które są różne w zależności od zwierzęcia, co wymaga przetestowania większej liczby zwierząt. Odpowiedź neuronów CEM specyficznych dla mężczyzn została wcześniej wykazana, zarówno przez badania elektrofizjologii, jak i obrazowania wapnia, na zmienną reakcję na askarozyd #323.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wytwarzanie urządzenia

UWAGA: Patrz referencja1.

UWAGA: Krzemowe formy matki zostały wykonane przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych w celu uformowania wzoru fotorezystu SU-8 na matrycy krzemowej1,7. Maski fotolityczne do wzorowania wafla zostały wydrukowane w rozdzielczości 25 0 dpi. Urządzenie dostosowane do osobników męskich opiera się na konstrukcji Chronis Olfactory Chip19 ze zmienionym portem załadunkowym nicieni, na podstawie projektu otrzymanego od M. Zimmer (korespondencja osobista, 2016). Wprowadzono zwrot, aby kontrolować rotację zwierząt. Szerokość kanału portu załadunkowego nicieni została zwężona do 50 μm. Wszystkie kanały mają wysokość 32 μm. Po uzyskaniu krzemowej formy matki użytkownik może postępować zgodnie z poniższym protokołem, opisanym wcześniej1.

  1. Wymieszać bazę PDMS i czynnik sieciujący w stosunku masowym 10:1.
  2. Dokładnie wymieszać za pomocą pipet transferowych.
  3. Odpowietrzyć mieszaninę w desykatorze próżniowym przez 1 h, aż do usunięcia wszystkich widocznych pęcherzyków powietrza.
  4. Wlać mieszaninę na matrycę krzemową w naczyniu o średnicy 150 mm, aż osiągnie grubość 5 mm (10 g). Użyć pipety Pasteura do usunięcia wszelkich pęcherzyków powietrza lub zanieczyszczeń, które dostały się do mieszaniny.
  5. Utwardzać w temperaturze 65 °C przez co najmniej 3 h lub przez noc.
  6. Odciąć PDMS od matrycy za pomocą skalpela, a następnie rozdzielić poszczególne urządzenia za pomocą żyletki.
  7. Wyciąć otwory wlotowe i wylotowe za pomocą dermal punch o średnicy 1 mm.
  8. Przepłukać otwory dH2O, etanolem, a następnie ponownie dH2O, aby usunąć cząsteczki pozostałe po wycinaniu. Wysuszyć urządzenie strumieniem powietrza.
  9. Oczyścić obie strony kanałów oraz górną stronę urządzenia za pomocą taśmy klejącej, usuwając wszelki kurz lub zanieczyszczenia pozostałe na urządzeniu, aby zapewnić skuteczne wiązanie.
  10. Połączyć urządzenie z szkiełkiem okrywnym nr 1 za pomocą plazmy, kładąc stronę z kanałami dołu.
    1. Poddać szkiełko okrywne i urządzenie (stroną z kanałami do góry) działaniu plazmy powietrznej, stosując warunki zapewniające prawidłowe wiązanie, np. 10 W przez 30 s lub 24 W przez 60 s.
      UWAGA: Ustawienia można dostosować w celu poprawy wydajności wiązania. Warunki wiązania plazmowego nie są tak krytyczne jak właściwe oczyszczanie przy próbie poprawy wydajności wiązania. Niedostatecznie oczyszczone urządzenie nie połączy się, nawet w idealnych warunkach plazmowych.
    2. Odwrócić szkiełko okrywne na stronę z kanałami urządzenia i docisnąć kciukiem przez 5 s.

2. Przygotowanie buforu

  1. Rozcieńczyć 1x S Basal (10 mM NaCl i 0,05 M KPO4, pH 6,0) z jałowego roztworu zapasu 10x.
  2. Rozcieńczyć zapas 1 M tetramizolu do końcowego stężenia 1 mM w 1x S Basal dla wszystkich roztworów buforowych.
  3. Dodać fluoresceinę do zbiorników „kontroli przepływu” oraz „buforu”.
    1. Przygotować zapas fluoresceiny o stężeniu 10 mg/mL w 1x S Basal.
    2. Rozcieńczyć zapas do końcowych stężeń 1 µg/mL w kontroli przepływu i 0,1 µg/mL w buforze.
  4. Przygotować bodźce.
    1. Rozcieńczyć glicerol do końcowego stężenia 1 M w 1X S Basal.
    2. Rozcieńczyć askarosyd #3 (ascr#3) do końcowego stężenia 1 µM w 1X S Basal.

3. Konfiguracja urządzenia

UWAGA: Patrz1.

Konfiguracja urządzenia mikrofluidycznego do eksperymentu z nicieniami; obejmuje strzykawki, zawory i system kontroli przepływu buforu.
Rysunek 1. Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego. (A) Zbiorniki i przewody. Strzykawka o pojemności 30 ml bez tłoka służy jako „zbiornik”. Jest ona przyłączona do zaworu Luer z trzema opcjami przepływu. Jedno wyjście jest połączone ze strzykawką o pojemności 3 ml z tłokiem, natomiast drugie z igłą (pomarańczową), która jest wprowadzona do przewodu łączącego się z urządzeniem mikroprzepływowym. (B) Ogólny schemat układu eksperymentu obrazowania mikroprzepływowego. Urządzenie znajduje się na stole odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, nad obiektywami. Bufor „kontroli przepływu” przechodzi przez zawór trójdrożny sterowany przez jednostkę umieszczoną na półce nad układem. Linie zawierające bufory są następnie wprowadzone do odpowiednich portów urządzenia. (C) Porty urządzenia mikroprzepływowego. Porty „flow control” (kontrola przepływu) flankują pozostałe porty wlotowe: porty „stimulus” (bodziec) oraz „buffer” (bufor). Port „outlet” (wylot) znajduje się po prawej stronie. Ze względu na położenie obszaru załadunku nicieni, port „worm loading” (załadunek nicieni) jest portem znajdującym się najbliżej centrum urządzenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotuj trzy zbiorniki z płynem, mocując strzykawkę o pojemności 30 lub 60 mL do 3-drożnego zaworu Luer, do którego przymocowano również strzykawkę 3 mL z igłą (jak na Rysunku 1A). Podłącz igłę do przewodu prowadzącego do urządzenia mikroprzepływowego (jak na Rysunku 1A-B).
  2. Usuń pęcherzyki powietrza ze zbiornika i przewodów.
  3. Napełnij strzykawkę 3 mL z podłączonym przewodem roztworem 1x S Basal i włóż ją do portu wylotowego.
  4. Delikatnie wywieraj nacisk na tłok strzykawki, aż bufor pojawi się przy górnej krawędzi otworów wlotowych.
  5. Podłącz przewody kontroli przepływu, buforu i bodźca do odpowiednich otworów wlotowych (jak na Rysunku 1B-C), upewniając się, że krople cieczy znajdują się zarówno w otworze portu załadunkowego, jak i na przyłączanym przewodzie z buforem.
  6. Ponownie delikatnie wywieraj nacisk na strzykawkę podłączoną do portu wylotowego, aż krople pojawią się we wlocie portu załadunkowego dla nicieni.
  7. Włóż stały pin blokujący do portu załadunkowego dla nicieni.
  8. Wyjmij strzykawkę z portu wylotowego i podłącz linię wylotową z podciśnieniem sieciowym (-670 Torr).
  9. Sprawdź urządzenie pod kątem obecności pęcherzyków w kanałach przepływowych, wizualnie oraz poprzez potwierdzenie wideo za pomocą oprogramowania kompatybilnego z użytą kamerą, np. oprogramowania open-source Micro-Manager. Wskazówki dotyczące korzystania z Micro-Manager znajdują się w kroku 6.
    1. Jeśli obecne są jakiekolwiek pęcherzyki, odczekaj, aż zostaną usunięte lub wchłonięte przez ściankę PDMS przed załadowaniem zwierząt; obecność pęcherzyków zaburzy prawidłowy przepływ płynów przez urządzenie.
  10. Używając filtra GFP, potwierdź prawidłową dynamikę przepływu w urządzeniu przed załadunkiem nicieni, uruchamiając zawór 3-drożny i obserwując przełączanie buforów.
    1. Określ prawidłową dynamikę przepływu: obserwuj zmiany fluoresceiny obecnej w roztworach kontroli przepływu i bufora (Rysunek 2D-2E) podczas zmiany wartości kontroli przepływu poprzez naciśnięcie przycisku sterującego odpowiadającego zaworowi 3-drożnemu w oprogramowaniu kontrolera perfuzji (Rysunek 1B).
    2. Po uruchomieniu programu Micro-Manager kliknij „Live”, aby obserwować obraz urządzenia w czasie rzeczywistym. Włącz fluorescencyjne źródło światła, aby zaobserwować przepływ buforów w urządzeniu (Rysunek 2D-2E).

Układ kontroli przepływu mikrofluidycznego; schemat, obraz mikroskopowy, wykres; analiza sygnalizacji ASHL.
Rysunek 2: Mikrofluidyczny chip węchowy przystosowany do samców. (A) Wzorce przepływu w urządzeniu, gdy nicień jest wystawiony na działanie buforu. Bufor (B) zaznaczono kolorem brązowym, kontrolę przepływu (FC) kolorem żółtym, a stymulację (S) kolorem białym. Port załadunkowy nicieni został zmodyfikowany poprzez dodanie zakrzywienia, co pozwala na lepszą kontrolę orientacji nicienia. (B) Wzorce przepływu w urządzeniu podczas wystawienia nicienia na bodziec. Bufor (B) zaznaczono kolorem brązowym, kontrolę przepływu (FC) kolorem żółtym, a bodziec (S) kolorem białym. (C) Pomiary wykonanego, dostosowanego urządzenia. Port załadunkowy dla dżdżownic kończy się w 42 µm otwierając, za pomocą 50 µm kanał zaprojektowany pod szerokość męską. Zmierzona wysokość kanałów wynosi 32 µmPomimo założonego celu wynoszącego 25 µm w projekcie. (D-E) uwięziony samiec wykazujący ekspresję psra-6::GCaMP3. Ten sra-6 promotor nie jest specyficzny dla neuronów ASH i można zaobserwować pewną ekspresję w neuronie ASI, choć w ASI nie odnotowano przelotowych zmian stężenia wapnia. Obraz przedstawia (D) kombinacja oświetlenia w polu jasnym i fluorescencyjnego, podczas gdy (E) jest wyłącznie fluorescencyjny. Paski skali oznaczają 42 µm. (FNeuron ASH reaguje na stymulację 1 M glicerolem silną aktywnością neuronalną. Niebieski obszar oznacza czas podania bodźca w postaci 1 M glicerolu. Zakreślony obszar oznacza błąd standardowy, przy n = 20 impulsach od siedmiu osobników. Czerwone linie przebiegu oznaczają odpowiedzi depolaryzacyjne. Osie Y przedstawiają ΔF/F0Pasek skali oznacza 5 s. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Patrz odnośnik23.

  1. Obrazowanie odpowiedzi neuronów ASH na 1 M glicerolu.
    1. Umieść około 20 samców C. elegans wykazujących ekspresję macierzy psra-6::GCaMP3 na płytce agarowej z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) z wysianym trawnikiem E. coli OP50. Do identyfikacji zwierząt z dodatnią macierzą wykorzystaj ekspresję fluorescencyjnego GECI i/lub marker współwstrzyknięcia.
      UWAGA: Zwierzęta z dodatnią macierzą będą fluorescować w zależności od użytego GECI (np. zwierzęta wykazujące ekspresję GCaMP będą fluorescować na zielono pod wpływem stymulacji światłem niebieskim, natomiast zwierzęta z RCaMP będą fluorescować na czerwono pod wpływem stymulacji światłem zielonym). Markery współwstrzyknięcia mogą obejmować inne białka fluorescencyjne, takie jak GFP i RFP, markery fenotypowe, takie jak rol-6, lub mogą przywracać fenotyp dominujący, np. mutację pha-128.
      1. W przypadku pobierania zwierząt bezpośrednio przed analizą, wybierz młode dorosłe samce. W przypadku pobierania dzień przed analizą, wybierz samce w stadium larwalnym L4.
  2. Obrazowanie odpowiedzi neuronów CEM na 1 µM ascr#3.
    1. Wybierz około 20 samców C. elegans w stadium L4 (fkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)) wykazujących ekspresję markera współwstrzyknięcia dsRed.
      UWAGA: Ekspresja dsRed w neuronach promieni ogona samca jest łatwiejsza do zaobserwowania i potwierdzenia niż ekspresja GCaMP w czterech neuronach CEM.
    2. Odizoluj te samce od hermafrodytów na płytce agarowej NGM z wysianym trawnikiem E. coli OP50 na 5-14 h przed przeprowadzeniem eksperymentu obrazowania.
      UWAGA: Samce nieodizolowane przez minimum 5 h nie reagują behawioralnie na ascr#3, w związku z czym mogą wykazywać jeszcze mniej przejściowych wzrostów poziomu wapnia w odpowiedzi na askarosyd niż przedstawione w niniejszej procedurze.

5. Obciążanie zwierząt

UWAGA: Patrz referencja1.

  1. Przenieś jednego nicienia na nieobsianą płytkę agarową NGM, stosując standardowe techniki hodowli nicieni.
    1. Przenieś nicienie, wypalając igłę (wykonaną z rozpłaszczonego drutu platynowego), nabierając bakterii na igłę i „dotykając” nicienia, aby go podnieść. Delikatnie umieść nicienia na nowej płytce, pozwalając mu samodzielnie z niej zejść.
  2. Dodaj około 5 mL 1x S Basal do nieobsianej płytki, tak aby została ona zalana.
  3. Zassać nicienia do strzykawki ładującej (tj. strzykawki 3 mL z dołączonym drenem), która została uprzednio napełniona roztworem 1x S Basal.
    1. Należy upewnić się, że nicień zostanie zassany tylko do drenu, a nie całkowicie do wnętrza strzykawki.
      UWAGA: Jeśli nicień wniknie do strzykawki, niemal niemożliwe jest jego ponowne wprowadzenie do drenu.
  4. Wyłącz próżnię, aby zatrzymać przepływ, przekręcając zawór Luer na wylocie.
  5. Usuń stały trzpień blokujący port ładowania nicieni.
  6. Przekręć zawór Luer połączony z portem wylotowym (Rycina 1B) w taki sposób, aby otworem było odpowietrzanie.
    UWAGA: Podczas ładowania nicienia korzystaj z transmisji wideo na żywo, aby potwierdzić położenie i orientację zwierzęcia (kroki 5.8-5.13).
  7. Wprowadź rurkę do ładowania nicieni do portu ładowania nicieni.
  8. Delikatnie wywieraj nacisk na strzykawek, aż nicień pojawi się w kanale ładującym.
  9. Jeśli nicień zacznie wchodzić do kanału ogonem do przodu, pociągnij tłok strzykawki, aby zapobiec wniknięciu nicienia do kanału.
  10. Przełączaj się między wywieraniem i cofaniem nacisku, aż głowa nicienia wniknie do kanału jako pierwsza.
  11. Włącz próżnię, przekręcając 3-drogowy zawór Luer połączony z portem wylotowym, tak aby otworzyć go na próżnię zamiast na atmosferę.
  12. Ręcznie wywieraj nacisk, wciskając tłok strzykawki, aby zorientować i umieścić głowę nicienia w taki sposób, by była wystawiona na kanał przepływu buforu, ale nie tak daleko, aby głowa mogła swobodnie się poruszać (Rycina 2D-2E).

6. Bodziec i akwizycja

  1. Używając oprogramowania do mikroskopii o otwartym kodzie źródłowym, takiego jak Micro-Manager, zarejestruj obraz, przechwytując go jako stos TIFF przy 10 klatkach/s, stosując wzbudzanie światłem niebieskim (470 nm) przez 30 s.
  2. W menu głównym ustaw czas ekspozycji na 10 ms.
    1. Otwórz „Multi-D Acq.” z menu głównego oprogramowania. Ustaw wartość „number” na „300”, a „interval” na „0”. Kliknij „Acquire!”, aby rozpocząć rejestrację wideo.
  3. Zastosuj 10 s impuls bodźca 5 s po rozpoczęciu akwizycji. Dostosuj czas trwania podawania bodźca według uznania.
    1. Po zarejestrowaniu 5 s wideo zmień ustawienie zaworu trójdrożnego sterującego buforem kontroli przepływu, aby podać bodziec badanemu zwierzęciu. Kliknij skrajny lewy przycisk w oprogramowaniu sterownika perfuzji (Rycina 1B).
    2. Po 10 s ekspozycji na bodziec (czas ten może być dostosowany przez użytkownika), zmień przepływ buforów, ponownie naciskając skrajny lewy przycisk w oprogramowaniu sterownika perfuzji.
  4. Kontynuuj rejestrację przy użyciu samego buforu, aż minie 30 s, aby fluorescencja GECI powróciła do poziomu bazowego.
  5. Powtórz procedurę zgodnie z potrzebami. Odczekaj 30 s pomiędzy zakończeniem akwizycji a rozpoczęciem kolejnej próby.

7. Analiza obrazu

  1. Otwórz stos TIFF w darmowym oprogramowaniu ImageJ, przeciągając plik do okna programu ImageJ.
  2. Użyj kursora, aby kliknąć i przeciągnąć w celu wyznaczenia obszaru zainteresowania (ROI) wokół badanego neuronu. Wyznacz obszar tak, aby obejmował on somę badanego neuronu (jak na Rysunku 3A).
  3. Wykreśl profil intensywności fluorescencji ROI wzdłuż stosu z (z-stack), wybierając Open -> Image -> Stacks -> Plot Z-axis Profile.
  4. W otwartym oknie kliknij „List”. Wybierz Edit -> Copy, aby skopiować wartości. Wklej wartości do programu arkusza kalkulacyjnego.
  5. Przeanalizuj fluorescencję tła dla każdego impulsu, przeciągając ROI do obszaru organizmu, w którym nie występuje ekspresja GCaMP.
  6. Wykonaj odjęcie tła dla każdego impulsu, odejmując wartość fluorescencji tła od wartości intensywności fluorescencji neuronu.
  7. Oblicz ΔF/F0 dla każdej klatki każdego impulsu.
    1. Oblicz F0 jako średnią wartość intensywności ROI dla pierwszego 1 s akwizycji (np. klatki 1-10).
    2. Oblicz ΔF/F0, dzieląc wartość po odjęciu tła dla badanej klatki przez obliczoną wartość F0.
  8. Powtórz procedurę dla każdego obrazowanego neuronu i każdego impulsu stymulującego.
  9. W przypadku neuronów o spójnych profilach odpowiedzi, takich jak ASH, wyciągnij średnią ze wszystkich impulsów dla każdego neuronu i oblicz SEM (jak na Rysunku 2F).
  10. Wykreśl średnie ΔF/F0 wraz z SEM w funkcji czasu dla każdego neuronu.
    UWAGA: W takim przypadku powszechną praktyką jest dołączenie również map ciepła (heatmaps) indywidualnych odpowiedzi neuronalnych dla każdego powtórzenia. W przypadku neuronów, które nie wykazują spójnych zmian w przejściach wapniowych po ekspozycji na bodźce podczas wielokrotnych stymulacji lub u różnych osobników23, bardziej zasadne może być przedstawienie przebiegów poszczególnych impulsów (jak na Rysunku 4). Szczegóły dotyczące wyboru sposobu prezentacji danych znajdują się w sekcji Dyskusja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład ogólnego zestawu urządzenia przedstawiono na Rysunku 1A-B. Rysunek 1A przedstawia prawidłową konstrukcję i konfigurację zbiornika. Rysunek 1B pokazuje połączenia zbiorników z urządzeniem mikroprzepływowym. Rysunek 1C przedstawia urządzenie mikroprzepływowe z ponumerowanymi portami w celu zapewnienia przejrzystości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przystosowany do samców chip węchowy zawiera skręt w węższy port ładowania, co pozwala na większą kontrolę orientacji i skuteczne chwytanie samców C. elegans. Pozwala to na wizualizację zarówno lewego, jak i prawego członka dwustronnych par neuronów, bez potrzeby układania w stosy. Krzywa ta prowadzi do orientacji od pionu przez 100% czasu u robaków, w których tylko jedna para obustronna jest celowana za pomocą markera fluorescencyjnego, takiego jak ASH (Rysunek 2D-E

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Manuelowi Zimmerowi za dostarczenie nam początkowego pliku projektowego, który został przystosowany do użytku z samcami; Franka Schroedera za syntezę i dostarczenie ascr#3; Rossowi Lagoyowi za wgląd i pomoc w obrazowaniu i analizie; oraz Laurze Aurilio za mistrzowską fabrykację, która wraz z Christopherem Chute przyczyniła się do recenzji tego rękopisu. Finansowanie tych prac zostało zapewnione w ramach grantu National Institutes of Health 1R01DC016058-01 (J.S.), grantu National Science Foundation CBET 1605679 (D.R.A.) oraz Burroughs Wellcome Career Award w Scientific Interface (D.R.A.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wafelkrzemowy University Wafer452
SU-8 2035MicroChemY111070-0500L1GL
DeveloperMicroChemY020100-4000L1PE
Maska waflowaCad / ArtServices-Zamówienieniestandardowe. Wydrukowano w rozdzielczości 25 000 dpi.
Sylgard-184Ellsworth Kleje184 SIL ELAST KIT 0,5 kg
1,0 mm Stemple skórneAcuderm Inc.P150
Miękkie rurkiCole-PalmerEW-06419-01
Twarde rurkiIDEX Zdrowie i Science1622
PinsNew England Small TubeNE-1027-12
Kołki blokująceNew England Small Tube0,415/0,425" OD x .500 Długapartia PB07027
strzykawki 3 mlBD309657
30 mlVitality Medical302832Używane jako zbiorniki buforowe.
igła ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23, poliprolilen LuerComponent Supply CompanyNE-231PL-50
Kranki z przyłączami Luer; 3-drożne; zamek męski; 5 schematów przepływu; niesterylneCole-PalmerEW-30600-07
Fisherfinest Premium Szkło osłonoweFisher Scientific12-548-5M
System sterowania Mercator LF-5 System plazmowyMercatorLF-5
Taśma klejącaScotchBSN43575
Series 20 ChamberWarner InstrumentsP-2
Eksykator próżniowyBel-Art Scienceware420250000Średnica wewnętrzna 24 cm.
Łodzie wagoweCole-PalmerEW-01017-27
Classic Plus BalanceMettler ToledoPB1501-S/FACT
Szklane pipety PasteuraCole-PalmerEW-25554-06
Pipety transferoweGenesee Scientific30-202
PiekarnikSheldon Manufacturing Inc9120993Numer modelu: 1500E.
60 mm, bez wentylacji, ostra krawędź szalki PetriegoTriTech ResearchT3308
Zeiss Axio Observer.A1
Orca Flash 4.0 Cyfrowy CMOSHammamatsuC11440-22CU
Niebieskie światło fluorescencyjneLumencorSOLA SM6-LCR-SA24-30V/7.9A DC.
Adapter oświetleniaZeiss423302-0000
Seria 1 i 2 Miniaturowy obojętny zawór odcinający z PTFE Parker001-0017-900Zawór 3-drogowy do sterowania przepływem.
ValveLink8.2®AutoMate Scientific01-18Sterownik przełącznika przepływu
Micro ManagerMicro-Manager-Darmoweoprogramowanie, można pobrać ze strony: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJImageJ-Free, można pobrać pod adresem: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, klasa bakteriologicznaApex9012-36-6
PeptoneApex20-260
CaCl2VWRBDH0224-1KG
MgSO4Sigma-Aldrich230391-1kg
CholesterolAlfa AesarA11470
EtanolSigma-Aldrich270741-4L
TetramisoleSigma-AldrichL9756-10(G)Przechowywać w temperaturze 4 & C.
FluoresceinaSigma-AldrichFD2000S-250 mgwrażliwy na światło. Przechowywać w fiolkach fotoochronnych.
GlycerolSigma-AldrichG6279-1L
Ascaroside #3-syntetyzowany w laboratorium Schroeder (Cornell University).
NaClGenesee Scientific18-215
KH2PO4BDHBDH9268.25
K2HPO4J.T. Baker3252-025
ASH GCaMP3 line--CX10979 (KyEx2865 [p-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Opracowany w laboratorium Bargmann. Udostępnione z biblioteki Albrecht Lab.
Linia CEM GCaMP6--JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Opracowane przez Robyn Lints. Dostarczone z biblioteki Srinivasan Lab.
E. coli (OP50)Caenorhabditis Centrum GenetykiOP50
"Zbiornik"-Aby utworzyć zbiornik: "Strzykawka o pojemności 30 ml" jest podłączona do "Zaworu odcinającego ze złączami Luer; 3-drożny; męski zamek; 5 wzorców przepływu; niesterylny", który jest podłączony do "strzykawki 3 ml" i "igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23", Poliprolilen Luer". "igła ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23, poliprolilen Luer" jest następnie wkładana do "miękkiej rurki" około 1/3 długości igły.
Strzykawki Zeiss-Hammamatsu Oprogramowanie

Bibliografia

  1. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
  2. Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
  3. Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
  4. Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
  5. Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
  6. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023(2016).
  7. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
  8. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2(2013).
  9. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008(2014).
  10. Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31(2014).
  11. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  12. Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
  13. Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
  14. Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
  15. McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
  16. Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164(2012).
  17. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1(1986).
  18. White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
  21. Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
  22. Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
  23. Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
  24. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  25. Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
  26. Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
  27. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
  28. Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  29. Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037(2012).
  30. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  31. García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
  32. Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
  33. Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613(2013).
  34. Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
  35. Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie wapniaodpowiedź na feromonyport do załadunku nicienianaliza w programie ImageJsystem kontroli przepływu cieczymikroskopia fluorescencyjna
Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.