Opisujemy opartą na HPLC metodę oznaczania kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
CMAH (hydroksylaza kwasu monofosforanu cytydyny-N-acetyloneuraminy) jest odpowiedzialna za utlenianie kwasów cytydynomonofosforanu N-acetyloneuraminy u ssaków. Jednak ludzie nie mogą utleniać kwasu N-acetyleneuraminowego monofosforanu cytydyny do kwasu N-glikolyloneuraminowego monofosforanu cytydyny z powodu pierwotnej delecji eksonu genu CMAH. Aby bardziej szczegółowo zrozumieć skutki i implikacje braku aktywności CMAH, model nokautu Cmah u myszy jest przedmiotem dużego zainteresowania w badaniach podstawowych i stosowanych. Metoda analizy mająca na celu określenie fenotypu tego modelu myszy jest szczegółowo opisana w niniejszym dokumencie i opiera się na wykrywaniu zarówno kwasu N-acetyloneuraminowego, jak i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Camah. Endogenne kwasy sjalowe są uwalniane i derywatyzowane za pomocą o-fenylenodiaminy w celu wytworzenia pochodnych fluorogennych, które można następnie analizować za pomocą HPLC. Przedstawiony protokół może być również stosowany do analizy próbek mleka i tkanek różnego innego pochodzenia, a także może być przydatny do badania skutków odżywczych i zdrowotnych kwasu N-glikolyloneuraminowego.
Wprowadzenie
Kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac) i kwas N-glikolylneuraminowy (Neu5Gc) są najczęściej występującymi kwasami sjalowymi u większości ssaków1. Chociaż ludzie są zdolni do endogennej syntezy Neu5Ac, nie są zdolni do wytwarzania Neu5Gc z powodu pierwotnej delecji eksonu w genie CMAH kodującym hydroksylazę CMP-Neu5Ac2,3. Jednak produkty spożywcze pochodzenia zwierzęcego mogą być dietetycznymi źródłami Neu5Gc4,5,6, co prowadzi do produkcji przeciwciał anty-Neu5Gc, a tym samym wywołuje odpow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Rolniczego w Nankinie zgodnie z Krajowymi Wytycznymi dla Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych (Ministerstwo Nauki i Technologii, PR Chin, 2006) dla zwierząt trzymanych w obiekcie SPF (ID pozwolenia: SYXK-J-2011-0037).
1. Model myszy Cmah Knock-out
- Użyj myszy C57Bl/6 typu dzikiego z Centrum Medycyny Porównawczej Uniwersytetu w Yangzhou (Chiny).
UWAGA: Myszy z nokautem Cmah zostały wygenerowane na podstawie informacji dostarczonych z poprzednich badań Cmah knock-out
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schematyczny przegląd opisanego procesu analizy przedstawiono na Rysunku 1; obejmuje on izolację kwasów sialowych z próbek mleka i wątroby myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu Cmah, a także fluoryzacyjną derywatyzację i analizę HPLC tych składników. Rysunek 2 i Rysunek 3 przedstawiają reprezentatywne chromatogramy HPLC derywatyzowanych kwasów sialowych z próbek mleka i wątroby mysz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół pozwala na fenotypową ocenę homozygotycznych myszy z nokautem Cmah poprzez analizę i ilościowe określenie względnych ilości Neu5Gc w próbkach mleka i wątroby. Analizę przeprowadzono przy użyciu standardowego zestawu HPLC z detekcją fluorescencyjną. Najbardziej krytycznym etapem tej procedury jest przygotowanie kolumn wymiany anionowej i wykonanie chromatografii anionowymiennej; Prawidłowe osadzenie żywicy i zebranie odpowiednich frakcji płuczących i elucyjnych wymag.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (granty o numerach 31471703, A0201300537 i 31671854 dla J.V. i L.L.) oraz Plan 100 Zagranicznych Talentów (grant numer JSB2014012 dla J.V.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| < silny> Chemikalia: < / silny> | |||
| kwas N-acetyloneuraminowy | Sigma | A0812 | |
| Kwas N-glikolylneuraminowy | Sigma | 50644 | 1 mg podwielokrotność powinna być wystarczająca |
| o-fenylenodiamina | Sigma | 694975 | |
| Wodorosiarczyn sodu | J& K Scientific Ltd | 75234 | |
| Narzędzia/Materiały: | |||
| 3 mL probówki SPE | Supelco | Sigma 57024 | puste kolumny ekstrakcyjne do fazy stałej |
| Króciec Luer | Sigma | S7396 | do zatrzymywania przepływu rurki SPE |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Młynek do tkanek Dounce | Sigma | D8938 | ciasne dopasowanie |
| Analiza HPLC: < / mocna> | |||
| fiolka HPLC o wysokim odzysku | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| System HPLC | Shimadzu | Nexera | |
| do HPLC | Shimadzu | RF-20Axs HPLC Kolumna | |
| Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4,6 mm | |
| LCMS klasy H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS Acetonitryl | Merck Millipore | #100029 | Hipergrade |
| wodorotlenku amonu | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
Bibliografia
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
