Artykuł metodologiczny

Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH.

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56030

⸱

14 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy opartą na HPLC metodę oznaczania kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy.

Streszczenie

CMAH (hydroksylaza kwasu monofosforanu cytydyny-N-acetyloneuraminy) jest odpowiedzialna za utlenianie kwasów cytydynomonofosforanu N-acetyloneuraminy u ssaków. Jednak ludzie nie mogą utleniać kwasu N-acetyleneuraminowego monofosforanu cytydyny do kwasu N-glikolyloneuraminowego monofosforanu cytydyny z powodu pierwotnej delecji eksonu genu CMAH. Aby bardziej szczegółowo zrozumieć skutki i implikacje braku aktywności CMAH, model nokautu Cmah u myszy jest przedmiotem dużego zainteresowania w badaniach podstawowych i stosowanych. Metoda analizy mająca na celu określenie fenotypu tego modelu myszy jest szczegółowo opisana w niniejszym dokumencie i opiera się na wykrywaniu zarówno kwasu N-acetyloneuraminowego, jak i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Camah. Endogenne kwasy sjalowe są uwalniane i derywatyzowane za pomocą o-fenylenodiaminy w celu wytworzenia pochodnych fluorogennych, które można następnie analizować za pomocą HPLC. Przedstawiony protokół może być również stosowany do analizy próbek mleka i tkanek różnego innego pochodzenia, a także może być przydatny do badania skutków odżywczych i zdrowotnych kwasu N-glikolyloneuraminowego.

Wprowadzenie

Kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac) i kwas N-glikolylneuraminowy (Neu5Gc) są najczęściej występującymi kwasami sjalowymi u większości ssaków1. Chociaż ludzie są zdolni do endogennej syntezy Neu5Ac, nie są zdolni do wytwarzania Neu5Gc z powodu pierwotnej delecji eksonu w genie CMAH kodującym hydroksylazę CMP-Neu5Ac2,3. Jednak produkty spożywcze pochodzenia zwierzęcego mogą być dietetycznymi źródłami Neu5Gc4,5,6, co prowadzi do produkcji przeciwciał anty-Neu5Gc, a tym samym wywołuje odpowiedź immunologiczną w kierunku Neu5Gc7. Podejrzewa się, że ten dietetyczny wpływ Neu5Gc przyczynia się do przewlekłych stanów zapalnych i różnych innych chorób8,9,10. Aby kompleksowo zrozumieć wpływ Neu5Gc na ludzi, wysoce pożądany jest model zwierzęcy do systematycznego badania wpływu kwasów sjalowych przenoszonych przez żywność. Chociaż protokoły oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do analizy myszy z nokautem są dobrze ugruntowane i stanowią wygodny sposób oceny genotypu, funkcjonalna analiza fenotypu na poziomie metabolicznym wymaga bardziej szczegółowych metod analizy. Fenotyp mysiego modelu z nokautem Cmah można ocenić, izolując i analizując skład kwasów sjalowych w próbkach wątroby lub mleka. Kilka metod wykrywania kwasów sjalowych w tkankach zwierzęcych zostało wcześniej opisanych: reakcja kwasów sjalowych z rezorcynolem11 lub kwasem tiobarbiturowym12 powoduje powstanie produktu chromoforowego i może być łatwo analizowana za pomocą zestawu opartego na czytniku płytek, ale można określić tylko całkowitą zawartość kwasu sjalowego. Alternatywnie, analizę kwasów sjalowych opisano również za pomocą chromatografii gazowej13, spektrometrii mas MALDI-ToF14 lub metod amperometrycznych15. Jednak najczęściej stosowane metody analizy kwasu sjalowego opierają się na uwalnianiu hydrolitycznym, a następnie derywatyzacji fluorescencyjnej, a następnie wysokosprawnej chromatografii cieczowej16,17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Rolniczego w Nankinie zgodnie z Krajowymi Wytycznymi dla Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych (Ministerstwo Nauki i Technologii, PR Chin, 2006) dla zwierząt trzymanych w obiekcie SPF (ID pozwolenia: SYXK-J-2011-0037).

1. Model myszy Cmah Knock-out

  1. Użyj myszy C57Bl/6 typu dzikiego z Centrum Medycyny Porównawczej Uniwersytetu w Yangzhou (Chiny).
    UWAGA: Myszy z nokautem Cmah zostały wygenerowane na podstawie informacji dostarczonych z poprzednich badań Cmah knock-out17,19 i uzyskane komercyjnie przy użyciu strategii CRISPR/Cas920 poprzez usunięcie 92 par zasad z eksonu 6 genu Cmah, który jest również usunięty w ludzkim genie CMAH19. Myszy z dodatnim F0 (2 osobniki) skrzyżowano z myszami typu dzikiego w celu uzyskania heterozygotycznych myszy F1. Po skrzyżowaniu heterozygotycznych myszy F1 (5 osobników), z powodzeniem uzyskano homozygotyczne myszy F2 z nokautem Cmah (3 osobniki).
  2. Przeprowadź genotypowanie myszy przy użyciu genomowego DNA zgodnie z metodą przedstawioną przez Zangala21 przy użyciu komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA.
    1. Amplifikuj odpowiedni fragment DNA genu Cmah przy użyciu komercyjnej polimerazy DNA i pary starterów 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3' i 5'tttaaaatgtcccgggggagaagc3'. Przeprowadzić amplifikację genu przy użyciu 34 cykli PCR składających się z denaturacji w temperaturze 94 °C przez 40 s, wyżarzania w temperaturze 63 °C przez 40 s i wydłużenia w temperaturze 72 °C przez 1 minutę.
    2. Wizualizacja produktów PCR na 1% żelu agarozowym. Należy obserwować pojedynczy prążek (0,5 kb) dla osobnika typu dzikiego, podwójny prążek (0,4 i 0,5 kb) dla heterozygotycznego osobnika z nokautem i pojedynczy prążek (0,4 kb) dla homozygotycznego osobnika z nokautem.

2. Pobieranie próbek

  1. Zbierz mleko myszy przy użyciu protokołu opisanego przez Willinghama i wsp.22.
  2. Zbierz tkankę wątroby myszy za pomocą protokołu opisanego przez Gonçalvesa i wsp.23 i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.

3. Izolacja kwasów sjalowych z mleka

  1. Przygotować 100 ml 2 M roztworu kwasu octowego, dodając 12 ml lodowatego kwasu octowego do 88 ml destylowanegoH2O.
  2. Przenieść 50 μl mleka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 1,2 ml przygotowanego wodnego roztworu kwasu octowego.
  3. Inkubować zawiesinę przez 4 godziny w temperaturze 80 °C i odwirowywać próbkę przy 14 000 x g przez 10 minut.
  4. Przenieś górne 1 000 μl supernatantu do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i usuń rozpuszczalnik przez odparowanie odśrodkowe w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia (w zależności od dołączonej pompy próżniowej zajmie to 4 - 20 godzin). Ponownie rozpuścić próbkę w 500 μl destylowanegoH2O.
  5. Przygotować kolumnę do wymiany mikroanionów. Ten etap w szczególności wzbogaci związki anionowe i usunie związki kationowe i obojętne z próbek mleka i wątroby, a tym samym zwiększy selektywność fluorogenicznego środka znakującego OPD do derywatyzacji kwasu sjalowego.
    1. Przenieść dla każdej próbki 200 mg żywicy anionowymiennej (Dowex 1X8) do pustych probówek kolumnowych o pojemności 3 ml z dołączonym zaworem odcinającym.
    2. Dodać 2 ml wodnego roztworu kwasu octowego przygotowanego w kroku 3.1 w celu zastąpienia jonów chlorkowych w żywicy jonami octanowymi. Zamknij kurek, gdy tylko rozpuszczalnik dotrze do górnej części żywicy.
    3. Delikatnie dodaj 2 ml destylowanegoH2O, otwórz zawór odcinający i zatrzymaj przepływ, gdy tylko większość rozpuszczalnika dotrze do górnej części żywicy. Upewnij się, że żywica jest zawsze pokryta rozpuszczalnikiem.
    4. Przemyć kolumnę z żywicą jeszcze dwa razy 2 ml destylowanegoH2Ow celu usunięcia nadmiaru octanu.
  6. Przenieść otrzymane 500 μl rozpuszczalnika próbki z kroku 3.4 na kolumnę z żywicą i odrzucić przepływ. Delikatnie przemyć żywicę 2 ml destylowanegoH2O. Aniony próbki próbki z żywicy należy wypłukać za pomocą 1 ml 50 mM roztworu octanu amonu (386 mg octanu amonu rozpuszczonego w 100 ml destylowanegoH2O) do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie odśrodkowe w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
    UWAGA: Suche próbki można przechowywać w temperaturze 4-6 °C przez okres do 12 miesięcy.

4. Izolacja kwasów sjalowych z tkanki wątroby

  1. Delikatnie rozmrozić 20 - 50 mg wątroby myszy i przenieść ją do młynka do tkanek Dounce (1 ml lub 2 ml objętości). Dodać 1,2 ml wodnego roztworu kwasu octowego przygotowanego w kroku 3.1 i homogenizować tkankę przez delikatne ścinanie przez 10 s. Otrzymaną zawiesinę przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Wykonaj kroki od 3.3 do 3.6.
    UWAGA: Suche próbki można przechowywać w temperaturze 4-6 °C przez okres do 12 miesięcy.

5. Przygotowanie mieszanego wzorca kwasu sjalowego

  1. Odważyć od 5 do 8 mg kwasu N-acetyloneuraminowego na wadze analitycznej do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zanotować dokładną masę i dodać 164 μl destylowanegoH2Ona każdy mg (tj. jeśli masa Neu5Ac wynosi 7,2 mg, dodać 7,2 x 164 = 1,181 μL destylowanegoH2O). W ten sposób uzyskuje się roztwór podstawowy Neu5Ac o masie 20 mM, który można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 12 miesięcy.
  2. Otrzymać kwas N-glikolyloneuraminowy w mniejszych ilościach po umiarkowanej cenie, na przykład w podwielokrotnościach 1 mg. Dodać 154 μL destylowanegoH2Obezpośrednio do związku w celu uzyskania ~20 mM roztworu podstawowego Neu5Gc. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 12 miesięcy.
  3. Połączyć 5 μl z każdego roztworu podstawowego z kroków 5.1 i 5.2 do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie odśrodkowe w temperaturze pokojowej do sucha.
    UWAGA: Mieszany wzorzec kwasu sjalowego można przechowywać w temperaturze 4 - 6 °C przez okres do 12 miesięcy.

6. Derywatyzacja fluorescencyjna kwasów sjalowych

  1. Przygotować 10 ml roztworu OPD, składającego się ze 100 mg o-fenylenodiaminy i 208 mg wodorosiarczynu sodu w 10 ml destylowanegoH2O.
  2. Dodać 20 μl roztworu OPD do próbek kwasu sjalowego pochodzących z mleka myszy (krok 3), wątroby myszy (etap 4) lub wzorca mieszanego kwasu sjalowego (etap 5). Wirować energicznie przez 30 s i inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 80 °C w ciemności (tj. owinąć mikroprobówki folią aluminiową).
  3. Pozostawić próbki do ostygnięcia przez 5 minut, dodać 80 μl destylowanegoH2Oi odwirować probówki o stężeniu 14 000 x g przez 1 minutę.
  4. Przenieść 80 μl z supernatantu do 300 μl fiolki HPLC o wysokim stopniu odzysku. Derywatyzowane próbki kwasu sjalowego można przechowywać w temperaturze 4 - 6 °C przez okres do jednego tygodnia.

7. Analiza HPLC pochodnych kwasu sjalowego

  1. Analizuj próbki za pomocą standardowego systemu HPLC podłączonego do detektora fluorescencyjnego online.
  2. Do analizy należy użyć kolumny C18 z odwróconą fazą o standardowych wymiarach 250 mm długości i 4,6 mm średnicy.
  3. Przygotować rozpuszczalnik A, rozcieńczając 200 ml roztworu podstawowego 800 ml wody klasy LCMS (LCMS - chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas). Sam roztwór podstawowy można przygotować w następujący sposób:
    1. Dodać 46 g kwasu mrówkowego do 800 mlH2Oklasy LCMS.
    2. Doprowadzić pH do 4,5, dodając kroplami roztwór wodorotlenku amonu (puriss. p.a.).
    3. Przenieść rozpuszczalnik do cylindra miarowego i napełnić do 1 000 ml pojemnikiem H2Oklasy LCMS. Ten roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze 4 - 6 °C przez okres do 3 miesięcy.
  4. W przypadku rozpuszczalnika B należy użyć acetonitrylu klasy LCMS.
  5. Rozdzielić pochodne kwasów sjalowych przy natężeniu przepływu 1 ml/min z następującą elucją:
    1. Zacznij od dodania 10% rozpuszczalnika B zmieszanego z rozpuszczalnikiem A.
    2. Od 0 min do 15 min stopniowo zwiększaj udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym do 60%.
    3. Od 15 min do 16 min szybko zwiększ udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym od 60% do 90%. To inicjuje mycie kolumny HPLC.
    4. W celu dalszego przepłukania kolumny HPLC należy utrzymać poziom rozpuszczalnika B na poziomie 90% w okresie od 16 min do 18 min, a następnie stopniowo ponownie zmniejszać poziom rozpuszczalnika B do 10% między 18 min a 19 min.
    5. Ponownie wyrównać kolumnę HPLC do warunków początkowych 10% B między 19 a 24 min.
  6. Wstrzyknąć 50 μl próbki do systemu HPLC.
  7. Monitorować eluenty za pomocą detektora fluorescencji o długości fali wzbudzenia/emisji 373/448 nm, a derywatyzowanych kwasów sjalowych można oczekiwać w przybliżonych czasach retencji 9 min (dla Neu5Gc-OPD) i 10 min (dla Neu5Ac-OPD).
  8. Obliczyć względną ilość Neu5Gc (FNeu5Gc) z obszarów pików fluorescencji Neu5Ac (ANeu5Ac) i Neu5Gc (ANeu5Gc) w następujący sposób: FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). W przypadku próbek mleka i wątroby od homozygotycznej myszy z nokautem Cmah FNeu5Gc powinien wynosić 0%, podczas gdy wartości dla FNeu5Gc myszy heterozygotycznych i dzikich mogą się znacznie różnić w zależności od wieku myszy i rodzaju tkanki (od 2% do >90%), przy oczekiwanym marginesie błędu ±12%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny przegląd opisanego procesu analizy przedstawiono na Rysunku 1; obejmuje on izolację kwasów sialowych z próbek mleka i wątroby myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu Cmah, a także fluoryzacyjną derywatyzację i analizę HPLC tych składników. Rysunek 2 i Rysunek 3 przedstawiają reprezentatywne chromatogramy HPLC derywatyzowanych kwasów sialowych z próbek mleka i wątroby mysz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół pozwala na fenotypową ocenę homozygotycznych myszy z nokautem Cmah poprzez analizę i ilościowe określenie względnych ilości Neu5Gc w próbkach mleka i wątroby. Analizę przeprowadzono przy użyciu standardowego zestawu HPLC z detekcją fluorescencyjną. Najbardziej krytycznym etapem tej procedury jest przygotowanie kolumn wymiany anionowej i wykonanie chromatografii anionowymiennej; Prawidłowe osadzenie żywicy i zebranie odpowiednich frakcji płuczących i elucyjnych wymag...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (granty o numerach 31471703, A0201300537 i 31671854 dla J.V. i L.L.) oraz Plan 100 Zagranicznych Talentów (grant numer JSB2014012 dla J.V.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< silny> Chemikalia: < / silny>
kwas N-acetyloneuraminowySigmaA0812
Kwas N-glikolylneuraminowySigma506441 mg podwielokrotność powinna być wystarczająca
o-fenylenodiaminaSigma694975
Wodorosiarczyn soduJ& K Scientific Ltd75234
Narzędzia/Materiały:
3 mL probówki SPESupelcoSigma 57024puste kolumny ekstrakcyjne do fazy stałej
Króciec LuerSigmaS7396do zatrzymywania przepływu rurki SPE
Dowex 1X8Dow ChemicalsSigma 44340200 - 400 mesh
Młynek do tkanek DounceSigmaD8938ciasne dopasowanie
Analiza HPLC: < / mocna>
fiolka HPLC o wysokim odzyskuAgilent Technologies#5188-2788
System HPLCShimadzuNexera
do HPLCShimadzuRF-20Axs HPLC Kolumna
PhenomenexHyperclone ODS250 x 4,6 mm
LCMS klasy H2OMerck Millipore#WX00011
LCMS AcetonitrylMerck Millipore#100029Hipergrade
wodorotlenku amonuFluka#44273puriss. P.a.
Detektor fluorescencji roztwór

Bibliografia

  1. Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
  2. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
  3. Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
  4. Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
  5. Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
  6. Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
  7. Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
  8. Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
  9. Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
  10. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  11. Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
  12. Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
  13. Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
  14. Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
  15. Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
  16. Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
  17. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  18. Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
  19. Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246(2007).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169(2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza kwasu sialowegodetekcja HPLCkwas N acetyloneuraminowykwas N glikolyloneuraminowypochodniowanie o fenylenodiaminchromatografia wymiany anionowejizolacja tkanki w trobyprzygotowanie pr bek mlekadetekcja fluorescencyjna

Powiązane artykuły