Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pozioma elektroforeza żelowa w celu lepszego wykrywania kompleksów białko-RNA

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56031

⸱

28 lipca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest podstawowym narzędziem do analizy interakcji RNA-białko. Tradycyjnie w większości eksperymentów używano żeli pionowych. Jednak żele poziome mają kilka zalet, takich jak możliwość monitorowania kompleksów podczas elektroforezy. Udostępniamy szczegółowy protokół generowania i stosowania poziomej natywnej elektroforezy żelowej.

Streszczenie

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest podstawowym narzędziem biologii molekularnej, które jest szeroko stosowane do analizy biochemicznej oddziaływań RNA-białko. Oddziaływania te były tradycyjnie analizowane za pomocą żeli poliakrylamidowych generowanych między dwiema szklanymi płytkami i próbkami elektroforezowanymi pionowo. Jednak żele poliakrylamidowe zalewane w tackach i elektroforezowane poziomo mają kilka zalet. Na przykład poziome żele używane do analizy kompleksów między fluorescencyjnymi substratami RNA a określonymi białkami mogą być wielokrotnie obrazowane w miarę postępu elektroforezy. Daje to unikalną możliwość monitorowania kompleksów RNA-białko w kilku momentach eksperymentu. Ponadto pozioma elektroforeza żelowa umożliwia równoległą analizę wielu próbek. Może to znacznie ułatwić eksperymenty w czasie, a także analizę wielu reakcji jednocześnie w celu porównania różnych składników i warunków. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania i wykorzystywania poziomej natywnej elektroforezy żelowej do analizy interakcji RNA-białko.

Wprowadzenie

Testy przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) okazały się nieocenionym narzędziem biochemicznym do analizy specyficznych interakcji białko-kwas nukleinowy1,2,3. Testy te mogą dostarczyć ważnych informacji na temat powinowactwa białek do RNA lub DNA3, stechiometrii składowej kompleksów kwas-białko nukleinowy1 i dostarczyć ważnych nowych informacji na temat specyficzności wiązania białek wiążących RNA poprzez eksperymenty z konkurencją substratów1.

Tradycyjna konfiguracja eksperymentalna dla tych testów polega na mieszaniu oczyszczonego białka z radioznakowanym substratem RNA. Powstałe kompleksy są następnie analizowane za pomocą niedenaturujących (natywnych) żeli poliakrylamidowych wlewanych między dwie szklane płytki, a następnie elektroforeza próbki w aparacie pionowym3. Chociaż podejście to zostało wykorzystane w sposób wyczerpujący w celu uzyskania ważnych informacji na temat mechanizmów biochemicznych, które leżą u podstaw wiązania białek z kwasami nukleinowymi, ma ono również kilka ograniczeń. Na przykład ta podstawowa strategia ma stosunkowo niską przepustowość i nie można jej łatwo dostosować do aplikacji, które wymagają równoległego analizowania wielu reakcji wiązania. Ponadto, w przypadku tradycyjnej aparatury pionowej, trudno jest potencjalnie monitorować kompleksy w wielu momentach podczas elektroforezy3,4.

Tutaj prezentujemy adaptację testu EMSA, która wykorzystuje natywne żele poliakrylamidowe odlane w aparacie płaskim, poziomą elektroforezę i fluorescencyjnie znakowane substraty RNA4,5,6,7. Włączenie tych stosunkowo prostych modyfikacji do podstawowej strategii zapewnia kilka potężnych korzyści. W szczególności poziomy format płaski z łatwością nadaje się do jednoczesnej analizy dziesiątek próbek4. Ponadto, w przypadku niektórych kompleksów RNA-białko, takich jak te utworzone między białkiem Bicaudal-C a jego substratem RNA, elektroforeza w poziomym żelu zapewnia zwiększoną zdolność do rozpoznawania odrębnych kompleksów RNA-białko i odróżniania ich od niezwiązanego substratu RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie poziomego natywnego żelu poliakrylamidowego4.

  1. Przygotowanie potrzebnych materiałów.
    1. Do poziomego aparatu żelowego użyj pudełka żelowego (37 cm x 24 cm) z tacą o wymiarach 27 cm x 21 cm i pojemnością na dwa 24-dołkowe grzebienie. Ta konfiguracja zapewnia łącznie 48 próbek, które mogą być analizowane jednocześnie.
    2. Przygotuj następujące odczynniki: 40% Acrylamide-Bis 19:1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED i 10% APS (nadsiarczan amonu).
  2. Wytwarzanie 10% natywnego żelu akrylowego.
    1. W kolbie o pojemności 500 ml dodaj 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% akrylamidu i wodę do końcowej objętości 400 ml.
    2. Dodać 4 ml 10% APS i 400 μl TEMED. Dobrze wymieszaj.
    3. Wlej mieszaninę do poziomej tacki odlewniczej i pozwól żelowi polimeryzować przez 30 minut. Żel będzie miał grubość około 2 cm.
      UWAGA: Żele można odlewać w dygestorium, aby przyspieszyć polimeryzację. Po polimeryzacji na wierzchu żelu pozostanie cienka warstwa płynu.
    4. Wylej płyn i spłucz działającym buforem. Ostrożnie wyjmij grzebień (grzebienie) i przepłucz studzienki bieżącym buforem za pomocą strzykawki.
  3. Przygotowanie bufora uruchomieniowego.
    1. Przygotuj 2 l bufora do biegania 1x TBE do pudełka na żel. Rozcieńczyć 400 ml 5XTBE w 1600 ml i wymieszać. Umieść 1x bufor TBE w chłodni do ostygnięcia.
  4. Wstępne uruchamianie żelu
    1. Dodaj 2 l zimnego buforu do pudełka z żelem i włóż żel.
    2. Żel należy wstępnie uruchomić pod napięciem 120 V przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w chłodni. W tym czasie należy przygotować reakcję wiązania.

2. Reakcja wiązania8

  1. 2.1.Przygotować następujące składniki reakcji.
    20 mM naziemna telewizja cyfrowa
    10 mM BSA
    10 mM drożdżowych tRNA
    5X bufor wiążący (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20)
    100 nM znakowane fluoresceiną RNA zakupione komercyjnie
    Skoncentrowane białko Bicaudal-C
    50% glicerol w H2O
    z powłoką DEPC H2O z powłoką DEPC
  2. Zmontować składniki reakcji wiązania w probówce mikrowirówki wolnej od RNazy.
    1. Do probówki dodać 5 μl 10 mM BSA, 5 μL 20 mM DTT, 5 μL 10 mM tRNA drożdży, 10 μL 5x buforu wiążącego.
  3. Dodać białko do końcowego stężenia 250 nM w 50 μl. Dodać wodę do końcowej objętości 45 μl.
  4. Dodać 5 μl znakowanego fluorescencyjnie substratu RNA. Użyj zakupionego komercyjnie 3-' substratu 32-nukleotydowego znakowanego fluoresceiną.
  5. Mieszać i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

3. Analiza próbek na natywnym poziomym żelu poliakrylamidowym

  1. Do każdej reakcji dodaj 15 μl 50% glicerolu i delikatnie wymieszaj.
  2. Ostrożnie dodaj 30 μl każdej reakcji do żelu. Ilość próbki, którą można załadować do pojedynczego dołka, różni się w zależności od grubości żelu i wielkości studzienek. Do pojedynczej studzienki żeli utworzonych za pomocą 24-dołkowego grzebienia i rozlanych do grubości 24 cm załadowaliśmy objętości od 15 μl do 45 μl.
  3. Po podłączeniu zasilacza do aparatu żelowego należy włączyć zasilanie i wyregulować napięcie. Uruchomić żel w temperaturze 4 °C przy napięciu 120 V.
    UWAGA: W przypadku poziomego aparatu żelowego wynosi to około 5 V/cm. W przypadku pionowego aparatu żelowego jest to 16 V/cm.
    1. Aby zapobiec uszkodzeniu lub wybieleniu znakowanego fluorescencyjnie RNA, należy przeprowadzić elektroforezę w ciemności.
    2. Różnicować czasy elektroforezy w zależności od specyfiki analizowanego kompleksu RNA-białko.
      UWAGA: Główną zaletą poziomej analizy EMSA jest to, że elektroforezę można zatrzymać, zobrazować żel, a następnie żel można umieścić z powrotem w aparacie, a elektroforezę można kontynuować przez dłuższy czas.

4. Obrazowanie żelu

  1. Wykonuj analizy za pomocą dowolnego urządzenia przeznaczonego do wykrywania i obrazowania podłoży fluorescencyjnych.
  2. Umieść żel na imagerze.
  3. Dostosuj ustawienia imagera. W przypadku ligandów RNA znakowanych fluoresceiną należy użyć następujących ustawień: FAM (długość fali 473 nm), napięcie fotopowielacza 750 (PMT), rozmiar piksela 100 μm.
  4. Zeskanuj żel, aby uchwycić obraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność i wszechstronność poziomej natywnej elektroforezy w żelu, przeanalizowano wiązanie białka Bicaudal-C (Bicc1) z Xenopus z fluorescencyjnie znakowanym RNA zawierającym miejsce wiązania Bicc1. Białka Bicc1 pełnią funkcję specyficznych dla mRNA represorów translacji, kontrolując decyzje dotyczące losu komórek podczas maciernych etapów rozwoju zwierząt9,10,11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Natywne żele poliakrylamidowe są nieocenionym narzędziem do badania interakcji białko-RNA i tradycyjnie żele te są elektroforezowane w pionie 2,3. Zastosowaliśmy modyfikację protokołu, która zastępuje natywne żele poliakryloamidowe stworzone i elektroforezowane poziomo 1,4,6,7,15. Zmiany te stosowane w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Laurze Vanderploeg za przygotowanie figur. Praca w laboratorium Arkuszy jest wspierana przez 1050395 grantowe NSF i grant NIH (R21HD076828). Prace w laboratorium Ryder są wspierane przez granty NIH R01GM117237 i R01GM117008. Megan Dowdle jest wspierana przez stypendium SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship za pośrednictwem University of Wisconsin-Madison Graduate School oraz Biotechnology Training Program za pośrednictwem National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (T32GM008349).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poziome pudełko żeloweOWLN/AProdukt nie jest już produkowany. Podobne pudełka żelowe można znaleźć w Thermo Scientific, pudełka żelowe z serii A. Numer katalogowy: A2-BP
24-dołkowe duże poziome grzebienie do elektroforezy żelowejOWLN/AProdukt już nie produkowany. Podobne pudełka żelowe można znaleźć w Thermo Scientific, grzebienie do pudełek żelowych z serii A. Numer katalogowy: A2-24C
Powerpac 300Bio-Rad1655050
Mini-Protean II Komórka do elektroforezyBio-Rad165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Akrylamid/BisIBIIB70015
TEMEDIBIIB70120
APSIBIIB70080
Drożdżowe tRNAAmbionAM7119
Fluoresceina oznaczona RNAIDTN/AZamówienie może być dostosowane do długości i pożądanej sekwencji
Hydrat soli tetrasodowej EDTASigma-AldrichE5391-1KG
HEPESSigma-AldrichH4034-500G
Tris Base UltrapureUS BiologicalT8600
Kwas borowyFisher ScientificBP168-500
Chlorek potasuFisher ScientificBP366-1
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
DEPCSigma-Aldrich1609-47-8
Ditiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483 12 3
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8

Bibliografia

  1. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  2. Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
  5. Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
  6. Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
  7. Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
  8. Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
  9. Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386(2012).
  10. Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  11. Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  12. Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  13. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  14. Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  15. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
  16. Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Natywny PAGEoddzia ywania RNA bia koEMSA analiza przesuni cia mobilno ci elektroforetycznejfluorescencyjne substraty RNAanaliza obrazowania elir wnoleg a analiza pr bekeksperymenty z przebiegiem czasowymelektroforeza w ch odnibufor do prowadzenia TBE
Pozioma elektroforeza żelowa w celu lepszego wykrywania kompleksów białko-RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.