Artykuł metodologiczny

Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56034

⸱

24 października 2017

 ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Colloids and Interfaces

W tym artykule

Podsumowanie

Eksperymenty na oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) często zaniedbują fizjologiczne warunki roztworu. W pracy przedstawiono podejścia do badania wpływu buforu o wysokim zasoleniu na separację faz ciecz-ciecz w naładowanych wieloskładnikowych GUV w funkcji asymetrii i temperatury roztworu transmembranowego.

Streszczenie

Oddzielone fazowo gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) wykazujące współistniejące domeny uporządkowane cieczą i nieuporządkowane cieczą są powszechnym narzędziem biofizycznym do badania hipotezy tratwy lipidowej. Liczne badania zaniedbują jednak wpływ warunków fizjologicznych roztworu. W związku z tym w niniejszej pracy przedstawiono wpływ asymetrii o wysokim zasoleniu i roztworów transbłonowych na separację fazy ciecz-ciecz w naładowanych GUV wyhodowanych z dioleylfosfatydyloglicerolu, sfingomieliny jaj i cholesterolu. Efekty badano w warunkach izotermicznych i zmiennych temperaturach.

Opisujemy sprzęt i strategie eksperymentalne mające zastosowanie do monitorowania stabilności współistniejących domen cieczy w naładowanych pęcherzykach w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu o wysokim zasoleniu. Obejmuje to podejście polegające na przygotowaniu naładowanych wieloskładnikowych GUV w buforze o wysokim zasoleniu w wysokich temperaturach. Protokół zakłada możliwość przeprowadzenia częściowej wymiany roztworu zewnętrznego poprzez prosty etap rozcieńczania przy jednoczesnej minimalizacji rozcieńczenia pęcherzyków. Przedstawiono alternatywne podejście wykorzystujące urządzenie mikroprzepływowe, które pozwala na pełną wymianę roztworu zewnętrznego. Badano również wpływ roztworu na separację faz w różnych temperaturach. W tym celu przedstawiamy podstawowy projekt i użyteczność wbudowanej we własnym zakresie studzienki kontroli temperatury. Ponadto zastanawiamy się nad oceną stanu fazowego GUV, pułapkami z nim związanymi i sposobami ich obejścia.

Wprowadzenie

Od czasu obserwacji domen o rozmiarach mikronów w oddzielonych fazami ciekły-ciecz gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, GUV były używane jako system modelowy do badania hipotezy tratwy lipidowej1,2,3. Ponieważ obszar ich wolnostojącej dwuwarstwy leży w zasięgu komórek biologicznych, są one odpowiednimi naśladowcami błon plazmatycznych z hipotetycznymi tratwami. Liczne badania nad takimi GUV przeprowadzono z pęcherzykami rozproszonymi w czystej wodzie, sacharozie lub roztworach o niskim zasoleniu4,5,6,7,8. Warunki te nie odzwierciedlają jednak fizjologicznie istotnego narażenia błon biologicznych na środowisko o wysokim zasoleniu i asymetrii roztworu transbłonowego, tak jak ma to miejsce w przypadku komórek.

W tej pracy i w poprzedniej publikacji z naszej grupy9, stany fazowe naładowanych wieloskładnikowych GUV zostały zbadane jako funkcja obecności soli i asymetrii roztworu w poprzek membrany. GUV przygotowano z mieszanin dioleoilofosfatydyloglicerolu (DOPG), sfingomieliny jaj (eSM) i cholesterolu (Chol) w roztworze sacharozy (o osmolarności 210 mOsm/kg) lub buforze o wysokim zasoleniu (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 210 mOsm/kg). Wybór lipidów był uzasadniony danymi uzyskanymi już na schemacie fazowym tej mieszaniny6,8.

W literaturze dostępnych jest wiele metod przygotowania GUVów10,11,12 (zauważ, że tutaj nie będziemy rozważać tych obejmujących transfer lipidów z fazy olejowej do fazy wodnej13,14 ze względu na nieodłączne niebezpieczeństwo pozostałości oleju w membranie, które mogą wpływać na zachowanie fazowe). Przygotowanie GUV w buforze o wysokim zasoleniu wiąże się ze szczególnymi wyzwaniami. W przypadku roztworów o niskiej sile jonowej metoda elektroformacji15,16 przedstawia szybki sposób przygotowania GUV o wysokiej wydajności z niewielkimi wadami10,17. Metoda opiera się na osadzaniu warstwy lipidów na powierzchni przewodzącej (elektrodzie), suszeniu ich i nawilżaniu roztworem wodnym przy jednoczesnym zastosowaniu pola prądu przemiennego. Jednak ta metoda wymaga korekt, jeśli w roztworze wodnym znajduje się sól18,19. Zakłada się, że siłą napędową wzrostu pęcherzyków przez elektroformację jest elektroosmoza16, która jest utrudniona przy wysokich przewodnościach20. W związku z tym pęcznienie elektryczne GUV w roztworach o wysokim zasoleniu nie jest prostym podejściem, ponieważ wymaga optymalizacji pod kątem różnych stężeń soli obecnych w roztworze pęczniejącym. Pęcznienie pęcherzyków wspomagane żelem21,22 to potencjalna alternatywa dla elektroformacji o jeszcze szybszym czasie powstawania. Podejście to opiera się na zwiększonym uwodnieniu filmu lipidowego, gdy jako substrat stosuje się żel (agarozę lub alkohol poliwinylowy (PVA)). Podejścia te wiążą się jednak z ryzykiem zanieczyszczenia membrany w przypadku pęcznienia na bazie agarozy23 i/lub limitów temperatury, jak w przypadku pęcznienia na bazie PVA. Podobnie, niedawno ustanowiono protokół uprawy GUV na podłożu z papieru celulozowego24. Ogólnym problemem tej metody jest brak kontroli nad czystością substratu, a także stosowanie dużych ilości lipidów. W tej pracy przedstawimy i przedstawimy zalety najbardziej tradycyjnej metody przygotowania GUV, a mianowicie metody spontanicznego pęcznienia25,26. Polega ona na wysuszeniu warstwy lipidowej na podłożu lipofobicznym, uwodnieniu jej w atmosferze pary wodnej, a następnie pęcznieniu w pożądanym roztworze pęczniejącym (patrz Rysunek 1 i szczegóły w sekcji Protokół). Metoda ta nie zapewnia kontroli nad rozkładem wielkości pęcherzyków i skutkuje ogólnie mniejszymi pęcherzykami w porównaniu z metodami, w których produkcja jest wspomagana przez pole elektryczne, podłoże polimerowe lub środki mikroprzepływowe. Jednak jakość i rozmiar pęcherzyków jest odpowiedni do badania stanu fazy błonowej, jak opisano tutaj.

Tworzenie asymetrii między roztworami w poprzek błony pęcherzykowej wiąże się również z pewnymi wyzwaniami. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest bezpośrednie rozcieńczenie zawiesiny pęcherzyków w pożądanym roztworze zewnętrznym27,28. Jednak zmniejsza to również gęstość rozmieszczenia pęcherzyków. Inną strategią jest powolna wymiana roztworu zewnętrznego wokół GUV osadzonych na dnie komory przepływowej, która umożliwia dopływ i odpływ roztworu. Aby uniknąć zakłócenia lub nawet utraty pęcherzyków wraz z przepływem, stosuje się niskie natężenia przepływu8, co sprawia, że takie podejście jest nieefektywne czasowo. Co więcej, żadne z tych podejść nie gwarantuje pełnej wymiany rozwiązań zewnętrznych. Oczywistym rozwiązaniem jest unieruchomienie pęcherzyków, aby uniknąć ich utraty podczas zewnętrznej wymiany roztworu. Na przykład, biotynylowane GUV mogą być przywiązane do powierzchni pokrytej streptawidyną29. Jednak takie podejście może prowadzić do różnic w składzie na przylegających, a tym samym nieprzylegających segmentach membrany30,31. Zastosowanie pól magnetycznych lub elektrycznych do wychwytywania pęcherzyków powoduje nałożenie napięcia błony32. Użycie pęsety optycznej do uwięzienia pęcherzyka wymaga dołączenia uchwytu (tj. koralika), podczas gdy użycie napinacza optycznego może wiązać się z miejscowym ogrzewaniem33. Pułapkowanie GUV można również osiągnąć poprzez hodowanie ich na drutach platynowych bez końcowego odłączania34. W ten sposób powstają pęcherzyki, które nie są izolowane i które są zwykle połączone z drutami lub innymi pęcherzykami za pomocą cienkich rurek lipidowych (pęt).

Prezentowana praca podkreśla strategie przezwyciężania wyżej wymienionych ograniczeń. W pierwszej kolejności przedstawiamy szczegółowy opis metody spontanicznego pęcznienia dostosowanej i zoptymalizowanej do produkcji GUV w o wysokim zasoleniu. Następnie wprowadzamy dwa podejścia do efektywnego tworzenia asymetrycznych warunków roztworu poprzez proste rozcieńczenie lub wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego. Ponieważ naszym celem jest analiza stanu fazy membranowej GUV w różnych warunkach roztworu, kolejne sekcje opisują kryteria udanej analizy statystycznej i przedstawiają wskazówki, jak uniknąć błędnej kategoryzacji.

Analizy były wykonywane w warunkach izotermicznych, jak również w różnych temperaturach. Podczas gdy kontrola temperatury jest powszechnie stosowana, szczegóły dotyczące eksperymentalnych komór kontroli temperatury są rzadko opisywane. Tutaj prezentowana jest wbudowana przez nas konfiguracja do obserwacji GUV w różnych warunkach temperaturowych.

Protokół

1. Spontaniczne pęcznienie GUV

UWAGA: Chloroform jest substancją szkodliwą i bardzo lotną. Wszystkie operacje z wykorzystaniem chloroformu należy przeprowadzać w dygestorium. Do przenoszenia i/lub przechowywania roztworów chloroformu nie należy używać plastikowych naczyń laboratoryjnych, takich jak końcówki do pipet czy plastikowe pojemniki. Chloroform rozpuszcza plastik, co prowadzi do zanieczyszczenia roztworu. Zamiast tego należy stosować szklane strzykawki i szklane naczynia. Ponadto należy pracować jak najczyściej, aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczeń, ponieważ mogą one oddziaływać na membrany. Należy pamiętać, że typowe stężenia lipidów w końcowych preparatach GUV są w zakresie mikromolarnym, zatem zanieczyszczenia w tym zakresie stężeń mogą wywierać silny wpływ na właściwości membrany.

  1. Oprócz podstawowego wyposażenia należy przygotować następujące elementy.
    1. Przygotować płytkę z politetrafluoroetylenu (PTFE, powszechnie znanego jako Teflon) do osadzania lipidów o rozmiarze ~1,5 cm x 1,5 cm i odpowiedniej grubości. Jedną stronę płytki należy zmatowić drobnym papierem ściernym.
      UWAGA: PTFE jest lipofobowy i nie będzie zwilżany przez roztwory chloroformu, jeśli powierzchnia będzie gładka. Obie strony płytki PTFE można zmatowić, aby uniknąć pomyłki w wyborze właściwej strony do osadzania lipidów. Grubość płytki powinna być dobrana tak, aby ułatwić manipulację, np. aby nie była zbyt elastyczna i mogła zostać łatwo przykryta roztworem hydratacyjnym (patrz Rysunek 1). W tym przypadku użyto płytek o grubości ~2 mm. Po zmatowieniu płytka PTFE może być ponownie wykorzystana w nowych eksperymentach po odpowiednim oczyszczeniu (krok 1.3).
    2. Przygotować szczelnie zamykaną fiolkę szklaną o odpowiedniej objętości (~15 mL) do końcowej hydratacji filmu lipidowego i wzrostu pęcherzyków.
    3. Przygotować szczelnie zamykany pojemnik szklany, do którego mieści się fiolka szklana ~15 mL; będzie on służył do stworzenia atmosfery nasyconej wodą w celu wstępnego pęcznienia filmu lipidowego, patrz Rysunek 1.
  2. Przygotować 4 mM roztwory stokowe lipidów w pożądanym stosunku 1,2-dioleoil-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolu) (sól sodowa) (DOPG), sfingomieliny jajecznej (eSM) i cholesterolu (Chol), z dodatkiem 0,1 mol% nadchloranu 1,1′-dioctadecylo-3,3,3′,3′-tetrametyloindokarbocjaniny (DiIC18) do całkowitej koncentracji lipidów 4 mM. Jako rozpuszczalnika należy użyć chloroformu. Patrz Tabela materiałów.
  3. Płytkę PTFE oraz pojemnik szklany należy dokładnie wypłukać kolejno komercyjnym detergentem do naczyń, etanolem i chloroformem, a na koniec osuszyć.
  4. Za pomocą szklanej strzykawki nanieść i równomiernie rozprowadzić 10 - 15 µL roztworu stokowego lipidów na zmatowioną stronę płytki PTFE, aby utworzyć jednolity film lipidowy. W razie potrzeby do rozprowadzenia roztworu należy użyć igły strzykawki.
  5. Umieścić płytkę PTFE na czystej powierzchni i poddać ją wraz z osadzonym filmem lipidowym desykacji przez 2 h w temperaturze 60 °C w celu usunięcia chloroformu. Dla wygody, podczas desykacji płytkę można umieścić w oczyszczonym i niezamkniętym szklanym pojemniku 15 mL.
    UWAGA: Wysoka temperatura zapewnia, że film lipidowy znajduje się w jednorodnym stanie jednofazowym w tym oraz we wszystkich kolejnych krokach.
  6. Po desykacji napełnić szklany pojemnik do wstępnego pęcznienia wodą dejonizowaną do poziomu, który nie pozwoli na wywrócenie fiolki szklanej ~15 mL wskutek wyporności (~1 cm), patrz Rysunek 1.
  7. Włożyć fiolkę szklaną ~15 mL z płytką PTFE do pojemnika i przykryć go, aby mogła wytworzyć się atmosfera nasycona wodą, patrz Rysunek 1B.
    UWAGA: Skroplona woda na wewnętrznych ściankach pojemnika jest dobrym wskaźnikiem pomyślnego nasycenia parą wodną.
  8. Pozostawić osadzony film lipidowy do wstępnego pęcznienia w zamkniętym szklanym pojemniku w temperaturze 60 °C przez 4 h. W tym czasie przygotować pożądany roztwór do pęcznienia.
    UWAGA: W przypadku preparacji pęcherzyków, które mogą być prowadzone w niższej temperaturze, czas ten można znacznie skrócić – nawet do kilku minut – jeśli zamiast tego do wstępnego pęcznienia użyje się ciepłego azotu lub argonu nasyconego wodą.
    1. Przygotować 200 mM sacharozy lub 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 dostosowane za pomocą HCl i podgrzać do 60 °C, aby otrzymać roztwór do pęcznienia.
  9. Po wstępnym pęcznieniu wyjąć fiolkę szklaną ~15 mL z płytką PTFE z pojemnika. Za pomocą strzykawki połączonej z filtrem 0,45 µm dodać ~5 mL roztworu do pęcznienia do fiolki szklanej 15 mL, aby nawodnić film lipidowy.
    UWAGA: Przymocowanie igły do filtra ułatwia wprowadzanie roztworu do pęcznienia. Zaleca się wstępne podgrzanie strzykawki i filtra, aby zapewnić jednofazowy stan filmu lipidowego podczas dodawania roztworu do pęcznienia. Filtrowanie roztworu minimalizuje zanieczyszczenia (organiczne i nieorganiczne), takie jak bakterie czy osady soli itp.
  10. Szczelnie zamknąć fiolkę szklaną ~15 mL zawierającą uwodniony film lipidowy na płytce PTFE, aby zminimalizować parowanie. W razie potrzeby użyć folii parafinowej w celu wzmocnienia uszczelnienia. Pozostawić uwodniony film lipidowy w temperaturze 60 °C przez noc w celu końcowego pęcznienia GUV.

2. Pozyskiwanie GUV

UWAGA: Agregacja GUV-ów spuchniętych i oddzielonych od podłoża PTFE skutkuje powstaniem niewielkiego (~1 mm), chmurowatego skupiska widocznego gołym okiem. W przypadku nieużycia barwnika fluorescencyjnego skupisko to ma białawy kolor. W przeciwnym razie jest ono zabarwione zgodnie ze spektrum absorpcyjnym fluoroforu. Dodanie DiIC18 nadaje chmurce różowy kolor (patrz Rysunek 2). Pęcherzyki są skoncentrowane w agregacie, a jego odzyskanie maksymalizuje wydajność pęcherzyków.

  1. Schłodzić pęcherzyki do temperatury pokojowej w ciągu ok. 1 h. Odciąć ok. 1/10 szpiczastego końca plastikowego tipa do pipety tłokowej, aby skupisko lub agregat pęcherzyków mogło przejść przez otwór.
    UWAGA: Szybkość chłodzenia jest szczególnie istotna, jeśli przewidywane jest rozdział faz stała-ciecz, ponieważ wpływa ona na rozmiar domen stałych. W tym przypadku, aby spowolnić chłodzenie, próbkę umieszczono w kontakcie z metalowym blokiem o wymiarach 5 cm x 9,5 cm x 7,5 cm (W x D x Sz), który schłodził się do temperatury pokojowej w ciągu 1 h.
  2. Pobrać pipetą skupisko wraz z odpowiednią objętością roztworu pęczniejącego (patrz Rysunek 2). Ponownie zawiesić agregat w roztworze pęczniejącym, aby stworzyć symetryczne warunki roztworu, lub w dowolnym pożądanym roztworze izoosmotycznym, aby stworzyć asymetryczne warunki roztworu.
    UWAGA: Dolna granica objętości jest ograniczona rozmiarem agregatu, który ma zostać całkowicie odzyskany. Roztwór zewnętrzny ulega rozcieńczeniu i w celu oceny dokładnego stężenia należy uwzględnić objętość roztworu pęcherzyków.

3. Obserwacja GUV w celu oceny stanu fazowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

UWAGA: GUV zostały domieszkowane DiIC18 jako markerem fluorescencyjnym. Fluorofor ten preferencyjnie rozdziela się do fazy ciekłej nieuporządkowanej (Ld). Umożliwia to obserwację domen powstających w wyniku separacji faz w GUV za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ocenę stanu fazowego przeprowadziliśmy przy użyciu mikroskopii epi-fluorescencyjnej. W zasadzie obserwacje te są możliwe również z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skaningowej (CLSM), która pozwala także na kwantyfikację sygnału (np. w celu określenia jednowarstwowości błony). Jednakże CLSM wymaga bardziej zaawansowanego sprzętu, a obserwacje epi-fluorescencyjne przed skanowaniem są w każdym przypadku pomocne.

  1. Wybierz obiektyw (np. powiększenie 40X z aperturą numeryczną (NA) 0,6, jak zastosowano w tym przypadku) do obserwacji GUV i stosuj go konsekwentnie podczas porównywania stanów fazowych o tym samym składzie w różnych warunkach roztworu. Użyj odpowiednich filtrów długości fal wzbudzenia i emisji, aby umożliwić obserwacje fluorescencyjne z użyciem zastosowanego fluoroforu (np. wzbudzenie przy 560 ± 40 nm i 630 ± 75 nm z dzielnikiem wiązki 585 nm pomiędzy nimi, jak zastosowano dla DiIC18).
    UWAGA: Granice stanów fazowych w wykreśle fazowym będą zależeć od rozdzielczości osiąganej przez obiektyw, ponieważ definiuje ona minimalną wielkość wykrywalnych mikrodomen.
  2. Do analizy wybieraj tylko te GUV, które spełniają następujące kryteria jakościowe.
    1. Upewnij się co do jednowarstwowości błony GUV poprzez wizualną obserwację różnych pęcherzyków i porównaj ich intensywności; pęcherzyki o najniższej intensywności emisji fluorescencji są najprawdopodobniej jednowarstwowe.
      UWAGA: Spontaniczne pęcznienie może prowadzić do powstania partii pęcherzyków, w których duża część pęcherzyków olbrzymich nie jest jednowarstwowa.
    2. Przeprowadź dodatkową kontrolę poprzez ilościowe określenie intensywności emisji fluorescencji domniemanych jednowarstwowych pęcherzyków olbrzymich i sprawdź odpowiadający temu sygnał rozproszenia w danej populacji. Jeśli pomiędzy różnymi GUV nie zaobserwowano różnic całkowitoliczbowych, wszystkie są prawdopodobnie jednowarstwowe.
      UWAGA: Jeśli pęcherzyki są przygotowywane z konwencjonalnych lipidów przy użyciu uznanej metody, takiej jak spontaniczne pęcznienie, opisane powyżej podejście do wykrywania pęcherzyków jednowarstwowych jest wystarczające. W przypadku opracowywania nowego protokołu przygotowania GUV lub stosowania niekonwencjonalnych lipidów wymagane będą bardziej szczegółowe badania w celu potwierdzenia jednowarstwowości. Na przykład sygnały fluorescencji błony pęcherzyków znakowanych przygotowanych według nowego protokołu można porównać z sygnałami GUV przygotowanych uznaną metodą; lub do błon pęcherzyków można wprowadzić białko porowe błony α-hemolizynę24. Barwnik dodany na zewnątrz pęcherzyków wniknie wówczas do ich wnętrza lub nie, w zależności od obecności pęcherzyków jednowarstwowych lub wielowarstwowych.
    3. Upewnij się, że GUV ma odpowiednią średnicę minimalną, aby domeny były nadal rozpoznawalne.
    4. Upewnij się, że GUV nie posiada (lub posiada minimalną liczbę) defektów, takich jak części wystające lub przylegające, bądź struktury wewnętrzne.
  3. Przenieś alikwot zawiesiny GUV na szkiełko przedmiotowe i szczelnie je zamknij. Przygotuj komorę obserwacyjną.
  4. Nanieś próbkę na szkiełko przedmiotowe. Otocz ją silikonową przekładką z centralnym okrągłym wycięciem. Aby uniknąć zanieczyszczenia, upewnij się, że przekładka nie ma kontaktu z próbką. Uszczelnij wnętrze, kładąc szkiełko nakrywkowe na wierzchu silikonowej przekładki.
    UWAGA: Zamiast silikonowej przekładki można użyć smaru silikonowego lub samodzielnie wykonanych przekładek z polidimetylosiloksanu (PDMS). Uszczelnienie komory zapewnia minimalne parowanie próbki i utrzymuje warunki izoosmolarne.
  5. Pozostaw próbkę na ~5 min w celu reekwilibracji ewentualnych domen.
    UWAGA: Naprężenia mechaniczne wynikające z pipetowania mogą wymieszać domeny błonowe, które potrzebują czasu na ponowne sformowanie.
  6. Umieść szkiełko przedmiotowe z próbką na stoliku mikroskopu i przeanalizuj stan fazowy partii GUV metodą statystyczną. Zaobserwuj więcej niż 30 GUV na partię i określ ich stan fazowy zgodnie z następującymi kryteriami oceny stanu fazowego GUV z użyciem DiIC18 (Rysunek 3).
    UWAGA: Po wzroście pęcherzyki mogą zmienić swój indywidualny skład z powodu (na przykład) odszczepiania się domen lub wymiany materiału błonowego poprzez nanotubule. GUV wykazują zatem zmienność składu w obrębie tej samej partii35.
    1. Jednofazowa faza ciekła, będąca albo fazą uporządkowaną (Lo), albo nieuporządkowaną (Ld): upewnij się, że ogólny kształt GUV jest sferyczny i gładki, a DiIC18 jest jednorodnie rozłożony w błonie (pierwsze obrazy w górnym i dolnym panelu na Rysunku 3).
    2. Stan współistnienia dwufazowego Lo+Ld: upewnij się, że pęcherzyki wykazują domeny, które wydają się okrągłe z gładkimi granicami; zgodnie z zachowaniem rozdziału DiIC18 domeny są jasnoczerwone (Ld) lub ciemnoczerwone/czarne (Lo) (drugie obrazy w górnym i dolnym panelu na Rysunku 3, w fałszywych kolorach). Sprawdź, czy domeny mogą swobodnie dyfundować po powierzchni pęcherzyka i mogą się łączyć.
    3. Stan współistnienia dwufazowego stałego (S)+ciekłego (S+Lo lub S+Ld): upewnij się, że domeny mogą mieć kształt palcowaty lub okrągławy, ale z kanciastymi granicami (trzecie obrazy w górnym i dolnym panelu na Rysunku 3). Obserwuj domeny ciekłe (czerwone) na stałym (czarnym) tle, które nie będzie wykazywać dyfuzji. Przeciwnie, domeny stałe (czarne) będą mogły swobodnie dyfundować na ciekłym tle (czerwonym).
    4. Współistnienie trójfazowe S+Lo+Ld: obserwuj występowanie trzech typów domen: (i) kanciastych czarnych domen (S), zanurzonych w (ii) ciemnych (Lo) i (iii) jasnych (Ld) domenach czerwonych.
  7. Przypisz populację GUV do stanu fazowego, który został określony jako dominujący w losowej próbce, jak w następujących przykładach:
    1. Jeśli zaobserwowano 20 GUV jednofazowych i 15 GUV Lo+Ld, uznaj partię za fazę jednokomponentową ciekłą.
    2. Jeśli zaobserwowano 10 GUV S+L, 30 GUV Lo+Ld i 25 GUV jednofazowych, uznaj partię za Lo+Ld.

4. Obserwacja GUV w urządzeniu mikrofluidycznym

UWAGA: W pierwszej kolejności należy wykonać urządzenie mikrofluidyczne; szczegóły dotyczące projektu i montażu urządzenia mikrofluidycznego zostały przedstawione w innym opracowaniu36,37; krótki opis znajduje się na Ryc. 4.

  1. Przygotować świeży roztwór do pęcznienia GUV (roztwór soli lub sacharozy zgodnie z krokiem 1.8.1) i przefiltrować go przez 0.45 µm filtr
    UWAGA: Wszelkie zanieczyszczenia w przepływających roztworach mogą doprowadzić do zapchania urządzenia mikrofluidycznego.
  2. Cięcie 200 µL plastikowe końcówki do pipety tłokowej i umieść je w otworach w części urządzenia wykonanej z PDMS. Dodaj 100 µL i 5 µL świeżego i przefiltrowanego roztworu pęczniejącego do zbiornika (patrz Rycina 5A) oraz odpowiednio każdą z przyciętych końcówek pipet. Wirować całe urządzenie z prędkością 900 x g przez 10 min w wirówce z rotorem kątowym, aby wstępnie napełnić urządzenie i usunąć powietrze.
  3. Napełnij wcześniej szklaną strzykawkę o pojemności 1 ml oraz podłączony do niej przewód roztworem pęczniejącym, a następnie ustaw tłok w pozycji 0 ml.
  4. Wprowadź rurkę do wylotu płynowego urządzenia, a strzykawkę umieść w pompie strzykawkowej.
    UWAGA: Wybór marki strzykawki oraz pompy strzykawkowej nie ma znaczenia. Niemniej jednak strzykawki szklane są bardziej precyzyjne, a pompa powinna umożliwiać pracę w µL/min zakres przepływu
  5. Podłącz niestandardową jednostkę sterowania ciśnieniem do 8 wlotów mikropłynnej warstwy sterującej (patrz Rysunek 5A). Ustaw ciśnienie w jednostce kontroli ciśnienia na 3 bar (powietrze, azot lub argon), pozostawiając zawory prowadzące do urządzenia mikroprzepływowego w pozycji zamkniętej.
  6. Umieść urządzenie mikroprzepływowe, podłączone do pompy strzykawkowej i jednostki kontroli ciśnienia, na stole odwróconego mikroskopu konfokalnego.
    1. Należy użyć obiektywu o takim samym powiększeniu i aperturze numerycznej (NA), jak podczas obserwacji zbiorczych. Należy sprawdzić, czy statystyki stanu fazowego, opisane w kroku 3.7, pozostają niezmienne przy użyciu innego obiektywu, aby uniknąć artefaktów obserwacyjnych wynikających z różnic w rozdzielczości.
  7. Wprowadź GUV do urządzenia.
    1. Najpierw odpipetuj całą objętość z wyjątkiem 25 do 50 µL roztworu, który pozostał w zbiorniku. Dodać 150 µL roztworu GUV (zarówno w sacharozie, jak i w soli, zgodnie z krokiem 1.8.1, ale dopasowanym do roztwór użyty do wstępnego napełnienia urządzenia w kroku 4.1) do zbiorniczka i wymieszać poprzez delikatne pipetowanie. Ustawić strzykawkę na 10 µL/min przepływ w trybie pobierania przez około 20 min lub do momentu zajęcia ponad 90% pułapek.
      UWAGA: Nie należy dopuścić do całkowitego opróżnienia zbiornika. W przeciwnym razie do mikrokanałów dostaną się pęcherzyki powietrza. Podczas załadunku należy dolać do zbiornika roztwór GUV, dbając jednocześnie o to, aby podczas pipetowania do urządzenia nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
  8. Otwórz wszystkie zawory jednostki sterowania ciśnieniem, aby zamknąć mikroprzepływowe zawory pierścieniowe wokół pułapek/GUV. Ustaw pompę strzykawkową na 0 µL/minPo 1 h należy zaobserwować GUV i zarejestrować obrazy konfokalne. Pobudzenie i detekcję GUV należy przeprowadzić zgodnie z parametrami zastosowanego fluoroforu (np. wzbudzenie przy 561 nm i detekcja w zakresie 580–620 nm, analogicznie jak w przypadku DiIC18). Należy zastosować te same kryteria doboru co w kroku 3.6, i należy dokładnie odnotować położenie każdego GUV (t.j. numer kolumny i wiersza, patrz Rycina 4)
  9. Wymień roztwór otaczające GUV.
    1. Ustaw pompę strzykawkową na 0 µL/min i odpipetować całość, pozostawiając jedynie 25 μl 50 µL roztworu GUV z rezerwuaru. Dodać 150 µL drugiego roztworu (sacharozy lub soli zgodnie z krokiem 1.8.1, w zależności od pożądanego roztworu na zewnątrz GUV) do zbiorniczka i wymieszaj, delikatnie pipetując. Odpipetuj wszystko poza 25 do 50 µL roztworu buforowego z rezerwuaru.
      UWAGA: Roztwór ten należy przefiltrować za pomocą 0.45 µm również przefiltrować.
  10. Powtórz poprzedni krok co najmniej 5 razy, aby całkowicie wymienić roztwór w zbiorniku. Ustaw strzykawkę na 10 µL/min przepływ w trybie odsysania (withdraw mode) przez ok. 10 min w celu wymiany roztworu w mikrokanałach.
  11. Zmniejszyć szybkość przepływu do 1 µL/minOtwórz 8 zaworów jednostki sterowania ciśnieniem na 2 s, a następnie zamknij je ponownie (co spowoduje otwarcie i zamknięcie zaworów pierścienia mikroprzepływowego). Ustaw szybkość przepływu na 0 µL/min Ponownie.
  12. Po 1 h należy zaobserwować GUV i zarejestrować obrazy konfokalne. Ponownie należy zwrócić uwagę na zapisanie kolumny i rzędu mikrokomory, w której znajduje się każda GUV, aby umożliwić porównanie tej samej GUV przed i po wymianie buforu zewnętrznego.

5. Projektowanie i kalibracja komory kontroli temperatury

UWAGA: Odpowiednią komorę do kontroli temperatury można nabyć w handlu lub zbudować samodzielnie. Kontrola temperatury jest zazwyczaj realizowana poprzez sprzężenie termiczne komory z próbką GUV z łaźnią wodną lub ogniwem Peltiera. W niniejszym tekście opisujemy konstrukcję i charakterystykę samodzielnie zbudowanej komory do kontroli temperatury, współpracującej z zewnętrznym termostatem wodnym. Takie termostaty są dostępne w wielu laboratoriach lub mogą zostać odzyskane ze starszego sprzętu, takiego jak lasery lub spektrometry.

  1. Zmontować komorę przepływu ciepła, w tym przypadku wykonaną z bloku aluminiowego, z przyłączami do łaźni wodnej, jak pokazano na Rysunku 6. Uszczelnić otwory u góry i na dole oraz umożliwić obserwację próbki w polu jasnym poprzez przyklejenie szkiełek podstawowych do bloku.
  2. Odwrócić komorę przepływową na stronę, na której zostanie umieszczona próbka, i nanieść pipetą kroplę o objętości około 100 µL roztworu używanego w eksperymentach zgodnie z krokiem 1.8.1. Opcjonalnie można wprowadzić światłowodową sondę temperatury (np. FISO FTI-10) lub dodać barwnik czuły na temperaturę w odpowiednim stężeniu, np. 500 µM Rodaminy B.
  3. Zmontować komorę obserwacyjną GUV, używając smaru silikonowego naniesionego w kształcie pierścienia lub innego dystansera (PTFE lub gumy) i uszczelnić ją szkiełkiem podstawowym o grubości 0,17 µm. Upewnić się, że kropla nie styka się z materiałem uszczelniającym ani dystanserem, aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczeń.
  4. Powoli obrócić cały zespół do góry nogami i podłączyć do niego zewnętrzny termostat wodny za pomocą odpowiednich przewodów. Zwrócić szczególną uwagę na ewentualne wycieki wody.
  5. Ustawić najniższą pożądaną temperaturę na zewnętrznym termostacie wodnym i pozostawić system do ustabilizowania, aż odczyt czujnika temperatury stanie się stały; czas potrzebny na równowagowanie pozwoli oszacować minimalny czas odpowiedzi systemu.
  6. Przed rozpoczęciem korzystania z komory należy co najmniej raz przeprowadzić eksperymenty kontrolne.
    1. Zmierzyć temperaturę roztworu (np. za pomocą sondy światłowodowej) i porównać ją z odczytem termostatu w interesującym zakresie temperatur.
    2. Sprawdzić minimalne przesunięcie względem odczytu termostatu oraz liniowość zmierzonych temperatur.
    3. Sprawdzić występowanie gradientu temperatury wewnątrz komory obserwacyjnej przy użyciu barwnika czułego na temperaturę. Zmierzyć temperaturę roztworu za pomocą intensywności fluorescencji lub mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) dla różnych odległości od dolnego szkiełka podstawowego40. Dodatkowo sprawdzić, czy w obszarze obserwacji GUV występuje gradient temperatury, jak pokazano na Rysunku 7.

6. Obserwacje GUV w różnych temperaturach

UWAGA: Zazwyczaj w przypadku GUV, których membrany wykazują potencjał do rozdzielania faz i wydają się jednorodne w temperaturze obserwacji Tobs, rozdzielenie faz zostanie wywołane poniżej Tobs (to, czy zostanie to zaobserwowane, zależy od badanego zakresu temperatur). I odwrotnie, pęcherzyki z rozdzielonymi fazami powinny stać się jednorodne w temperaturze wyższej niż Tobs. Nie musi to być jednak regułą dla konkretnego (złożonego) składu lipidowego i może być interesujące, aby zawsze badać cały dostępny zakres temperatur38. Protokół obserwacji i oceny temperatur przejścia fazowego nie zależy od konkretnej metody zastosowanej do kontroli temperatury.

  1. Zmontować komorę obserwacji temperatury zgodnie z sekcją 5, pomijając światłowodową sondę temperatury lub fluorofor wrażliwy na temperaturę.
  2. Ustawić zewnętrzną kąpiel wodną na temperaturę pokojową (23 °C) i pozostawić układ do wyrównania temperatury przez 10-15 min.
  3. Policzyć liczbę pęcherzyków z rozdziałem faz zgodnie z kryteriami z kroku 3.6; ogólny stan fazowy populacji GUV da wskazówkę dotyczącą zakresu temperatury przejścia układu. Jeśli stan fazowy w całej populacji pęcherzyków jest dość heterogeniczny, przejść bezpośrednio do kroku 6.5.
  4. Zwiększyć (jeśli większość pęcherzyków wykazuje rozdział faz) lub zmniejszyć (jeśli większość pęcherzyków jest homogeniczna) temperaturę w szerokich odstępach (np. 1 - 2 °C) i pozostawić układ do wyrównania temperatury przez około 2 min. Ponownie ocenić stan fazowy populacji GUV na podstawie losowej próbki i zmieniać temperaturę do momentu, aż populacja pęcherzyków wykaże heterogeniczny stan fazowy.
  5. Gdy populacja znajdzie się blisko punktu przejścia fazowego (tzn. stany fazowe poszczególnych GUV są dość heterogeniczne), zmniejszyć interwał temperatury (np. 0.5 °C), aby zwiększyć rozdzielczość. Pozostawić układ do wyrównania temperatury przez ~2 min i ponownie ocenić stan fazowy populacji GUV na podstawie losowej próbki.
  6. Po przekroczeniu punktu przejścia fazowego kontynuować zmianę temperatury, aż wszystkie GUV staną się odpowiednio homogeniczne lub z rozdziałem faz.
  7. Sprawdzić występowanie histerezy, aby ocenić, czy czasy wyrównywania temperatury są wystarczające.
    1. Zmienić kierunek skanowania temperatury, tzn. jeśli skanowanie było wykonywane przy zwiększaniu temperatury, przeprowadzić je przy zmniejszaniu temperatury.
    2. Wybrać co najmniej podzbiór temperatur, aby ocenić stosunek stanów fazowych populacji GUV (np. 80% z rozdziałem faz).
    3. Jeśli znaczne odchylenia między oboma kierunkami w stosunku stanów fazowych wskazują na histerezę, należy zmniejszyć wielkość kroku temperatury i/lub zwiększyć czas wyrównywania w krokach 6.4 i 6.5.
    4. Jeśli brak jest histerezy, co potwierdzają równe stosunki, można rozważyć zwiększenie wielkości kroku i/lub czasu wyrównywania.
  8. Nanieść stosunki stanów fazowych w funkcji temperatury. W celu kwantyfikacji dopasować dane do odpowiedniego modelu (Rysunek 8).
    UWAGA: Krzywe przejścia fazowego zazwyczaj mają trajektorię sigmoidalną, a sigmoidalny model Boltzmanna zapewnia odpowiedni zestaw parametrów dopasowania:
    Równanie sigmoidalne w analizie denaturacji termicznej; formuła naukowa dla badań stabilności białek.
    y: ułamek homogenicznych/z rozdziałem faz GUV
    A1: początkowa wartość ułamka
    A2: końcowa wartość ułamka
    T: temperatura
    Tmix: temperatura przy połowie maksymalnej wartości y
    Ponieważ y jest ułamkiem homogenicznych GUV, wartości A1 i A2 powinny być ustalone odpowiednio na 0 i 1. Przy założeniu, że przejście miscibility jest sigmoidalne, jeśli zmierzona wartość ułamka wynosi 0 w określonej temperaturze, wszystkie wartości ułamka w niższym zakresie temperatur uznaje się za 0. Analogicznie, jeśli wartość ułamka wynosi 1 w danej temperaturze, wszystkie wartości ułamka w wyższym zakresie temperatur przyjmuje się za 1.

Wyniki

Pęcznienie GUV

Stosując opisaną tutaj metodę spontanicznego pęcznienia, GUVs składające się z DOPG, eSM i Chol hodowano przez noc w 210 mM sacharozy lub 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, co doprowadziło do powstania widocznego agregatu. Odzyskanie agregatu zapewnia wysoką wydajność pęcherzyków. Resuspensja w roztworze pęczniejącym skutkowała symetrycznymi warunkami roztworów po obu stronach błony. Aby stworzyć warunki asymetryczne, agregat resuspendowano odpowiednio w izoosmolarnej sacharozie lub roztworze o wysokim zasoleniu (Rysunek 2). Wynikające z tego rozcieńczenie odpowiada quasi-zewnętrznej wymianie roztworu przy jednoczesnym zminimalizowaniu rozcieńczenia liczby GUVs.

Mapowanie diagramu fazowego GUV za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Obecność 0,1 mol% specyficznego dla fazy DiIC18 w GUV umożliwiła obserwację ich stanów fazowych za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Pęcherzyki wykazujące separację faz S+L obserwowano przy użyciu obiektywu 63x/1,2NA, aby móc rozdzielić drobno ustrukturyzowane domeny o kształcie palców. We wszystkich pozostałych przypadkach stosowano obiektyw 40x/0,6 NA. Aby uniknąć artefaktów podczas wizualnej inspekcji GUV oraz zmaksymalizować powtarzalność, określono kryteria decydujące o tym, które pęcherzyki uwzględnić w analizie stanu fazowego (krok protokołu 3.6).

GUV przygotowane z trójskładnikowych mieszanin DOPG/eSM/Chol o szerokim zakresie stosunków, napęczniałe w sacharozie lub roztworze o wysokim zasoleniu i obserwowane w temperaturze pokojowej, wykazywały homogeniczne fazy Lo lub Ld, rozdział faz Lo+Ld oraz S+L, patrz Rycina 3. Rycina 9 przedstawia przykładowe pęcherzyki z defektami, których nie należy uwzględniać w analizie danych, a także pokazuje sposób identyfikacji pęcherzyków wielowarstwowych.

Ze względu na nieznaną historię, GUV prawdopodobnie wykazują zmienność składu w obrębie partii35. W związku z tym ogólny stan fazowy konkretnego składu określano metodą statystyczną. Populacje GUV o określonym składzie lipidowym przypisywano do stanu fazowego, który dominował w losowej próbce (krok protokołu 3.6). Jednak składniki bliskie obszarowi koegzystencji Lo+Ld często dawały partie, w których dominujący stan fazowy stanowił niewielką większość. W takich niejednoznacznych przypadkach inspekcję wizualną powtarzano na co najmniej trzech niezależnych próbkach. Ułamek pęcherzyków o identycznym stanie fazowym (np. wykazujących separację faz Lo+Ld) obecnych w losowych próbkach uśredniano z liczby prób, co przyjmowano jako wynik końcowy (Rycina 10).

Opisane protokoły pozwoliły na uzyskanie wystarczającego wzrostu GUV w szerokim zakresie różnych proporcji DOPG, eSM i Chol w roztworach o wysokim zasoleniu oraz w roztworach sacharozy. Pod warunkiem zastosowania symetrycznych, jak i asymetrycznych warunków roztworu o wysokim zasoleniu, udało się wyznaczyć rozległe obszary w trójskładnikowym wykresie fazowym (Rycina 11). Różnice w zachowaniu fazowym pęcherzyków zaobserwowane w różnych warunkach roztworu zostały szczegółowo omówione w innym opracowaniu9.

Obserwacje zachowania fazowego po całkowitej wymianie buforu z wykorzystaniem metody mikrofluidycznej

Tworzenie asymetrycznych warunków roztworu poprzez rozcieńczanie prowadzi do pozostania pozostałości roztworu pęczniejącego na zewnątrz. Nasze podejście mikrofluidyczne umożliwia całkowitą wymianę roztworu zewnętrznego. Rysunek 5A przedstawia urządzenie mikrofluidyczne w pełni zmontowane na stole mikroskopu konfokalnego wraz z wylotem fluidycznym i wlotami do kontroli ciśnienia. Probówki są połączone za pomocą metalowych rurek pod kątem 90 °, aby zapewnić miejsce dla obrazowania w świetle przechodzącym z góry.

Do obserwacji wewnątrz urządzenia mikrofluidycznego wykorzystano mikroskop konfokalny z obiektywem imersyjnym wodnym 63x/1.2NA. Podobnie jak w przypadku wcześniejszych obserwacji w objętości, do barwienia błony użyto DiIC18. Podczas obserwacji stanu fazowego GUV uwięzionych w urządzeniu należy uważać, aby nie błędnie zinterpretować danych. Ze względu na bliskość GUV względem słupków, drogi światła wzbudzenia i emisji mogą być częściowo blokowane przez PDMS, co prowadzi do fałszywego wrażenia obecności domen (Rycina 12). W tym przypadku przydatna jest detekcja światła przechodzącego, aby sprawdzić położenie GUV przy słupkach. Ten niepożądany efekt jest szczególnie wyraźny w przypadku małych GUV o średnicy mniejszej niż 10 µm. W takich sytuacjach dane zostały odrzucone. Obraz konfokalny na Rycini 13A pokazuje płaski przekrój pęcherzyka, który przecina domenę Lo obecną na pęcherzyku GUV. W tym przypadku płaskie skany przekroju wykonane powyżej lub poniżej tej sekcji nie wykazałyby domeny ze względu na jej niewielki rozmiar w porównaniu z rozmiarem GUV, co mogłoby doprowadzić do pominięcia domeny i uznania pęcherzyka za znajdujący się w jednorodnym stanie fazowym. Dlatego w celu zbadania całej powierzchni GUV należy zastosować konfokalny z-stack. W przypadku mikroskopii szerokopolowej może to nie być problemem, ponieważ cały pęcherzyk można obrazować jednocześnie.

Na koniec przedstawiono przykłady GUV przed i po wymianie roztworu zewnętrznego, na których wyraźnie widać stany fazowe membran (Rysunek 14). Każde urządzenie posiada 60 komór (każda z parą słupków do wychwytywania pojedynczej GUV), co umożliwia przeprowadzenie dziesiątek eksperymentów na jednym urządzeniu (patrz Rysunek 4). Jednak niektóre GUV mogą zostać utracone podczas wymiany roztworu zewnętrznego. Można to zminimalizować poprzez następujące kroki: 1) Zastosowanie powłoki z albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu zapobiegania adhezji/pękaniu GUV na słupkach; powlekanie odbywa się poprzez wystawienie ścianek komory na działanie 20 mg/mL BSA przez 60 min i następne płukanie buforem roboczym. Inną cząsteczką adhezyjną, którą można zastosować, jest poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)39. 2) Staranne dopasowanie osmotyczne roztworów wewnętrznego i zewnętrznego, aby uniknąć powstania wiotkich GUV, które mogłyby przejść przez środek słupków, lub pękania GUV. 3) Optymalizacja procedury przygotowania GUV w celu uzyskania pęcherzyków o średnicy większej niż ~8 µm, aby zapobiec ich przechodzeniu przez środek słupków.

Projektowanie i charakterystyka komory z kontrolą temperatury do obserwacji stanów fazowych GUV

Zaprojektowaliśmy prostą komorę przepływową, która posiada przyłącza do zewnętrznego termostatu wodnego (Rysunek 6). Komorę wykonaliśmy poprzez frezowanie bloku aluminium. Generalnie materiał komory nie musi być przewodzący ciepło, ponieważ próbka jest sprzężona z łaźnią wodną za pomocą dolnego szkiełka podstawowego, jak pokazano na Rysunku 6B i 6C.

Niezależnie od dokładnej konstrukcji, należy ocenić wydajność komory. W szczególności sprawdzono liniowość temperatury próbki w stosunku do temperatury ustawionej zewnętrznie, ewentualne systematyczne przesunięcie temperatury oraz gradient temperatury wewnątrz komory. Dwa pierwsze punkty zweryfikowano poprzez bezpośredni pomiar temperatury w komorze za pomocą światłowodowej sondy temperatury (np. FISO FTI-10). Sprawdzono również występowanie gradientu temperatury w zawiesinie GUV. Taki gradient mógłby wynikać z przepływu ciepła na zewnątrz komory. Pomiary temperatury z rozdzielczością przestrzenną można uzyskać za pomocą fluoroforu wrażliwego na temperaturę40, patrz Rysunek 7.

Wykresy danych i dopasowanie w celu wyznaczenia Tmix fazowo rozdzielonych GUV

Wykreślenie frakcji jednorodnych GUV w obserwowanym zakresie temperatur zaowocowało trajektorią punktów danych o kształcie sigmoidalnym. Dane dopasowano do modelu Boltzmanna (sekcja protokołu 6.8), z którego można było wywieść Tmix (Rycina 8).

tworzenie dwuwarstwy lipidowej; schemat; płytka PTFE; suszenie rozpuszczalnika; atmosfera nasycona wodą; pęcznienie
Rycina 1: Kroki eksperymentalne podczas protokołu spontanicznego pęcznienia (górny panel) wraz z odpowiadającym im etapem wzrostu pęcherzyków (dolny panel). (A) Homogenny film lipidowy zostaje naniesiony na chropowatą płytkę PTFE i osuszony z rozpuszczalnika. (B) Wysuszony film lipidowy jest następnie wstępnie pęczniony w atmosferze nasyconej wodą w zamkniętym pojemniku z wodą, aby ułatwić hydratację dwuwarstwy. Pusta fiolka szklana zawiera płytkę PTFE i pozostaje otwarta podczas tego etapu hydratacji. (C) Wstępnie spęczniony film lipidowy zostaje ostatecznie w pełni hydratowany poprzez dodanie odpowiedniego roztworu pęczniącego na pokrytą lipidami płytkę PTFE wewnątrz szklanej fiolki. Aby uniknąć odparowania, fiolka szklana jest szczelnie zamknięta podczas inkubacji nocnej. Aby zminimalizować różnice w składzie w obrębie jednej partii, wszystkie kroki muszą być wykonywane w temperaturze, w której mieszanina lipidowa jest w pełni mieszalna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Metoda oczyszczania GUV przy użyciu roztworu soli; układ eksperymentalny z pipetą i słoikami; schemat.
Rysunek 2: Pozyskiwanie GUV. (A) Osadzona warstwa lipidowa składająca się z DOPG/eSM/Chol w stosunkach molowych 20/60/20 z dodatkiem 0,1 mol% DiIC18 pęczniało w buforze o wysokim zasoleniu, składającym się ze 100 mM NaCl i 10 mM Tris (pH 7,5). Pokrywka szklanego naczynia została dodatkowo uszczelniona folią parafinową. Powiększony obszar zainteresowania zawiera powstały agregat GUV. Jego czerwony kolor wynika z obecności DiIC18. (B) GUV-y pobrano za pomocą przyciętej końcówki pipety. Na tym obrazie agregat został pobrany pipetą wraz z 50 µL roztworu pęczniejącego, które przeniesiono do nowej fiolki. (C) Aby stworzyć asymetryczne warunki roztworu transbłonowego, agregat rozcieńczono w innym izotonicznym roztworze zewnętrznym. W tym przypadku agregat wraz z 50 µL roztwór pęczniejący zawieszono ponownie w 950 µL roztwór sacharozy, co daje 20-krotne rozcieńczenie roztworu pęczniejącego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe separacji faz lipidowych; wpływ buforu solnego/sacharozowego na domeny lipidowe, badanie mikroskopowe.
Rycina 3: Obrazowanie GUV. Obrazy fluorescencyjne w szerokim polu GUV domieszkowanych 0,1 mol% DiIC18 przygotowane i obserwowane w symetrycznych roztworach soli lub sacharozy, składających się z różnych proporcji DOPG, eSM i Chol (w buforze solnym, od lewej do prawej: 40/20/40; 50/20/30; 30/60/10; w sacharozie, od lewej do prawej: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Obrazy przedstawiają GUV w różnych (współistniejących) stanach fazowych, ocenionych zgodnie z kryteriami opisanymi w kroku 3.6 protokołu. Obrazowanie pęcherzyków wykonano przy użyciu obiektywu 40X/0.6 NA. Paski skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego; sterowanie cieczą; konfiguracja do analizy biomolekuł; ścieżki wlotowe i wylotowe.
Rysunek 4: Układ projektu kanału mikroprzepływowego. GUV wnikają do dolnej warstwy przepływowej (kanały obrysowane) poprzez wlot poniżej zbiornika. Filtr blokuje niepożądane zanieczyszczenia przed dostaniem się do urządzenia. Następnie wnikają one do macierzy 60 komór (8 rzędów i 15 kolumn), z których każda zawiera filary do wychwytywania pojedynczych GUV (patrz wstawka). Każda komora może zostać odizolowana za pomocą zaworu pierścieniowego sterowanego przez warstwę kontrolną (wypełnione na czarno kanały) znajdującą się powyżej warstwy przepływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ mikrofluidyczny: schemat systemu sterowania przepływem do precyzyjnego dozowania cieczy w eksperymentach.
Rycina 5: Urządzenie mikrofluidyczne. (A) Fotografia urządzenia mikrofluidycznego używanego do chwytania pojedynczych GUV oraz całkowitej wymiany roztworu zewnętrznego. Etykiety wskazują zbiornik do dodawania roztworów (1), 8 wlotów ciśnienia połączonych z jednostką sterowania ciśnieniem (2) oraz wylot cieczy połączony ze strzykawką i pompą (3). Panel (B) przedstawia jednostkę sterowania ciśnieniem wyposażoną w 8 zaworów, z których każdy reguluje jedną rurkę połączoną z urządzeniem mikrofluidycznym. Tutaj zawory nr 1 i nr 2 są otwarte, a co za tym idzie, odpowiadające im zawory pierścieniowe są zamknięte. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ mikroskopowy, komora przepływowa z kontrolą termostatu, badanie optyczne, dynamika płynów.
Rysunek 6: Komora kontroli temperatury. (A) Komora przed montażem. (B) Zmontowana komora (skierowana w górę) z przyklejonymi do góry i do dołu szkiełkami nakrywkowymi o grubości 2 mm. Pomarańczowy gumowy dystans ma wysokość 0,5 mm i jest uszczelniony szkiełkiem nakrywkowym o grubości 0,17 mm w celu obserwacji zamkniętej zawiesiny GUV. Na tym zdjęciu, w celu kalibracji, wstawiono sondę temperatury (brązowe włókno wychodzące z komory po prawej stronie). (C) Końcowy montaż na stoliku mikroskopu odwróconego bez sondy temperatury. Pomarańczowy gumowy dystans jest teraz skierowany w dół. Guma jest wystarczająco lepka, aby utrzymać próbkę na miejscu. Należy zauważyć, że światło może przenikać przez próbkę, co umożliwia obserwacje zarówno w epifluorescencji, jak i w polu jasnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres temperatury w funkcji odległości, przedstawiający gradient termiczny w poprzek szkiełka podstawowego wraz z punktami danych i analizą.
Rycina 7: Przestrzennie rozdzielcze dane temperaturowe wewnątrz komory obserwacyjnej uzyskane za pomocą pomiarów FLIM barwnika wrażliwego na temperaturę (tutaj: 500 µM Rodaminy B)40. Punkty danych uzyskane w odległości 0, 10, 30, 300 i 400 µm nad dolnym szkiełkiem podstawowym. Czerwone i niebieskie punkty danych zmierzono dla temperatury kąpieli wodnej ustawionej odpowiednio na 30 °C i 12 °C. Czarne punkty danych wskazują kąpiel wodną pozostawioną do wyrównania z temperaturą pokojową. Zaobserwowano niewielkie wahania temperatury w całej komorze, które jednak pozostały poniżej 0.5 °C (szare słupki). Całkowita wysokość komory wynosi około 500 µm zgodnie z grubością dystansera (patrz wyżej). Słupki błędów wskazują odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

równowaga statyczna; wykres; temperatura a frakcja jednorodnych GUV; naukowa analiza danych; Tmix 18,7°C
Rysunek 8: Wyznaczanie temperatury mieszalności. Wykres przedstawia poszczególne punkty danych dotyczące frakcji jednorodnych (jednofazowych) GUV przygotowanych z DOPG/eSM/Chol w stosunku 30/40/30 z dodatkiem 0,1 mol% DiIC18 z trzech niezależnych próbek losowych (N = 20 - 40). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej. Punkty danych dopasowano do modelu Boltzmanna opisanego w kroku 6.8 (ciągła czarna linia), z którego wyznaczono temperaturę mieszania domen Tmix (podążając ciągłą czerwoną linią do osi odciętych) zgodnie z połową maksimum krzywej sigmoidalnej na osi rzędnych (przerywana czarna linia). Wartości początkowe i końcowe (A1 i A2) ustalono odpowiednio na 0 i 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia pęcherzyków lamelarnych; wadliwa struktura pęcherzyka; obrazy fluorescencyjne; analiza naukowa.
Rycina 9: Wadliwe pęcherzyki. Przykłady olbrzymich pęcherzyków przygotowanych z mieszaniny 20/60/20 DOPG/eSM/Chol i domieszkowanych 0,1 mol% DiIC18, które nie spełniają kryteriów określonych w kroku 4.2, obrazowane za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Zakresy wyświetlania intensywności poszczególnych obrazów były za każdym razem optymalizowane pod kątem intensywności fluorescencji przedstawionego pęcherzyka. Ze względu na obecność dodatkowego materiału błonowego i enkapsulowanych mniejszych pęcherzyków, stan fazowy pęcherzyka na zdjęciu (A) nie może zostać jednoznacznie określony. Wygląd tego olbrzymiego pęcherzyka nie pozwala na przeprowadzenie wiarygodnej wizualnej oceny lamelarności. Panel (B) przedstawia pęcherzyk, którego wnętrze jest wypełnione materiałem błonowym. W konsekwencji sygnał fluorescencyjny zewnętrznej błony pęcherzyka nakłada się na sygnał wewnętrzny, co uniemożliwia wizualizację lamelarności i potencjalnych domen. (C) Intensywności fluorescencji trzech różnych olbrzymich pęcherzyków pokazane są w bezpośrednim porównaniu w tym samym zakresie intensywności wyświetlania. Obraz ten pokazuje, że olbrzymie pęcherzyki wielolamelarne (1, 2) można zidentyfikować po zwiększonym sygnale fluorescencyjnym w porównaniu do GUV (3). W tym przypadku zarówno wielolamelarne, jak i jednolamelarne olbrzymie pęcherzyki wykazują rozdział faz Lo+Ld. Pęcherzyki na wszystkich obrazach były obrazowane za pomocą obiektywu 40x/0,6 NA. Paski skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza składu separacji faz; wykres słupkowy; porównanie warunków z sacharozą i solą.
Rysunek 10: Odsetek GUV z separacją faz Lo+Ld uśredniony z co najmniej trzech niezależnych prób. Pęcherzyki składały się z mieszaniny 30/40/30 DOPG/eSM/Chol, bliskiej granicy regionu współistnienia Lo+Ld. Słupki błędów dla symetrycznych warunków z sacharozą ilustrują rozrzut między partiami. Opis osi rzędnych określa roztwory wewnątrz/na zewnątrz pęcherzyków; sucrose: 210 mM sacharozy; salt: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5; Słupki błędów oznaczają odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Trójskładnikowy diagram fazowy mieszanin lipidów; metoda rozcieńczania; rozkład sacharozy i soli; diagram.
Rysunek 11: Diagram fazowy GUV przygotowanych z DOPG, eSM i Chol, sporządzony dla różnych warunków roztworu przy użyciu 210 mM sacharozy (sucrose) oraz 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 (salt). Stany fazowe GUV badano w układach sacharoza/sacharoza (A; górna sekcja), sacharoza/sól (wewnątrz/na zewnątrz) (A; dolna sekcja wielokątna), sól/sól (B; górna sekcja) oraz sól/sacharoza (B; dolna sekcja wielokątna). Schematy ilustrują dominujący wzór domen w zaznaczonych sekcjach oraz odpowiadające im warunki roztworu. Stany fazowe pęcherzyków przedstawione w dolnych sekcjach wielokątnych zaobserwowano w asymetrycznych warunkach roztworu po 20-krotnym rozcieńczeniu GUV. Adaptacja z referencji9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wzorzec interferencji fal, schemat z formacją kolistą; badanie dynamiki fal, analiza dyfrakcji.
Rysunek 12: Artefakty w uwięzionych GUV. Przykład małego GUV, w którym widoczna jest fałszywa domena wynikająca z bliskiego sąsiedztwa słupków (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Obraz w świetle przechodzącym (pole jasne) ukazujący słupki (szare) jest nałożony na konfokalny obraz fluorescencyjny GUV (pomarańczowy). W obrazie w polu jasnym widoczne jest tworzenie przez słupki wzoru interferencyjnego. Sygnał fluorescencji w pobliżu słupków (po prawej) jest osłabiony, co stwarza wrażenie separacji faz. Pasek skali = 5 µm.

Obraz mikroskopowy struktur pierścieniowatych, analiza fluorescencyjna, analiza naukowa, wyniki eksperymentalne.
Rycina 13: Przykłady dwóch różnych GUV schwytanych przez słupki PDMS, w których wyraźnie widoczne są stany fazowe. (A) Pęcherzyk z separacją faz Lo + Ld wykonany z DOPG/eSM/Chol 60/20/20. (B) Pęcherzyk wykonany z 40/30/30 wykazujący jednofazowość Ld lub Lo. W celu potwierdzenia braku domen (poza ogniskową) zbadano konfokalny stos obrazów z (z-stack) całego pęcherzyka. Krawędzie słupków są widoczne po prawej stronie obrazów (szare). Pasek skali = 5 µm.

Obrazy mikroskopowe przedstawiające tworzenie się fluorescencyjnych pierścieni przed i po traktowaniu; wyniki eksperymentalne.
Rysunek 14: Wynikowe zachowanie fazowe po całkowitej wymianie płynu za pomocą urządzenia mikrofluidycznego. Przedstawiono ten sam GUV przed i po wymianie roztworu dla (A) przejścia z symetrycznego układu sól/sól (wewnątrz/zewnątrz) na sól/sucroza (wewnątrz/zewnątrz) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, pasek skali 2 µm) oraz (B) przejścia z symetrycznego układu sucroza/sucroza (wewnątrz/zewnątrz) na sucroza/sól (wewnątrz/zewnątrz) (DOPG/eSM/Chol 30/40/30, pasek skali = 3 µm). Dostosowano z referencji9.

Dyskusja

Skuteczna produkcja GUV w celu obserwacji stanu fazowego w symetrycznych i asymetrycznych warunkach wysokiego zasolenia

Protokoły przedstawione w niniejszej pracy wprowadzają strategię oceny wpływu buforu o wysokim zasoleniu oraz asymetrii roztworów na stan fazowy błony naładowanych GUV w szerokim zakresie składów. Jednym z głównych wyzwań w dążeniu do osiągnięcia tego celu była produkcja naładowanych GUV w buforach o wysokim zasoleniu.

Z powodzeniem otrzymaliśmy GUV w roztworze sacharozy oraz w buforze o wysokim zasoleniu, stosując prostą metodę spontanicznego pęcznienia, która obejmuje etap wstępnej hydratacji osadzonego filmu lipidowego oraz nocny etap końcowej hydratacji w celu wzrostu pęcherzyków. Należy zaznaczyć, że osadzanie lipidów powinno być przeprowadzane na chropowatej płytce z PTFE, aby zapewnić równomierne rozprzestrzenianie się lipidów i uzyskanie pęcherzyków jednowarstwowych. Ponadto niezbędne jest, aby każdy etap przygotowania pęcherzyków odbywał się w temperaturze, w której film lipidowy znajduje się w jednorodnym i płynnym stanie fazowym. W przeciwnym razie populacja pęcherzyków może być polidyspersyjna pod względem składu, co może zafałszować końcową analizę stanu fazowego populacji. Specyficzny protokół spontanicznego pęcznienia GUV prowadzi do powstania agregatu pęcherzyków, co z jednej strony umożliwia jego resuspensję w małych objętościach w celu uzyskania wysoko skoncentrowanych dyspersji pęcherzyków, a z drugiej strony zapewnia asymetryczne warunki roztworu po obu stronach błony, minimalizując jednocześnie rozcieńczenie pęcherzyków8,28. Kluczowe jest, aby podczas rozcieńczania pęcherzyków lub wymiany roztworu zewnętrznego osmolarity wewnątrz i na zewnątrz pozostały dopasowane, ponieważ zmiany morfologiczne spowodowane niedopasowaniem osmolarity mogą indukować lub zapobiegać separacji faz Lo+Ld41 lub, w przypadku warunków hipotonicznych, mogą prowadzić do pękania pęcherzyków.

W tym przypadku próby optymalizacji protokołów elektroformowania w roztworze o wysokim zasoleniu nie doprowadziły do powstania GUV, natomiast pęcznienie wspomagane PVA zaowocowało utworzeniem pęcherzyków wielowarstwowych. Mimo że wymaga to dłuższego czasu przygotowania i skutkuje partiami pęcherzyków o niższej jakości10,17, pomyślna produkcja pęcherzyków naładowanych poprzez pęcznienie spontaniczne wiąże się z dodatkowymi zaletami. Wymaga ona minimalnego nakładu pracy, zapewniając jednocześnie wydajność wystarczającą do statystycznych analiz partii i, w przeciwieństwie do elektroformowania, nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani optymalizacji. Ponadto nie zaobserwowano zanieczyszczeń wynikających z utleniania lipidów42,43. Według literatury nie ma różnic między składem lipidowym pęcherzyków a odpowiadającymi im roztworami stokowymi, z których zostały one wytworzone7,17. Co więcej, tworzenie pęcherzyków na podłożu PTFE nie powoduje wprowadzenia żadnych zanieczyszczeń, w przeciwieństwie do metod pęcznienia wspomaganego żelem, gdzie podłoże może wprowadzać obce cząsteczki23. Elektroformowanie wiąże się z dalszymi wadami związanymi z nadmiernym rozcieńczeniem pęcherzyków podczas tworzenia asymetrycznych warunków roztworu. GUV wytworzone przez elektroformowanie występują zazwyczaj jako dyspersja homogeniczna (w przeciwieństwie do silnie skoncentrowanej zawiesiny pęcherzyków w formie grudki tworzącej się podczas pęcznienia spontanicznego). Jakiekolwiek rozcieńczenie roztworu zewnętrznego spowodowałoby również znaczne zmniejszenie liczby pęcherzyków. Ponadto w toku niniejszej pracy zaobserwowano, że GUV DOPG/eSM/Chol wytworzone przez elektroformowanie w sacharozie stawały się niestabilne po rozcieńczeniu w buforze o wysokim zasoleniu. Fluorescencja z plam lipidowych na szkiełku mikroskopowym wskazywała, że pęcherzyki pękały przed możliwością ich wizualnej inspekcji. Taką niestabilność można przypisać podwyższonemu napięciu błon pęcherzyków przygotowanych metodą elektroformowania w porównaniu do tych otrzymanych w wyniku pęcznienia spontanicznego10.

Choć rozcieńczanie pęcherzyków jest łatwym i szybkim sposobem na stworzenie asymetrycznych warunków roztworu GUV, pozwala ono jedynie na częściową wymianę roztworu zewnętrznego, mimo że w wysokim stopniu (tutaj: 95 %, Rysunek 2), ponieważ po rozcieńczeniu pozostaną śladowe ilości roztworu pęczniejącego. Wybór stopnia wymiany roztworu zewnętrznego jest kompromisem między pobraniem pipetą skupiska pęcherzyków wraz z roztworem pęczniejącym (sekcja 2) a uniknięciem zbyt dużego rozcieńczenia. W związku z tym wprowadziliśmy alternatywne podejście mikrofluidyczne, szczegółowo omówione w innym opracowaniu37, które umożliwia szybką i całkowitą wymianę roztworu zewnętrznego podczas obserwacji stanu fazowego GUV w celu weryfikacji obserwacji stanu fazowego przeprowadzonych dla pęcherzyków rozcieńczonych. Stwierdzono, że obserwacje zmian stanu fazowego przy przejściu z symetrycznych na asymetryczne warunki roztworu są zgodne. Ponadto obie zaprezentowane tutaj metody generowania asymetrycznych warunków roztworu są porównywalnie szybkie (por. Ref.8) i nie wiążą się z żadnym znanym ryzykiem lokalnych zmian składu (por. referencje30,31), zwiększenia napięcia błony (por. referencję32) czy lokalnego nagrzewania (por. referencję33), co ma miejsce w przypadku alternatywnych metod omówionych we Wstępie. Podczas pułapkowania mikrofluidycznego równowaga osmotyczna między wnętrzem a zewnętrzem pęcherzyka jest niezbędna nie tylko w celu uniknięcia wspomnianych wyżej artefaktów stanu fazowego, ale także dlatego, że deflacja spowodowana hipertonicznymi warunkami roztworu może spowodować wysunięcie się uwięzionych GUV spoza filarów po wymianie roztworu zewnętrznego.

Mimo że metodę spontanicznego pęcznienia z powodzeniem zastosowano do hodowli nienaładowanych pęcherzyków z układu DOPC/eSM/Chol, w innych przypadkach brak ładunków może upośledzać pęcznienie GUV ze względu na wynikający z tego brak odpychania między poszczególnymi dwuwarstwami44. Przedłużenie okresu wstępnego pęcznienia lub wprowadzenie objętościowych grup polarnych lipidów może przeciwdziałać temu problemowi45. Ponadto stabilność pęcherzyków po ich rozcieńczeniu w roztworach innych niż ten użyty do pęcznienia może być różna dla różnych składów lipidowych i mediów rozcieńczających, czego w niniejszej pracy nie badaliśmy. Nie zbadaliśmy również możliwości regulowania średnicy GUV za pomocą przedstawionej tutaj metody przygotowania. Prawdopodobnie jednak parametry takie jak skład pęcherzyków i roztwór pęczniejący wpływają na wyniki. Zastosowanie alternatywnych metod46 może przynieść większe pęcherzyki dla lipidów i roztworów użytych w tej pracy, jednak mogą one wiązać się z innymi wadami charakterystycznymi dla danej metody. Opisane powyżej podejście do wytwarzania GUV w symetrycznych i asymetrycznych warunkach wysokiego zasolenia stanowi potencjalne narzędzie do dalszych badań nad pęcherzykami o różnych składach lipidowych, rozproszonymi w różnych mediach. Ponieważ nie zbadaliśmy tych możliwości, przyszłe próby wykażą, w jakim stopniu metody przygotowania i rozcieńczania GUV mogą być stosowane w sposób ogólny.

Obserwacja separacji faz w różnych temperaturach

Istnieją różne konfiguracje eksperymentalne odpowiednie do badania GUV w zmiennych temperaturach. Chociaż układy te nie są zazwyczaj szczegółowo opisywane w literaturze, niniejsza praca przedstawia podstawowy zestaw możliwy do zastosowania w takich badaniach.

Pomiary kontrolne wykazują, że temperatura w tej zaprojektowanej i zbudowanej wewnętrznie komorze jest precyzyjnie kontrolowana przez termostat, a gradienty temperatury wewnątrz komory mieszczą się w granicach eksperymentalnej rozdzielczości temperatury. Zapewniono, że eksperymentalne warunki termiczne są zgodne z odczytem termostatu.

Podczas oceny stanów fazowych GUV w szerokim zakresie temperatur ważne jest, aby obserwowane pęcherzyki były dobrze zrównoważone po zmianie temperatury. Jednym ze sposobów zapewnienia tego jest sprawdzenie występowania histerezy. Jeśli występuje histereza, należy zmniejszyć kroki temperatury i/lub wydłużyć czas równoważenia. Ponieważ kontrola temperatury w niniejszej pracy jest realizowana za pomocą termostatu wodnego, zakres temperatur roboczych jest idealnie ograniczony do 0 - 100 °C. Zakres ten można rozszerzyć, stosując inne ciecze do kontroli temperatury, takie jak olej, lub wykorzystując inne układy, np. element Peltiera. W praktyce temperatura robocza jest również ograniczona przez możliwość kondensacji lub odparowania. Ponadto w temperaturach znacznie odbiegających od temperatury pokojowej bardziej prawdopodobne staje się wystąpienie stacjonarnego gradientu temperatury w całej komorze obserwacyjnej. Co więcej, sprzęt obrazujący może ulec uszkodzeniu w ekstremalnych temperaturach. W typowych zakresach temperatur odpowiednich dla badań pęcherzyków lipidowych (~10 - 50 °C7,9) należy wziąć pod uwagę ryzyko uszkodzenia sprzętu obserwacyjnego, choć zazwyczaj nie jest ono spodziewane.

Artefakty obserwacji domen pęcherzykowych

W szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej istnieje szereg źródeł artefaktów obserwacyjnych. Przede wszystkim należy mieć świadomość, że maksymalna rozdzielczość r obiektu poddanego inspekcji wizualnej w celu określenia stanów fazowych pęcherzyków wyznacza granicę detekcji domen lipidowych zgodnie z równaniem:
Równanie granicy rozdzielczości: r=0.61λ/NA, stosowane w mikroskopii do wyznaczania optycznej zdolności rozdzielczej.
gdzie λ to długość fali emisji, a NA to apertura numeryczna obiektywu. Typowy obiektyw z powiększeniem 40x i NA wynoszącym 0.6, który wykrywa zielone światło emisji o długości około 560 nm, osiągnąłby rozdzielczość optyczną ~0.6 µm. Zatem badania porównujące stany fazowe pęcherzyków wykonanych z konkretnych mieszanin lipidów w różnych warunkach powinny wykorzystywać ten sam obiektyw dla tej samej mieszaniny lipidów.

Kolejnym artefaktem jest powstawanie domen lipidowych w wyniku fotoutleniania lipidów spowodowanego przedłużoną ekspozycją na światło wzbudzenia41. Fotouszkodzenia występują preferencyjnie w nienasyconych węglowodorowych fragmentach lipidów. W rzeczywistości, dla niektórych składów lipidowych, w początkowo jednorodnych pęcherzykach zaobserwowano tutaj tworzenie się takich domen po przedłużonym czasie ekspozycji na światło wzbudzenia (~30 s). Aby przeciwdziałać temu problemowi, światło wzbudzenia było skupione na jednym polu widzenia tylko przez kilka sekund w celu oceny stanu fazowego. Z tego względu DiIC18 był odpowiedni do naszych celów. Inne barwniki mogą być jednak znacznie bardziej wrażliwe i mogą wymagać pracy przy niższych intensywnościach wzbudzenia oraz krótszych czasach ekspozycji na światło wzbudzenia.

Mechaniczne naprężenie ścinające powstające podczas przenoszenia pęcherzyków pipetą może tymczasowo mieszać domeny, zniekształcając tym samym pozorny przebieg przemian fazowych pęcherzyków. W przypadku niektórych partii różne pęcherzyki wykazywały odmienne zachowania fazowe w 0 min i 5 min po przeniesieniu pipetą na szkiełko podstawowe mikroskopu. Wykazano również, że naprężenie ścinające wywołane przepływem cieczy w urządzeniu mikrofluidycznym prowadzi do mieszania domen47. Przed obserwacją pęcherzyki powinny pozostać w spoczynku przez wystarczający czas w celu osiągnięcia stanu równowagi. W niniejszym badaniu pęcherzyki uwięzione w urządzeniu mikrofluidycznym pozostawiono w spoczynku na 1 h po załadowaniu pęcherzyków i wymianie roztworów przed przystąpieniem do obserwacji.

Aby uniknąć niektórych z wyżej wymienionych trudności, a także ograniczeń wynikających z limitu dyfrakcji światła, można zastosować alternatywne metody, takie jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego48 lub techniki mikroskopii superrozdzielczej49.

Podsumowanie i perspektywy

Przedstawiona praca demonstruje zestaw metod pozwalających na analizę wpływu warunków roztworów symetrycznych i asymetrycznych o wysokim zasoleniu na separację faz membran. Wszystkie zaprezentowane metody nadają się do innych zastosowań. Urządzenie mikrofluidyczne stanowi na przykład platformę do badania kinetyki tworzenia się i znikania domen po indukcji asymetrii roztworu. W ten sposób można również zbadać pojawianie się domen w funkcji stężenia soli. Wszystkie metody mogą być ponadto wykorzystane do analizy wpływu na zachowanie fazowe przy użyciu dowolnych innych interesujących roztworów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest częścią konsorcjum MaxSynBio, które jest wspólnie finansowane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Niemiec oraz Towarzystwo Maxa Plancka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sól sodowaAvanti Polar Lipids840475C, w skrócie DOPG w tekście
sfingomielina jaj kurzychAvanti Polar Lipids860061w skrócie eSM
cholesterol (wełna owcza, > 98 %)Avanti Polar Lipids700000skrócie Chol
Nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaninySondy molekularneD-282w skrócie DiIC18
Chloroform, klasa HPLC (≥ 99,8 %)Merck
NaCl (> 99,8%)Roth
HCl (37%)Roth
Tris (≥ 99,9%)Roth
Sacharoza (≥ 99,5 %)Sigma Aldrich
Parafilm
Fiolka gwintowana 45x27 mm, 15 mLKimbleSoda płaskie dno, biała zakrętka
pH-metrMettler ToledoMP220
OsmometrGonotecOsmomat030
Mikroskop epifluorescencyjnyZeissAxio Observer D1
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeicaTCS SP5
Obiektyw 40x, 0.6 NAZeissLD Achroplan
Obiektyw 40x, 0.75 BRAK ObiektywLeica506174
63x, 0.9 NALeica506148
56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Glä ser
Szkiełko nakrywkowe, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Glä aser
Parafilm "M"BremixElastyczne strzykawki do pakowania
, 5 mL, 10 mLBraun
0,45 µ m filtr strzykawkowyGVS Ameryka PółnocnaCameo 25AS, 1213723Octan, sterylny
w Szkiełko mikroskopowe ,

Bibliografia

  1. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys J. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  2. Bagatolli, L. A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim Biophys Acta. 1758 (10), 1541-1556 (2006).
  3. Carquin, M., D'Auria, L., Pollet, H., Bongarzone, E. R., Tyteca, D. Recent progress on lipid lateral heterogeneity in plasma membranes: From rafts to submicrometric domains. Prog Lipid Res. 62, 1-24 (2016).
  4. Baumgart, T., Hess, S. T., Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425 (6960), 821-824 (2003).
  5. Bacia, K., Schwille, P., Kurzchalia, T. Sterol structure determines the separation of phases and the curvature of the liquid-ordered phase in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (9), 3272-3277 (2005).
  6. Vequi-Suplicy, C. C., Riske, K. A., Knorr, R. L., Dimova, R. Vesicles with charged domains. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1338-1347 (2010).
  7. Blosser, M. C., Starr, J. B., Turtle, C. W., Ashcraft, J., Keller, S. L. Minimal effect of lipid charge on membrane miscibility phase behavior in three ternary systems. Biophys J. 104 (12), 2629-2638 (2013).
  8. Pataraia, S., Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1838 (8), 2036-2045 (2014).
  9. Kubsch, B., Robinson, T., Lipowsky, R., Dimova, R. Solution Asymmetry and Salt Expand Fluid-Fluid Coexistence Regions of Charged Membranes. Biophys J. 110 (12), 2581-2584 (2016).
  10. Dimova, R., et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  11. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  12. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  13. van Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  14. Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C., Sandoghdar, V. Production of Isolated Giant Unilamellar Vesicles under High Salt Concentrations. Front Physiol. 8, 63(2017).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome Electroformation. Faraday Discuss. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 19, 323-336 (1988).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  18. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  19. Pott, T., Bouvrais, H., Meleard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem Phys Lipids. 154 (2), 115-119 (2008).
  20. Green, N. G., Ramos, A., Gonzalez, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 61 (4 Pt B), 4011-4018 (2000).
  21. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J Am Chem Soc. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  22. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  23. Lira, R. B., Dimova, R., Riske, K. A. Giant Unilamellar Vesicles Formed by Hybrid Films of Agarose and Lipids Display Altered Mechanical Properties. Biophys J. 107 (7), 1609-1619 (2014).
  24. Kresse, K. M., Xu, M., Pazzi, J., Garcia-Ojeda, M., Subramaniam, A. B. Novel Application of Cellulose Paper As a Platform for the Macromolecular Self-Assembly of Biomimetic Giant Liposomes. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (47), 32102-32107 (2016).
  25. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  26. Needham, D., Evans, E. Structure and Mechanical-Properties of Giant Lipid (DMPC) Vesicle Bilayers from 20-Degrees-C Below to 10-Degrees-C above the Liquid-Crystal Crystalline Phase-Transition at 24-Degrees-C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  27. Manneville, J. B., et al. COPI coat assembly occurs on liquid-disordered domains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (44), 16946-16951 (2008).
  28. Wollert, T., Wunder, C., Lippincott-Schwartz, J., Hurley, J. H. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458 (7235), 172(2009).
  29. Kuhn, P., et al. A facile protocol for the immobilisation of vesicles, virus particles, bacteria, and yeast cells. Integr Biol (Camb). 4 (12), 1550-1555 (2012).
  30. Sarmento, M. J., Prieto, M., Fernandes, F. Reorganization of lipid domain distribution in giant unilamellar vesicles upon immobilization with different membrane tethers. Biochim Biophys Acta. 1818 (11), 2605-2615 (2012).
  31. Lipowsky, R., Rouhiparkouhi, T., Discher, D. E., Weikl, T. R. Domain formation in cholesterol-phospholipid membranes exposed to adhesive surfaces or environments. Soft Matter. 9 (35), 8438(2013).
  32. Korlach, J., Reichle, C., Muller, T., Schnelle, T., Webb, W. W. Trapping, deformation, and rotation of giant unilamellar vesicles in octode dielectrophoretic field cages. Biophys J. 89 (1), 554-562 (2005).
  33. Delabre, U., et al. Deformation of phospholipid vesicles in an optical stretcher. Soft Matter. 11 (30), 6075-6088 (2015).
  34. Fidorra, M., Garcia, A., Ipsen, J. H., Hartel, S., Bagatolli, L. A. Lipid domains in giant unilamellar vesicles and their correspondence with equilibrium thermodynamic phases: a quantitative fluorescence microscopy imaging approach. Biochim Biophys Acta. 1788 (10), 2142-2149 (2009).
  35. Bezlyepkina, N., Gracia, R. S., Shchelokovskyy, P., Lipowsky, R., Dimova, R. Phase diagram and tie-line determination for the ternary mixture DOPC/eSM/cholesterol. Biophys J. 104 (7), 1456-1464 (2013).
  36. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618(2013).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 44105(2013).
  38. Veatch, S. L., Gawrisch, K., Keller, S. L. Closed-loop miscibility gap and quantitative tie-lines in ternary membranes containing diphytanoyl PC. Biophys J. 90 (12), 4428-4436 (2006).
  39. Kolesinska, B., et al. Interaction of beta(3) /beta(2) -peptides, consisting of Val-Ala-Leu segments, with POPC giant unilamellar vesicles (GUVs) and white blood cancer cells (U937)--a new type of cell-penetrating peptides, and a surprising chain-length dependence of their vesicle- and cell-lysing activity. Chem Biodivers. 12 (5), 697-732 (2015).
  40. Robinson, T., et al. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab Chip. 9 (23), 3437-3441 (2009).
  41. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  42. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  43. Breton, M., Amirkavei, M., Mir, L. M. Optimization of the Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) with Unsaturated Phospholipids. J Membr Biol. 248 (5), 827-835 (2015).
  44. Lasic, D. D., Needham, D. The "stealth" liposome: a prototypical biomaterial. Chemical Reviews. 95, 2601-2628 (1995).
  45. Needham, D., McIntosh, T. J., Lasic, D. D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1108 (1), 40-48 (1992).
  46. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Jr Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophys J. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  47. Sturzenegger, F., Robinson, T., Hess, D., Dittrich, P. S. Membranes under shear stress: visualization of non-equilibrium domain patterns and domain fusion in a microfluidic device. Soft Matter. 12 (23), 5072-5076 (2016).
  48. Veatch, S. L., Polozov, I. V., Gawrisch, K., Keller, S. L. Liquid domains in vesicles investigated by NMR and fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 2910-2922 (2004).
  49. Owen, D. M., Magenau, A., Williamson, D., Gaus, K. The lipid raft hypothesis revisited--new insights on raft composition and function from super-resolution fluorescence microscopy. Bioessays. 34 (9), 739-747 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozdział fazprzygotowanie GUVasymetria roztworukomora kontroli temperaturyurządzenie mikroprzepływowelipidowa dwuwarstwadyfuzja domenocena stanu fazowego
Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.