Artykuł metodologiczny

Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/56034

⸱

24 października 2017

 ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Colloids and Interfaces

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) często zaniedbują fizjologiczne warunki roztworu. W pracy przedstawiono podejścia do badania wpływu buforu o wysokim zasoleniu na separację faz ciecz-ciecz w naładowanych wieloskładnikowych GUV w funkcji asymetrii i temperatury roztworu transmembranowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oddzielone fazowo gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) wykazujące współistniejące domeny uporządkowane cieczą i nieuporządkowane cieczą są powszechnym narzędziem biofizycznym do badania hipotezy tratwy lipidowej. Liczne badania zaniedbują jednak wpływ warunków fizjologicznych roztworu. W związku z tym w niniejszej pracy przedstawiono wpływ asymetrii o wysokim zasoleniu i roztworów transbłonowych na separację fazy ciecz-ciecz w naładowanych GUV wyhodowanych z dioleylfosfatydyloglicerolu, sfingomieliny jaj i cholesterolu. Efekty badano w warunkach izotermicznych i zmiennych temperaturach.

Opisujemy sprzęt i strategie eksperymentalne mające zastosowanie do monitorowania stabilności współistniejących domen cieczy w naładowanych pęcherzykach w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu o wysokim zasoleniu. Obejmuje to podejście polegające na przygotowaniu naładowanych wieloskładnikowych GUV w buforze o wysokim zasoleniu w wysokich temperaturach. Protokół zakłada możliwość przeprowadzenia częściowej wymiany roztworu zewnętrznego poprzez prosty etap rozcieńczania przy jednoczesnej minimalizacji rozcieńczenia pęcherzyków. Przedstawiono alternatywne podejście wykorzystujące urządzenie mikroprzepływowe, które pozwala na pełną wymianę roztworu zewnętrznego. Badano również wpływ roztworu na separację faz w różnych temperaturach. W tym celu przedstawiamy podstawowy projekt i użyteczność wbudowanej we własnym zakresie studzienki kontroli temperatury. Ponadto zastanawiamy się nad oceną stanu fazowego GUV, pułapkami z nim związanymi i sposobami ich obejścia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu obserwacji domen o rozmiarach mikronów w oddzielonych fazami ciekły-ciecz gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, GUV były używane jako system modelowy do badania hipotezy tratwy lipidowej1,2,3. Ponieważ obszar ich wolnostojącej dwuwarstwy leży w zasięgu komórek biologicznych, są one odpowiednimi naśladowcami błon plazmatycznych z hipotetycznymi tratwami. Liczne badania nad takimi GUV przeprowadzono z pęcherzykami rozproszonymi w czystej wodzie, sacharozie lub roztworach o niskim zasoleniu4,5,6,7,8. Warunki te nie odzwierciedlają jednak fizjologicznie istotnego narażenia błon biologicznych na środowisko o wysokim zasoleniu i asymetrii roztworu transbłonowego, tak jak ma to miejsce w przypadku komórek.

W tej pracy i w poprzedniej publikacji z naszej grupy9, stany fazowe naładowanych wieloskładnikowych GUV zostały zbadane jako funkcja obecności soli i asymetrii roztworu w poprzek membrany. GUV przygotowano z mieszanin dioleoilofosfatydyloglicerolu (DOPG), sfingomieliny jaj (eSM) i cholesterolu (Chol) w roztworze sacharozy (o osmolarności 210 mOsm/kg) lub buforze o wysokim zasoleniu (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 210 mOsm/kg). Wybór lipidów był uzasadniony danymi uzyskanymi już na schemacie fazowym tej mieszaniny6,8.

W literaturze dostępnych jest wiele metod przygotowania GUVów10,11,12 (zauważ, że tutaj nie będziemy rozważać tych obejmujących transfer lipidów z fazy olejowej do fazy wodnej13,14 ze względu na nieodłączne niebezpieczeństwo pozostałości oleju w membranie, które mogą wpływać na zachowanie fazowe). Przygotowanie GUV w buforze o wysokim zasoleniu wiąże się ze szczególnymi wyzwaniami. W przypadku roztworów o niskiej sile jonowej metoda elektroformacji15,16 przedstawia szybki sposób przygotowania GUV o wysokiej wydajności z niewielkimi wadami10,17. Metoda opiera się na osadzaniu warstwy lipidów na powierzchni przewodzącej (elektrodzie), suszeniu ich i nawilżaniu roztworem wodnym przy jednoczesnym zastosowaniu pola prądu przemiennego. Jednak ta metoda wymaga korekt, jeśli w roztworze wodnym znajduje się sól18,19. Zakłada się, że siłą napędową wzrostu pęcherzyków przez elektroformację jest elektroosmoza16, która jest utrudniona przy wysokich przewodnościach20. W związku z tym pęcznienie elektryczne GUV w roztworach o wysokim zasoleniu nie jest prostym podejściem, ponieważ wymaga optymalizacji pod kątem różnych stężeń soli obecnych w roztworze pęczniejącym. Pęcznienie pęcherzyków wspomagane żelem21,22 to potencjalna alternatywa dla elektroformacji o jeszcze szybszym czasie powstawania. Podejście to opiera się na zwiększonym uwodnieniu filmu lipidowego, gdy jako substrat stosuje się żel (agarozę lub alkohol poliwinylowy (PVA)). Podejścia te wiążą się jednak z ryzykiem zanieczyszczenia membrany w przypadku pęcznienia na bazie agarozy23 i/lub limitów temperatury, jak w przypadku pęcznienia na bazie PVA. Podobnie, niedawno ustanowiono protokół uprawy GUV na podłożu z papieru celulozowego24. Ogólnym problemem tej metody jest brak kontroli nad czystością substratu, a także stosowanie dużych ilości lipidów. W tej pracy przedstawimy i przedstawimy zalety najbardziej tradycyjnej metody przygotowania GUV, a mianowicie metody spontanicznego pęcznienia25,26. Polega ona na wysuszeniu warstwy lipidowej na podłożu lipofobicznym, uwodnieniu jej w atmosferze pary wodnej, a następnie pęcznieniu w pożądanym roztworze pęczniejącym (patrz Rysunek 1 i szczegóły w sekcji Protokół). Metoda ta nie zapewnia kontroli nad rozkładem wielkości pęcherzyków i skutkuje ogólnie mniejszymi pęcherzykami w porównaniu z metodami, w których produkcja jest wspomagana przez pole elektryczne, podłoże polimerowe lub środki mikroprzepływowe. Jednak jakość i rozmiar pęcherzyków jest odpowiedni do badania stanu fazy błonowej, jak opisano tutaj.

Tworzenie asymetrii między roztworami w poprzek błony pęcherzykowej wiąże się również z pewnymi wyzwaniami. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest bezpośrednie rozcieńczenie zawiesiny pęcherzyków w pożądanym roztworze zewnętrznym27,28. Jednak zmniejsza to również gęstość rozmieszczenia pęcherzyków. Inną strategią jest powolna wymiana roztworu zewnętrznego wokół GUV osadzonych na dnie komory przepływowej, która umożliwia dopływ i odpływ roztworu. Aby uniknąć zakłócenia lub nawet utraty pęcherzyków wraz z przepływem, stosuje się niskie natężenia przepływu8, co sprawia, że takie podejście jest nieefektywne czasowo. Co więcej, żadne z tych podejść nie gwarantuje pełnej wymiany rozwiązań zewnętrznych. Oczywistym rozwiązaniem jest unieruchomienie pęcherzyków, aby uniknąć ich utraty podczas zewnętrznej wymiany roztworu. Na przykład, biotynylowane GUV mogą być przywiązane do powierzchni pokrytej streptawidyną29. Jednak takie podejście może prowadzić do różnic w składzie na przylegających, a tym samym nieprzylegających segmentach membrany30,31. Zastosowanie pól magnetycznych lub elektrycznych do wychwytywania pęcherzyków powoduje nałożenie napięcia błony32. Użycie pęsety optycznej do uwięzienia pęcherzyka wymaga dołączenia uchwytu (tj. koralika), podczas gdy użycie napinacza optycznego może wiązać się z miejscowym ogrzewaniem33. Pułapkowanie GUV można również osiągnąć poprzez hodowanie ich na drutach platynowych bez końcowego odłączania34. W ten sposób powstają pęcherzyki, które nie są izolowane i które są zwykle połączone z drutami lub innymi pęcherzykami za pomocą cienkich rurek lipidowych (pęt).

Prezentowana praca podkreśla strategie przezwyciężania wyżej wymienionych ograniczeń. W pierwszej kolejności przedstawiamy szczegółowy opis metody spontanicznego pęcznienia dostosowanej i zoptymalizowanej do produkcji GUV w o wysokim zasoleniu. Następnie wprowadzamy dwa podejścia do efektywnego tworzenia asymetrycznych warunków roztworu poprzez proste rozcieńczenie lub wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego. Ponieważ naszym celem jest analiza stanu fazy membranowej GUV w różnych warunkach roztworu, kolejne sekcje opisują kryteria udanej analizy statystycznej i przedstawiają wskazówki, jak uniknąć błędnej kategoryzacji.

Analizy były wykonywane w warunkach izotermicznych, jak również w różnych temperaturach. Podczas gdy kontrola temperatury jest powszechnie stosowana, szczegóły dotyczące eksperymentalnych komór kontroli temperatury są rzadko opisywane. Tutaj prezentowana jest wbudowana przez nas konfiguracja do obserwacji GUV w różnych warunkach temperaturowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Spontaniczne obrzęki GUV

UWAGA: Chloroform jest substancją szkodliwą, która jest bardzo lotna. Wszystkie operacje z użyciem chloroformu należy wykonywać pod wyciągiem. Nie używaj plastikowych przyborów laboratoryjnych, takich jak końcówki do pipet lub plastikowe pojemniki do przenoszenia i/lub przechowywania roztworów chloroformu. Chloroform rozpuszcza plastik, który zanieczyszcza roztwór. Zamiast tego użyj szklanych strzykawek i szklanych pojemników. Ponadto pracuj tak czysto, jak to możliwe, aby uniknąć wprowadzania zanieczyszczeń, ponieważ mogą one wchodzić w interakcje z membranami. Należy pamiętać, że typowe stężenia lipidów w końcowych preparatach GUV mieszczą się w zakresie mikromolowym, a zatem zanieczyszczenia w tym zakresie stężeń mogą mieć silny wpływ na zachowanie błony.

  1. Oprócz podstawowego wyposażenia przygotuj następujące elementy.
    1. Przygotować płytkę z politetrafluoroetylenu (PTFE, potocznie zwaną teflonem) do osadzania lipidów o wymiarach ~1,5 cm x 1,5 cm i odpowiedniej grubości. Zszorstkuj płytę z jednej strony drobnym papierem ściernym.
      UWAGA: PTFE jest liofobiczny i nie zostanie zwilżony roztworami chloroformu, jeśli jest gładki. Obie strony płytki PTFE można zszorstkować, aby uniknąć nieporozumień co do właściwej strony do osadzania lipidów. Grubość płytki powinna być tak dobrana, aby była łatwa w obsłudze, np. aby nie była zbyt elastyczna i mogła być łatwo pokryta roztworem hydratacyjnym (patrz Rysunek 1). Tutaj użyliśmy płyt o grubości ~2 mm. Po zszorstkowaniu płytka PTFE może być ponownie wykorzystana do nowych eksperymentów po odpowiednim oczyszczeniu (krok 1.3).
    2. Przygotować zamykaną szklaną fiolkę o odpowiedniej objętości (~15 ml) do końcowego uwodnienia filmu lipidowego i wzrostu pęcherzyków.
    3. Przygotuj zamykany szklany pojemnik, do którego zmieści się szklana fiolka o pojemności ~15 ml; zostanie on użyty do stworzenia nasyconej wodą atmosfery do wstępnego pęcznienia filmu lipidowego, patrz Rysunek 1.
  2. Przygotować 4 mM zapasy lipidów w pożądanym stosunku 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sól sodowa) (DOPG), sfingomielinę jaj (eSM) i cholesterol (Chol), z dodatkowym 0,1% mol% nadchloranu 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′′-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiIC18) do całkowitego stężenia lipidów 4 mM. Użyj chloroformu jako rozpuszczalnika. Zobacz tabelę materiałów.
  3. Dokładnie wypłucz płytkę PTFE i szklany pojemnik dostępnym w handlu płynem do mycia naczyń, etanolem i chloroformem w tej kolejności, a na koniec wysusz je.
  4. Za pomocą szklanej strzykawki nałóż i równomiernie rozprowadź 10 - 15 μl surowca lipidowego na szorstkiej stronie płytki PTFE, aby utworzyć jednolity film lipidowy. W razie potrzeby użyć igły strzykawki, aby rozprowadzić roztwór.
  5. Umieścić płytkę PTFE na czystej powierzchni i wysuszyć ją wraz z osadzonym filmem lipidowym przez 2 godziny w temperaturze 60 °C w celu usunięcia chloroformu. Dla wygody podczas suszenia należy umieścić płytkę w oczyszczonym i niezamkniętym szklanym pojemniku o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Wysoka temperatura zapewnia, że film lipidowy jest w jednorodnym stanie pojedynczej cieczy na tym i wszystkich kolejnych etapach.
  6. Po wysuszeniu napełnij wstępnie pęczniejący szklany pojemnik wodą dejonizowaną do poziomu, który nie pozwala na przewrócenie szklanej fiolki o pojemności ~15 ml (~1 cm) przez pływalność, patrz Rysunek 1.
  7. Umieść szklaną fiolkę ~15 ml z płytką PTFE do pojemnika i przykryj ją, aby mogła powstać atmosfera nasycona wodą, patrz Rysunek 1B.
    UWAGA: Skondensowana woda na wewnętrznych ściankach pojemnika stanowi dobrą wskazówkę dla udanego nasycenia parą wodną.
  8. Pozostawić osadzony film lipidowy do wstępnego pęcznienia w zamkniętym szklanym pojemniku w temperaturze 60 °C przez 4 godziny. W tym czasie przygotuj pożądany roztwór pęczniejący.
    UWAGA: W przypadku preparatów pęcherzykowych, które można przeprowadzić w niższej temperaturze, czas ten może być znacznie skrócony - do kilku minut - jeśli zamiast tego do wstępnego pęcznienia stosuje się ciepły azot nasycony wodą lub argon.
    1. Przygotować 200 mM sacharozy lub 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 dostosowaną za pomocą HCl i podgrzać do 60 °C, aby uzyskać roztwór pęczniejący.
  9. Po wstępnym spęcznieniu wyjmij z pojemnika szklankę o pojemności ~15 ml z płytką PTFE. Za pomocą strzykawki podłączonej do filtra 0,45 μm dodaj ~5 ml roztworu pęczniejącego do szklanej fiolki o pojemności 15 ml, aby uwodnić film lipidowy.
    UWAGA: Przymocowanie igły do filtra ułatwia wprowadzanie roztworu pęczniejącego. Wstępne ogrzanie strzykawki i filtra może być wskazane w celu zapewnienia stanu pojedynczej fazy ciekłej filmu lipidowego podczas dodawania roztworu pęczniejącego. Filtrowanie roztworu minimalizuje (w)organiczne zanieczyszczenia bakteriami, osadami soli itp.
  10. Uszczelnij szklaną fiolkę o pojemności ~15 ml przytrzymującą uwodniony film lipidowy na płytce PTFE, aby zminimalizować parowanie. W razie potrzeby użyj folii parafinowej, aby poprawić uszczelnienie. Pozostaw uwodniony film lipidowy w temperaturze 60 °C na noc w celu ostatecznego pęcznienia GUV.

2. Zbieranie GUV

UWAGA: Skupisko spuchniętych i oderwanych od podłoża PTFE GUV powoduje powstanie małego (~1 mm) grudki przypominającej chmurę, widocznej gołym okiem. Wydaje się białawy, gdy nie stosuje się barwnika fluorescencyjnego. W przeciwnym razie jest barwiony zgodnie ze spektrum absorpcji fluoroforu. Dodanie DiIC18 sprawia, że chmura jest różowa (patrz Rysunek 2). Pęcherzyki są skoncentrowane w agregacie, a jego zbiór maksymalizuje wydajność pęcherzyków.

  1. Schłodzić pęcherzyki do temperatury pokojowej w ciągu ~1 godziny. Wyciąć ~1/10 spiczastego końca plastikowej końcówki pipety tłokowej, aby zgrupowanie lub skupisko pęcherzyków zmieściło się w otworze.
    UWAGA: Szybkość chłodzenia jest szczególnie ważna, jeśli spodziewana jest separacja faz stałych-ciekłych, ponieważ zmienia ona rozmiar domen stałych. Tutaj, aby spowolnić chłodzenie, umieściliśmy próbkę w kontakcie z metalowym blokiem o wymiarach 5 cm x 9,5 cm x 7,5 cm (wys. x dł. x szer.), który ostygł do temperatury pokojowej w ciągu 1 godziny.
  2. Odpipetować aparat udojowy razem z odpowiednią objętością roztworu pęczniejącego (patrz Rysunek 2). Ponownie zawiesić kruszywo w roztworze pęczniejącym, aby stworzyć symetryczne warunki roztworu, lub dowolny żądany roztwór izoosmotyczny, aby stworzyć asymetryczne warunki roztworu.
    UWAGA: Dolna granica objętości jest ograniczona wielkością agregatu, który ma zostać zebrany w całości. Roztwór zewnętrzny rozcieńcza się i w celu oceny dokładnego stężenia należy wziąć pod uwagę objętość roztworu pęcherzykowego.

3. Obserwacja GUV do oceny stanu fazowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

UWAGA: GUV były domieszkowane DiIC18 jako marker fluorescencyjny. Ten fluorofor preferencyjnie dzieli się na fazę nieuporządkowaną cieczą (Ld). Pozwala to na obserwację pod mikroskopią fluorescencyjną domen powstałych w wyniku separacji faz w GUV. Przeprowadziliśmy ocenę stanu fazowego za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Zasadniczo obserwacje te są również możliwe przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM), która pozwala również na kwantyfikację sygnału (np. w celu określenia jednopłytkowości membrany). Jednak CLSM wymaga bardziej wyrafinowanego sprzętu, a (zazwyczaj) obserwacje epi-fluorescencji przed skanowaniem są pomocne w każdym przypadku.

  1. Zdecyduj się na obiektyw (np. 40-krotne powiększenie z aperturą numeryczną 0,6 (NA), jak w tym przypadku), aby obserwować GUV i używaj go konsekwentnie podczas porównywania stanów fazowych tego samego składu w różnych warunkach roztworu. Należy stosować odpowiednie filtry długości fal wzbudzenia i emisji, aby umożliwić obserwacje fluorescencji przy użyciu zastosowanego fluoroforu (np. wzbudzenie przy 560 ± 40 nm i 630 ± 75 nm z rozdzielaczem wiązki 585 nm pomiędzy nimi, jak to jest stosowane dla DiIC18).
    UWAGA: Granice stanu fazowego na diagramie fazowym będą zależeć od rozdzielczości osiąganej przez cel, ponieważ określa on minimalny rozmiar mikrodomen do wykrycia.
  2. Do analizy wybieraj tylko te GUV, które spełniają następujące kryteria jakości.
    1. Zapewnić jednopłytkowość błony GUV poprzez obserwację wzrokową różnych pęcherzyków i porównać ich intensywność; pęcherzyki o najniższej intensywności emisji fluorescencji są najprawdopodobniej jednopłytkowe.
      UWAGA: Spontaniczne pęcznienie może prowadzić do powstania partii pęcherzyków, w których duża część gigantycznych pęcherzyków nie jest jednopłytkowata.
    2. Przeprowadź dodatkową kontrolę, określając ilościowo intensywność emisji fluorescencji rzekomo jednowarstwowych gigantycznych pęcherzyków i sprawdź odpowiedni sygnał do rozpraszania w populacji. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych różnic całkowitych między różnymi GUV, wszystkie z nich prawdopodobnie będą jednowarstwowe.
      UWAGA: Jeśli pęcherzyki są przygotowywane z konwencjonalnych lipidów przy użyciu ustalonej metody, takiej jak spontaniczne pęcznienie, podejście opisane powyżej do wykrywania pęcherzyków jednopłytkowych jest wystarczające. W przypadku opracowania nowego protokołu przygotowania GUV lub stosowania niekonwencjonalnych lipidów, konieczne będą bardziej szczegółowe badania w celu potwierdzenia jednopłytkowości. Na przykład, sygnały fluorescencji błonowej znakowanych pęcherzyków przygotowanych za pomocą nowego protokołu można porównać z sygnałami GUV przygotowanych uznaną metodą; lub białko porów błony α-hemolizyna może być wstawione do błon pęcherzykowych24. Barwnik dodany na zewnątrz pęcherzyków dostałby się następnie do ich wnętrza lub nie, w zależności od obecności odpowiednio pęcherzyków jedno- lub wielopłytkowych.
    3. Upewnij się, że GUV ma rozsądną minimalną średnicę, aby domeny były nadal rozpoznawalne.
    4. Upewnij się, że GUV nie ma (prawie) żadnych wad, takich jak wystające lub przylegające części lub struktury wewnętrzne.
  3. Przenieść porcję zawiesiny GUV na szkiełko mikroskopowe i odpowiednio je uszczelnić. Przygotuj komorę obserwacyjną.
  4. Umieść próbkę na szkiełku mikroskopowym. Otocz go silikonową przekładką z centralnym okrągłym wycięciem. Aby uniknąć zanieczyszczenia, upewnij się, że przekładka nie styka się z próbką. Uszczelnij wnętrze, umieszczając szkiełko nakrywkowe na silikonowej przekładce.
    UWAGA: Zamiast silikonowej przekładki można użyć smaru silikonowego lub domowych przekładek z polidimetylosiloksanu (PDMS). Uszczelnienie komory zapewnia minimalne parowanie próbki i utrzymuje warunki izoosmolarne.
  5. Pozostaw próbkę na ~5 minut w celu ponownego zrównoważenia możliwych domen.
    UWAGA: Naprężenia mechaniczne spowodowane pipetowaniem mogą powodować mieszanie się domen membranowych, które potrzebują czasu na odkształcenie.
  6. Umieść szkiełko mikroskopowe z próbką na stoliku mikroskopu i przeanalizuj stan fazowy partii GUV w ujęciu statystycznym. Obserwuj więcej niż 30 GUV na partię i określ ich stan fazowy zgodnie z poniższymi kryteriami oceny stanu fazowego GUV za pomocą DiIC18 (Rysunek 3).
    UWAGA: Po wzroście pęcherzyki mogą zmieniać swój indywidualny skład z powodu (na przykład) pączkowania domen lub wymiany materiału membranowego za pośrednictwem nanorurek. W związku z tym GUV wykazują różnice składowe w obrębie tej samej klasy batch35.
    1. Pojedyncza faza ciekła jest albo uporządkowana cieczą (Lo), albo nieuporządkowana cieczą (Ld): Upewnij się, że ogólny kształt GUV jest kulisty i gładki, a DiIC18 jest jednorodnie rozłożony w membranie (pierwsze obrazy w górnym i dolnym panelu w Rysunek 3).
    2. Dwufazowy stan współistnienia Lo + Ld: Upewnij się, że pęcherzyki wykazują domeny, które wydają się okrągłe z gładkimi granicami; zgodnie z zachowaniem podziału DiIC18 domeny są jaskrawoczerwone (Ld) lub ciemnoczerwone/czarne (Lo) (drugie obrazy w górnym i dolnym panelu w Rysunek 3, w fałszywym kolorze). Sprawdź, czy domeny mogą swobodnie dyfundować na powierzchni pęcherzyka i mogą się łączyć.
    3. Stan współistnienia dwufazowego ciała stałego (S) + cieczy (S + Lo lub S + Ld): Upewnij się, że domeny mogą wyglądać jak palce lub okrągłe, ale z kanciastymi granicami (trzecie obrazy w górnym i dolnym panelu w Rysunek 3). Obserwuj domeny cieczy (czerwone) na jednolitym (czarnym) tle, które nie będą wyświetlać dyfuzji. Przeciwnie, stałe (czarne) domeny będą mogły swobodnie rozpraszać się na płynnym tle (czerwonym).
    4. Trójfazowe współistnienie S+Lo+Ld: Obserwuj pojawiające się trzy typy domen: (i) kanciaste czarne domeny (S), osadzone w (ii) ciemnych (Lo) i (iii) jasnych (Ld) czerwonych domenach.
  7. Przypisz populację GUV do stanu fazowego, który został określony jako dominujący w próbie losowej, jak w poniższych przykładach:
    1. Jeśli zaobserwuje się 20 jednocieczowych GUV i 15 Lo+Ld GUV, należy uznać partię za jednocieczową fazę.
    2. Jeśli zaobserwuje się 10 GUV S+L, 30 GUV Lo+Ld i 25 GUV pojedynczych cieczy, należy uznać partię za Lo+Ld.

4. Obserwacja GUV w urządzeniu mikroprzepływowym

UWAGA: Najpierw wyprodukuj urządzenie mikroprzepływowe; szczegóły dotyczące projektu i montażu urządzenia mikroprzepływowego zostały podane gdzie indziej36,37; zobacz Rysunek 4 dla krótkiego opisu.

  1. Przygotować świeży roztwór pęczniejący GUV (sól lub sacharozę zgodnie z krokiem 1.8.1) i przefiltrować go przez filtr 0,45 μm.
    UWAGA: Wszelkie zanieczyszczenia w przepływających roztworach mogą zatkać urządzenie mikroprzepływowe.
  2. Wytnij plastikowe końcówki do pipet tłokowych o pojemności 200 μl i umieść je w otworach w części PDMS urządzenia. Dodać 100 μl i 5 μl świeżego i przefiltrowanego roztworu pęczniejącego do zbiornika (patrz odpowiednio Rysunek 5A) i każdą z odciętych końcówek pipet. Odwiruj całe urządzenie przy 900 x g przez 10 minut w wirówce z wirnikiem wahadłowym w celu wstępnego napełnienia urządzenia i usunięcia powietrza.
  3. Wstępnie napełnić szklaną strzykawkę o pojemności 1 ml i dołączoną rurkę roztworem pęczniejącym i przesunąć tłok do pozycji 0 ml.
  4. Umieścić rurkę w wylocie płynu urządzenia i umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej.
    UWAGA: Wybór marki strzykawki i pompy strzykawkowej nie jest ważny. Jednak szklane strzykawki są bardziej precyzyjne, a pompa powinna być w stanie pracować w zakresie przepływu μl/min.
  5. Podłącz niestandardową jednostkę kontroli ciśnienia do 8 wlotów warstwy sterowania mikroprzepływowego (patrz Rysunek 5A). Ustaw ciśnienie w regulatorze ciśnienia na 3 bary (powietrze, azot lub argon), ale ustaw zawory w urządzeniu mikroprzepływowym w pozycji zamkniętej.
  6. Umieść urządzenie mikroprzepływowe, teraz podłączone do pompy strzykawkowej i jednostki sterującej ciśnieniem, na stoliku z odwróconym mikroskopem konfokalnym.
    1. Użyj obiektywu o takim samym powiększeniu i NA, jak podczas obserwacji masowych. Kontroluj, czy statystyki stanu fazowego, jak wyjaśniono w kroku 3.7, pozostają takie same, jeśli używany jest inny cel w celu uniknięcia artefaktów obserwacyjnych, które są oparte na różnych rozdzielczościach.
  7. Załaduj GUV do urządzenia.
    1. Najpierw odpipetować wszystkie oprócz 25 do 50 μl roztworu, który pozostał w zbiorniku. Dodać 150 μl roztworu GUV (w postaci sacharozy lub soli zgodnie z krokiem 1.8.1, ale pasującego do roztworu użytego do wstępnego napełnienia urządzenia w kroku 4.1) do zbiornika i wymieszać przez delikatne pipetowanie. Ustawić natężenie przepływu strzykawki 10 μl/min w trybie pobierania na około 20 minut lub do momentu, gdy więcej niż 90% pułapek zostanie zajętych.
      UWAGA: Nie należy dopuścić do wyschnięcia zbiornika. Jeśli tak się stanie, pęcherzyki powietrza dostaną się do mikrokanałów. Podczas ładowania należy dodać więcej roztworu GUV do zbiornika, ale należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza podczas pipetowania do urządzenia.
  8. Otwórz wszystkie zawory jednostki sterującej ciśnieniem, aby zamknąć pierścieniowe zawory mikroprzepływowe wokół syfonów/GUV. Ustawić pompę strzykawkową na 0 μl/min. Po 1 godzinie obserwuj GUV i rejestruj obrazy konfokalne. Wzbudzić i wykryć GUV zgodnie z użytym fluoroforem (np. wzbudzenie przy 561 nm i wykrywanie w zakresie 580 - 620 nm, jak w przypadku DiIC18). Użyj tych samych kryteriów wyboru z kroku 3.6 i zwróć uwagę na lokalizację każdego GUV (tj. numer kolumny i wiersza, patrz Rysunek 4)
  9. Wymień rozwiązanie otaczające GUV.
    1. Ustawić pompę strzykawkową na 0 μl/min i odpipetować wszystkie oprócz 25 do 50 μl roztworu GUV ze zbiornika. Dodać 150 μl drugiego roztworu (w postaci sacharozy lub soli zgodnie z krokiem 1.8.1, w zależności od pożądanego roztworu poza GUV) do zbiornika i wymieszać przez delikatne pipetowanie. Odpipetować z rezerwuaru wszystkie oprócz 25 do 50 μl roztworu buforowego.
      UWAGA: To rozwiązanie należy również przefiltrować za pomocą filtra 0,45 μm.
  10. Powtórz poprzedni krok co najmniej 5 razy, aby dokładnie wymienić roztwór w zbiorniku. Ustawić strzykawkę na natężenie przepływu 10 μl/min w trybie pobierania na ~10 minut, aby wymienić roztwór w mikrokanałach.
  11. Zmniejszyć natężenie przepływu do 1 μl/min. Otwórz 8 zaworów regulatora ciśnienia na 2 s i ponownie zamknij (co powoduje otwarcie i zamknięcie zaworów pierścieniowych mikroprzepływowych). Ponownie ustaw natężenie przepływu na 0 μl/min.
  12. Po 1 godzinie obserwuj GUV i rejestruj obrazy konfokalne. Ponownie należy zwrócić uwagę na kolumnę i rząd mikrokomory, w której znajduje się każdy GUV, aby umożliwić porównanie tego samego GUV przed i po wymianie bufora zewnętrznego.

5. Projektowanie i kalibracja komory kontroli temperatury

UWAGA: Odpowiednią komorę do kontroli temperatury można zdobyć komercyjnie lub w domu. Kontrola temperatury odbywa się zwykle poprzez termiczne sprzężenie komory z próbką GUV z łaźnią wodną lub elementem Peltiera. W tym miejscu opisujemy konstrukcję i charakterystykę domowej studzienki do regulacji temperatury współpracującej z zewnętrznym termostatem wodnym. Takie termostaty są dostępne w wielu laboratoriach lub można je odzyskać ze starego sprzętu, takiego jak lasery czy spektrometry.

  1. Zmontuj komorę przepływu ciepła, tutaj, wykonaną z aluminiowego bloku, ze złączami do łaźni wodnej, jak pokazano na Rysunek 6. Uszczelnij otwory na górze i na dole i włącz jasną obserwację próbki w polu poprzez przyklejenie szkieł nakrywkowych do bloku.
  2. Odwrócić komorę przepływową po stronie, po której zostanie umieszczona próbka i odpipetować kroplę około 100 μl roztworu użytego w doświadczeniach zgodnie z krokiem 1.8.1. Opcjonalnie należy włożyć światłowodową sondę temperatury (np. FISO FTI-10) lub dodać barwnik wrażliwy na temperaturę w odpowiednim stężeniu, np. 500 μM Rhodamine B.
  3. Zmontuj komorę obserwacyjną GUV za pomocą smaru silikonowego osadzonego w kształcie pierścienia lub innego elementu dystansowego (PTFE lub gumy) i uszczelnij ją szkłem osłonowym 0,17 μm. Upewnij się, że kropla nie styka się ze środkiem uszczelniającym lub przekładką, aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczeń.
  4. Powoli odwróć zespół do góry nogami i podłącz do niego zewnętrzny termostat wody z odpowiednią rurką. Zwróć szczególną uwagę na wszelkie wycieki wody.
  5. Ustaw najniższą żądaną temperaturę na zewnętrznym termostacie wodnym i pozwól systemowi zrównoważyć się, aż odczyt czujnika temperatury będzie stabilny; czas potrzebny do zrównoważenia da oszacowanie minimalnego czasu reakcji systemu.
  6. Eksperymenty kontrolne należy wykonać co najmniej raz przed rozpoczęciem korzystania z komory.
    1. Zmierz temperaturę roztworu (np. za pomocą sondy z włókna szklanego) i porównaj ją z odczytem termostatu w interesującym nas zakresie temperatur.
    2. Sprawdź minimalne przesunięcie od odczytu termostatu i liniowość mierzonych temperatur.
    3. Sprawdź, czy wewnątrz komory obserwacyjnej występuje gradient temperatury za pomocą barwnika wrażliwego na temperaturę. Zmierz temperaturę roztworu za pomocą mikroskopii obrazowej intensywności fluorescencji lub mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) dla różnych odległości od dolnego szkiełka okładkowego40. Dodatkowo sprawdź, czy w obszarze obserwacji GUV występuje gradient temperatury, jak pokazano na Rysunek 7.

6. Obserwacje GUV w różnych temperaturach

UWAGA: Zazwyczaj, dla GUV, których membrany są potencjalnie oddzielone fazowo i które wydają się być jednorodne w temperaturze obserwacji Tobs, separacja faz zostanie wywołana poniżej Tobs (czy to zostanie zaobserwowane, zależy od badanego zakresu temperatur). I odwrotnie, pęcherzyki oddzielone fazami powinny stać się jednorodne w temperaturze wyższej niż Tobs. Nie musi to jednak mieć miejsca w przypadku konkretnego (złożonego) składu lipidowego i może być interesujące, aby zawsze skanować cały dostępny zakres temperatur38. Protokół obserwacji i oceny temperatur przemian fazowych nie opiera się na konkretnej metodzie stosowanej do kontroli temperatury.

  1. Zamontuj komorę obserwacji temperatury zgodnie z rozdziałem 5, pomijając światłowodową sondę temperatury lub fluorofor wrażliwy na temperaturę.
  2. Ustaw zewnętrzną łaźnię wodną na temperaturę pokojową (23 °C) i pozwól systemowi zrównoważyć się przez 10-15 minut.
  3. Policz liczbę pęcherzyków oddzielonych fazami, stosując kryteria z kroku 3.6; ogólny stan fazowy populacji GUV da wskazówkę co do regionu temperatury przejścia systemu. Jeśli stan fazowy w całej populacji pęcherzyków jest raczej niejednorodny, przejdź bezpośrednio do kroku 6.5.
  4. Zwiększyć (jeśli większość pęcherzyków jest oddzielona fazowo) lub zmniejszyć (jeśli większość pęcherzyków jest jednorodna) temperaturę w grubych odstępach czasu (np. 1 - 2 °C) i pozostawić system do równowagi przez około 2 minuty. Ponownie ocenić stan fazowy populacji GUV za pomocą losowej próbki i zmieniać temperaturę, aż populacja pęcherzyków wykaże niejednorodny stan fazowy.
  5. Gdy populacja zbliży się do punktu przejścia fazowego (tzn. stany fazowe wśród poszczególnych GUV są raczej niejednorodne), zmniejsz przedział temperatur (np. 0,5 °C), aby zwiększyć rozdzielczość. Pozwól systemowi zachować równowagę przez ~ 2 minuty i ponownie oceń stan fazowy populacji GUV za pomocą losowej próbki.
  6. Po przekroczeniu punktu przejścia fazowego zmieniaj temperaturę, aż wszystkie GUV będą teraz odpowiednio jednorodne lub oddzielone fazowo.
  7. Sprawdź, czy występuje histereza, aby ocenić, czy czasy równowagi są wystarczające.
    1. Zmień kierunek skanowania temperatury, tj. jeśli skanowanie zostało wykonane w celu zwiększenia temperatury, wykonaj skanowanie, zmniejszając temperaturę.
    2. Należy wybrać co najmniej podzbiór temperatur do oceny stosunku stanu fazowego populacji GUV (np. 80% separacji fazowej).
    3. Jeżeli znaczne odchylenia między oboma kierunkami stosunku stanu fazowego wskazują na histerezę, należy zmniejszyć wielkość kroku temperatury i/lub zwiększyć czas równowagi w krokach 6.4 i 6.5.
    4. Jeśli nie ma histerezy wskazywanej przez równe stosunki, rozważ zwiększenie rozmiaru kroku i/lub czasu równoważenia.
  8. Wykreśl stosunki stanu fazowego w zależności od temperatury. W celu kwantyfikacji dopasuj dane do odpowiedniego modelu (Rysunek 8).
    UWAGA: Krzywe przemian fazowych zwykle charakteryzują się trajektorią sigmoidalną, a sigmoidalny model Boltzmanna zapewnia odpowiedni zestaw parametrów dopasowania:
    figure-protocol-1
    y: frakcja jednorodnych/oddzielonych fazowo GUV
    A1: początkowa wartość ułamka
    A2: końcowa wartość ułamka
    T: temperatura
    T mix: temperatura przy połowie maksymalnej y
    Ponieważ y jest ułamkiem jednorodnych GUV, A1 i A2 powinny być ustalone odpowiednio na 0 i 1. Ponieważ zakłada się, że przejście mieszalności jest sigmoidalne, po zmierzeniu wartości ułamka jako 0 w określonej temperaturze wszystkie wartości frakcji w poniższym zakresie temperatur uważa się za 0. I odwrotnie, gdy wartość ułamka wynosi 1 w określonej temperaturze, przyjmuje się, że wszystkie wartości ułamków z powyższego zakresu temperatur wynoszą 1.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrzęk GUV

Z opisanym tutaj podejściem do spontanicznego pęcznienia, GUV złożone z DOPG, eSM i Chol były hodowane przez noc w 210 mM sacharozy lub 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, tworząc widoczne agregaty. Zbiór kruszywa zapewnia wysoki plon pęcherzyków. Ponowne zawieszenie w roztworze pęczniejącym spowodowało powstanie symetrycznych warunków roztworu transbłonowego. Aby stworzyć warunki asymetryczne, kruszywo zostało ponownie zawieszone odpowiednio w izoosmolarnej sacharozie lub roztworze o wysokim zasoleniu (Rysunek 2). Powstałe w ten sposób rozcieńczenie odpowiada quasi-zewnętrznej wymianie roztworu, minimalizując jednocześnie rozcieńczenie liczby GUV.

Mapowanie diagramu fazowego GUV za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Obecność 0,1% mol% specyficznego dla fazy DiIC18 w GUV pozwoliła na obserwację ich stanów fazowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu. Pęcherzyki wykazujące separację faz S + L obserwowano za pomocą 63x/1,2NA, aby móc rozdzielić drobno ustrukturyzowane domeny przypominające palce. We wszystkich pozostałych przypadkach użyto obiektywu 40x/0,6 NA. Aby uniknąć artefaktów podczas oględzin GUV i zmaksymalizować odtwarzalność, ustalono pewne kryteria, które określały, które pęcherzyki należy wziąć pod uwagę w analizie stanu fazowego (krok 3.6 protokołu).

GUV przygotowane z trójskładnikowych mieszanin DOPG/eSM/Chol o szerokim zakresie proporcji, spuchniętych w roztworze sacharozy lub roztworze o wysokim zasoleniu i obserwowanych w temperaturze pokojowej, wykazywały jednorodne fazy Lo lub Ld, separację faz Lo+Ld i S+L, zobacz Rysunek 3. Rysunek 9 pokazuje przykładowo uszkodzone pęcherzyki, które nie powinny być uwzględniane w analizie danych, a także pokazuje, jak zidentyfikować pęcherzyki wielopłytkowe.

Ze względu na ich nieznaną historię, GUV mogą wykazywać zmienność składu wewnątrz partii35. W związku z tym ogólny stan fazowy danej kompozycji określono w podejściu statystycznym. Populacje GUV o określonym składzie lipidowym przypisano do stanu fazowego, który zaobserwowano jako dominujący w próbce losowej (krok protokołu 3.6). Jednak kompozycje zbliżone do regionu koegzystencji Lo+Ld często dawały partie, w których dominujący stan fazowy stanowił niewielką większość. W przypadku takich niejasnych przypadków oględziny powtórzono z co najmniej trzema niezależnymi próbkami. Frakcja pęcherzyków o identycznym stanie fazowym (np. wykazujących separację faz Lo+Ld) obecnych w próbkach losowych została uśredniona w stosunku do liczby prób, które zostały przyjęte jako wynik końcowy (Rysunek 10).

Opisane protokoły doprowadziły do wystarczającego wzrostu GUV w szerokim zakresie różnych proporcji DOPG, eSM i Chol w roztworach o wysokim zasoleniu i sacharozy. Rozległe obszary na diagramie faz trójskładnikowych mogą być mapowane zarówno w symetrycznych, jak i asymetrycznych warunkach roztworu o wysokim zasoleniu (Rysunek 11). Różnice w zachowaniu fazy pęcherzyka obserwowane w różnych warunkach roztworu zostały szczegółowo omówione w innym miejscu9.

Obserwacje zachowania fazowego po pełnej wymianie bufora przy użyciu metody mikroprzepływowej

Tworzenie asymetrycznych warunków roztworu przez rozcieńczanie powoduje powstawanie pozostałości pęczniejącego roztworu na zewnątrz. Nasze podejście mikroprzepływowe pozwala na kompletną wymianę rozwiązania zewnętrznego. Rysunek 5A pokazuje urządzenie mikroprzepływowe w pełni zmontowane na stoliku mikroskopu konfokalnego wraz z wylotem płynu i wlotami kontroli ciśnienia. Rurki są połączone metalowymi rurkami pod kątem 90 °, aby zapewnić miejsce na obrazowanie w świetle przechodzącym od góry.

Do obserwacji w urządzeniu mikroprzepływowym zastosowano mikroskop konfokalny z soczewką obiektywową 63x/1.2NA zanurzoną w wodzie. Podobnie jak w przypadku poprzednich obserwacji w ilościach hurtowych, do barwienia membrany użyto DiIC18. Podczas obserwacji stanu fazowego GUV uwięzionych w urządzeniu należy uważać, aby nie zinterpretować danych błędnie. Ze względu na bliskie sąsiedztwo GUV względem słupków, ścieżki światła wzbudzenia i emisji mogą być częściowo zablokowane przez PDMS, co prowadzi do fałszywego wyglądu domen (Rysunek 12). W tym przypadku detekcja światła przechodzącego jest przydatna do sprawdzenia położenia GUV na słupkach. Ten niepożądany efekt jest szczególnie widoczny w przypadku małych GUV o średnicy mniejszej niż 10 μm. W tych przypadkach dane zostały odrzucone. Obraz konfokalny w Rysunek 13A pokazuje płaski przekrój pęcherzyka, który przecina domenę Lo obecną na pęcherzyku GUV. W tym przypadku płaskie skany przekroju poprzecznego znajdujące się dalej powyżej lub poniżej przekroju nie pokazałyby domeny ze względu na jej mały rozmiar w porównaniu z GUV, dlatego zostałaby pominięta, a pęcherzyk uznany za znajdujący się w stanie fazy jednorodnej. W związku z tym do kontroli całej powierzchni GUV należy użyć konfokalnego stosu Z. W przypadku mikroskopii szerokokątnej może to nie stanowić problemu, ponieważ cały pęcherzyk może być obrazowany jednocześnie.

Na koniec podano przykłady GUV przed i po wymianie zewnętrznego roztworu, gdzie jest jasne, jakie są stany fazowe membran (Rysunek 14). Każde urządzenie ma 60 komór (każda z parą słupków do uwięzienia pojedynczego GUV), co pozwala na przeprowadzenie dziesiątek eksperymentów na urządzenie (patrz Rysunek 4). Jednak niektóre GUV mogą zostać utracone podczas wymiany rozwiązania zewnętrznego. Można to zminimalizować, wykonując następujące czynności: 1) Stosując powłokę z albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zapobiec przyrośnięciu/pękaniu GUV na słupkach; powlekanie odbywa się poprzez wystawienie ścianek komory na działanie 20 mg/ml BSA przez 60 minut, a następnie przepłukanie buforem roboczym. Inną cząsteczką adhezyjną, którą można zastosować, jest poli(L-lizyna)-graft-poli(glikol etylenowy)39. 2) Staranne osmotyczne dopasowanie roztworów wewnętrznych i zewnętrznych, aby uniknąć wiotkich GUV, które mogłyby przejść przez środek słupków lub pęknięcia GUV. 3) Optymalizacja procedury przygotowania GUV w celu uzyskania pęcherzyków o średnicy większej niż ~ 8 μm, aby zapobiec przechodzeniu przez środek słupków.

Projekt i charakterystyka komory o kontrolowanej temperaturze do obserwacji stanów fazowych GUV

Zaprojektowaliśmy prostą komorę przepływową, która posiada połączenia z zewnętrznym termostatem wodnym (Rysunek 6). Komorę uzyskaliśmy poprzez frezowanie bloku aluminiowego. Ogólnie rzecz biorąc, materiał komory nie musi przewodzić ciepła, ponieważ próbka jest sprzężona z łaźnią wodną za pomocą dolnego szkła nakrywkowego, jak pokazano na Rysunek 6B i 6C.

Niezależnie od dokładnego projektu, wydajność komory powinna być oceniana. W szczególności sprawdziliśmy liniowość temperatury próbki z temperaturą zadaną zewnętrznie, wszelkie systematyczne przesunięcia temperatury oraz gradient temperatury w komorze. Dwa pierwsze punkty zostały rozwiązane poprzez bezpośredni pomiar temperatury wewnątrz komory za pomocą światłowodowej sondy temperatury (np. FISO FTI-10). Sprawdziliśmy również, czy w zawieszeniu GUV nie występuje gradient temperatury. Takie nachylenie może wynikać z przepływu ciepła na zewnątrz komory. Przestrzennie rozdzielcze pomiary temperatury można uzyskać za pomocą wrażliwego na temperaturę fluoroforu40, patrz Rysunek 7.

Wykres i dopasowanie danych w celu uzyskania mieszanki T oddzielnych fazowo GUV

Wykreślenie frakcji jednorodnych GUV w obserwowanym zakresie temperatur dało trajektorię punktu danych o kształcie sigmoidalnym. Dopasowujemy dane do modelu Boltzmanna (sekcja protokołu 6.8), z którego można wywnioskować mieszaninę T (Rysunek 8).

figure-results-1
Rycina 1: Etapy eksperymentalne podczas protokołu spontanicznego pęcznienia (górny panel) z odpowiadającym mu etapem wzrostu pęcherzyków (dolny panel). (A) Jednorodny film lipidowy rozprowadza się na szorstkiej płytce PTFE i suszy z dowolnego rozpuszczalnika. (B) Wysuszony film lipidowy jest następnie wstępnie pęczniejący w atmosferze nasyconej wodą w zamkniętym pojemniku z wodą, aby ułatwić nawodnienie dwuwarstwowe. Fiolka ze szkła pustego zawiera płytkę PTFE i pozostaje otwarta podczas tego etapu hydratacji. (C) Wstępnie spuchnięty film lipidowy w końcu zostaje w pełni nawodniony przez dodanie pożądanego roztworu pęczniejącego do pokrytej lipidem płytki PTFE wewnątrz szklanej fiolki. Aby uniknąć parowania, szklana fiolka jest prawidłowo zamknięta podczas inkubacji przez noc. Aby zminimalizować różnice w składzie w partii, wszystkie etapy muszą być wykonywane w temperaturze, w której mieszanina lipidów jest w pełni mieszalna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zbiór GUV. (A) Zdeponowany film lipidowy składający się z DOPG / eSM / Chol w stosunku molowym 20/60/20 z 0,1% molowym DiIC18 był spuchnięty w buforze o wysokim zasoleniu złożonym ze 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5. Wieczko szklanego pojemnika zostało dodatkowo uszczelnione folią parafinową. Powiększony obszar zainteresowania zawiera wynikową agregację GUV. Jego czerwony wygląd jest konsekwencją obecności DiIC18. (B) GUV zostały zebrane ze ściętą końcówką pipety. Na tym obrazie kruszywo pipetowano razem z 50 μl roztworu pęczniejącego, który przeniesiono do świeżej fiolki. (C) Aby stworzyć asymetryczne warunki roztworu transmembranowego, kruszywo rozcieńczono w innym izotonicznym roztworze zewnętrznym. W tym przypadku agregat wraz z 50 μl roztworu pęczniejącego został ponownie zawieszony w 950 μl roztworu sacharozy, co dało 20-krotne rozcieńczenie roztworu pęczniejącego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazowanie GUV. Szerokokątne obrazy fluorescencyjne GUV domieszkowanych 0,1% mol% DiIC18 przygotowane i obserwowane w symetrycznych roztworach soli lub sacharozy składających się z różnych proporcji DOPG, eSM i Chol (w buforze solnym, od lewej do prawej: 40/20/40; 50/20/30; 30/60/10; w sacharozy, od lewej do prawej: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Obrazy przedstawiają GUV w różnych (współistniejących) stanach fazowych ocenianych zgodnie z kryteriami w kroku 3.6 protokołu. W tym przypadku pęcherzyki zostały sfotografowane przez obiektyw 40X/0,6 NA. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Układ projektu kanału mikroprzepływowego. GUV wchodzą do dolnej warstwy płynowej (zarysowane kanały) przez wlot poniżej zbiornika. Filtr blokuje niechciane zanieczyszczenia z urządzenia. Następnie wchodzą do układu 60 komór (8 rzędów i 15 kolumn), z których każda zawiera słupki do pojedynczego przechwytywania GUV (patrz wkładka). Każda komora może być odizolowana w zaworze pierścieniowym uruchamianym przez warstwę kontrolną (wypełnione czarne kanały) powyżej warstwy płynowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Urządzenie mikroprzepływowe. (A) Fotografia urządzenia mikroprzepływowego używanego do wychwytywania pojedynczych GUV i pełnej wymiany roztworu zewnętrznego. Etykiety wskazują zbiornik do dodawania roztworów (1), 8 x wloty ciśnienia podłączone do jednostki sterującej ciśnieniem (2) oraz wylot płynu podłączony do strzykawki i pompy (3). Panel (B) przedstawia jednostkę sterującą ciśnieniem z 8 zaworami, z których każdy reguluje 1 rurkę podłączoną do urządzenia mikroprzepływowego. Tutaj zawory #1 i #2 są otwarte, a zatem odpowiednie zawory pierścieniowe są zamknięte. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Komora kontroli temperatury. (A) Izba przed zgromadzeniem. (B) Zmontowana komora (skierowana do góry) z 2 mm szkłami nakrywkowymi przyklejonymi do góry i od dołu. Pomarańczowa gumowa przekładka ma wysokość 0,5 mm i jest uszczelniona szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 0,17 mm do obserwacji zamkniętego zawieszenia GUV. Na tym zdjęciu sonda temperatury jest włożona w celu kalibracji (brązowe włókno wychodzące z komory po prawej stronie). (C) Montaż końcowy na stoliku mikroskopu odwróconego bez sondy temperatury. Pomarańczowa gumowa przekładka jest teraz skierowana w dół. Guma jest wystarczająco przyczepna, aby utrzymać próbkę na miejscu. Należy pamiętać, że światło może być przepuszczane przez próbkę, umożliwiając zarówno obserwacje epi-fluorescencji, jak i jasnego pola. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Przestrzennie rozdzielone dane dotyczące temperatury wewnątrz komory obserwacyjnej uzyskane za pomocą pomiarów FLIM barwnika wrażliwego na temperaturę (tutaj: 500 μM Rhodamine B)40. Punkty danych uzyskane na wysokości 0, 10, 30, 300 i 400 μm powyżej dolnego szkiełka nakrywkowego. Czerwone i niebieskie punkty danych zostały zmierzone dla temperatury łaźni wodnej ustawionej odpowiednio na 30 °C i 12 °C. Czarne punkty danych wskazują łaźnię wodną pozostawioną do zrównoważenia do temperatury pokojowej. Zaobserwowano niewielkie wahania temperatury w całej komorze, ale pozostały one poniżej 0,5 °C (szare słupki). Całkowita wysokość komory wynosi około 500 μm w zależności od grubości przekładki (patrz wyżej). Słupki błędów wskazują odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Lokalizacja temperatury mieszalności. Wykres przedstawia poszczególne punkty danych jednorodnej (stan pojedynczej cieczy) frakcji GUV przygotowanej z DOPG/eSM/Chol w stosunku 30/40/30 domieszkowanej 0,1 mol% DiIC18 z trzech niezależnych próbek losowych (N = 20 - 40). Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średnich. Punkty danych dopasowano do modelu Boltzmanna opisanego w kroku 6.8 (ciągła linia), z którego wydedukowano temperaturę mieszania domeny Tmix (podążaj za czerwoną ciągłą linią do odciętych) zgodnie z połową maksimum krzywej esicznej na rzędnej (przerywana linia). Wartości początkowe i końcowe (A1 i A2) ustalono odpowiednio na 0 i 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Uszkodzone pęcherzyki. Przykłady gigantycznych pęcherzyków przygotowanych z 20/60/20 DOPG/eSM/Chol i domieszkowanych 0,1% mol% w przypadku DiIC18, które nie spełniają kryteriów określonych w kroku 4.2, zobrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnego. Zakresy wyświetlania intensywności poszczególnych obrazów były każdorazowo optymalizowane pod kątem intensywności fluorescencji przedstawionego pęcherzyka. Ze względu na obecność dodatkowego materiału membrany i zamkniętych mniejszych pęcherzyków, stan fazowy pęcherzyka w (A) nie może być jednoznacznie określony. Wygląd tego gigantycznego pęcherzyka nie pozwala na żadną wiarygodną kontrolę wzrokową pod kątem blaszkowatości. Panel (B) przedstawia pęcherzyk, którego wnętrze jest wypełnione materiałem membranowym. W konsekwencji sygnał fluorescencyjny zewnętrznej błony pęcherzykowej nakłada się na jej sygnał wewnętrzny, co uniemożliwia wizualizację blaszkowatości i potencjalnych domen. (C) Intensywności fluorescencji trzech różnych gigantycznych pęcherzyków są pokazane w bezpośrednim porównaniu w tym samym zakresie intensywności wyświetlania. Obraz ten pokazuje, że gigantyczne pęcherzyki wieloblaszkowe (1, 2) można zidentyfikować na podstawie ich zwiększonego sygnału fluorescencji w porównaniu z GUV (3). W tym przypadku wieloblaszkowe i jednolamelarne pęcherzyki olbrzymie wykazują separację faz Lo + Ld. Pęcherzyki na wszystkich zdjęciach zostały sfotografowane przez obiektyw 40x/0,6 NA. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Frakcja GUV oddzielonych fazami Lo+Ld uśredniona dla co najmniej trzech niezależnych próbek. Pęcherzyki składały się z 30/40/30 DOPG/eSM/Chol w pobliżu granicy regionu koegzystencji Lo+Ld. Słupki błędów dla symetrycznych warunków sacharozy ilustrują rozpraszanie między partiami. Etykieta rzędnej opisuje roztwory wewnątrz/na zewnątrz pęcherzyków; sacharoza: 210 mM sacharozy; sól: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5; Słupki błędów wskazują odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Diagram fazowy GUV przygotowanych z DOPG, eSM i Chol zmapowanych w różnych warunkach roztworu przy użyciu 210 mM sacharozy (sacharozy) i 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 (sól). Stany fazowe GUV badano w sacharozie/sacharozie (A; górna sekcja), sacharozy/soli (wejście/wydech) (A; dolny przekrój wielokątny), sól/sól (B; górna sekcja) i sacharoza/sacharoza (B; dolny przekrój wielokątny). Rysunki ilustrują dominujący wzorzec domeny w wyróżnionych sekcjach i odpowiadające im warunki rozwiązania. Stany fazowe pęcherzyków reprezentowane w dolnych przekrojach wielokątnych obserwowano w asymetrycznych warunkach roztworu po 20-krotnym rozcieńczeniu GUV. Na podstawie reference9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12: Artefakty w uwięzionych GUV. Przykład małego GUV, w którym można zobaczyć fałszywą domenę ze względu na bliskie sąsiedztwo słupków (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Obraz w świetle przechodzącym w jasnym polu przedstawiający słupki (szary) jest nałożony na konfokalny obraz fluorescencyjny GUV (pomarańczowy). Słupki są widoczne jako tworzące wzór interferencyjny na obrazie w jasnym polu. Sygnał fluorescencyjny w pobliżu słupków (po prawej) jest zmniejszony, co daje wrażenie separacji faz. Podziałka = 5 μm.

figure-results-13
Rysunek 13: Przykłady dwóch różnych GUV przechwyconych przez słupki PDMS, w których stany fazowe są wyraźnie widoczne. (A) Pęcherzyk oddzielony fazami Lo + Ld wykonany z DOPG/eSM/Chol 60/20/20. (B) Pęcherzyk wykonany z 40/30/30 wykazujący pojedynczą fazę Ld lub Lo. Zbadano konfokalny stos Z całego pęcherzyka, aby potwierdzić, że nie ma (nieostrych) domen. Krawędzie słupków są widoczne po prawej stronie zdjęć (kolor szary). Podziałka = 5 μm.

figure-results-14
Rysunek 14: Wynikowe zachowanie fazowe po pełnej wymianie płynu za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Ten sam GUV jest pokazany zarówno przed, jak i po wymianie roztworu dla (A) symetrycznej soli/soli (wejście/wyjście) na sól/sacharozę (wejście/wyjście) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, podziałka wynosi 2 μm) i (B) symetrycznej sacharozy/sacharozy (wejście/wyjście) do sacharozy/soli (wejście/wyjście) (DOPG/eSM/Chol 30/40/30, podziałka = 3 μm). Na podstawie reference9.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana produkcja GUV do obserwacji stanu fazowego w symetrycznych i asymetrycznych warunkach wysokiego zasolenia

Przedstawione tutaj protokoły wprowadzają strategię oceny wpływu asymetrii i roztworów o wysokim zasoleniu na stan fazy membranowej naładowanych GUV w szerokim zakresie składów. Jednym z głównych wyzwań na drodze do osiągnięcia tego celu była produkcja naładowanych GUV w o wysokim zasoleniu.

Udało nam się wyprodukować GUV w roztworze sacharozy i buforze o wysokiej zawartości soli za pomocą prostego podejścia do spontanicznego pęcznienia, które obejmuje etap wstępnego uwodnienia zdeponowanego filmu lipidowego i końcowy etap hydratacji przez noc w celu wzrostu pęcherzyków. Ważne jest, aby pamiętać, że osadzanie lipidów powinno odbywać się na szorstkiej płytce PTFE, aby zapewnić równomierne rozprowadzanie lipidów w celu uzyskania jednopłytkowych pęcherzyków. Ponadto ważne jest, aby wykonać każdy krok podczas przygotowania pęcherzyków w temperaturze, w której film lipidowy znajduje się w stanie jednorodnej i płynnej fazy. W przeciwnym razie populacja pęcherzyków może być polidyspersyjna w składzie i odchylać się od końcowej analizy stanu fazy populacji. Specyficzny protokół spontanicznego pęcznienia GUV daje grudkę pęcherzyków, która z jednej strony daje możliwość ponownego zawieszenia jej w małych objętościach w celu uzyskania wysoce skoncentrowanych dyspersji pęcherzyków, a z drugiej strony zapewnia asymetryczne warunki roztworu w poprzek błony, jednocześnie minimalizując rozcieńczenie pęcherzyków 8,28. Istotne jest, aby podczas rozcieńczania pęcherzyków lub zewnętrznej wymiany roztworu, osmolarność wewnętrzna i zewnętrzna pozostały dopasowane, ponieważ zmiany morfologii spowodowane niedopasowaniem osmolarności mogą indukować lub uniemożliwiać separację faz Lo + Ld41 lub, w przypadku warunków hipotonicznych, mogą prowadzić do pękania pęcherzyków.

W tym przypadku próby optymalizacji protokołów elektroformacji w roztworze o wysokim zasoleniu doprowadziły do braku GUV, podczas gdy pęcznienie wspomagane PVA dało pęcherzyki wielopłytkowe. Mimo że wymaga to dłuższego czasu przygotowania i skutkuje partiami pęcherzyków o niższej jakości10,17, pomyślne wytwarzanie naładowanych pęcherzyków przez spontaniczne pęcznienie ma dodatkowe zalety. Wymaga minimalnego wysiłku, a jednocześnie zapewnia wystarczającą wydajność do statystycznych analiz partii i, w przeciwieństwie do elektroformacji, nie jest wymagany żaden zaawansowany sprzęt ani optymalizacja. Ponadto nie zaobserwowano żadnych zanieczyszczeń przez utlenianie lipidów42,43. Według literatury nie ma różnic między składem lipidowym pęcherzyków a odpowiadającymi im stadami, z których zostały wyhodowane 7,17. Co więcej, tworzenie się pęcherzyków na podłożu z PTFE nie powoduje włączenia żadnych zanieczyszczeń, w przeciwieństwie do metod pęcznienia wspomaganego żelem, w których obce cząsteczki mogą być wprowadzane przez substrat23. Elektroformacja wiąże się z dalszymi wadami związanymi z nadmiernym rozcieńczeniem pęcherzyków podczas tworzenia asymetrycznych warunków roztworu. GUV wytwarzane w procesie elektroformacji występują zwykle w postaci jednorodnej dyspersji (w przeciwieństwie do silnie skoncentrowanej zawiesiny pęcherzykowej w postaci grudki powstałej podczas spontanicznego pęcznienia). Jakiekolwiek rozcieńczenie roztworu zewnętrznego znacznie rozcieńczyłoby również liczbę pęcherzyków. Ponadto w trakcie tych prac zaobserwowano, że GUV DOPG/eSM/Chol wytwarzane przez elektroformację w sacharozie stawały się niestabilne po rozcieńczeniu w buforze o wysokim zasoleniu. Fluorescencja z plam lipidowych na szkiełku mikroskopowym wskazywała, że pęcherzyki pękną, zanim możliwe będzie ich oględziny. Niestabilność ta może być spowodowana zwiększonym napięciem błony pęcherzyków powstałych w wyniku elektroformacji w porównaniu z napięciem uzyskanym w wyniku spontanicznego pęcznienia10.

Chociaż rozcieńczenie pęcherzyków jest łatwym i szybkim podejściem do stworzenia asymetrycznych warunków roztworu GUV, dokonuje ono tylko częściowej wymiany roztworu zewnętrznego, aczkolwiek do dużej frakcji (tutaj: 95 %, Rysunek 2), ponieważ po rozcieńczeniu pozostaną ślady pęczniejącego roztworu. Wybór stopnia wymiany roztworu zewnętrznego jest kompromisem między pipetowaniem grudki pęcherzyka razem z roztworem pęczniejącym (sekcja 2) a nierozcieńczaniem go zbyt mocno. W związku z tym wprowadziliśmy alternatywne podejście mikroprzepływowe omówione szczegółowo w innym miejscu37, które pozwala na szybką i kompletną wymianę roztworu zewnętrznego podczas obserwacji stanu fazowego GUV w celu weryfikacji obserwacji stanu fazowego dokonanych dla rozcieńczonych pęcherzyków. Obserwacje zmian stanu fazowego podczas przechodzenia od symetrycznych do asymetrycznych warunków rozwiązania rzeczywiście okazały się zgodne. Dodatkowo, obie przedstawione tutaj metody generowania asymetrycznych warunków roztworu są porównywalnie szybkie (porównaj Ref.8) i nie wiążą się ze znanym ryzykiem lokalnych zmian składu (porównaj referencje30,31), wzrostu napięcia membrany (porównaj odniesienie32) lub lokalnego ogrzewania (porównaj odniesienie33), jak to ma miejsce w odniesieniu do metod alternatywnych omówionych we wprowadzeniu. Podczas wychwytywania mikroprzepływowego równowaga osmotyczna między wnętrzem pęcherzyka a zewnętrzem jest nie tylko niezbędna, aby uniknąć artefaktów stanu fazowego, jak wspomniano powyżej, ale także deflacja spowodowana warunkami roztworu hipertonicznego może spowodować, że uwięzione GUV prześlizgną się przez słupki po zewnętrznej wymianie roztworu.

Mimo że spontaniczne pęcznienie zostało z powodzeniem zastosowane do wyhodowania nienaładowanych pęcherzyków z systemu DOPC / eSM / Chol, w innych przypadkach brak ładunków może upośledzać pęcznienie GUV z powodu wynikającego z tego braku odpychania między poszczególnymi dwuwarstwami44. Wydłużenie okresu przed pęcznieniem lub wprowadzenie dużych lipidowych grup głowy może przeciwdziałać temu problemowi45. Ponadto stabilność pęcherzyków po ich rozcieńczeniu w roztworach innych niż te stosowane do pęcznienia może być różna dla różnych składów lipidowych i pożywek rozcieńczających, czego tutaj nie badaliśmy. Nie badaliśmy również możliwości dostrojenia średniej średnicy GUV za pomocą przedstawionej tutaj metody przygotowania. Ale parametry takie jak skład pęcherzyków i roztwór pęczniejący mogą mieć wpływ na wyniki. Zastosowanie metod alternatywnych46 może prowadzić do powstania większych pęcherzyków dla zastosowanych tu lipidów i roztworów, jednak mogą one mieć inne wady związane z tą metodą. Opisane powyżej podejście do wytwarzania GUV w symetrycznych i asymetrycznych warunkach wysokiego zasolenia stanowi potencjalne narzędzie do dalszych badań pęcherzyków zbudowanych z różnych składów lipidowych i rozproszonych w różnych podłożach. Ponieważ nie zbadaliśmy tych możliwości, przyszłe badania pokażą, jak ogólnie można zastosować metody przygotowania i rozcieńczania GUV.

Obserwacja separacji faz w różnych temperaturach

Istnieją różne konfiguracje eksperymentalne odpowiednie do badania GUV w różnych temperaturach. Chociaż te konfiguracje nie są zwykle szczegółowo opisane w literaturze, obecna praca przedstawia podstawowy zestaw mający zastosowanie do takich badań.

Pomiary kontrolne pokazują, że temperatura tej zaprojektowanej i zbudowanej przez nas komory jest precyzyjnie kontrolowana przez termostat, a gradienty temperatury wewnątrz komory mieszczą się w eksperymentalnej rozdzielczości temperatury. Zapewnia się, że eksperymentalne warunki termiczne są zgodne z odczytem termostatu.

Podczas oceny stanów fazowych GUV w szerokim zakresie temperatur ważne jest, aby obserwowane pęcherzyki były dobrze zrównoważone po zmianie temperatury. Jednym z możliwych sposobów, aby to zapewnić, jest sprawdzenie, czy nie ma histerezy. Jeśli występuje histereza, należy zmniejszyć stopnie temperatury i/lub wydłużyć czasy równowagi. Ponieważ regulacja temperatury w tej pracy odbywa się za pomocą termostatu wodnego, zakres temperatur roboczych jest idealnie ograniczony do 0 - 100 °C. Zakres ten można rozszerzyć poprzez zastosowanie innych płynów kontrolujących temperaturę, takich jak olej, lub poprzez zastosowanie innych konfiguracji, np. urządzenia Peltiera. W praktyce temperatura pracy jest również ograniczona przez ewentualną kondensację lub parowanie. Ponadto, w przypadku temperatur odległych od temperatury pokojowej, bardziej prawdopodobne staje się wystąpienie gradientu temperatury w stanie ustalonym w całej komorze obserwacyjnej. Ponadto sprzęt do obrazowania może zostać uszkodzony w ekstremalnych temperaturach. Dla typowych zakresów temperatur odpowiednich do badań pęcherzyków lipidowych (~10 - 50 °C 7,9) należy rozważyć uszkodzenie sprzętu obserwacyjnego, ale zazwyczaj nie jest to oczekiwane.

Artefakty obserwacji domeny pęcherzyków

Istnieje wiele źródeł artefaktów obserwacyjnych wykorzystujących szerokokątną mikroskopię fluorescencyjną. Przede wszystkim należy mieć świadomość, że maksymalna rozdzielczość r obiektu zastosowana do wizualnej kontroli stanów fazowych pęcherzyków określa granicę wykrywalności domen lipidowych zgodnie z:
Rayleigh criterion explaining resolution formula, equation for optical microscopy analysis.
gdzie λ jest długością fali emisji, a NA jest aperturą numeryczną obiektywu. Typowy obiektyw o 40-krotnym powiększeniu i NA 0,6, który wykrywa zielone światło emisyjne około 560 nm, osiągnąłby rozdzielczość optyczną ~0,6 μm. W związku z tym badania, w których porównuje się stany fazowe pęcherzyków wytworzonych z poszczególnych mieszanin lipidowych w różnych warunkach, powinny mieć ten sam cel dla tej samej mieszaniny lipidów.

Innym artefaktem jest występowanie domen lipidowych w wyniku fotoutleniania lipidów w wyniku długotrwałej ekspozycji na światło wzbudzające41. Fotouszkodzenia występują przede wszystkim na nienasyconych ugrupowaniach lipidowych węglowodorów. W rzeczywistości dla niektórych kompozycji lipidowych takie tworzenie się domen początkowo jednorodnych pęcherzyków zaobserwowano tutaj po dłuższym okresie ekspozycji na światło wzbudzające (~30 s). Aby przeciwdziałać temu problemowi, światło wzbudzenia było skupione na jednym polu widzenia tylko przez kilka sekund w celu oceny stanu fazowego. W związku z tym DiIC18 był odpowiedni do naszych celów. Inne barwniki mogą być jednak znacznie bardziej wrażliwe i mogą wymagać obchodzenia się z niższymi intensywnościami wzbudzenia i krótszymi czasami ekspozycji na światło wzbudzenia.

Mechaniczne naprężenie ścinające spowodowane przenoszeniem pęcherzyków pipetą potencjalnie tymczasowo miesza domeny, zniekształcając w ten sposób pozorne zachowanie fazy pęcherzyka. W przypadku niektórych partii różne pęcherzyki wykazywały różne zachowania fazowe 0 min i 5 min po przeniesieniu pipety na szkiełko nakrywkowe mikroskopu. Wykazano również, że naprężenie ścinające wywołane przepływem płynu w urządzeniu mikroprzepływowym powoduje mieszanie domen47. Pęcherzyki należy pozostawić w spokoju przez wystarczająco dużo czasu, aby zapewnić równowagę przed obserwacją. W ramach tego badania pęcherzyki uwięzione na urządzeniu mikroprzepływowym pozostawiono w spokoju przez 1 godzinę po załadowaniu pęcherzyków i wymianie roztworu przed obserwacją.

Aby uniknąć niektórych z wyżej wymienionych trudności, jak również ograniczeń wynikających z limitu dyfrakcji światła, można zastosować alternatywne metody, takie jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego48 lub techniki mikroskopii superrozdzielczej49 .

Wnioski i perspektywy

W prezentowanej pracy przedstawiono zestaw metod, który pozwala na analizę wpływu warunków roztworu o wysokim zasoleniu, symetrycznego i asymetrycznego na separację faz membranowych. Wszystkie przedstawione metody nadają się do innych zastosowań. Na przykład urządzenie mikroprzepływowe stanowi platformę do badania kinetyki powstawania i zanikania domen po indukcji asymetrii roztworu. W ten sposób można również zbadać wygląd domeny w funkcji stężenia soli. Wszystkie metody mogą być również wykorzystane do przyjrzenia się wpływowi na zachowanie fazy przy użyciu dowolnych innych interesujących rozwiązań.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częścią konsorcjum MaxSynBio, które jest wspólnie finansowane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Niemiec oraz Towarzystwo Maxa Plancka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sól sodowaAvanti Polar Lipids840475C, w skrócie DOPG w tekście
sfingomielina jaj kurzychAvanti Polar Lipids860061w skrócie eSM
cholesterol (wełna owcza, > 98 %)Avanti Polar Lipids700000skrócie Chol
Nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaninySondy molekularneD-282w skrócie DiIC18
Chloroform, klasa HPLC (≥ 99,8 %)Merck
NaCl (> 99,8%)Roth
HCl (37%)Roth
Tris (≥ 99,9%)Roth
Sacharoza (≥ 99,5 %)Sigma Aldrich
Parafilm
Fiolka gwintowana 45x27 mm, 15 mLKimbleSoda płaskie dno, biała zakrętka
pH-metrMettler ToledoMP220
OsmometrGonotecOsmomat030
Mikroskop epifluorescencyjnyZeissAxio Observer D1
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeicaTCS SP5
Obiektyw 40x, 0.6 NAZeissLD Achroplan
Obiektyw 40x, 0.75 BRAK ObiektywLeica506174
63x, 0.9 NALeica506148
56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Glä ser
Szkiełko nakrywkowe, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mmMenzel-Glä aser
Parafilm "M"BremixElastyczne strzykawki do pakowania
, 5 mL, 10 mLBraun
0,45 µ m filtr strzykawkowyGVS Ameryka PółnocnaCameo 25AS, 1213723Octan, sterylny
w Szkiełko mikroskopowe ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophys J. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  2. Bagatolli, L. A. To see or not to see: lateral organization of biological membranes and fluorescence microscopy. Biochim Biophys Acta. 1758 (10), 1541-1556 (2006).
  3. Carquin, M., D'Auria, L., Pollet, H., Bongarzone, E. R., Tyteca, D. Recent progress on lipid lateral heterogeneity in plasma membranes: From rafts to submicrometric domains. Prog Lipid Res. 62, 1-24 (2016).
  4. Baumgart, T., Hess, S. T., Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425 (6960), 821-824 (2003).
  5. Bacia, K., Schwille, P., Kurzchalia, T. Sterol structure determines the separation of phases and the curvature of the liquid-ordered phase in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (9), 3272-3277 (2005).
  6. Vequi-Suplicy, C. C., Riske, K. A., Knorr, R. L., Dimova, R. Vesicles with charged domains. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1338-1347 (2010).
  7. Blosser, M. C., Starr, J. B., Turtle, C. W., Ashcraft, J., Keller, S. L. Minimal effect of lipid charge on membrane miscibility phase behavior in three ternary systems. Biophys J. 104 (12), 2629-2638 (2013).
  8. Pataraia, S., Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Effect of cytochrome c on the phase behavior of charged multicomponent lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1838 (8), 2036-2045 (2014).
  9. Kubsch, B., Robinson, T., Lipowsky, R., Dimova, R. Solution Asymmetry and Salt Expand Fluid-Fluid Coexistence Regions of Charged Membranes. Biophys J. 110 (12), 2581-2584 (2016).
  10. Dimova, R., et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  11. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  12. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  13. van Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  14. Stein, H., Spindler, S., Bonakdar, N., Wang, C., Sandoghdar, V. Production of Isolated Giant Unilamellar Vesicles under High Salt Concentrations. Front Physiol. 8, 63(2017).
  15. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome Electroformation. Faraday Discuss. 81, 303-311 (1986).
  16. Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 19, 323-336 (1988).
  17. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  18. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  19. Pott, T., Bouvrais, H., Meleard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem Phys Lipids. 154 (2), 115-119 (2008).
  20. Green, N. G., Ramos, A., Gonzalez, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics. 61 (4 Pt B), 4011-4018 (2000).
  21. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J Am Chem Soc. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  22. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  23. Lira, R. B., Dimova, R., Riske, K. A. Giant Unilamellar Vesicles Formed by Hybrid Films of Agarose and Lipids Display Altered Mechanical Properties. Biophys J. 107 (7), 1609-1619 (2014).
  24. Kresse, K. M., Xu, M., Pazzi, J., Garcia-Ojeda, M., Subramaniam, A. B. Novel Application of Cellulose Paper As a Platform for the Macromolecular Self-Assembly of Biomimetic Giant Liposomes. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (47), 32102-32107 (2016).
  25. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
  26. Needham, D., Evans, E. Structure and Mechanical-Properties of Giant Lipid (DMPC) Vesicle Bilayers from 20-Degrees-C Below to 10-Degrees-C above the Liquid-Crystal Crystalline Phase-Transition at 24-Degrees-C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
  27. Manneville, J. B., et al. COPI coat assembly occurs on liquid-disordered domains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (44), 16946-16951 (2008).
  28. Wollert, T., Wunder, C., Lippincott-Schwartz, J., Hurley, J. H. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458 (7235), 172(2009).
  29. Kuhn, P., et al. A facile protocol for the immobilisation of vesicles, virus particles, bacteria, and yeast cells. Integr Biol (Camb). 4 (12), 1550-1555 (2012).
  30. Sarmento, M. J., Prieto, M., Fernandes, F. Reorganization of lipid domain distribution in giant unilamellar vesicles upon immobilization with different membrane tethers. Biochim Biophys Acta. 1818 (11), 2605-2615 (2012).
  31. Lipowsky, R., Rouhiparkouhi, T., Discher, D. E., Weikl, T. R. Domain formation in cholesterol-phospholipid membranes exposed to adhesive surfaces or environments. Soft Matter. 9 (35), 8438(2013).
  32. Korlach, J., Reichle, C., Muller, T., Schnelle, T., Webb, W. W. Trapping, deformation, and rotation of giant unilamellar vesicles in octode dielectrophoretic field cages. Biophys J. 89 (1), 554-562 (2005).
  33. Delabre, U., et al. Deformation of phospholipid vesicles in an optical stretcher. Soft Matter. 11 (30), 6075-6088 (2015).
  34. Fidorra, M., Garcia, A., Ipsen, J. H., Hartel, S., Bagatolli, L. A. Lipid domains in giant unilamellar vesicles and their correspondence with equilibrium thermodynamic phases: a quantitative fluorescence microscopy imaging approach. Biochim Biophys Acta. 1788 (10), 2142-2149 (2009).
  35. Bezlyepkina, N., Gracia, R. S., Shchelokovskyy, P., Lipowsky, R., Dimova, R. Phase diagram and tie-line determination for the ternary mixture DOPC/eSM/cholesterol. Biophys J. 104 (7), 1456-1464 (2013).
  36. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618(2013).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 44105(2013).
  38. Veatch, S. L., Gawrisch, K., Keller, S. L. Closed-loop miscibility gap and quantitative tie-lines in ternary membranes containing diphytanoyl PC. Biophys J. 90 (12), 4428-4436 (2006).
  39. Kolesinska, B., et al. Interaction of beta(3) /beta(2) -peptides, consisting of Val-Ala-Leu segments, with POPC giant unilamellar vesicles (GUVs) and white blood cancer cells (U937)--a new type of cell-penetrating peptides, and a surprising chain-length dependence of their vesicle- and cell-lysing activity. Chem Biodivers. 12 (5), 697-732 (2015).
  40. Robinson, T., et al. Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging. Lab Chip. 9 (23), 3437-3441 (2009).
  41. Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  42. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  43. Breton, M., Amirkavei, M., Mir, L. M. Optimization of the Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) with Unsaturated Phospholipids. J Membr Biol. 248 (5), 827-835 (2015).
  44. Lasic, D. D., Needham, D. The "stealth" liposome: a prototypical biomaterial. Chemical Reviews. 95, 2601-2628 (1995).
  45. Needham, D., McIntosh, T. J., Lasic, D. D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1108 (1), 40-48 (1992).
  46. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Jr Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophys J. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  47. Sturzenegger, F., Robinson, T., Hess, D., Dittrich, P. S. Membranes under shear stress: visualization of non-equilibrium domain patterns and domain fusion in a microfluidic device. Soft Matter. 12 (23), 5072-5076 (2016).
  48. Veatch, S. L., Polozov, I. V., Gawrisch, K., Keller, S. L. Liquid domains in vesicles investigated by NMR and fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 2910-2922 (2004).
  49. Owen, D. M., Magenau, A., Williamson, D., Gaus, K. The lipid raft hypothesis revisited--new insights on raft composition and function from super-resolution fluorescence microscopy. Bioessays. 34 (9), 739-747 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Phase SeparationGUV PreparationSolution AsymmetryTemperature Control ChamberMicrofluidic DeviceLipid BilayerDomain DiffusionPhase State Assessment

Powiązane artykuły