Method Article

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

DOI:

10.3791/56039

⸱

September 12th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aorta jest największą tętnicą w ciele. Ściana aorty składa się z wewnętrznej warstwy komórek śródbłonka, środkowej warstwy naprzemiennie elastycznych blaszek i komórek mięśni gładkich (SMC) oraz zewnętrznej warstwy fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej. W przeciwieństwie do szeroko zakrojonych badań nad modelami patologicznymi (np. miażdżycą) w aorcie dorosłej, znacznie mniej wiadomo o aorcie embrionalnej i okołoporodowej. W tym miejscu skupiamy się na SMC i przedstawiamy protokoły analizy morfogenezy i patogenezy zarodkowych i okołoporodowych SMC aorty w prawidłowym rozwoju i chorobie. W szczególności cztery zawarte protokoły to: i) mapowanie losu zarodków in vivo i analiza klonalna; ii) eksplantacja zarodkowej aorty; iii) izolacja SMC z aorty okołoporodowej; oraz iv) podskórne umieszczenie minipompy osmotycznej u ciężarnych (lub nieciężarnych) myszy. W związku z tym podejścia te ułatwiają badanie pochodzenia (początków), losu i architektury klonalnej SMC w aorcie in vivo. Pozwalają one na modulację morfogenezy aorty embrionalnej w macicy poprzez ciągłą ekspozycję na środki farmakologiczne. Ponadto izolowane eksplantaty tkanki aorty lub SMC aorty mogą być wykorzystywane do uzyskania wglądu w rolę określonych celów genowych podczas podstawowych procesów, takich jak muskularyzacja, proliferacja i migracja. Te generujące hipotezy eksperymenty na izolowanych SMC i eksplantowanej aorcie mogą być następnie oceniane w kontekście in vivo za pomocą podejść farmakologicznych i genetycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy krążenia organizmów wielokomórkowych funkcjonują w celu dostarczania składników odżywczych i tlenu do komórek, które nie mają kontaktu ze środowiskiem zewnętrznym oraz usuwania produktów przemiany materii i dwutlenku węgla z tych komórek. U kręgowców główny układ krążenia składa się z serca, które pompuje krew przez szereg naczyń krwionośnych. Ściany dużych naczyń krwionośnych, takich jak tętnice i żyły, składają się z trzech warstw: i) błony wewnętrznej lub wewnętrznej warstwy komórek śródbłonka; ii) podłoże lub środkowa warstwa naprzemiennie wydłużonych obwodowo komórek mięśni gładkich, SMC i elastycznych blaszek; oraz iii) przydanka, czyli zewnętrzna warstw....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dotyczące myszy są zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Yale.

1. Mapowanie losu zarodka in vivo i analiza klonalna

Uwaga: Szeroko korzystaliśmy z tych podejść do oceny pochodzenia komórek i ich architektury klonalnej w modelach rozwoju i chorób7,8,9,10.

  1. Skonfiguruj kojarzenie między myszami za pomocą CreER a myszami za pomocą Cre reporter.
    UWAGA: CreER służy do znakowania SMC; Myh11-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W reprezentatywnej analizie klonalnej SMC w zarodkach zmutowanych dla Eln (gen kodujący białko macierzy zewnątrzkomórkowej elastyny), Eln(+/-), myszy Acta2-CreERT2 zostały skrzyżowane z myszami Eln(+/-) również noszącymi wielokolorowy ROSA26R(Rb/Rb) reporter. Jak opisano w kroku 1, sprawdzono czopki, ciężarne matki indukowano pojedynczym wstrzyknięciem tamoksyfenu (1,5 mg) w dawce E12,5 i uśmiercono je w dawce E18,5. Z.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przeciwieństwie do szeroko zakrojonych badań nad mysią aortą i jej głównymi gałęziami w stanach patologicznych u dorosłych, takich jak modele miażdżycy, mniej wiadomo na temat morfogenezy i patogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej. Tutaj skupiamy się na aorcie embrionalnej/okołoporodowej, w szczególności na SMC, i przedstawiamy protokoły badania aorty za pomocą metod in vivo, eksplantacji tkanek i izolacji SMC. Te uzupełniające się podejścia zapewniają badaczowi różnorodne podejścia do badania aorty embrio.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Deanowi Li za udostępnienie protokołu jego laboratorium dotyczącego izolacji SMC aorty. Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 i R01HL133016 dla D.M.G.), American Heart Association (Grant-in-Aid 14GRNT19990019 dla D.M.G.) i Yale University (Brown-Coxe Fellowship dla A.M. i fundusze startowe dla D.M.G.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TamoksyfenSigmaT5648
Olej kukurydzianySigmaC-8267Nośnik do tamoksyfenu
4-OH-tamoksyfenSigmaH7904Aktywny metabolit tamoksyfenu
ProgesteronSigmaP8783-5GStosować przy połowie stężenia tamoksyfenu
OCT związekSakura tissue tek4583Do wytwarzania kriobloków
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542IHC barwienie jądra, końcowe stężenie 5 mg / ml
Cy3 bezpośrednio sprzężone przeciwciało anty-SMASigmaA2547IHC barwienie SMA, końcowe rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-CD31BD Pharmingen550274IHC barwienie GFP, stężenie końcowe 0,006 mg / ml
Przeciwciało anty-GFPThermo Fisher ScientificA-11121Barwienie IHC CD31, stężenie końcowe 0,0016 mg / ml
Przeciwciało drugorzędowe kozie anty-królik, Alexa 647Life Technologiesa21244Barwienie IHC, stężenie końcowe 0,004 mg / ml
Przeciwciało drugorzędowe kozie anty-królik, Alexa 488Life Technologiesa11008Barwienie IHC, stężenie końcowe 0,004 mg / ml
DMEMThermo Fisher Scientific10567-014Do hodowli komórkowych
FBSThermo Fisher Scientific 10437028
Przeciwciało blokujące antyintegrynę beta3BD Biosciences553343Klon 2C9. G2, stężenie końcowe 0,02 mg/ml
KolagenazaWorthington Biochemical Corp44H14977ADo trawienia aorty
ElastazaWorthington Biochemical Corp34K15139Do trawienia aorty
Antybiotykowo-przeciwgrzybicze (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Rekombinowany ludzki FGFPromegaG5071
Rekombinowany ludzki EGFPromegaG5021
Penicylina/streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
Amfoterycyna BThermo Fisher Scientific15290026
Płytki do hodowli tkankowychCorningCLS430165
Alzet Minipompa osmotycznaDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i Pionowy Mikroskop fluorescencyjnyNikon 
  TCS  SP5Myszy Leica
Branson Sonifier 450VWR
Myh11-CreERT2Laboratorium Jacksona 19079
Acta2-CreERT2Uzyskane z laboratorium dr Pierre'a Chambona i Daniela Metzgera
ROSA26R-CreERT2 myszyThe Jackson Laboratory 8463
Myszy ROSA26R(mTmG/mTmG)Laboratorium Jacksona  
myszy ROSA26R (EYFP/EYFP)Laboratorium Jacksona   006148 
ROSA26R(Konfetti/Konfetti) myszyLaboratorium Jacksona 13731
Myszy ROSA26R(Rb/Rb)Laboratorium dr Irva WeissmanaUzyskane z laboratorium dr Irv Weissman
Myszy 026862

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smoo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Embryonic AortaPerinatal AortaSmooth Muscle CellsIn Vivo Fate MappingExplant Aorta CultureSmooth Muscle Cell IsolationOsmotic Mini PumpClonal AnalysisTissue SectioningFluorescent Microscopy

Related Articles