Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

DOI:

10.3791/56039

⸱

12 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aorta jest największą tętnicą w ciele. Ściana aorty składa się z wewnętrznej warstwy komórek śródbłonka, środkowej warstwy naprzemiennie elastycznych blaszek i komórek mięśni gładkich (SMC) oraz zewnętrznej warstwy fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej. W przeciwieństwie do szeroko zakrojonych badań nad modelami patologicznymi (np. miażdżycą) w aorcie dorosłej, znacznie mniej wiadomo o aorcie embrionalnej i okołoporodowej. W tym miejscu skupiamy się na SMC i przedstawiamy protokoły analizy morfogenezy i patogenezy zarodkowych i okołoporodowych SMC aorty w prawidłowym rozwoju i chorobie. W szczególności cztery zawarte protokoły to: i) mapowanie losu zarodków in vivo i analiza klonalna; ii) eksplantacja zarodkowej aorty; iii) izolacja SMC z aorty okołoporodowej; oraz iv) podskórne umieszczenie minipompy osmotycznej u ciężarnych (lub nieciężarnych) myszy. W związku z tym podejścia te ułatwiają badanie pochodzenia (początków), losu i architektury klonalnej SMC w aorcie in vivo. Pozwalają one na modulację morfogenezy aorty embrionalnej w macicy poprzez ciągłą ekspozycję na środki farmakologiczne. Ponadto izolowane eksplantaty tkanki aorty lub SMC aorty mogą być wykorzystywane do uzyskania wglądu w rolę określonych celów genowych podczas podstawowych procesów, takich jak muskularyzacja, proliferacja i migracja. Te generujące hipotezy eksperymenty na izolowanych SMC i eksplantowanej aorcie mogą być następnie oceniane w kontekście in vivo za pomocą podejść farmakologicznych i genetycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy krążenia organizmów wielokomórkowych funkcjonują w celu dostarczania składników odżywczych i tlenu do komórek, które nie mają kontaktu ze środowiskiem zewnętrznym oraz usuwania produktów przemiany materii i dwutlenku węgla z tych komórek. U kręgowców główny układ krążenia składa się z serca, które pompuje krew przez szereg naczyń krwionośnych. Ściany dużych naczyń krwionośnych, takich jak tętnice i żyły, składają się z trzech warstw: i) błony wewnętrznej lub wewnętrznej warstwy komórek śródbłonka; ii) podłoże lub środkowa warstwa naprzemiennie wydłużonych obwodowo komórek mięśni gładkich, SMC i elastycznych blaszek; oraz iii) przydanka, czyli zewnętrzna warstwa tkanki łącznej i fibroblastów. Zdecydowana większość badań z zakresu biologii naczyniowej koncentruje się na komórkach śródbłonka, badając tworzenie nowych jajowodów wyściełanych komórkami śródbłonka poprzez angiogenezę. Dla porównania, SMC cieszą się stosunkowo niewielkim zainteresowaniem. Jednak SMC są krytycznym typem komórek w budowie prawidłowej ściany tętnicy i patologiach naczyniowych.

Aorta jest tętnicą największego kalibru w ciele, odbierającą rzut serca z lewej komory serca. Dotykają go różne choroby ludzkie, w tym miażdżyca, tętniak i rozwarstwienie. W organizmach dorosłych aorta i jej główne gałęzie są intensywnie badane w modelach chorób naczyniowych. Na przykład myszy karmione dietą wysokotłuszczową, które nie mają genu kodującego receptor lipoprotein o niskiej gęstości lub apolipoproteinę E, rozwijają miażdżycę, a ostatnie badania mapowania losu wskazują, że istniejące wcześniej SMC powodują powstawanie wielu typów komórek w blaszce miażdżycowej1. W tętniakach aorty zmiany patologiczne obejmują apoptozę SMC i przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej2,3.

Znacznie mniej wiadomo na temat morfogenezy i patogenezy SMC w okresie embrionalnym i okołoporodowym. W tym miejscu udostępniamy protokoły do badania embrionalnych i okołoporodowych SMC aorty in vivo, w eksplantatach tkanek i w izolowanych komórkach. Na przykład pierwsza sekcja protokołu określa mapowanie losu i analizę klonalną u myszy embrionalnych. Rekombinaza Cre ulegająca ekspresji pod kontrolą promotora specyficznego dla komórki ułatwia znakowanie określonych komórek i ich potomstwa4,5,6; Jednak czasowa kontrola etykietowania specyficznego dla komórki może być wyzwaniem podczas rozwoju embrionalnego u myszy. W tym kontekście, w przypadku zarodków wykazujących ekspresję warunkowego CreER pod promotorem aktywnym w SMC (np. Myh11 lub Acta2) i reporterem Cre, podajemy metody wstrzykiwania tamoksyfenu lub jego aktywnego metabolitu 4-OH-tamoksyfenu u ciężarnych matek oraz do analizy znakowanych komórek w zarodkach lub potomstwie po urodzeniu. Ponadto, w przeciwieństwie do badań mapowania losu, które głównie wykorzystują reportery Cre z pojedynczym reporterem fluorofor1,7, analiza klonalna jest znacznie ulepszona dzięki wielokolorowym reporterom Cre.

Druga i trzecia sekcja protokołu opisują metody izolowania i hodowli embrionalnych eksplantatów aorty i aortalnych SMC od noworodków. Podejścia te pozwalają na manipulowanie szlakami sygnałowymi, szczególnie w eksplantatach aorty lub SMC, oraz na analizę bezpośredniego działania środków farmakologicznych. W ten sposób rola określonych genów w tkance będącej przedmiotem zainteresowania może być badana w znacznie szybszy sposób niż za pomocą tradycyjnych manipulacji genetycznych u myszy. Ponadto izolowane badania SMC ułatwiają analizę migracji i adhezji komórek, które są technicznie ograniczone in vivo.

Na koniec, czwarta sekcja protokołu opisuje umieszczenie podskórnej mini-pompy osmotycznej załadowanej środkami farmakologicznymi u ciężarnych (lub niebędących w ciąży) myszy. Metoda ta ułatwia analizę wpływu na rozwój embrionalny wywołanego przez środki, które wymagają ciągłej infuzji ze względu na szybki metabolizm. Alternatywa w postaci częstych zastrzyków nie jest praktyczna dla wielu środków i należy jej unikać, ponieważ może powodować znaczny dyskomfort u ciężarnej matki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dotyczące myszy są zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Yale.

1. Mapowanie losu zarodka in vivo i analiza klonalna

Uwaga: Szeroko korzystaliśmy z tych podejść do oceny pochodzenia komórek i ich architektury klonalnej w modelach rozwoju i chorób7,8,9,10.

  1. Skonfiguruj kojarzenie między myszami za pomocą CreER a myszami za pomocą Cre reporter.
    UWAGA: CreER służy do znakowania SMC; Myh11-CreERT2 lub Acta2-CreERT2 mice11,12 jest powszechnie używany do tego celu. Użyliśmy myszy ROSA26R-CreERT213 do szerokiego znakowania tkanek embrionalnych.
    1. Do analizy klonalnej użyj wielokolorowego reportera Cre (np. myszy Confetti lub Rainbow [Rb])8,14,15, a do mapowania losu użyj jednokolorowego reportera Cre (np. myszy ROSA26R-YFP16) lub dwukolorowego reportera Cre ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG)17.
      UWAGA: Ten schemat hodowlany wykorzystuje dorosłe myszy w wieku od 2 do 6 miesięcy (zwykle ~30 g) i generują zarodki z CreER i Cre reporter.
  2. Rano sprawdź, czy nie ma czopów dopochwowych za pomocą metalowej sondy i potraktuj południe w dniu wykrycia czopa jako dzień embrionalny (E) 0,5.
  3. Oddziel gniazdo od męskiego po wykryciu wtyczki.
  4. Przygotować 4-OH-tamoksyfen i roztwory robocze tamoksyfenu.
    1. W przypadku 4-OH-tamoksyfenu rozpuścić 5 mg w 50 μl 100% etanolu, wirować przez 2 minuty, a następnie dodać 450 μl oleju kukurydzianego. Na lodzie poddać sonikacji na poziomie wyjściowym 2 przez 10 cykli z przerwą między cyklami, aż próbka ostygnie. Po całkowitym rozpuszczeniu próbki (zwykle ~ 4 - 5 cykli sonikacji), weź 200 μl sonikowanego roztworu i rozpuść w 1,800 μl oleju kukurydzianego, aby uzyskać końcowy roztwór roboczy (4-OH-tamoksyfen, 1 mg / ml).
    2. W przypadku tamoksyfenu rozcieńczyć do 50 mg/ml w 100% etanolu i wirować aż do rozpuszczenia. Rozcieńczyć w oleju kukurydzianym, aby uzyskać końcowy roztwór roboczy (tamoksyfen, 10 mg/ml) i mieszać w temperaturze 45 °C, aby upewnić się, że jest całkowicie rozpuszczony.
  5. W celu wczesnej indukcji zarodka należy wstrzyknąć 4-OH-tamoksyfen dootrzewnowo ciężarnej matce.
    1. Stosować zastrzyki 4-OH-tamoksyfenu (do ~150 μg na ciężarną mysz lub około 5 mg / kg masy ciała) w dawce E5,5, a następnie w miarę uzyskiwania zdolnych do życia matek, zarodków i młodych.
    2. Tamoksyfen należy stosować w dawkach 0,5 - 1,5 mg (lub 17 - 50 mg/kg) u matek ciążących z zarodkami w wieku ~E9 i później. Do wszystkich wstrzyknięć należy używać igły 30G.
      Uwaga: Filtracja przez filtr 0,22 μm jest zwykle stosowana do sterylizacji wszystkich mieszanin przed wstrzyknięciem.  
  6. Do analizy klonalnej należy stosować wstrzyknięcia dootrzewnowe dużych dawek 4-OH-tamoksyfenu (np. 5 mg/kg) lub tamoksyfenu (np. 50 mg/kg) w celu oznaczenia wielu komórek.
    1. Aby oznaczyć poszczególne komórki, należy zmniejszyć dawkę 4-OH-tamoksyfenu lub tamoksyfenu w taki sposób, aby w tkance będącej przedmiotem zainteresowania (tj. aorcie) prawie wszystkie analizowane zarodki (jak opisano poniżej na końcu tego rozdziału) albo nie miały żadnych komórek znakowanych, albo tylko komórki jednego koloru; jest to dawka progowa.
  7. Aby oznaczyć komórki w średnio-późnym okresie ciąży i prześledzić ich los lub klonalność u myszy po urodzeniu, należy wstrzyknąć progesteron do jamy dootrzewnowej ciężarnej matki jednocześnie z tamoksyfenem w stosunku dawki 1:2 (progesteron:tamoksyfen).
    UWAGA: Dawki tamoksyfenu wynoszą 17 - 50 mg/kg, a dawki progesteronu 8,5 - 25 mg/kg (tj. połowa dawek tamoksyfenu). Wstrzyknięcie progesteronu może opóźnić poród o ~1 - 2 dni.
  8. Poddać eutanazji matkę ciążącą z zarodkami w pożądanym wieku przy użyciu metody otwartej kropli, w której matkę umieszcza się w pojemniku zawierającym bawełnę lub gazę nasączoną nierozcieńczonym izofluranem. Potwierdzić zgon poprzez otwarcie jamy klatki piersiowej w celu wywołania odmy opłucnowej, usunięcie ważnych narządów i/lub wykonanie zwichnięcia szyjki macicy.
  9. Oczyść brzuch 70% etanolem. Użyj nożyczek, aby rozciąć brzuch i wyciąć macicę. Usuń zarodki z macicy i ostrożnie oddziel zarodki od łożyska i woreczka żółtkowego za pomocą kleszczy.
  10. Eutanazji należy poddać zarodki w wieku E15 lat lub starszym, wykonując zwichnięcie szyjki macicy lub ścięcie głowy nożyczkami chirurgicznymi lub ostrym ostrzem.
    UWAGA: Zarodki młodsze niż E15 szybko umierają po eutanazji matki i/lub usunięciu zarodków od matki.
  11. Umieść zarodki w lodowatym PBS i odetnij mały kawałek ogona za pomocą nożyczek, aby genotyp dla CreER i Cre reporter.
  12. Utrwalić zarodki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Umyj zarodki trzy razy w PBS, a następnie inkubuj zarodki w 30% sacharozie w PBS w probówkach o pojemności 15 ml, czekając, aż opadną, co może potrwać do dwóch dni.
  13. Napełnij plastikowe formy zamrażające do 2/3 maksymalnego poziomu związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Umieść każdy zarodek pionowo w formie, całkowicie zanurzony w OCT. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby zminimalizować pęcherzyki.
  14. Umieść bloki tkanek zamrażających pionowo w kąpieli z suchym lodem, 70% etanolem, aby zamrozić. Przechowywać bloki w temperaturze -80 °C.
  15. Ustaw temperaturę kriostatu na -22 °C i wytnij bloki, aby wygenerować przekroje poprzeczne przez całą aortę o grubości 10 - 20 μm. Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed przechowywaniem ich w temperaturze -80 °C.
  16. Rozmrozić szkiełka w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem, aby uniknąć bielenia fluoroforów. Umyj szkiełka za pomocą PBS-Tween20 0,1%.
    1. W celu analizy klonalnej wybarwić szkiełka pod kątem jąder (DAPI, 5 mg/ml) i bezpośrednio zobrazować inne fluorofory w reporterze Rainbow Cre (Cerulean: maksimum wzbudzenia 433 nm, maksimum emisji 475 nm; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
      1. Do wykrywania fluoroforów za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego należy stosować następujące filtry: DAPI (maks. wzbudzenie/szerokość pasma 350/50 nm, maksimum emisji/pasmo 460/50 nm), Cerulean (wzbudzenie 436/20 nm, emisja 480/40 nm), czerwień teksańska (wzbudzenie 560/40 nm, emisja 630/75 nm) oraz filtr niestandardowy do oddzielenia mCherry od mOrange (wzbudzenie 577/10 nm, emisja 630/50 nm).
    2. W celu mapowania losu za pomocą reportera mTmG Cre należy wykryć GFP (484 nm, 510 nm), albo bezpośrednio obrazując, albo za pomocą barwienia immunologicznego. Do obrazowania za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego należy użyć filtra GFP (wzbudzenie 470/40 nm, emisja 525/50 nm).
    3. Do barwienia immunologicznego należy inkubować skrawki z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C, przemywać 0,1% Triton X-100 w PBS, a następnie inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę. Stosować przeciwciała pierwszorzędowe anty-CD31 (stężenie końcowe 0,0016 mg/ml), anty-GFP (0,006 mg/ml) i Cy3-bezpośrednio sprzężone anty-SMA (końcowe rozcieńczenie 1:500) i stosować przeciwciała drugorzędowe bezpośrednio sprzężone z fluoroforami (końcowe rozcieńczenie 1:500) (patrz Tabela materiałów).
  17. Slajdy obrazu za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie: 4X - 20X) lub mikroskopu konfokalnego (10X -63X). Aby uzyskać duże powiększenie, użyj konfokalnego obiektywu olejowego o powiększeniu 63x, aperturze numerycznej 1,4-0,6 i rozmiarze klatki 1,024 x 1,024 pikseli.

2. Eksplantat Hodowla Aorty Emplantacyjnej

Uwaga: To podejście było wcześniej używane do oceny roli integryny beta3 w zwężeniu eksplantowanej aorty embrionalnej Eln(-/-) class9,18.

  1. Poddać eutanazji matkę w ciąży w czasie w E15.5 poprzez nadmierną inhalację izofluranu, jak w kroku 1.8 powyżej.
  2. Zbierz i poddaj eutanazji zarodki, zgodnie z krokami 1.9 - 1.10 powyżej.
  3. Ustaw zarodek na wznak i przypnij wyprostowane kończyny do deski preparcyjnej. Wizualizuj za pomocą stereoskopu preparacyjnego i użyj nożyczek, aby wyciąć pionowe nacięcie od brzucha przez mostek do górnej części klatki piersiowej. Wypreparuj grasicę, tchawicę, płuca, przełyk, wątrobę i jelito.
  4. Delikatnie pociągnij serce brzusznie za pomocą kleszczy i użyj nożyczek, aby wypreparować aortę z dala od grzbietowej strony klatki piersiowej i jamy brzusznej. Aby uwolnić aortę, przetnij ją w bliższej części korzenia i dystalnej pozycji brzucha.
  5. Umieść aortę w lodowatym sterylnym PBS w kapturze do hodowli komórkowych. Przenieść aortę na płytkę 24-dołkową i hodować ją w DMEM z 0,5% FBS przez okres do 24 godzin w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Pożywkę hodowlaną można uzupełnić przeciwciałem blokującym (np. przeciwciałem antyintegrynowym αvβ3 w dawce 0,02 mg/ml9; patrz tabela materiałów) lub środkiem farmakologicznym.
  6. Umyj aortę dwukrotnie PBS, a następnie utrwal ją 4% paraformaldehydem przez 20 minut.
  7. Przemyć trzykrotnie PBS i przenieść aortę do 1,5 ml probówki z 30% sacharozą w PBS. Po opadnięciu aorty wykonaj zamrożone bloki tkankowe, wycięte skrawki i barwienie immunologiczne, jak opisano w krokach 1.13 - 1.15 powyżej.

3. Izolacja SMC od aorty okołoporodowej

Uwaga: To podejście jest obecnie używane do porównywania biologii aortalnych SMC wyizolowanych od Eln(-/-) i myszy okołoporodowych typu dzikiego.

  1. Poddaj eutanazji młode myszy w dniu poporodowym (P) 0,5, albo przez zwichnięcie szyjki macicy, albo przez ścięcie głowy nożyczkami chirurgicznymi lub ostrym ostrzem, jak opisano w kroku 1.10 powyżej.
  2. Wykonaj krok 2.3, a następnie, po otwarciu klatki piersiowej i brzucha, nakłuj lewą komorę igłą 23G. Za pomocą plastikowej rurki połączyć igłę ze sterylną strzykawką zawierającą PBS, trzymaną pionowo w pozycji uniesionej, tak aby PBS przepływał grawitacyjnie do lewej komory. Pozostawić wlew sterylnego PBS do lewej komory, aż wątroba zblednie.
    1. Użyj kleszczy, aby usunąć tkankę przybyszową na zewnątrz aorty i wypreparować aortę zgodnie z opisem w kroku 2.4.
  3. Trawić aortę w pojedynczym roztworze DMEM (500 μL) uzupełnionym 225 U/ml kolagenazy, 2,25 U/ml elastazy i 1x antybiotyko-antybiotyko-grzybikiem przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Ręcznie wstrząsać probówką co 5 - 10 minut.
  4. W sterylnym kapturze do hodowli komórek miareczkować strawioną tkankę, pipetując w górę i w dół pipetą o pojemności 200 μl, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zawiesinę jednokomórkową do probówki o pojemności 15 ml, dodać 2 ml DMEM i odwirować przy 920 x g przez 5 minut w temperaturze 25°C.
  5. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml pożywki hodowlanej SMC (DMEM zawierający 10% FBS uzupełniony 1 μg/ml rhFGF, 10 μg/ml rhEGF, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny B). Przenieść na 35-milimetrową płytkę hodowlaną.
    UWAGA: Po wstępnej izolacji uzyskuje się ~ 400 000 komórek z pojedynczej aorty typu dzikiego P0,5; ~ 300 000 z tych komórek to SMC.
  6. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i co 3 dni zmieniać na świeżą pożywkę hodowlaną SMC. Stosując standardowe techniki z trypsyną, przechodź przez komórki, gdy się zlewają. Do eksperymentów użyj komórek z fragmentów 3 - 7.

4. Umieszczenie podskórnej minipompy osmotycznej u ciężarnych (lub niebędących w ciąży) myszy

Uwaga: To podejście było wcześniej używane do ciągłego dostarczania środka farmakologicznego (np. integryny β3 i inhibitora β5 cylengitydu) do zarodków w macicy9. Pompę wprowadzono do ciężarnej matki w temperaturze E13,5 i utrzymywano do porodu.

  1. Znieczulić myszy 2-5% izofluranem w tlenie (natężenie przepływu 1 l/min) w celu indukcji i 1-3% w celu konserwacji. Użyj odruchu szczypania palców u stóp, aby monitorować poziom znieczulenia i w razie potrzeby dostosuj środek znieczulający. Podawać podskórnie buprenorfinę (0,05 - 0,1 mg/kg) w celu znieczulenia.
  2. Ogol dolną część pleców maszynką do strzyżenia. Używaj sterylnych zasłon, rękawiczek i narzędzi oraz utrzymuj myszy na podgrzewanej płytce chirurgicznej podczas operacji.
  3. Umieść każdą mysz w pozycji leżącej i wyszoruj grzbiet betadyną, a następnie alkoholem izopropylowym. Około 3 - 5 cm rostralnie do podstawy ogona w dolnej części pleców, użyj skalpela, aby wykonać poziome nacięcie skóry o długości 0,5 - 1,0 cm bez uszkadzania leżącego poniżej mięśnia.
  4. Wprowadzić hemostat do nacięcia i utworzyć podskórną kieszeń do implantacji pompy, otwierając i zamykając szczęki hemostatu.
  5. Napełnij minipompę osmotyczną wybranym środkiem, zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów). Włóż napełnioną pompkę do kieszeni i zamknij nacięcie klipsami lub niewchłanialnymi szwami 6-0. Upewnij się, że całkowity czas operacji jest krótszy niż 10 minut.
  6. Po operacji monitoruj myszy co 15 minut, aż wyzdrowieją z leżenia mostka. Buprenorfinę podawać podskórnie (0,05 - 0,1 mg/kg) co 6 - 12 godzin przez 48 godzin. Kiedy myszy w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia ogólnego, monitoruj je codziennie. Usuń klipsy lub szwy 7 - 10 dni po zabiegu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W reprezentatywnej analizie klonalnej SMC w zarodkach zmutowanych dla Eln (gen kodujący białko macierzy zewnątrzkomórkowej elastyny), Eln(+/-), myszy Acta2-CreERT2 zostały skrzyżowane z myszami Eln(+/-) również noszącymi wielokolorowy ROSA26R(Rb/Rb) reporter. Jak opisano w kroku 1, sprawdzono czopki, ciężarne matki indukowano pojedynczym wstrzyknięciem tamoksyfenu (1,5 mg) w dawce E12,5 i uśmiercono je w dawce E18,5. Z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przeciwieństwie do szeroko zakrojonych badań nad mysią aortą i jej głównymi gałęziami w stanach patologicznych u dorosłych, takich jak modele miażdżycy, mniej wiadomo na temat morfogenezy i patogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej. Tutaj skupiamy się na aorcie embrionalnej/okołoporodowej, w szczególności na SMC, i przedstawiamy protokoły badania aorty za pomocą metod in vivo, eksplantacji tkanek i izolacji SMC. Te uzupełniające się podejścia zapewniają badaczowi różnorodne podejścia do badania aorty embrio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Deanowi Li za udostępnienie protokołu jego laboratorium dotyczącego izolacji SMC aorty. Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 i R01HL133016 dla D.M.G.), American Heart Association (Grant-in-Aid 14GRNT19990019 dla D.M.G.) i Yale University (Brown-Coxe Fellowship dla A.M. i fundusze startowe dla D.M.G.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TamoksyfenSigmaT5648
Olej kukurydzianySigmaC-8267Nośnik do tamoksyfenu
4-OH-tamoksyfenSigmaH7904Aktywny metabolit tamoksyfenu
ProgesteronSigmaP8783-5GStosować przy połowie stężenia tamoksyfenu
OCT związekSakura tissue tek4583Do wytwarzania kriobloków
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542IHC barwienie jądra, końcowe stężenie 5 mg / ml
Cy3 bezpośrednio sprzężone przeciwciało anty-SMASigmaA2547IHC barwienie SMA, końcowe rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-CD31BD Pharmingen550274IHC barwienie GFP, stężenie końcowe 0,006 mg / ml
Przeciwciało anty-GFPThermo Fisher ScientificA-11121Barwienie IHC CD31, stężenie końcowe 0,0016 mg / ml
Przeciwciało drugorzędowe kozie anty-królik, Alexa 647Life Technologiesa21244Barwienie IHC, stężenie końcowe 0,004 mg / ml
Przeciwciało drugorzędowe kozie anty-królik, Alexa 488Life Technologiesa11008Barwienie IHC, stężenie końcowe 0,004 mg / ml
DMEMThermo Fisher Scientific10567-014Do hodowli komórkowych
FBSThermo Fisher Scientific 10437028
Przeciwciało blokujące antyintegrynę beta3BD Biosciences553343Klon 2C9. G2, stężenie końcowe 0,02 mg/ml
KolagenazaWorthington Biochemical Corp44H14977ADo trawienia aorty
ElastazaWorthington Biochemical Corp34K15139Do trawienia aorty
Antybiotykowo-przeciwgrzybicze (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Rekombinowany ludzki FGFPromegaG5071
Rekombinowany ludzki EGFPromegaG5021
Penicylina/streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
Amfoterycyna BThermo Fisher Scientific15290026
Płytki do hodowli tkankowychCorningCLS430165
Alzet Minipompa osmotycznaDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i Pionowy Mikroskop fluorescencyjnyNikon 
  TCS  SP5Myszy Leica
Branson Sonifier 450VWR
Myh11-CreERT2Laboratorium Jacksona 19079
Acta2-CreERT2Uzyskane z laboratorium dr Pierre'a Chambona i Daniela Metzgera
ROSA26R-CreERT2 myszyThe Jackson Laboratory 8463
Myszy ROSA26R(mTmG/mTmG)Laboratorium Jacksona  
myszy ROSA26R (EYFP/EYFP)Laboratorium Jacksona   006148 
ROSA26R(Konfetti/Konfetti) myszyLaboratorium Jacksona 13731
Myszy ROSA26R(Rb/Rb)Laboratorium dr Irva WeissmanaUzyskane z laboratorium dr Irv Weissman
Myszy 026862

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810(2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4(2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zarodkowa aortakom rki mi ni g adkichmapowanie los w in vivohodowla eksplant w aortyizolacja kom rek mi ni g adkichosmotyczna minipompaanaliza klonalnasekcjonowanie tkanekmikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły