Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aorta jest największą tętnicą w ciele. Ściana aorty składa się z wewnętrznej warstwy komórek śródbłonka, środkowej warstwy naprzemiennie elastycznych blaszek i komórek mięśni gładkich (SMC) oraz zewnętrznej warstwy fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej. W przeciwieństwie do szeroko zakrojonych badań nad modelami patologicznymi (np. miażdżycą) w aorcie dorosłej, znacznie mniej wiadomo o aorcie embrionalnej i okołoporodowej. W tym miejscu skupiamy się na SMC i przedstawiamy protokoły analizy morfogenezy i patogenezy zarodkowych i okołoporodowych SMC aorty w prawidłowym rozwoju i chorobie. W szczególności cztery zawarte protokoły to: i) mapowanie losu zarodków in vivo i analiza klonalna; ii) eksplantacja zarodkowej aorty; iii) izolacja SMC z aorty okołoporodowej; oraz iv) podskórne umieszczenie minipompy osmotycznej u ciężarnych (lub nieciężarnych) myszy. W związku z tym podejścia te ułatwiają badanie pochodzenia (początków), losu i architektury klonalnej SMC w aorcie in vivo. Pozwalają one na modulację morfogenezy aorty embrionalnej w macicy poprzez ciągłą ekspozycję na środki farmakologiczne. Ponadto izolowane eksplantaty tkanki aorty lub SMC aorty mogą być wykorzystywane do uzyskania wglądu w rolę określonych celów genowych podczas podstawowych procesów, takich jak muskularyzacja, proliferacja i migracja. Te generujące hipotezy eksperymenty na izolowanych SMC i eksplantowanej aorcie mogą być następnie oceniane w kontekście in vivo za pomocą podejść farmakologicznych i genetycznych.
Wprowadzenie
Systemy krążenia organizmów wielokomórkowych funkcjonują w celu dostarczania składników odżywczych i tlenu do komórek, które nie mają kontaktu ze środowiskiem zewnętrznym oraz usuwania produktów przemiany materii i dwutlenku węgla z tych komórek. U kręgowców główny układ krążenia składa się z serca, które pompuje krew przez szereg naczyń krwionośnych. Ściany dużych naczyń krwionośnych, takich jak tętnice i żyły, składają się z trzech warstw: i) błony wewnętrznej lub wewnętrznej warstwy komórek śródbłonka; ii) podłoże lub środkowa warstwa naprzemiennie wydłużonych obwodowo komórek mięśni gładkich, SMC i elastycznych blaszek; oraz iii) przydanka, czyli zewnętrzna warstw....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły dotyczące myszy są zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Yale.
1. Mapowanie losu zarodka in vivo i analiza klonalna
Uwaga: Szeroko korzystaliśmy z tych podejść do oceny pochodzenia komórek i ich architektury klonalnej w modelach rozwoju i chorób7,8,9,10.
- Skonfiguruj kojarzenie między myszami za pomocą CreER a myszami za pomocą Cre reporter.
UWAGA: CreER służy do znakowania SMC; Myh11-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W reprezentatywnej analizie klonalnej komórek mięśni gładkich (SMC) w embrionach z mutacją w zakresie Eln (gen kodujący białko macierzy zewnątrzkomórkowej elastynę), Eln(+/-), Acta2-CreERT2 myszy krzyżowano z Eln(+/-) myszy niosące również wielokolorowy transgen ROSA26R(Rb/Rb) reporter. Zgodnie z opisem w kroku 1, sprawdzono obecność czopów, u ciężarnych matek wywołano ekspresję za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia tam.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przeciwieństwie do szeroko zakrojonych badań nad mysią aortą i jej głównymi gałęziami w stanach patologicznych u dorosłych, takich jak modele miażdżycy, mniej wiadomo na temat morfogenezy i patogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej. Tutaj skupiamy się na aorcie embrionalnej/okołoporodowej, w szczególności na SMC, i przedstawiamy protokoły badania aorty za pomocą metod in vivo, eksplantacji tkanek i izolacji SMC. Te uzupełniające się podejścia zapewniają badaczowi różnorodne podejścia do badania aorty embrio.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Deanowi Li za udostępnienie protokołu jego laboratorium dotyczącego izolacji SMC aorty. Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 i R01HL133016 dla D.M.G.), American Heart Association (Grant-in-Aid 14GRNT19990019 dla D.M.G.) i Yale University (Brown-Coxe Fellowship dla A.M. i fundusze startowe dla D.M.G.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tamoksyfen | Sigma | T5648 | |
| Olej kukurydziany | Sigma | C-8267 | Nośnik do tamoksyfenu |
| 4-OH-tamoksyfen | Sigma | H7904 | Aktywny metabolit tamoksyfenu |
| Progesteron | Sigma | P8783-5G | Stosować przy połowie stężenia tamoksyfenu |
| OCT związek | Sakura tissue tek | 4583 | Do wytwarzania kriobloków |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC barwienie jądra, końcowe stężenie 5 mg / ml |
| Cy3 bezpośrednio sprzężone przeciwciało anty-SMA | Sigma | A2547 | IHC barwienie SMA, końcowe rozcieńczenie 1:500 |
| Przeciwciało anty-CD31 | BD Pharmingen | 550274 | IHC barwienie GFP, stężenie końcowe 0,006 mg / ml |
| Przeciwciało anty-GFP | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | Barwienie IHC CD31, stężenie końcowe 0,0016 mg / ml |
| Przeciwciało drugorzędowe kozie anty-królik, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | Barwienie IHC, stężenie końcowe 0,004 mg / ml |
| Przeciwciało drugorzędowe kozie anty-królik, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | Barwienie IHC, stężenie końcowe 0,004 mg / ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | Do hodowli komórkowych |
| FBS | Thermo Fisher Scientific 10437028 | ||
| Przeciwciało blokujące antyintegrynę beta3 | BD Biosciences | 553343 | Klon 2C9. G2, stężenie końcowe 0,02 mg/ml |
| Kolagenaza | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | Do trawienia aorty |
| Elastaza | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | Do trawienia aorty |
| Antybiotykowo-przeciwgrzybicze (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Rekombinowany ludzki FGF | Promega | G5071 | |
| Rekombinowany ludzki EGF | Promega | G5021 | |
| Penicylina/streptomycyna (10 000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amfoterycyna B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Płytki do hodowli tkankowych | Corning | CLS430165 | |
| Alzet Minipompa osmotyczna | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Pionowy Mikroskop fluorescencyjny | Nikon | ||
| TCS SP5 | Myszy Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 | Laboratorium Jacksona | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 | Uzyskane z laboratorium dr Pierre'a Chambona i Daniela Metzgera | ||
| ROSA26R-CreERT2 myszy | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| Myszy ROSA26R(mTmG/mTmG) | Laboratorium Jacksona | ||
| myszy ROSA26R (EYFP/EYFP) | Laboratorium Jacksona | 006148 | |
| ROSA26R(Konfetti/Konfetti) myszy | Laboratorium Jacksona | 13731 | |
| Myszy ROSA26R(Rb/Rb) | Laboratorium dr Irva Weissmana | Uzyskane z laboratorium dr Irv Weissman |
Bibliografia
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smoo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
