Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda oceny wpływu bakteriocyny na mikrobiotę jelitową myszy

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56053

⸱

25 lipca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 2Department of Food Safety and Infection Biology, Norwegian University of Life Sciences (NMBU), 3Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid (UCM), 4Faculty of Chemistry, Biotechnology and Food Science, Norwegian University of Life Sciences (NMBU)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Uważa się, że bakteriocyny odgrywają kluczową rolę w definiowaniu różnorodności mikrobiologicznej w różnych niszach ekologicznych. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę oceny wpływu bakteriocyny na skład mikrobioty jelitowej na modelu zwierzęcym.

Streszczenie

Bardzo intrygujące pytania pojawiają się wraz z naszą pogłębiającą się wiedzą na temat składu mikroflory jelitowej i związku ze zdrowiem, szczególnie w odniesieniu do czynników, które przyczyniają się do utrzymania równowagi populacji. Dostępne metodologie oceny tych czynników są jednak ograniczone. Bakteriocyny to peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez wiele bakterii, które mogą zapewniać przewagę konkurencyjną w pozyskiwaniu żywności i/lub tworzeniu nisz. Wiele szczepów probiotycznych bakterii kwasu mlekowego (LAB) ma ogromny potencjał w promowaniu zdrowia ludzi i zwierząt poprzez zapobieganie rozwojowi patogenów. Mogą być również stosowane do immunomodulacji, ponieważ wytwarzają bakteriocyny. Jednak antagonistyczna aktywność bakteriocyn jest zwykle określana za pomocą laboratoryjnych testów biologicznych w dobrze zdefiniowanych, ale nadmiernie uproszczonych warunkach w porównaniu ze złożonym środowiskiem jelitowym u ludzi i zwierząt, w którym bakterie są narażone na wieloczynnikowe wpływy gospodarza i setki gatunków drobnoustrojów dzielących tę samą niszę. W pracy opisano kompletną i skuteczną procedurę oceny wpływu różnych bakteriocyn o różnej swoistości docelowej w systemie mysim. Zmiany w składzie mikrobioty podczas leczenia bakteriocyną są monitorowane za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA. Nasze podejście wykorzystuje zarówno producentów bakteriocyny, jak i ich izogeniczne mutanty niewytwarzające bakteriocyny, przy czym te ostatnie dają możliwość odróżnienia modyfikacji mikrobioty związanych z bakteriocyną od niezwiązanych z bakteriocyną. Metody ekstrakcji DNA kałowego i sekwencjonowania 16S rDNA są spójne i wraz z bioinformatyką stanowią potężną procedurę wykrywania niewielkich zmian w profilach bakteryjnych i ustalania korelacji pod względem stężenia cholesterolu i trójglicerydów między populacjami bakterii a markerami zdrowia. Nasz protokół jest ogólny i dlatego może być stosowany do badania innych związków lub składników odżywczych, które mogą zmieniać skład mikrobioty gospodarza, zarówno podczas badania toksyczności, jak i korzystnych skutków.

Wprowadzenie

Bakteriocyny to peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez szeroką gamę gatunków bakterii1,2. Związki te i ich producenci, zwłaszcza LAB, są badane i eksploatowane na całym świecie od dziesięcioleci pod kątem ich potencjalnych zastosowań w konserwacji żywności i medycynie3. Wiadomo, że kilka bakteriocyn zabija ważne patogeny, w tym gatunki Listeria, Enterococcus, Staphylococcus i Bacillus. Niektóre bakteriocyny mają nawet zdolność modulowania odpowiedzi immunologicznej4. Wiele bakteriocyn ma stosunkowo wąskie widma, co jest bardzo cenione w niektórych zastosowaniach. Na przykład niektóre bakteriocyny o wąskim spektrum działania mogą być stosowane do kierowania specyficznej aktywności przeciwko wybranym grupom problematycznych bakterii, bez większych zakłóceń dla komensalnej lub korzystnej flory dzielącej tę samą niszę; Jest to szczególnie istotne w środowisku jelitowym, gdzie wiele pożytecznych mikroorganizmów rozwija się w interaktywny i dynamiczny sposób5. Bakteriocyny są również bardzo atrakcyjne do stosowania profilaktycznego lub probiotycznego, ponieważ mogą hamować (out)growth patogenów, patobiontów lub bakterii oportunistycznych, które mogą zaburzyć równowagę homeostazy jelit6,7.

Pod względem ich natury i właściwości fizykochemicznych, bakteriocyny są bardzo różnorodne, ponieważ mają różne struktury, specyfikę docelową, sposoby działania itp. Większość bakteriocyn została szczegółowo przebadana w warunkach in vitro, ale bardzo niewiele zostało przetestowanych w matrycach żywności8,9 lub in vivo, takich jak w zwierzęcym jelitie6, 10. Właściwości in vitro mogą się znacznie różnić podczas oceny in vivo ze względu na złożoność środowiska jelitowego, a także przypuszczalny niezamierzony wpływ na pożyteczne bakterie. Większość probiotyków to LAB. Wytwarzają one szereg innych metabolitów, w tym krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, o których wiadomo, że wpływają na fizjologię gospodarza, a także wykazują właściwości przeciwdrobnoustrojowe w stosunku do niektórych bakterii. Dlatego w przypadku szczepów probiotycznych, które wytwarzają bakteriocyny, najlepiej jest ustalić realistyczne testy, takie jak zdrowe zwierzęta z prawidłową mikrobiotą.

W niniejszym badaniu przedstawiamy strategię, która pozwala ocenić wpływ różnych szczepów wytwarzających bakteriocynę, których bakteriocyny mają różne widma hamujące, na zdrowe myszy. Nasza strategia obejmuje karmienie myszy izogenicznymi mutantami niebakteriocyny, co umożliwia różnicowanie efektów za pośrednictwem bakteriocyny od efektów niezwiązanych z bakteriocyną. Sekwencjonowanie 16S rDNA pozwala na śledzenie dynamicznych zmian zachodzących w populacji bakterii w jelitach. Dalsza analiza statystyczna rozszyfrowuje korelacje między gatunkami bakterii, a także między gatunkami bakterii a mierzonymi parametrami fizjologicznymi (np. masą ciała, parametrami biochemicznymi surowicy itp.). Uważamy, że protokół przedstawiony w tym badaniu ma również zastosowanie do innych zastosowań probiotycznych lub prebiotycznych poza badaniem bakteriocyn u żywych zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka i obsługa muszą być prowadzone w specjalistycznym oddziale opieki nad zwierzętami. Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednią Komisję Etyczną Uniwersytetu w Walencji i władze lokalne, zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi obowiązującymi na mocy prawa Unii Europejskiej i 2010/63/UE oraz rządu hiszpańskiego RD 53/2013 w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych, w celu poszanowania zasady 3R w doświadczeniach na zwierzętach (Wymiana, Redukcja, udoskonalenie).

1. Zamrożone kultury bakterii używane do inokulacji myszy

  1. Zaszczepić poszczególne szczepy LAB w 5 ml pożywki mózgowo-sercowej (BHI) i hodować je przez 20 - 24 godziny (przez noc) w temperaturze 30 °C.
  2. Rozcieńczyć każdą nocną hodowlę bakteryjną 100-krotnie w BHI, przenosząc 2 ml nocnej hodowli do 200 ml BHI. Uprawiaj je w temperaturze 30 °C przez 20 - 24 h.
    UWAGA: Szczepy użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 1.
  3. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Usunąć supernatant i umyć komórki dwukrotnie, zawieszając każdą osadkę komórkową w 100 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zbierając komórki jak w kroku 1.3.
  5. Po drugim praniu zawiesić każdą komórkę w 20 ml lodowatego 15% glicerolu w PBS.
  6. Zawiesinę komórkową podzielić na objętości 1 ml w probówkach, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Ogniwa należy zużyć w ciągu 1-2 miesięcy od tego momentu.
  7. Określ liczbę komórek przed przechowywaniem i przed podaniem, aby znana była liczba żywych komórek podanych myszom.
    1. W celu zliczenia komórek należy wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia komórek w lodowatym 0,9% roztworze chlorku sodu (NaCl). Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia na płytce agarowej BHI. Inkubować przez noc (20 - 24 h) w temperaturze 30 °C w celu wzrostu komórek i tworzenia kolonii, w celu określenia jednostek tworzących kolonie (jtk)/ml.
  8. Aby uzyskać wodę pitną zawierającą bakterie, należy rozcieńczyć komórki każdej podstawowej kultury bakteryjnej w 100 ml sterylnej, przefiltrowanej wody pitnej, z końcową średnią jtk wynoszącą 109/ml wody. W celu oceny przeżywalności bakterii należy policzyć żywe komórki bezpośrednio po rozcieńczeniu i po 24 godzinach raz w tygodniu przez pierwsze dwa tygodnie leczenia bakteriami.

2. Test na myszach i projekt eksperymentalny

Uwaga: Do tego eksperymentu potrzebne są specyficzne wolne od patogenów (SPF) młode samice myszy BALB/c (6 - 8 tygodni); tutaj zakupiono łącznie 100 zwierząt.

  1. Zapewnij myszom swobodny dostęp do granulowanego pokarmu i wody przez cały czas trwania eksperymentu.
  2. Zaprojektuj eksperyment i oblicz moc.
    1. Jeśli każdy zabieg ma swoją własną kontrolę, należy zastosować sparowany schemat kliniczno-kontrolny (test t). Użyć wstępnego testu w celu obliczenia średniej i błędu standardowego najważniejszego skutku lub najważniejszych skutków, które mają zostać określone.
    2. Zoptymalizuj moc testu i liczbę zwierząt potrzebnych na grupę, korzystając z różnych metod i swobodnie dostępnych programów11.
    3. Aby przetestować działanie szczepów bakteriocyny wytwarzanych i niebędących producentami, należy użyć 9 zwierząt na warunki doświadczalne.
      UWAGA: Liczba ta została określona na podstawie eksperymentalnego błędu standardowego i zapewniła zadowalającą moc (0,7 - 1,0) oraz poziom istotności poniżej 0,05,
      UWAGA: W podanym przykładzie stworzono 11 grup myszy, po jednej na klatkę. Dziesięć klatek odpowiadało zabiegom z użyciem 5 szczepów wytwarzających bakteriocynę i odpowiadających im 5 izogenicznych szczepów nieprodukujących; Jedenasta klatka miała 10 myszy i stanowiła nieleczoną kontrolę.
  3. Po przybyciu myszy do obiektów hodowlanych należy je rozmieścić w klatkach i oznaczyć uszy, aby umożliwić indywidualne śledzenie. Zaaklimatyzuj myszy do obiektów i warunków hodowlanych przez tydzień przed kontynuowaniem.
  4. Przygotuj wodę pitną zawierającą bakterie, jak opisano w kroku 1.8, i umieść butelki z wodą pitną w odpowiednich niezależnych klatkach, które są wyraźnie oznaczone, tak aby myszy w każdej klatce korzystały z tej samej butelki z wodą.
    UWAGA: Grupa kontrolna musi być trzymana w osobnej klatce, bez kontaktu z badanymi bakteriami.
  5. Codziennie przygotuj nową butelkę ze świeżą wodą pitną (100 ml) i dodaj świeżo rozmrożone zawiesiny bakteryjne. Rób to przez 15 kolejnych dni.
  6. Postępuj zgodnie z leczeniem bakteriami przez okres dwóch tygodni, w tym czasie myszy piją wodę wolną od bakterii (Rysunek 1).

3. Pobieranie próbek

  1. Zbierz próbki kału.
    1. Przygotuj autoklawowane klatki (puste) i sterylne kleszcze oraz oznacz sterylne probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej myszy.
    2. Próbki należy pobierać o tej samej porze dnia, aby uniknąć zmian w składzie mikrobioty w ciągu dnia. W celu uzyskania optymalnych wyników świeże próbki należy pobierać oddzielnie.
      UWAGA: Najlepiej zbierać kał wcześnie rano, kiedy myszy mają tendencję do spontanicznego wypróżniania się.
    3. Wyczyść pustą klatkę 70% alkoholem i umieść w niej mysz. Pozwól mu się wypróżnić i zbierz 2-4 granulki kału za pomocą sterylnych kleszczy, umieszczając je w probówkach o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Czasami wystarczy przytrzymać ogonek myszy do góry; Stolec można następnie pobrać bezpośrednio z odbytu do rurki.
    4. Zbieraj próbki kału od każdej myszy raz w tygodniu podczas czterotygodniowego eksperymentu (Rysunek 1). Pierwsze próbki należy pobrać pierwszego dnia (T0, czas zerowy), tuż przed ekspozycją myszy na bakterie. Zbierz następujące próbki kału w dniach 7, 14, 21 i 28.
    5. Próbki należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do czasu ich transportu do laboratorium, gdzie są zamrażane w temperaturze -80 °C. Należy zaplanować z wyprzedzeniem i zapewnić wystarczającą ilość pojemników do przechowywania, ponieważ podczas eksperymentu zostanie pobrana duża liczba próbek kału.
  2. Waż wszystkie myszy co tydzień w dniu zbierania kału.
  3. Zbierz próbki krwi z żyły twarzowej od wszystkich myszy w 15dniu, ostatnim dniu podawania bakterii, i określ poziom trójglicerydów, cholesterolu całkowitego, lipoprotein o dużej gęstości (HDL) i lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w surowicy krwi.
    UWAGA: Doświadczony personel powinien pobrać krew, aby zmniejszyć stres u zwierząt.

4. Liczenie LAB i aktywność bakteriocyny

  1. Zważyć jedną osadkę kału z każdej próbki w probówce o pojemności 1,5 ml i dodać odpowiednią objętość lodowatego 0,9% NaCl, aby uzyskać 10% (w/v) roztwór. Użyj sterylnych mikrotłuczków do probówek o pojemności 1,5 ml do homogenizacji zawiesiny kałowej i przygotuj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia w lodowatym 0,9% NaCl.
  2. Policz całkowitą liczbę komórek LAB.
    1. Przenieść rozcieńczone komórki (100 μl) do 4 ml podgrzanego miękkiego agaru Man Rogosa Sharpe (MRS) (50 °C, 0,8% agaru). Wymieszaj przez wirowanie przed wylaniem komórek na stałą płytkę agarową MRS (1,5% agar).
    2. Wysuszyć płytkę, zdejmując pokrywkę na 5 - 10 minut w sterylnym kapturze, a następnie inkubować komórki przez 20 - 24 godziny w temperaturze 30 °C w celu wzrostu komórek i utworzenia kolonii.
  3. Policz komórki produkujące bakteriocynę.
    1. Przenieść rozcieńczone komórki (100 μl) producenta bakteriocyny do 4 ml wstępnie podgrzanego miękkiego agaru MRS (50 °C, 0,8% agaru), wymieszać przez wirowanie i wylać komórki na płytkę agarową MRS (1,5% agar); warstwa ta jest określana jako pierwsza warstwa.
    2. Przenieś kolejne 4 ml bezkomórkowego miękkiego agaru MRS (0,8% agaru) na pierwszą warstwę, aby osadzić wszystkie komórki w miękkim agarze.
      UWAGA: Ta warstwa ma na celu zapobieganie wzrostowi komórek jako kolonii na powierzchni płytek agarowych. Komórki rosnące na powierzchni są łatwo przemieszczane podczas wylewania komórek wskaźnikowych na wierzch (krok 4.3.4), co skomplikuje interpretację wyników. Ta warstwa jest określana jako druga warstwa.
    3. Wysuszyć płytkę, zdejmując pokrywkę na 5 - 10 minut w sterylnym kapturze, a następnie inkubować przez 20 - 24 godziny w temperaturze 30 °C w celu wzrostu komórek i utworzenia kolonii.
    4. Aby zidentyfikować kolonie wytwarzające bakteriocynę, należy zmieszać 40 μl nocnej kultury odpowiedniego szczepu wskaźnikowego, jak pokazano w Tabeli 1, z 4 ml wstępnie podgrzanego miękkiego agaru. Wlej mieszaninę na talerz; Ta warstwa jest określana jako trzecia warstwa.
    5. Wysuszyć płytkę, zdejmując pokrywkę na 5 - 10 minut w sterylnym kapturze przed inkubacją przez 20 - 24 godziny w temperaturze 30 °C w celu wzrostu komórek i utworzenia kolonii.
      UWAGA: Kolonie wytwarzające bakteriocynę mają wyraźne strefy (hamowania) wokół kolonii (Rysunek 2).

5. Ekstrakcja DNA, amplifikacja 16S rDNA i sekwencjonowanie

UWAGA: Kroki ekstrakcji DNA są opisane dla użycia komercyjnego zestawu (np. Realpure "SSS" Kit).

  1. Zawiesić 1 - 2 granulki kału myszy (~ 200 mg) w 300 μl roztworu do lizy.
  2. Przenieść próbkę do mikroprobówki o pojemności 2 ml, w której uprzednio umieszczono około 0,5 g szklanych kulek (średnica: 0,1 mm).
  3. Do każdej próbki dodać 1 μl mutanolizyny w stężeniu 10 j./μl i 2 μl lizozymu w stężeniu 20 mg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 - 60 min. Postępować zgodnie z jednym ze standardowych protokołów ekstrakcji DNA z próbek kału12.
  4. Zastosuj dwa cykle kroków ubijania koralików, każdy po 1 minutę.
  5. Dodaj 2 μl proteinazy K i dokładnie wymieszaj.
  6. Inkubować przez 20 minut i wirować co 5 minut.
  7. Schłodzić próbki do temperatury 37 °C i dodać do próbki 1 μl 5 μg/ml RNazy A. Dokładnie wymieszaj.
  8. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 - 60 minut.
  9. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i dodać 180 μl roztworu do wytrącania białek. Wiruj energicznie z maksymalną prędkością przez 20 - 30 s.
  10. Wirować przy 16 000 x g przez 5 min. Jeśli w supernatancie unoszą się jakiekolwiek cząstki, należy inkubować próbki w lodzie przez 5 minut, a następnie ponownie odwirować.
  11. Przenieść supernatant zawierający DNA do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 300 μl izopropanolu.
  12. Wymieszać przez odwrócenie probówek 20-30 razy i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C. Alternatywnie, inkubować probówki przez dłuższy okres (np. przez noc).
  13. Wirować przy 16 000 x g przez 2 min.
  14. Usunąć sklarowany osad i wysuszyć probówkę na bilecie chłonnym. Dodaj 300 μl 70% etanolu, aby przepłukać osad DNA.
  15. Wirować przy 16 000 x g przez 1 minutę, usunąć supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na około 15 minut.
  16. Po wyschnięciu osadu dodać 100 μl sterylnej wody lub buforu Tris (10 mM)/EDTA (1 mM) i ponownie zawiesić osad.
  17. Aby wyeliminować wszelkie możliwe związki hamujące podczas kolejnych etapów, oczyść DNA. Wyekstrahowane DNA zmieszać z 2 objętościami (200 μl) buforu NTI, aby dostosować warunki wiązania dla kroku 5.15.
  18. Umieścić membranę krzemionkową zawierającą kolumnę czyszczącą PCR w probówce zbiorczej (2 ml) i załadować próbkę.
  19. Wirować przez 30 s przy 11 000 x g. Wyrzucić przepływ.
  20. Przemyć membranę krzemionkową 700 μl buforu NT3 i powtórzyć krok 5.16.
  21. Suszyć membranę krzemionkową przez odwirowywanie przez 1 minutę przy 11 000 x g w celu usunięcia wszelkich pozostałości etanolu zawierającego bufor płuczący NT3.
  22. Przenieść kolumnę do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 70 °C w celu całkowitego usunięcia etanolu.
  23. Dodać 30 μl wody klasy PCR i inkubować przez 5 minut w temperaturze 70 °C. Eluować przez odwirowanie przez 1 minutę przy 11 000 x g.
  24. Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru UV/Vis lub metody fluorometrycznej.
  25. Znormalizuj i połącz próbki DNA od myszy dzielących tę samą klatkę w każdym punkcie czasowym.
  26. Aby zaobserwować indywidualne zmiany w czasie, sekwencjonuj próbki DNA od trzech losowo wybranych myszy z grupy kontrolnej i dwóch innych losowych klatek w dniach 0, 14 i 28.

6. Amplifikacja i sekwencjonowanie genów 16S rRNA

  1. Przygotuj bibliotekę amplifikowanych genów 16S rRNA. Amplifikuj region V3-V4 bakteryjnego genu 16S rRNA5 za pomocą starterów do przodu i do tyłu z odpowiednimi adapterami zwisu:
    5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'
    5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC CC C-3'
  2. Sprawdź wzmocnione pasma za pomocą elektroforezy z 1% żelem agarozowym.
  3. Oczyść produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą kulek magnetycznych do oczyszczania amplikonu.
  4. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami, zgodnie ze wskazaniami producenta, zgodnie z używaną platformą sekwencjonowania masowego6.

7. Analiza danych i statystyka

  1. Filtrowanie jakościowe (zwykle wykonywane w zakładach sekwencjonowania).
    1. Filtruj surowe odczyty danych i demultipleksuj za pomocą oprogramowania dostarczonego ze sprzętem.
    2. Przetwarzaj odczyty sparowanego końca za pomocą potoku UPARSE13 zaimplementowanego w USEARCH14 (wersja 7.0.1090). Scal sparowane końce i zastosuj filtrowanie jakości przy użyciu maksymalnej wartości oczekiwanego błędu (maxee) wynoszącej 1,0. Odrzuć sekwencje mniejsze niż 150 nt. Dereplikacja sekwencji w celu odrzucenia singletonów.
    3. Grupuj sekwencje w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) na 97% identyczności sekwencji i użyj UCHIME15 do filtrowania sekwencji chimerycznych.
  2. Selekcja OTU, przypisanie taksonomiczne i rekonstrukcja filogenetyczna oraz analizy i wizualizacje różnorodności.
    1. Przetwarzaj OTU, korzystając z Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)16.
    2. Wybierz i wyrównaj reprezentatywne OTU z bazą danych zestawu podstawowego Greengenes17 przy użyciu PyNAST18 z minimalną tożsamością 75% (domyślnie).
    3. Przypisz taksonomię do wyrównanych sekwencji za pomocą programu klasyfikacyjnego Ribosomal Database Project (RDP)19 z pewnością 0,8.
    4. Znormalizuj tabelę OTU do liczby sekwencji próbki o najmniejszej głębokości sekwencji.
    5. Zbuduj drzewo filogeniczne z wyrównanych sekwencji za pomocą Fast Tree20 po etapie filtracji, aby usunąć bardzo zmienne regiony i pozycje, które są lukami. To drzewo służy do obliczania rozmaitości alfa i beta oraz do obliczania krzywych rozrzedzenia i indeksów Shannona.
    6. Aby wygenerować i zwizualizować nieważone metryki odległości UniFrac21, użyj głównej analizy współrzędnych (PCoA).
      UWAGA: Do analizy statystycznej można używać różnych pakietów oprogramowania, takich jak R22 lub narzędzi statystycznych zaimplementowanych w QIIME16.
    7. Do porównania wskaźników różnorodności Shannona między różnymi terapiami należy użyć ANCOVA, biorąc pod uwagę czas jako ciągłą zmienną zależną w R.
    8. Porównaj odległości między zabiegami w PCoA w QIIME za pomocą dwustronnego testu t Studenta i oblicz nieparametryczne wartości p z 1,000 permutacjami Monte Carlo przy użyciu poprawki Bonferroniego.
    9. Analizuj pod kątem korelacji między względną obfitością określonych OTU a innymi mierzonymi parametrami, takimi jak poziom cholesterolu, HDL, LDL itp. w surowicy, korzystając z analizy korelacji Pearsona. W tym celu należy użyć CoNet23 z późniejszą wizualizacją sieci korelacji za pomocą Cytoscape 3.1.124.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Produkcję bakteriocyn uznano za pozytywną cechę probiotyczną bakterii LAB, ponieważ przyjęto, że zapobiega ona wzrostowi bakterii oportunistycznych i patogenów. Celem niniejszej pracy było wykazanie zdolności bakteriocyn do modulowania populacji mikrobioty jelitowej w modelu mysim. W tym celu opracowano procedurę pozwalającą porównać efekt przyjmowania szczepów produkujących bakteriocyny oraz ich izogennych szczepów nieprodukujących. Procedura inokulacji oraz ramy czasowe badania przedsta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj procedura została wykorzystana do określenia, czy zmiany w mikrobiocie są związane ze zdrowiem lub wiekiem. Różne części protokołu są ważne, ale wśród nich pobieranie próbek kału, wybór fragmentu DNA do sekwencjonowania i analizy oraz przeprowadzanie ekstrakcji DNA i analizy bioinformatycznej mogą być z pewnością najbardziej krytycznymi punktami. Pobieranie próbek ma kluczowe znaczenie, ponieważ ze względów etycznych myszy nie powinny być zestresowane i ponieważ wiadomo, że zmienia to proporcje bakterii w j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować grantowi EEA NILS Science and Sustainability Coordinated Mobility of Researchers (odniesienie 017-ABEL-CM-2013). C.B. i G.P.-M. były wspierane przez grant AGL2015-70487-P z hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności. O.C.O.U. i D.B.D. były wspierane przez strategiczny program stypendialny na badania nad żywnością z Norweskiego Uniwersytetu Przyrodniczego (NMBU) (projekt 1205051025). Chcielibyśmy również podziękować Inmaculadzie Noguerze za pomoc w opiece nad zwierzętami i pobieraniu próbek oraz Jesusowi Dehesa za pomoc w zapewnieniu dostępności materiałów laboratoryjnych w obiekcie dla zwierząt. Jesteśmy również wdzięczni profesorowi Larsowi-Gustavowi Snipenowi za jego rady dotyczące statystyki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy Balb/c (samica)Harlanpowinny mieć 6 - 8 tygodni
Plastikowa szalka PetriegoThermo Scientific101VR20
Rosół z naparu mózgowo-sercowegoConda1400.00
Europejski agar bakteriologicznyPronadisa1800.00
Agaroza D1 Low EEOPronadisa8010.00
1x Bufor TAEThermo Scientific15558042
bulion MRSDifco288130
PBS tabletkiSigmaP4417-100TAB
wagaMettler ToledoPB602-S
sterylne kleszczeLevantina de Laboratorios S.L.260-3710014
MikrowirówkaEppendorf5424
WirówkaHermleZ383K
chlorek soduAppliChem Panreac121659.1211
Zestaw Realpure SSS RealLife Science Solutions, Durviz, HiszpaniaRBME04 (300 ml)
IsopropanolAppliChem Panreac131090.1611
EthanolAppliChem Panreac131086.1214
Fluorometr kubitowyInvitrogen
Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32851
Koraliki AMPure XPBeckman Coulter Genomics, USAA63881 (60 ml)
Zestaw do kwantyfikacji biblioteki PerfeCta NGSQuanta BioSciences, Maryland, USA733-2300
Zestaw odczynników MiSeq v3Illumina, San Diego, Kalifornia, USAMS-102-3003
Startery do amplifikacjiStartery zawierają region V3-V4 bakteryjnego genu 16S rRNA i adaptery zwisu Illumina: 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3' i 5'-GTC TCG TGG GCT GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'
indeksów Nextera XTFC-131-1002Indeksy i adaptery sekwencjonowania Illumina
Mikropestle do probówek 1,5 mL, Eppendorf / Sigma , Ref.SigmaZ317314-1PAK
Koraliki szklane, średnica 0,1 mmBiospec Products11079-101
Zestaw do czyszczenia żelu NucleoSpin i PCRMacherey-Nagel740609.25
Omni Bead Ruptor 24Omni International Inc.19-040
mutanolizynaSigmaM9901-10KU
lizozymRoche10837059001
proteinaza KRoche3115887001
RNaza ASigmaR4875
Myszy Zestaw testowy genu 16S rRNA Zestaw

Bibliografia

  1. Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
  2. Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
  3. Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
  4. Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait? Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
  5. Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
  6. Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
  7. Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
  8. Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
  9. Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
  10. Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113(2012).
  11. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
  12. Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036(2016).
  13. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
  14. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  15. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
  16. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
  17. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  18. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
  19. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  20. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490(2010).
  21. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
  22. R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
  23. Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606(2012).
  24. Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  25. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1(2013).
  26. Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787(2013).
  27. Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
  28. Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
  29. Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
  30. Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
  31. Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
  32. Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model mysisekwencjonowanie 16S rDNAekstrakcja DNA z kałuszczepy izogenicznehodowle bakteryjneliczenie CFUuzdatnianie wody pitnejpobieranie próbek kału
Metoda oceny wpływu bakteriocyny na mikrobiotę jelitową myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.