Uważa się, że bakteriocyny odgrywają kluczową rolę w definiowaniu różnorodności mikrobiologicznej w różnych niszach ekologicznych. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę oceny wpływu bakteriocyny na skład mikrobioty jelitowej na modelu zwierzęcym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda oceny wpływu bakteriocyny na mikrobiotę jelitową myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bardzo intrygujące pytania pojawiają się wraz z naszą pogłębiającą się wiedzą na temat składu mikroflory jelitowej i związku ze zdrowiem, szczególnie w odniesieniu do czynników, które przyczyniają się do utrzymania równowagi populacji. Dostępne metodologie oceny tych czynników są jednak ograniczone. Bakteriocyny to peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez wiele bakterii, które mogą zapewniać przewagę konkurencyjną w pozyskiwaniu żywności i/lub tworzeniu nisz. Wiele szczepów probiotycznych bakterii kwasu mlekowego (LAB) ma ogromny potencjał w promowaniu zdrowia ludzi i zwierząt poprzez zapobieganie rozwojowi patogenów. Mogą być również stosowane do immunomodulacji, ponieważ wytwarzają bakteriocyny. Jednak antagonistyczna aktywność bakteriocyn jest zwykle określana za pomocą laboratoryjnych testów biologicznych w dobrze zdefiniowanych, ale nadmiernie uproszczonych warunkach w porównaniu ze złożonym środowiskiem jelitowym u ludzi i zwierząt, w którym bakterie są narażone na wieloczynnikowe wpływy gospodarza i setki gatunków drobnoustrojów dzielących tę samą niszę. W pracy opisano kompletną i skuteczną procedurę oceny wpływu różnych bakteriocyn o różnej swoistości docelowej w systemie mysim. Zmiany w składzie mikrobioty podczas leczenia bakteriocyną są monitorowane za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA. Nasze podejście wykorzystuje zarówno producentów bakteriocyny, jak i ich izogeniczne mutanty niewytwarzające bakteriocyny, przy czym te ostatnie dają możliwość odróżnienia modyfikacji mikrobioty związanych z bakteriocyną od niezwiązanych z bakteriocyną. Metody ekstrakcji DNA kałowego i sekwencjonowania 16S rDNA są spójne i wraz z bioinformatyką stanowią potężną procedurę wykrywania niewielkich zmian w profilach bakteryjnych i ustalania korelacji pod względem stężenia cholesterolu i trójglicerydów między populacjami bakterii a markerami zdrowia. Nasz protokół jest ogólny i dlatego może być stosowany do badania innych związków lub składników odżywczych, które mogą zmieniać skład mikrobioty gospodarza, zarówno podczas badania toksyczności, jak i korzystnych skutków.
Wprowadzenie
Bakteriocyny to peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez szeroką gamę gatunków bakterii1,2. Związki te i ich producenci, zwłaszcza LAB, są badane i eksploatowane na całym świecie od dziesięcioleci pod kątem ich potencjalnych zastosowań w konserwacji żywności i medycynie3. Wiadomo, że kilka bakteriocyn zabija ważne patogeny, w tym gatunki Listeria, Enterococcus, Staphylococcus i Bacillus. Niektóre bakteriocyny mają nawet zdolność modulowania odpowiedzi immunologicznej4. Wiele bakteriocyn ma stosunkowo wąskie widma, co jest bardzo cenione w....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka i obsługa muszą być prowadzone w specjalistycznym oddziale opieki nad zwierzętami. Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednią Komisję Etyczną Uniwersytetu w Walencji i władze lokalne, zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi obowiązującymi na mocy prawa Unii Europejskiej i 2010/63/UE oraz rządu hiszpańskiego RD 53/2013 w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych, w celu poszanowania zasady 3R w doświadczeniach na zwierzętach (Wymiana, Redukcja, udoskonalenie).
1. Zamrożone kultury bakterii używane do inokulacji myszy
- Zaszczepić poszczególne szczepy LAB w 5 ml pożywk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Produkcję bakteriocyn uznano za pozytywną cechę probiotyczną bakterii LAB, ponieważ przyjęto, że zapobiega ona wzrostowi bakterii oportunistycznych i patogenów. Celem niniejszej pracy było wykazanie zdolności bakteriocyn do modulowania populacji mikrobioty jelitowej w modelu mysim. W tym celu opracowano procedurę pozwalającą porównać efekt przyjmowania szczepów produkujących bakteriocyny oraz ich izogennych szczepów nieprodukujących. Procedura inokulacji oraz ramy czasowe badania przedsta.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj procedura została wykorzystana do określenia, czy zmiany w mikrobiocie są związane ze zdrowiem lub wiekiem. Różne części protokołu są ważne, ale wśród nich pobieranie próbek kału, wybór fragmentu DNA do sekwencjonowania i analizy oraz przeprowadzanie ekstrakcji DNA i analizy bioinformatycznej mogą być z pewnością najbardziej krytycznymi punktami. Pobieranie próbek ma kluczowe znaczenie, ponieważ ze względów etycznych myszy nie powinny być zestresowane i ponieważ wiadomo, że zmienia to proporcje bakterii w j.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować grantowi EEA NILS Science and Sustainability Coordinated Mobility of Researchers (odniesienie 017-ABEL-CM-2013). C.B. i G.P.-M. były wspierane przez grant AGL2015-70487-P z hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności. O.C.O.U. i D.B.D. były wspierane przez strategiczny program stypendialny na badania nad żywnością z Norweskiego Uniwersytetu Przyrodniczego (NMBU) (projekt 1205051025). Chcielibyśmy również podziękować Inmaculadzie Noguerze za pomoc w opiece nad zwierzętami i pobieraniu próbek oraz Jesusowi Dehesa za pomoc w zapewnieniu dostępności materiałów laboratoryjnych w obiekcie dla zwierząt. Jesteśmy również wdzięczni profe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myszy Balb/c (samica) | Harlan | powinny mieć 6 - 8 tygodni | |
| Plastikowa szalka Petriego | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Rosół z naparu mózgowo-sercowego | Conda | 1400.00 | |
| Europejski agar bakteriologiczny | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agaroza D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x Bufor TAE | Thermo Scientific | 15558042 | |
| bulion MRS | Difco | 288130 | |
| PBS tabletki | Sigma | P4417-100TAB | |
| waga | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterylne kleszcze | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Mikrowirówka | Eppendorf | 5424 | |
| Wirówka | Hermle | Z383K | |
| chlorek sodu | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Zestaw Realpure SSS Real | Life Science Solutions, Durviz, Hiszpania | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Fluorometr kubitowy | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS | Invitrogen | Q32851 | |
| Koraliki AMPure XP | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| Zestaw do kwantyfikacji biblioteki PerfeCta NGS | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| Zestaw odczynników MiSeq v3 | Illumina, San Diego, Kalifornia, USA | MS-102-3003 | |
| Startery do amplifikacji | Startery zawierają region V3-V4 bakteryjnego genu 16S rRNA i adaptery zwisu Illumina: 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3' i 5'-GTC TCG TGG GCT GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3' | ||
| indeksów Nextera XT | FC-131-1002 | Indeksy i adaptery sekwencjonowania Illumina | |
| Mikropestle do probówek 1,5 mL, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Koraliki szklane, średnica 0,1 mm | Biospec Products | 11079-101 | |
| Zestaw do czyszczenia żelu NucleoSpin i PCR | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolizyna | Sigma | M9901-10KU | |
| lizozym | Roche | 10837059001 | |
| proteinaza K | Roche | 3115887001 | |
| RNaza A | Sigma | R4875 |
Bibliografia
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
