Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Podsumowanie

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Streszczenie

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników o powinowactwie peptydów do rozpoznawania celów zarówno biotycznych, jak i abiotycznych. Odczynniki powinowactwa peptydowego mogą być używane do podobnych zastosowań do przeciwciał, w tym do wykrywania i terapii, ale są bardziej wytrzymałe i zdolne do działania w bardziej ekstremalnych warunkach. Specyficzne wzbogacanie środków wychwytujących peptydy do białka będącego przedmiotem zainteresowania jest wzmocnione za pomocą półautomatycznych metod sortowania, które usprawniają etapy wiązania i mycia, a tym samym zmniejszają występowanie fałszywie dodatnich substancji wiążących. W niniejszym dokumencie opisano półautomatyczną metodę sortowania do użytku z komercyjnym zautomatyzowanym urządzeniem do sortowania komórek aktywowanym magnetycznie z nieograniczoną biblioteką sortowania wyświetlaczy bakteryjnych wyrażającą losowe peptydy 15-merowe. Z niewielkimi modyfikacjami metody te można rozszerzyć na inne zautomatyzowane urządzenia, inne biblioteki sortujące i inne organizmy. Podstawowym celem tej pracy jest dostarczenie kompleksowej metodologii i wyjaśnienie procesu myślowego stosowanego w analizie i minimalizacji wynikowej puli kandydatów. Techniki te obejmują analizę wiązania na komórkach za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), w celu oceny powinowactwa i swoistości podczas sortowania i porównywania poszczególnych kandydatów, a także analizę sekwencji peptydowych w celu identyfikacji trendów i sekwencji konsensusu w celu zrozumienia i potencjalnej poprawy powinowactwa i swoistości dla celu będącego przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Biopanning to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa, z bibliotekami wyświetlania bakterii wygodnym źródłem odczynników powinowactwa peptydów ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24}. Podobnie jak w przypadku wyświetlania fagów ^25,26 i drożdży ^27,28, peptydy są eksponowane na powierzchni komórki i są dostępne do wiązania się zarówno z celami biotycznymi, jak i abiotycznymi, przy czym te interakcje są napędzane zarówno przez szkielet peptydu, jak i unikalne właściwości łańcuchów bocznych aminokwasów ²⁹. W przeciwieństwie do wyświetlania fagów, same bakterie są samoreplikujące się i zawierają cały materiał genetyczny wymagany do ekspozycji bez elucji związanego faga i ponownej infekcji komórek. W przeciwieństwie do drożdży, ekspozycja bakteryjna jest szybsza ze względu na szybki (około 20 minut ³⁰) czas podwojenia Escherichia coli. Powstałe w ten sposób odczynniki powinowactwa peptydów mogą być wytwarzane poza komórką do użytku na różnych platformach detekcyjnych ^16,17,26 i mają potencjał do wykorzystania jako żywe materiały, gdy są wyświetlane na komórce ^2,31,32. W porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi do rozpoznawania określonych celów, peptydy są znacznie mniejsze i bardziej elastyczne, a bibliotekami wyświetlania peptydów można łatwo manipulować na poziomie DNA, aby uniknąć określonych aminokwasów, takich jak cysteina ³³. Peptydy są coraz częściej wykorzystywane w terapiach ^34,35,36 i innych zastosowaniach, w których zwykle wykorzystuje się przeciwciała ze względu na ich łatwość wykrywania, powtarzalną produkcję syntetyczną (poza komórkami) i doskonałe utrzymanie wydajności w ekstremalnych warunkach, zapewniając funkcjonalny odczynnik nawet po wystawieniu na działanie wysokiej temperatury lub długotrwałym przechowywaniu bez chłodzenia ^37,38. Zdolność do pokonania łańcucha chłodniczego w zakresie przechowywania odczynników jest szczególnie interesująca dla na przykład Departamentu Obrony, który musi działać w ekstremalnych warunkach. Stabilność termiczna była zatem pożądaną cechą odczynników o powinowactwie, rozpoznających wybrane cele podane jako przykłady w tym manuskrypcie.

Ostatnio, biblioteki wyświetlania bakterii do biopanoramowania stały się jeszcze prostsze i bardziej niezawodne dzięki zastosowaniu półautomatycznych, aktywowanych magnetycznie metod sortowania komórek (MACS lub MCS) ^9,14,39. Metody te zostały zademonstrowane dla celów biologicznych przy użyciu kilku podobnych platform sortowania o różnych zaletach, w tym dostępnego na rynku automatycznego urządzenia do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (autoMACS lub autoMCS) (patrz tabela materiałów) ^1,14,15 i bardziej specjalistycznych urządzeń, które zamykają próbkę w jednorazowym kartridżu ^7,9 lub chip ³⁹, cenna specyfikacja do stosowania z organizmami lub toksynami, które mają poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub wyższy⁷. Te półautomatyczne metody mogą zostać rozszerzone o sortowanie peptydów zdolnych do wiązania się z materiałami abiotycznymi, jeśli materiały są magnetyczne lub mają zdolność powlekania kulką magnetyczną, oraz do stosowania z różnymi organizmami (takimi jak bakterie beztlenowe), jeśli warunki sortowania i wzrostu zostaną zmienione. Oprócz sortowania bibliotek wyświetlaczy bakteryjnych, komercyjny instrument autoMCS został również częściowo wykorzystany do początkowych etapów odkrywania fragmentów ludzkich przeciwciał jednołańcuchowych wyświetlanych na powierzchni drożdży, a następnie dalszej izolacji za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) ⁴⁰. Głównymi zaletami półautomatyzacji są skrócenie czasu i wysiłku związanego z sortowaniem oraz bardziej niezawodne i powtarzalne eliminowanie niezwiązanych komórek z kulek magnetycznych podczas etapów mycia, co prowadzi do zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich, mniejszej liczby wymaganych rund sortowania i mniej skomplikowanej analizy końcowej ^9,14. W przypadku komercyjnego urządzenia autoMCS istnieje wiele wstępnie załadowanych programów, które mogą być optymalne dla różnych zastosowań, takich jak sortowanie wstępne ujemne (zubożenie), priorytetyzacja czystości, minimalizacja końcowej objętości próbki oraz zwiększanie lub zmniejszanie czułości izolacji rzadkich komórek ⁴¹.

Głównym celem tej pracy jest zademonstrowanie metodologii biopanowania biblioteki wyświetlaczy bakteryjnych za pomocą komercyjnie dostępnego instrumentu autoMCS, oraz wyjaśnienie procesu myślowego zastosowanego w analizie i minimalizacji wynikowej puli kandydatów w celu ułatwienia rozszerzenia na inne zastosowania. Używana tutaj biblioteka wyświetlania (patrz tabela materiałów) ^12,13 zawiera około 10^{9-10 11} unikalnych 15-merowych peptydów wyświetlanych za pomocą zmodyfikowanej wersji bakteryjnego białka błony zewnętrznej OmpX w nieograniczonym charakterze na powierzchni komórki, które oczekuje się, że będzie reprezentatywne dla wolnego peptydu w roztworze, jeśli zostanie wytworzone syntetycznie. To rusztowanie białkowe zawiera dodatkowo peptyd P2X kontroli pozytywnej na C-końcu do monitorowania ekspresji poprzez wiązanie z YPet Mona. Jednak zakupiona lub nowatorska biblioteka o odpowiedniej różnorodności i innych cechach niezbędnych dla konkretnego pożądanego zastosowania powinna działać podobnie z tą procedurą biopanoramowania, chociaż mogą być wymagane pewne drobne zmiany. Schemat tego protokołu biopanoramowania jest zilustrowany na Rysunek 1. Ponadto protokół można dostosować do innych zautomatyzowanych platform sortowania magnetycznego i innych strategii sortowania. Ręczne sortowanie magnetyczne za pomocą magnesu stołowego zostało pomyślnie zademonstrowane, aczkolwiek z bardziej skomplikowaną i czasochłonną analizą wymaganą ze względu na zwiększoną liczbę wyników fałszywie dodatnich ¹⁴, niemniej jednak stanowi alternatywną opcję dla kroków autoMCS, jeśli nie jest dostępne żadne automatyczne urządzenie do sortowania komórek magnetycznych.

Protokół

1. Biblioteki wyświetlania bakterii biopanujących za pomocą autoMCS

UWAGA: Ten protokół sortowania oparty na autoMCS został wcześniej opisany ¹⁴, a bardziej szczegółowy "Rozszerzony protokół dla nowych użytkowników" jest dostępny w materiałach uzupełniających do tego manuskryptu, aby uzyskać więcej szczegółów, w tym wyjaśnienie potencjalnych modyfikacji. Jeśli urządzenie autoMCS jest niedostępne do sortowania, zapoznaj się z dodatkowym protokołem z Sarkes et al. 2015, ponieważ protokół sortowania ręcznego jest również opisany w tej pracy ¹⁴. Udostępniony tutaj protokół autoMCS został dodatkowo zmodyfikowany w celu uwzględnienia dodatkowych kroków sortowania ujemnego w celu poprawy specyficzności ^1,15. Schemat tego protokołu biopanoramowania jest zilustrowany na Rysunek 1.

1. Sortowanie ujemne w celu usunięcia spoiw, które mogą reagować krzyżowo z kulkami magnetycznymi
   1. Zaszczepić 500 ml Luria Bulion Miller (LB) zawierającego odpowiedni antybiotyk około 1 x 10¹¹komórek z różnorodnej biblioteki sortowania ekspozycji bakteryjnych (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Używana tutaj biblioteka peptydów do wyświetlania bakterii (patrz tabela materiałów) zawiera około 10 9-10¹¹unikalnych członków ^8,12 i jest uprawiana w LB zawierającym 25 μg/ml chloramfenikolu (LB Cm₂₅). Pozostała część tego protokołu zakłada, że ta biblioteka jest używana.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 225 obr./min, aż kultura osiągnie OD₆₀₀ 0,5-0,55. Indukuj ekspresję peptydu za pomocą 0,04% w/v L-arabinozy, rozcieńczając 4% zapas w stosunku 1:100, wstrząsając z prędkością 225 obr./min przez 45 minut w temperaturze 37°C.
   3. Umieść indukowaną kulturę na lodzie. Odwirować około 2 x 10¹¹ komórek przy 6000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml PBS, delikatnie mieszając.
      UWAGA: OD₆₀₀ wynoszący 1,0 w przybliżeniu równa się 1 x 10⁹ komórek/ml dla E. coli.
      UWAGA: NIE WIRUJ, ponieważ może to spowodować lizę komórek; zawiesić ręcznie lub krótko wstrząsając w temperaturze ≤ 225 obr./min, 4°C.
   4. Przenieść komórki do probówki (probówek) do mikrowirówek i wirować w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4°C. Usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA; PBS-B).
   5. Przemyć 300 μl kulek pokrytych streptawidyną (około 3 x 10⁹ kulek, patrz tabela materiałów) w 1 ml PBS-B i wirować przez 5 minut przy ≥5 000 x g (przy RT). Umieść rurkę w laboratoryjnym magnetycznym separatorze cząstek. Ostrożnie usunąć supernatant, unikając osadu.
   6. Ponownie zawiesić kulki w komórce plus mieszaninę PBS-B przygotowaną powyżej. Inkubować w temperaturze 4°C na platformie obrotowej przez 45 minut. Umieść próbki na lodzie.
   7. Włącz instrument autoMCS, aby zainicjować system. Przewody należy zalać za pomocą fabrycznych run i wash (patrz tabela materiałów), wybierając "Umyj teraz" u dołu ekranu w menu "Separacja", a następnie "Płukanie" i "Uruchom".
   8. Zalej system za pomocą PBS-B, używając PBS-B zarówno jako bufora myjącego, jak i bufora uruchomionego w następnych krokach. Wybierz menu "Separacja" z górnego paska nawigacyjnego i wybierz "Umyj teraz". Wybierz "Płukanie" i "Uruchom", aby zalać system świeżym PBS-B.
   9. Przenieść mieszaninę komórek i kulek z etapu inkubacji do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umieścić tę probówkę w szczelinie na próbkę i opróżnić stożkowe probówki o pojemności 15 ml w szczelinach wyboru dodatniego i ujemnego we wstępnie schłodzonym (4°C) stojaku (patrz tabela materiałów). Umieść stojak na platformie instrumentu.
   10. Przypisz program separacji do każdej próbki na stojaku (w jednym przebiegu można posortować do 5 próbek). Dodać etap "płukania" pomiędzy każdą próbką i po ostatniej próbce. Wybierz "Uruchom", aby rozpocząć separację komórek. Wybierz "OK", aby potwierdzić, że dostępna jest wystarczająca ilość bufora.
       UWAGA: Program separacji "Posselds" działa dobrze dla sortowania negatywnego i pozytywnego sortowania rundy 1, a "Posseld" jest preferowany do sortowania rund 2 - 4, ale oba te programy zostały z powodzeniem użyte do wszystkich rund sortowania negatywnego i pozytywnego ^14,15 i inne programy mogą okazać się lepsze dla konkretnego zastosowania (opisane dalej w dyskusji).
   11. Po zakończeniu programu wyjmij stojak i zachowaj odpowiednią frakcję. Tutaj, w przypadku sortowania ujemnego, zachowaj ułamki ujemne (zawierające komórki bez koralików). Ułóż na lodzie.
   12. Użyj ujemnej frakcji sortowania w całości, aby zaszczepić 1 l LB Cm₂₅ 0,2% w/v D-glukozy. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
   13. Przed wyłączeniem przyrządu autoMCS należy zmienić pracy i mycia na pracy i mycia producenta (patrz tabela materiałów). Wybierz "Umyj teraz", a następnie "Spłucz" i "Uruchom". Po zakończeniu upewnij się, że w linii odkażania znajduje się 70% etanolu, a następnie naciśnij "ikonę zasilania" w prawym górnym rogu ekranu i wybierz "Tak".
   14. Po zakończeniu zamykania systemu (butelki będą fioletowe) wyłącz maszynę.
   15. Następnego dnia użyj hodowli przez noc, aby przygotować bulion do zamrażania z około 1 x 10¹¹komórek na fiolkę w LB z 15% glicerolem. Dodatkowo, lub alternatywnie, użyj tej kultury w następnym kroku: dodatkowe sortowanie ujemne (sekcja 1.2) lub pierwsza runda sortowania pozytywnego (sekcja 1.3).
2. Sortowanie negatywne w celu usunięcia spoiw, które mogą reagować krzyżowo z innymi interesującymi celami
   UWAGA: Sekcja 1.2 może zostać pominięta, jeśli dalsze sortowanie ujemne nie jest potrzebne lub pożądane. W takim przypadku należy przejść do sekcji 1.3. Szczątkowe wiązanie z jakimikolwiek niepożądanymi celami można ocenić za pomocą FACS, jak w sekcji 2: Analiza FACS rund sortowania.
   1. W przypadku sortowania ujemnego względem określonego docelowego białka, takiego jak podobne białko, które może również wiązać się z odkrytymi peptydami ^1,15, powtórz kroki wzrostu i indukcji 1.1.1 - 1.1.3, zaczynając od zamrożonego zapasu biblioteki zubożonej w streptawidynę z kroku 1.1.15 lub hodowli nocnej z kroku 1.1.12 (przy użyciu OD₆₀₀ do oszacowania i zaszczepienia komórkami 1 x 10¹¹).
   2. Przenieść komórki do probówki (probówek) do mikrowirówek i wirować w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4°C. Usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającym 600 nM biotynylowanego białka reagującego krzyżowo. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut na platformie obrotowej.
      UWAGA: 600 nM to sugerowane stężenie początkowe, które może ulec zmianie, jeśli zaobserwuje się zauważoną korzyść. Biotynylację docelowego białka można osiągnąć i określić ilościowo przy użyciu odczynników sugerowanych w tabeli materiałów.
   3. W międzyczasie przemyć 100 μl kulek pokrytych streptawidyną (około 1 x 10⁹ kulek) w 1 ml PBS-B i wirować przez 5 minut przy ≥ 5 000 x g (w temperaturze pokojowej). Umieść rurkę w laboratoryjnym magnetycznym separatorze cząstek i ostrożnie usuń supernatant, unikając osadu.
   4. Odwirować komórki docelowe przy 6 000 x g przez 5 minut (RT lub 4°C), usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS-B. Ponownie zawiesić kulki w całej objętości przemytych komórek związanych z celem białka reagującego krzyżowo. Inkubować w temperaturze 4°C na platformie obrotowej przez 30 minut.
   5. Umieścić próbkę na lodzie i wykonać kroki 1.1.7 - 1.1.15 w celu sortowania ujemnego, tworząc odpowiednie zapasy do zamrażania. Kontynuować do sekcji 1.3 dla sortowania dodatniego, jeśli osiągnięto wszystkie pożądane sortowanie ujemne, lub powtórzyć sekcję 1.2 do sortowania ujemnego w stosunku do innego potencjalnego białka reagującego krzyżowo.
3. Runda 1 Sortowanie pozytywne<br /> UWAGA: Sortowanie dodatnie w rundzie 1 względem określonego celu białkowego jest podobne do sortowania ujemnego względem określonego celu sortowania (patrz 1.2), z wyjątkiem tego, że frakcja dodatnia zawierająca kulki jest zachowywana.
   1. Zaszczepić 500 ml LB Cm₂₅ około 1 x^{10 11}komórek z różnorodnej biblioteki sortowania ekspozycji bakteryjnych, które zostały zubożone streptawidyną i wyhodowane przez noc (od kroku 1.1.12) lub zamrożone (od kroku 1.1.15) i rozmrożone na lodzie, lub które zostały jeszcze bardziej pozbawione spoiw innych docelowych białek reagujących krzyżowo (od etapu 1.2.5), zgodnie z życzeniem.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 225 obr./min, aż kultura osiągnie OD₆₀₀ 0,5-0,55. Indukuj ekspresję peptydu za pomocą 0,04% w/v L-arabinozy, rozcieńczając 4% zapas w stosunku 1:100, wstrząsając z prędkością 225 obr./min przez 45 minut w temperaturze 37°C.
   3. Umieść indukowaną kulturę na lodzie. Odwirować około 2 x 10¹¹ komórek przy 6 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml PBS, delikatnie obracając (ręcznie lub krótko wstrząsając ≤ prędkością 225 obr./min, 4°C).
   4. Przenieść komórki do probówki (probówek) do mikrowirówek i wirować w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4°C. Usunąć supernatant.
   5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającym 600 nM biotynylowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut na platformie obrotowej.
      UWAGA: 600 nM to sugerowane stężenie początkowe, które może ulec zmianie, jeśli zaobserwuje się zauważoną korzyść. Biotynylację docelowego białka można osiągnąć i określić ilościowo przy użyciu odczynników sugerowanych w tabeli materiałów.
   6. W międzyczasie przemyć 100 μl kulek pokrytych streptawidyną (około 1 x 10⁹ kulek) w 1 ml PBS-B i wirować przez 5 minut przy ≥ 5 000 x g (w temperaturze pokojowej). Umieść rurkę w laboratoryjnym separatorze cząstek magnetycznych i ostrożnie usuń supernatant, unikając osadu.
   7. Po zakończeniu inkubacji z tarczą, odwirować komórki związane z celem w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut (RT lub 4°C) w celu usunięcia niezwiązanego białka docelowego. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml PBS-B. Zawiesić kulki w całej objętości umytych komórek związanych z celem białkowym. Inkubować w temperaturze 4°C na platformie obrotowej przez 30 minut. Ułóż na lodzie.
   8. Włącz instrument autoMCS, aby zainicjować system. Przewody należy zalać za pomocą fabrycznych do uruchamiania i mycia (patrz tabela materiałów), wybierając opcję "Umyj teraz" u dołu ekranu w menu Separacja, a następnie "Płukanie" i "Uruchom".
   9. Zalej system za pomocą PBS-B, używając PBS-B zarówno jako bufora myjącego, jak i bufora uruchomionego w następnych krokach. Wybierz menu Separacja z górnego paska nawigacyjnego i wybierz opcję Umyj teraz. Wybierz opcję Rinse and Run (Płukanie i uruchamianie), aby zalać system świeżym PBS-B.
   10. Przenieść mieszaninę komory i kulek z powyższego etapu inkubacji do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, przepłukując probówkę dodatkowymi 500 μl PBS-B i łącząc popłuczynę z próbką. Umieścić tę probówkę w szczelinie na próbkę i opróżnić stożkowe probówki o pojemności 15 ml w szczelinach wyboru dodatniego i ujemnego we wstępnie schłodzonym (4°C) stojaku (patrz tabela materiałów). Umieść stojak na platformie instrumentu.
   11. Przypisz program separacji do każdej próbki na stojaku (w jednym przebiegu można posortować do 5 próbek). Dodać etap "płukania" pomiędzy każdą próbką i po ostatniej próbce. Wybierz "Uruchom", aby rozpocząć separację komórek. Wybierz "OK" lub "KONTYNUUJ", aby potwierdzić, że dostępna jest wystarczająca ilość bufora.
       UWAGA: Program separacji "Posselds" działa dobrze dla sortowania negatywnego i pozytywnego sortowania rundy 1, a "Posseld" jest preferowany do sortowania rund 2 - 4, ale oba te programy zostały z powodzeniem użyte do wszystkich rund sortowania negatywnego i pozytywnego ^14,15 i inne programy mogą okazać się lepsze dla konkretnego zastosowania (opisane dalej w dyskusji).
   12. Po zakończeniu programu wyjmij stojak i zachowaj odpowiednią frakcję. Tutaj, aby uzyskać sortowanie dodatnie, zachowaj frakcje dodatnie (zawierające komórki i koraliki). Ułóż na lodzie.
   13. Przed wyłączeniem przyrządu autoMCS należy zmienić pracy i mycia na pracy i mycia producenta (patrz tabela materiałów). Wybierz "Umyj teraz", a następnie "Spłucz" i "Uruchom". Po zakończeniu upewnij się, że w linii odkażania znajduje się 70% etanolu, a następnie naciśnij "ikonę zasilania" w prawym górnym rogu ekranu i wybierz "Tak".
   14. Po zakończeniu zamykania systemu (butelki będą fioletowe) wyłącz maszynę.
   15. Użyj dodatniej frakcji sortowania w całości, aby zaszczepić 1 l LB Cm₂₅ 0,2% w/v D-glukozy. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
   16. Następnego dnia użyj nocnej hodowli, aby przygotować zapasy z zamrażarki w LB zawierające 15% glicerolu i/lub kontynuuj pozytywne sortowanie w rundzie 2 w sekcji 1.4.
4. Kolejne pozytywne rundy sortowania
   UWAGA: Zazwyczaj zalecane są cztery rundy sortowania, chociaż zazwyczaj wystarczają trzy rundy sortowania ^14,15. Kiedy należy przerwać sortowanie, pomaga analiza FACS rund sortowania opisana w sekcji 2. Koncentracje objętości tarczy i kulki magnetycznej zmniejszają się z każdą kolejną dodatnią rundą sortowania.
   1. Używając hodowli nocnej z poprzedniej rundy sortowania (lub zamrożonego materiału komórkowego z tej rundy), zaszczepić 5 ml LB Cm₂₅ 100 μl komórek (rozcieńczenie 1:50). Inkubować w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przy 225 obr./min, aż kultura osiągnie OD₆₀₀ 0,5 - 0,55.
   2. Indukuj ekspresję peptydu za pomocą 0,04% w/v L-arabinozy, wstrząsając z prędkością 225 obr./min przez 45 minut w temperaturze 37°C. Umieść indukowane komórki na lodzie.
      UWAGA: Ta indukowana hodowla może być również wykorzystana do oceny powinowactwa i swoistości wiązania dla rundy sortowania, z której pochodzi, jak opisano w sekcji 2 poniżej.
   3. Odwirować 1 x 10⁸ komórek przy 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl PBS zawierającym połowę stężenia biotynylowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania, użytego w poprzedniej rundzie sortowania (dlatego 300 nM dla rundy 2, 150 nM dla rundy 3, i 75 nM dla rundy 4 od sugerowanego przez nas punktu wyjścia). Inkubować przez 45 minut na lodzie (lub w temperaturze 4 °C na platformie obrotowej).
   4. W międzyczasie umyj kulki pokryte streptawidyną (15 μl dla rundy 2, 8 μl dla rundy 3 i 4 μl dla rundy 4) w 1 ml PBS-B i wiruj przez 5 minut w temperaturze ≥ 5 000 x g (w temperaturze pokojowej). Umieść rurkę w laboratoryjnym magnetycznym separatorze cząstek i ostrożnie usuń supernatant, unikając osadu. Zawieś koraliki w 50 μl PBS-B.
   5. Po 45 minutowej inkubacji z tarczą opisaną w kroku 1.4.3, odwirować komórki w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl przemytych kulkach z ppkt 1.4.4. Utrzymać próbkę na lodzie i wykonać kroki 1.3.7 - 1.3.13 w celu uzyskania pozytywnego sortowania.
   6. Zaszczepić 5 ml kultury LB Cm₂₅ uzupełnionej 0,2% w/v D-glukozy z całą dodatnią, zawierającą kulki frakcją z sortu.
   7. Następnego dnia użyj nocnej hodowli, aby przygotować zapasy z zamrażarki w LB zawierające 15% glicerolu i/lub przejdź do następnej pozytywnej rundy sortowania, wracając do kroku 1.4.1.
      UWAGA: Użycie indukowanej hodowli z 1.4.2 do oceny powinowactwa i swoistości wiązania, jak opisano w sekcji 2 poniżej, może pomóc w ustaleniu, kiedy należy przerwać sortowanie. Jeśli dwie rundy sortowania z rzędu wykazują podobne powinowactwo wiązania lub późniejsza runda wykazuje zmniejszone powinowactwo wiązania dla interesującego obiektu, jest to pożądane miejsce do przerwania sortowania. Po ostatniej rundzie wróć do kroku 1.4.1, ale zatrzymaj się na 1.4.2.

2. Analiza FACS rund sortowania

1. Wykorzystując indukowane komórki z kroku 1.4.2 dla każdej rundy sortowania lub identycznych kultur, dodać 5 μl indukowanych komórek do 25 μl każdego z następujących przygotowanych roztworów do oceny wiązania (patrz również tabela materiałów): sam PBS; PBS z 150 nM YPet Mona (YPet ^12,13; kontrola pozytywna do ekspresji), jeśli jest dostępna; docelowe białko 900 nM sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak barwnik reagujący aminami z emisją/wzbudzeniem przy 493 nm⁄518 nm (Target-488); 900 nM celu(-y) białka reagującego krzyżowo, używanego do sortowania ujemnego, znakowanego tym samym barwnikiem fluorescencyjnym (białko reaktywne krzyżowo-488); i 900 nM streptawidyny-R-fikoerytryny (SAPE). Inkubować na lodzie przez 45 min.
   UWAGA: Jeśli kontynuujesz bezpośrednio od kroku 1.4.2, ten krok zawsze zostanie wykonany następnego dnia po zakończeniu biopanoramowania dla tej rundy, ponieważ wybrana biblioteka została wyhodowana przez noc, a następnie poddana subkulturze i indukowana następnego dnia. Można również stosować kultury wyhodowane i wyhodowane w podobny sposób z mrożonych okrągłych materiałów sortujących; W takim przypadku wszystkie rundy mogą być testowane i porównywane w jednym eksperymencie.
2. Odwirować komórki przy 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4°C. Usunąć supernatant i przechowywać próbki na lodzie.
   UWAGA: Granulki komórek można przechowywać na lodzie, dopóki wszystkie próbki nie będą gotowe do analizy.
3. Włącz przyrząd FACS, otwórz oprogramowanie, uruchom system i skalibruj przyrząd zgodnie z instrukcjami producenta ^43,44.
4. W oprogramowaniu FACS kliknij "Administrator" i kliknij żądany folder lub utwórz "Nowy folder". Kliknij ikonę "Nowy eksperyment" w lewym górnym rogu ekranu. Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę, aby "zmienić nazwę" eksperymentu. W ramach tego eksperymentu kliknij "Arkusze globalne".
5. Kliknij ikonę "Wykres punktowy", a następnie kliknij globalny arkusz kalkulacyjny, aby utworzyć ten wykres rozrzutu. Kliknij sam wykres z wykresem kropkowym, a następnie wybierz ikonę "Inspektora" w lewym górnym rogu ekranu i dostosuj osie do wyświetlania dwuwykładniczego, zaznaczając pola obok "Oś Y" i "Oś X" w otwartym oknie. Zamknij okno wyświetlania dwuwykładniczego, klikając X.
6. Utwórz "Nową probówkę", klikając ikonę w lewym górnym rogu ekranu i zmień nazwę próbki z odpowiednimi informacjami, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę próbki w sekcji "arkusz globalny" i wybierając "zmień nazwę". Rozwiń próbkę, klikając znak (+), a następnie kliknij dwukrotnie ikonę probówki, kliknij ją prawym przyciskiem myszy i ponownie wybierz "zmień nazwę", aby opisać próbkę.
7. Użyj tego wykresu punktowego z domyślnym SSC-A vs FSC-A, aby uruchomić ujemną próbkę kontrolną w samym PBS, klikając dwukrotnie tę probówkę lub wybierając strzałkę obok niej. Tuż przed uruchomieniem próbki ponownie zawiesić osad komórek w lodowatym buforze FACS o pojemności 500 μl i przenieść próbkę do probówki FACS (patrz tabela materiałów), dobrze mieszając przez pipetowanie i przesuwanie probówki. Umieść zawieszone komórki na probówce do wstrzykiwania próbki (SIT) urządzenia. Naciśnij "Acquire Data" z "Events to Display" na 30 000 - 50 000 i "Events to Record" na 10 000, natężenie przepływu na niskim poziomie (aby rozpocząć; zwiększyć w razie potrzeby) i wybrać "SIT flush".
   UWAGA: Odpowiednia prędkość (niska, średnia lub wysoka) to prędkość, przy której liczba zdarzeń/s wynosi w przybliżeniu od 200 do 2000. Użyj tego zakresu dla wszystkich kroków.
8. Podczas nabywania dostosuj próg napięcia lampy fotopowielacza (PMT), jeśli to konieczne, wybierając zakładkę "Próg". Kliknij i zmień "Wartość". Dostosuj napięcie dla rozproszenia do przodu i bocznego (FSC i SSC) tak, aby komórki kontroli ujemnej w samym PBS spadły nieco poniżej środka.
   UWAGA: Dodatkowe parametry (np. SSC) można dodać w zakładce "Próg" za pomocą ikony "dodaj". Zazwyczaj napięcia PMT od około 700 V do 1000 V zarówno dla SSC, jak i FSC działają dobrze dla E. coli.
9. Jeśli sample odczytuje prawidłowo, dostosuj natężenie przepływu, aby wyświetlić 200-2000 zdarzeń/s i naciśnij "Record Data". Po zakończeniu nagrywania wyjmij rurkę z SIT i umieść ją na lodzie. Wybierz ikonę "Brama wielokątna" i użyj myszki, aby narysować bramkę wokół większości populacji komórek na wykresie rozrzutu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykres punktowy i wybierz "Pokaż hierarchię populacji".
10. Użyj tej bramki "P1" jako rodzica, klikając na "P1" w hierarchii populacji. Utwórz nowy wykres punktowy zgodnie z krokiem 2.5. Kliknij prawym przyciskiem myszy każdą oś i zmień oś Y na FITC-A, a oś X na FSC-A. Bramka kontroli negatywnej (sam PBS) za pomocą ikony "bramki wielokątnej", z bramką tak ciasną, jak to możliwe, wokół górnej i lewej strony populacji.
    UWAGA: Dokładnie sprawdź hierarchię populacji, aby upewnić się, że bramka P1 jest bramką nadrzędną bramki P2. Jeśli tak nie jest, pojawi się w linii z bramką P1, a "Wszystkie zdarzenia" będą nadrzędne; Usuń bramę i utwórz ją ponownie, wykonując krok 2.10.
11. Wybierz "P2" w hierarchii populacji, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "odwróć bramę". Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres punktowy z bramką P2 i wybierz "Pokaż populacje". Wybierz populacje "P2" i "Nie P2" do wyświetlenia (mniej niż 1% populacji powinno znaleźć się poza bramą).
12. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres punktowy z bramką P2 i wybierz "Utwórz widok statystyk". Kliknij prawym przyciskiem myszy okno widoku statystyk i wybierz "Edytuj widok statystyk". Kliknij kartę "Populacje" i dodaj lub usuń populacje zgodnie z potrzebami, w tym populację nadrzędną, P1 (P2, a nie P2 powinny być już wyświetlane). Kliknij zakładkę "Statystyki" i dodaj "Mediana FITC-A" oraz wszelkie inne interesujące Cię statystyki. Zamknij okno, naciskając przycisk OK.
13. Utwórz podobny wykres kropkowy dla PE-A i FSC-A i bramki, używając samej próbki PBS (poprzednie wykresy można powielać i zmieniać). Użyj tego arkusza kalkulacyjnego, aby uruchomić wszystkie próbki (w tym komórki kontroli ujemnej inkubowane z każdym celem znakowanym fluoroforem) w ten sposób, rejestrując około 10 000 zdarzeń dla każdej z nich.
    UWAGA: Komórki, które wypadają poza bramkę po inkubacji z białkiem Target-488, kontrolą pozytywną YPet itp., są spoiwami z tym białkiem, a wartość z "Nie PX" (gdzie X to liczba populacji bramkowanej dla tego wykresu) powinna być zapisana jako % związana. W przypadku stosowania SAPE jako kontroli ujemnej należy użyć wykresu PE-A vs FSC-A. Należy również rejestrować medianę intensywności fluorescencji (MFI) P1, ponieważ daje to informacje wykraczające poza % wiązania, aby pokazać zakres wiązania w kategoriach względnych, i jest bardziej wiarygodne w obecności wartości odstających ⁴⁵. Medianę intensywności fluorescencji można znormalizować (nMFI) poprzez podzielenie MFI każdego peptydu przez MFI tylko rusztowania kontroli ujemnej (bez N-końcowego peptydu) lub klonu zawierającego sekwencję peptydową, która nie wiąże celu zainteresowania, po inkubacji z tym samym celem sprzężonym z tym samym fluoroforem ¹⁴. Jeśli te ujemne komórki kontrolne są niedostępne, nieindukowane komórki inkubowane z tym samym celem i znakowane tym samym fluoroforem mogą być również użyte do normalizacji.

3. Analiza sekwencji potencjalnych kandydatów i ocena powinowactwa wiązania

1. Oznaczanie sekwencji peptydów
   1. Wybierz i zsekwencjonuj dziesiątki lub setki kolonii bakteryjnych z ostatniej rundy (rund) biopanowania (zazwyczaj rundy 3 i/lub 4 są wystarczające ¹⁴).
   2. Przeanalizuj dane sekwencji za pomocą opracowanego przez nas pliku makra (zobacz informacje pomocnicze dotyczące kodu "Sub eCPX_Sequencing"), aby w szczególności przeanalizować sekwencje wygenerowane z biopanowania biblioteki wyświetlaczy bakteryjnych 15mer wymienionej w tabeli materiałów. Użyj arkusza kalkulacyjnego wymienionego w tabeli materiałów lub innego preferowanego kompatybilnego oprogramowania.
      UWAGA: W Internecie dostępnych jest wiele narzędzi, które mogą również pomóc w analizie sekwencji DNA ⁴⁷. Jeśli wolisz, użyj innej ustalonej metody analizy sekwencji i przejdź do kroku 3.1.3.
      1. Pobierz zestaw plików sekwencji (pliki .seq, dokumenty tekstowe również działają) i rozpakuj je do nowego folderu. W razie potrzeby przenieś lub skopiuj folder na dysk twardy komputera (w przeciwieństwie do folderu sieciowego), aby zwiększyć szybkość.
      2. Otwórz nowe okno arkusza kalkulacyjnego. Upewnij się, że włączyłeś makra i włączyłeś wszystkie funkcje, jeśli pojawią się te komunikaty.
         UWAGA: Poniższe kroki 3-6 należy wykonać tylko przy pierwszym użyciu makra. Aby przeprowadzić późniejszą analizę, po prostu "Uruchom makro", zaczynając od kroku 7.
      3. Skopiuj całą zawartość makra znajdującą się w pliku "Sub eCPX_Sequencing".
         UWAGA: Obecna wersja jest skonfigurowana z sekwencjami flankującymi dla 15-merowej biblioteki wymienionej w tabeli materiałów i będzie translować aminokwasy między nimi. Dodatkowe sekwencje można wprowadzić, kopiując 5-calowe sekwencje flankujące w kolumnie A i 3-calowe sekwencje flankujące w kolumnie B arkusza kalkulacyjnego, do 10 sekwencji dla każdej, przed uruchomieniem makra.
      4. W pustym pliku arkusza kalkulacyjnego wybierz zakładkę "Widok", a następnie kliknij dwukrotnie "Makra". Wybierz folder personal.xlb. Jeśli ta opcja jest niedostępna, najpierw nagraj makro, aby to się pojawiło.
      5. Kliknij "utwórz" lub "wejdź w", w zależności od tego, co można podświetlić. Wklej całe makro do modułu.
      6. Kliknij ikonę zapisywania lub przejdź do pliku, zapisz. Wyjdź z modułu. Jeśli pojawi się okno, naciśnij OK.
      7. Uruchom makro: Przejdź do folderu, w którym znajdują się pliki desired.seq. Kliknij pasek obok ikony folderu u góry, aby wyświetlić lokalizację folderu. Skopiuj go.
      8. Przejdź do nowego okna arkusza kalkulacyjnego. Wybierz kartę widoku, a następnie kliknij dwukrotnie makra. Wybierz "eCPX_Sequencing" z listy i kliknij "uruchom".
      9. W wyskakującym oknie wklej lokalizację pliku skopiowaną w kroku 7 i naciśnij Enter. Makro powinno zacząć przechodzić przez sekwencje i organizować je w tabele na różnych arkuszach.
      10. Użyj arkusza "Tabela podsumowania", aby określić, czy konieczne będzie sprawdzenie plików śledzenia pod kątem błędów i ręczne wprowadzenie poprawek (jeśli sekwencje zawierają "X" lub nie można ich przetłumaczyć).
          UWAGA: "Tabela podsumowująca" wyświetla translowane sekwencje peptydów, posortowane według sekwencji aminokwasów (od A do Z), chyba że błąd sekwencjonowania uniemożliwił translację. Litera "X" oznacza pojedynczy aminokwas, którego nie można było określić.
   3. Po przetłumaczeniu, uporządkowaniu sekwencji i poprawieniu wszelkich błędów sekwencjonowania, sprawdź posortowaną listę sekwencji peptydowych w arkuszu "Tabela podsumowania" pod kątem powtarzających się sekwencji.
   4. Hodować przez noc kultury dla sekwencjonowanych kolonii będących przedmiotem zainteresowania (w tym powtórzeń i/lub peptydów z zauważalnymi trendami co najmniej) w 5 ml LB Cm₂₅ w temperaturze 37°C, wstrząsając przy 225 obr./min, a następnego dnia przechowywać zapasy zamrażarki w LB zawierającym 15% glicerolu, jak w kroku 1.4.7. Zbadać peptydy z powtarzającymi się sekwencjami pod kątem powinowactwa wiązania i swoistości przy użyciu metod FACS opisanych w sekcji 3.3 i użyć formatu FASTA z listy sekwencji (tylko pełna lista i powtórzenia) w celu wyrównania sekwencji przy użyciu preferowanych programów do wyrównywania i analizy, jak w sekcji 3.2.
2. Wyrównanie sekwencji za pomocą Clustal Omega, Kalign i podobnych programów
   1. Skopiuj sekwencje w formacie FASTA z arkusza kalkulacyjnego makra lub w inny sposób utwórz listę plików FASTA z sekwencji, które mają zostać wyrównane (takich jak te z kroku 3.1.3).
      UWAGA: Kolumna A zawiera pliki FASTA w kolejności numerycznej według "Seq #", podczas gdy kolumna B wyświetla je posortowane według "sekwencji AA" z arkusza "Tabela podsumowania". Lista sekwencji peptydowych posortowanych według sekwencji aminokwasów wyświetli na górze bezużyteczne sekwencje, takie jak pusty wektor (jako "# Pusty") i te sekwencje, w których nie znaleziono kryteriów wyszukiwania 5' lub 3' (jako "# Wartość"). Ta funkcja pozwala na łatwą aktualizację lub usunięcie tych sekwencji z analizy.
   2. Otwórz oprogramowanie Clustal Omega⁴⁸ lub Kalign⁴⁹, przechodząc na stronę internetową ^50,51, lub użyj innego preferowanego oprogramowania do wyrównania sekwencji. Skopiuj i wklej listę sekwencji FASTA i wprowadź ją w polu poniżej "sekwencje w dowolnym obsługiwanym formacie". Zmień "karę za otwarcie luki" na 30 w sekcji "więcej opcji" w Kalign (nie jest to możliwe w Clustal Omega), ale poza tym zachowaj ustawienia domyślne przed kliknięciem "prześlij".
   3. Analizuj wyrównanie sekwencji za pomocą oprogramowania Jalview ^52,53 bezpośrednio w oprogramowaniu online Clustal Omega i Kalign, wybierając zakładkę "podsumowanie wyników" nad wyrównaniem, a następnie klikając ikonę "Jalview".
      UWAGA: Jeśli jest to preferowane lub w celu analizy wyrównań sekwencji generowanych przez alternatywne programy, pobierz oprogramowanie ⁵⁴ oddzielnie, a następnie skopiuj i wklej wyrównanie do okna analizy, które zostanie otwarte po kliknięciu "Plik", "Wyrównanie wejściowe" i "z pola tekstowego". Zapewnia to sposób łatwego określenia, czy sekwencja konsensusu jest obecna w wyrównaniu sekwencji wejściowej.
3. Porównywanie powinowactwa i swoistości wiązania przy użyciu FACS
   1. Zaszczepić 5 ml LB Cm₂₅ uzupełnionego 0,2% w/v D-glukozy z każdym indywidualnym izolatem będącym przedmiotem zainteresowania (z kroku 3.1.4 i/lub koloniami będącymi przedmiotem zainteresowania na podstawie dalszej analizy sekwencji w sekcji 3.2 itd.) i odpowiednią kontrolą ujemną (tylko rusztowanie wyświetlacza lub peptyd, który nie wiąże celu, jak opisano w uwadze do kroku 2.13). Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
   2. Użyć kultur nocnych do zaszczepienia 3 ml LB Cm₂₅ 60 μl komórek (rozcieńczenie 1:50). Inkubować w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przy 225 obr./min, aż kultura osiągnie OD₆₀₀ 0,5 - 0,55. Indukuj ekspresję peptydu za pomocą 0,04% w/v L-arabinozy plus 2 mM EDTA (dla ułatwienia wyświetlania peptydów ⁴²), wytrząsając z prędkością 225 obr./min przez 45 minut w temperaturze 37°C.
   3. Umieść indukowane kultury na lodzie. Dla każdego izolatu dodać 5 μl komórek do 25 μl PBS samego lub PBS zawierającego: 150 nM YPet ^12,13 (kontrola dodatnia do ekspresji), jeśli jest dostępna; 250 nM Cel-488; 250 nM białka reagujące krzyżowo-488; i 250 nM SAPE (więcej informacji znajduje się w ppkt 2.1). Inkubować na lodzie przez 45 minut.
   4. Odwirować komórki przy 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4°C. Ostrożnie usunąć supernatant, pobierając ciecz z przeciwnej strony osadu. Przechowuj granulki komórkowe na lodzie, aż wszystkie próbki będą gotowe do analizy.
   5. Ponownie zawiesić każdą komórkę w 500 μl lodowatego buforu FACS, dobrze mieszając przez pipetowanie i przesuwanie probówki, tuż przed odczytem za pomocą cytometru przepływowego (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Patrz uwagi do kroku 2.13 w celu uzyskania dalszych wyjaśnień dotyczących bramkowania i obliczania nMFI w celu porównania powinowactwa i swoistości wiązania. Niewiążące lub niespecyficzne spoiwa mogą być teraz usunięte z dalszej analizy, a spoiwa o najwyższym powinowactwie powinny zostać ponownie ocenione przez wyrównanie sekwencji zgodnie z sekcją 3.2 w celu poszukiwania dalszych trendów, które mogły zostać pominięte w początkowej sekwencjonowanej populacji. Sekcje 3.2 i 3.3 mogą być powtarzane w razie potrzeby w miarę odnotowywania nowych tendencji i sekwencji konsensusu. Analiza ta może obejmować więcej losowych sekwencji, jeśli trendy nie są widoczne.

Wyniki

Dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego sortowania komórek aktywowanego magnetycznie (autoMCS) zamiast manualnego sortowania magnetycznego, liczba fałszywie negatywnych kandydatów jest znacznie mniejsza podczas biopanningu bibliotek bakterii display ^9,14. W razie potrzeby można dodać etapy sortowania negatywnego, aby zmniejszyć liczbę niespecyficznych binderów do interesującego celu; sugeruje się, aby w pierwszej kolejności przeprowadzić co najmniej jedną selekcję negatywną przeciwko samym kuleczkom magnetycznymi. Ta selekcja negatywna przeciwko kuleczkom magnetycznym została przeprowadzona przed czterema rundami biopanningu wybranej biblioteki bakterii display w celu wyłonienia binderów antygenu ochronnego (PA), jak pokazano na Rysunku 2, oraz przed dodatkową selekcją negatywną przeciwko rivax i czterema rundami selekcji pozytywnej dla abrax, jak pokazano na Rysunku 3. Kuleczki użyte w tej procedurze są sprzężone ze streptawidyną w celu wychwytu biotynylowanych białek, dlatego problemem może być niezamierzona izolacja peptydów wiążących samą streptawidynę, co monitoruje się za pomocą FACS z zastosowaniem streptawidyny sprzężonej z fykoerytryną (Rysunek 3, SAPE). W przypadku oceny wiązania z białkiem docelowym należy co najmniej sprawdzić wiązanie ze streptawidyną dla każdego obiecującego kandydata. Zarówno procent wiązania, jak i nMFI dla SAPE powinny przyjmować niskie wartości we wszystkich rundach sortowania. Poziom wiązania ze streptawidyną może nieznacznie wzrastać z każdą rundą sortowania, co miało miejsce na Rysunku 3, ponieważ populacja jest wielokrotnie eksponowana na kuleczki magnetyczne pokryte streptawidyną po każdej rundzie. Jeśli poziom tła wiązania ze streptawidyną stanie się problematyczny dla dalszych analiz, można przeprowadzić dodatkowe sortowanie negatywne przeciwko kuleczkom magnetycznym po rundzie sortowania pozytywnego, w której wzrosła populacja wiążąca streptawidynę, aby ograniczyć późniejsze przesiewanie fałszywie pozytywnych wyników. Zaleca się dodatkowe sortowanie negatywne przeciwko białkom lub materiałom, które mogłyby specyficznie zakłócać późniejsze zastosowanie peptydu w konkretnym celu lub które, ze względu na podobieństwo strukturalne i/lub sekwencyjne, mogą wykazywać reaktywność krzyżową z odczynnikami powinowactwa do celu. Przykładem jest sortowanie negatywne przeciwko rivax przed izolacją peptydów wiążących abrax, ze względu na podobieństwo strukturalne i homologię sekwencji tych dwóch białek ^1,15. Ponownie, reaktywność krzyżową względem białek użytych w etapach sortowania negatywnego można monitorować podczas analizy rund sortowania za pomocą FACS (Rysunek 3, Rivax-488). W optymalnym scenariuszu procent wiązania i nMFI są niskie, tak jak w tym przykładzie.

W przypadku dostępności stały peptyd kontrolny dodatni, taki jak peptyd P2X na C-końcu rusztowania ekspozycyjnego wytwarzanego przez bibliotekę bakteryjną użytą w reprezentatywnych wynikach przedstawionych tutaj, może pomóc ustalić, czy brak powinowactwa wiązania w analizie FACS wynika z braku ekspresji samego rusztowania ekspozycyjnego, a nie z braku powinowactwa peptydów do celu. Na Rysunku 2 oraz Rysunku 3 monitoruje się wiązanie YPet Mona do tego peptydu P2X, co wykazuje, że we wczesnych rundach sortowania rusztowanie wykazuje słabą ekspresję. Jest to prawdopodobnie spowodowane przede wszystkim wysoką częstotliwością kodonów stop w peptydach N-końcowych w bibliotece losowej, co oznacza, że samo rusztowanie nie zostało wytworzone. Mogą dodatkowo wpływać inne czynniki, takie jak obecność peptydów o nieoczekiwanych efektach toksycznych dla E. coli lub obniżone tempo wzrostu bądź ekspozycji peptydów z innych powodów (np. mutacje w genomie bakteryjnym). Dodanie EDTA podczas indukcji może poprawić ekspresję w tych wczesnych rundach sortowania ⁴², jednak nie zostało to jeszcze przetestowane. Wiązanie do YPet Mona w każdej populacji biopanningu ulega znacznemu poprawieniu do 3. rundy. Porównując Rysunek 2 z Rysunkiem 3, widać również, że poziom ekspresji można poprawić poprzez wydłużenie czasu indukcji do 90 min (jak na Rysunku 2, YPet Mona) zamiast 45 min (jak na Rysunku 3, YPet Mona), choć 45 min jest zazwyczaj wystarczające. Należy zauważyć, że nMFI dla YPet Mona jest znormalizowane do poziomu wiązania YPet Mona w komórkach kontrolnych ujemnych, zatem wartości bliskie 1,0 są typowe, jeśli poziom ekspresji jest akceptowalny. Normalizacja MFI YPet Mona do MFI samego PBS z tej samej próbki jest również poprawnym sposobem porównywania względnych poziomów ekspresji, ale daje znacznie wyższe wartości (porównać Rysunek 2 oraz Rysunek 3 z wynikami uzyskanymi przez Sarkes et al. 2015 ¹⁵).

Wzbogacenie biblioteki o peptydy wiążące specyficzny wybrany cel zazwyczaj osiąga się w ciągu trzech rund pozytywnego sortowania, jednak kontynuacja do czwartej rundy sortowania może być korzystna, jak pokazano na Rysunku 2 i Rysunku 3. Tutaj procent związanych komórek oraz nMFI nadal rosną od rundy 3 do rundy 4 dla obu przykładowych celów, PA i abrax, które zostały zaznaczone czerwonymi ramkami odpowiednio na Rysunku 2 i Rysunku 3. Sekwencje peptydów o najwyższym powinowactwie mogą być już obecne w rundzie 3, ale prawdopodobnie ulegną dalszemu wzbogaceniu również w rundzie 4, co wspomaga selekcję potencjalnych kandydatów ¹⁴. Analiza sekwencji z rundy 4 ma tendencję do ujawniania powtarzających się sekwencji, a sekwencje te stanowią doskonały punkt wyjścia do analizy powinowactwa i specyficzności oraz wyznaczania sekwencji konsensusowej. Makro eCPX_Sequencing, dostarczone jako uzupełnienie do niniejszego opracowania, pomaga usprawnić tę wstępną analizę, co pokazano na Rysunku 4. Zaczynając od folderu z plikami .seq lub plikami tekstowymi, sekwencja DNA znajdująca się pomiędzy wybranymi sekwencjami 5' i 3' jest tłumaczona, organizowana według sekwencji aminokwasowej i analizowana pod kątem liczby poszczególnych reszt aminokwasowych w każdym peptydzie. Posortowana lista wyizolowanych sekwencji peptydowych, przedstawiona na zrzucie ekranu arkusza Summary Table na Rysunku 4, może posłużyć do łatwego określenia, które sekwencje się powtarzają i z jaką częstotliwością. Komórki w tym arkuszu zawierające powtarzające się sekwencje są obramowane różnymi kolorami dla łatwiejszej analizy. Zaleca się sprawdzenie tych powtarzających się sekwencji pod kątem sekwencji konsensusowych i innych trendów. Pomaga w tym oprogramowanie do dopasowania sekwencji, takie jak Kalign i Clustal Omega; analizę można przeprowadzić na całym wyniku sekwencjonowania (uwzględniając zarówno sekwencje powtarzające się, jak i niepowtarzające się z częstotliwością ich występowania) oraz na wyselekcjonowanej liście powtarzających się sekwencji (z ich częstotliwością względną lub bez niej). Reprezentatywne wyniki dla powtarzających się sekwencji PA i abrax, bez uwzględnienia częstotliwości, przedstawiono odpowiednio na Rysunku 5A i 5B. Należy zauważyć, że na Rysunku 5A dla celu PA kilka poszczególnych powtarzających się sekwencji samo w sobie zawiera sekwencję konsensusową WFCFTC (lub sekwencję podobną), podkreśloną na czerwono, która została wyznaczona poprzez zastosowanie analizy w oprogramowaniu Jalview do dopasowania sekwencji Kalign dla sekwencji powtarzających się. Konsensus ten, jako WXCFTC, został wcześniej określony jako konsensus wiążący PA, co daje pewność co do metody sortowania ⁹. Na Rysunku 5B, gdzie w ten sam sposób analizowano sekwencje powtarzające się dla celu abrax, wynik był zupełnie inny. Po pierwsze, w czwartej rundzie biopanningu dla wiążących abrax powtórzyło się tylko pięć sekwencji, w przeciwieństwie do piętnastu sekwencji powtarzających się wyizolowanych w czwartej rundzie biopanningu dla wiążących PA (choć w przypadku PA zsekwencjonowano o 44% więcej kolonii). Po drugie, żadna z pięciu powtarzających się sekwencji nie zawierała najbardziej obiecującej sekwencji „konsensusowej” (FWAWF, podkreślonej na fioletowo), choć kandydat AX-A15 zawierał sekwencję najlepiej pasującą (FWDTWF). Dalsza analiza, w tym wyznaczenie powinowactwa wiązania i specyficzności, pomogła ustalić konsensus FWDTWF wyznaczony z pięciu najlepszych kandydatów do wiązania abrax na Rysunku 5C, jak wyjaśniono poniżej.

Reprezentatywną kolonię z każdej powtarzającej się sekwencji można poddać dalszej analizie w celu określenia powinowactwa i swoistości wiązania do komórek z wykorzystaniem metody FACS, zgodnie z opisem w Rycina 6A dla powtarzających się sekwencji z biopanningu w celu wyłonienia peptydów wiążących abrax. Wyraźnie widać tutaj, że wszystkie pięć powtarzających się sekwencji wykazuje wyższe powinowactwo do abrax, docelowego celu, niż do rivax, białka o podobnej strukturze wykorzystanego do sortowania negatywnego, lub do streptawidyny, która jest obecna podczas sortowania ze względu na zastosowanie kulek magnetycznych w procesie biopanningu. Jest to zgodne z dotychczasowymi, obiecującymi wynikami dotyczącymi powinowactwa i specyficzności rund sortowania przedstawionymi w Rycina 3, gdzie wyraźnie widać, że wzbogacenie o wiązanie z zamierzonym celem, abrax, wzrasta z każdą rundą biopanningu, podczas gdy powinowactwo do podobnego białka, rivax, nie wykazuje takiej tendencji. Jednakże, stosując wyłącznie sekwencje powtarzające się z czwartej rundy, nie udało się wyznaczyć satysfakcjonującej sekwencji konsensusowej dla sortowania abrax (Rycina 5B or powyższą dyskusję). Jednakże, wracając do 100 sekwencjonowanych kolonii z rundy 4, podczas wizualnego poszukiwania sekwencji podobnych do najlepszego dopasowania dla przewidywanego konsensusu zauważono, że jeden dodatkowy kandydat, AX-A12, zawierał sekwencję FWDTWF odnotowaną w izolacie AX-A15, a inny kandydat, AX-A14, zawierał podobną sekwencję, DWNTWF. Te oraz inne sekwencje, które albo wykazywały podobieństwo do sekwencji powtarzalnych, albo wykazywały podobieństwo do innych sekwencji niepowtarzalnych lub zostały wybrane losowo, zostały poddane analizie metodą FACS w celu określenia powinowactwa i specyficzności wiązania. Przebadane próbki zostały uszeregowane w Sarkes i wsp. 2016 ¹ a 5 najlepszych binderów z tej analizy przedstawiono w Rysunek 6Bz sekwencją konsensusową określoną jako FWDTWF, przedstawioną w Rycina 5C.

Podobna analiza powinowactwa wiązania dla powtarzających się sekwencji peptydowych w 4. rundzie biopanningu w celu znalezienia peptydów rozpoznających cel PA wykazała, że najlepsze wiążące cząsteczki, uszeregowane według stosunku PA-488 nMFI:SAPE nMFI, zawierały konsensus WXCFTC lub sekwencję podobną (Tabela 1). Na podstawie tego stosunku sekwencje podzieliły się na te, które zawierały konsensus, oraz te, które go nie posiadały. Główne kandydaty, wszystkie zawierające sekwencje powiązane z konsensusem, zostały poddane analizie analogicznie do metod opisanych powyżej dla abrax na Rysunku 6, zgodnie z opracowaniem Sarkes et al. 2015 ¹⁴. Wyniki te pokazują, że w przypadku niektórych celów analiza peptydów z powtarzającymi się sekwencjami może być wystarczająca do uzyskania wiążących cząsteczek o znacznym powinowactwie i swoistości wobec wybranego celu oraz do wyznaczenia sekwencji konsensusowej, która sama w sobie może być wystarczająca do wiązania. Należy jednak zauważyć, że liczba powtórzeń nie musi odzwierciedlać względnego powinowactwa wiązania do celu (Tabela 1). Gdy sama analiza powtarzających się sekwencji nie pozwala na wyznaczenie wzorca, pomocne jest naprzemienne stosowanie analizy sekwencji i analizy wiązania w celu zawężenia puli kandydatów i ponownego zbadania tendencji wśród tych z wyższym powinowactwem. Nawet jeśli po analizie samych powtarzających się sekwencji zaobserwowano pewną tendencję, dodatkowe sekwencje niepowtarzalne mogą wykazywać te same lub inne tendencje po dalszych badaniach.

Rysunek 1: Schemat protokołu biopanningu dla bibliotek bakteryjnego displayu. Jak pokazano tutaj, biopanning bibliotek bakteryjnego displayu jest procesem cyklicznym. Każda komórka w bibliotece bakteryjnego displayu (patrz tabela materiałów) zawiera plazmidowe DNA, które jest utrzymywane tak długo, jak komórki są hodowane w obecności antybiotyku, na który plazmid zawiera gen oporności (w tym przypadku chloramphenicol). Każdy plazmid koduje również białko rusztowujące (scaffold), które eksponuje losowy peptyd na zewnątrz komórki. Ponieważ każda komórka powinna zawierać tylko jedną sekwencję plazmidowego DNA, każda komórka powinna eksponować tylko jeden peptyd w wielu miejscach w obrębie błony komórkowej. W zależności od poziomu różnorodności biblioteki na początku biopanningu oraz po każdej rundzie sortowania, sekwencja DNA może być lub nie być unikalna dla poszczególnych komórek. Biopanning rozpoczyna się od hodowli i indukcji biblioteki komórek w celu eksponowania poszczególnych peptydów na ich zewnętrznej błonie. Peptydy te mogą następnie wchodzić w interakcje z białkiem docelowym (które jest biotynilowane lub w inny sposób znakowane w celu przechwycenia). W przypadku magnetycznego sortowania komórek (MCS), niezwiązane białko jest usuwane, a komórki inkubowane z kuleczkami magnetycznymi pokrytymi białkiem wychwytującym (w tym przykładzie streptawidyną, która silnie oddziałuje z biotyną). Następnie całą kulturę poddaje się działaniu magnesu, aby oddzielić komórki związane od niezwiązanych. W celu separacji komórek zaleca się stosowanie zautomatyzowanego urządzenia do sortowania magnetycznego, aby zredukować liczbę wyników fałszywie dodatnich. Przedstawiono tutaj sortowanie pozytywne, w którym zachowywane są komórki związane z kuleczkami magnetycznymi i eluowane wspólnie z nimi. W przypadku sortowania negatywnego, które zazwyczaj wykonujemy na wstępie, proces jest taki sam, z wyjątkiem tego, że zamiast tego zachowywane są komórki wypłukane z kuleczek magnetycznych. Interesująca frakcja biblioteki, związana (sortowanie pozytywne) lub niezwiązana (sortowanie negatywne), jest hodowana przez noc i wykorzystywana w kolejnej rundzie sortowania. Każda kolejna runda pozytywnego biopanningu wymaga zmniejszenia stężenia celu i objętości kuleczek w celu zwiększenia rygorystyczności. Po każdej rundzie biopanningu powinowactwo i specyficzność peptydów do białka docelowego są oceniane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), co pomaga określić moment zakończenia biopanningu i rozpoczęcia badania poszczególnych kandydatów. W razie potrzeby przeprowadzane są sekwencjonowanie DNA i analiza sekwencji peptydów. Kroki analityczne te mogą same w sobie stanowić proces cykliczny, szczególnie w celu ujawnienia trendów w poszczególnych izolatach po ostatniej rundzie biopanningu. Na tym etapie trendy sekwencji peptydów i/lub konsensus są korelowane z powinowactwem wiązania i specyficznością. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykładowe dane z analizy FACS rund sortowania: cel PA. Powinowactwo wiązania określone za pomocą FACS przedstawiono po 4 rundach biopanningu (sortowanie pozytywne) wybranej biblioteki bakterii eksponujących peptydy wiążące się z celem, antygenem ochronnym (PA). Zostało to przeprowadzone po uprzednim wykonaniu sortowania negatywnego przeciwko magnetycznym kulkom pokrytym streptawidyną. W celu oceny wiązania komórki indukowano 0,4% L-arabinozą przez 90 min przed inkubacją z roztworami celu i kontrolnymi oraz analizą FACS. Analiza powinowactwa wiązania dla zamierzonego celu jest obramowana na czerwono. Przedstawiono tutaj wykresy rozrzutu FITC-A względem FSC-A oraz wartości procenta komórek związanych (w porównaniu do bramkowanej kontroli negatywnej inkubowanej z samym PBS) i znormalizowaną medianę intensywności fluorescencji (nMFI, w porównaniu do kontroli negatywnej bez peptydów inkubowanej z tym samym białkiem znakowanym fluorophorem) indukowanych komórek, które inkubowano przez 45 min z: samym buforem PBS, 150 nM YPet Mona (kontrola pozytywna dla ekspresji peptydów) lub 250 nM PA-488 (znakowany cel). Należy zwrócić uwagę na zwiększające się wzbogacenie powinowactwa wiązania do interesującego celu po każdej rundzie biopanningu. W przeciwieństwie do Rysunku 3, wszystkie separacje komórek autoMCS zostały wykonane przy użyciu programu Posselds. Część tych danych można również zwizualizować na wykresach rozrzutu FITC-H względem FSC-H w pracy Sarkes et al. 2015 ¹⁴ w celu porównania z przedstawionymi tutaj wykresami FITC-A względem FSC-A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykładowe dane z analizy FACS dla rund sortowania: cel abrax. Podobnie jak na Rysunku 2, przedstawiono tutaj porównawcze powinowactwo wiązania dla pełnego eksperymentu biopanningu, określone za pomocą FACS. Biblioteka bakterii display poddano negatywnemu sortowaniu przeciwko magnetycznym koralikom pokrytym streptawidyną, jak na Rysunku 2, a następnie dodatkowej rundzie negatywnego sortowania przeciwko białku homologicznemu o podobnej strukturze i funkcji, rivax, przed przeprowadzeniem 4 rund pozytywnego biopanningu dla peptydów wiążących się z zamierzonym celem, abrax. W celu oceny wiązania komórki indukowano 0,4% L-arabinozą przez 45 min przed wiązaniem z celem, kontrolą pozytywną i kontrolami negatywnymi oraz odczytem na FACS. Powinowactwo wiązania dla zamierzonego celu zaznaczono czerwoną ramką. Przedstawiono tutaj wykresy rozrzutu FITC-A vs FSC-A (lub PE-A vs FSC-H w przypadku SAPE) oraz wartości procentowe związanych komórek (w porównaniu do bramkowanej kontroli negatywnej inkubowanej z samym PBS) i nMFI indukowanych komórek, które inkubowano przez 45 min z: samym buforem PBS, 150 nM YPet Mona (kontrola pozytywna ekspresji peptydów), 250 nM Abrax-488 (znakowane białko docelowe), 250 nM Rivax-488 (znakowane potencjalne białko docelowe reagujące krzyżowo) lub 250 nM SAPE (kontrola negatywna dla bezpośredniego wiązania z magnetycznymi koralikami pokrytymi streptawidyną). Zwróć uwagę na rosnące wzbogacenie powinowactwa wiązania do interesującego nas celu, abrax, po każdej rundzie biopanningu oraz minimalne powinowactwo wiązania dla strukturalnie podobnego białka, rivax. W przeciwieństwie do Rysunku 2, pierwsza runda pozytywnego biopanningu została wykonana przy użyciu programu autoMCS Posselds, natomiast kolejne rundy sortowania zrealizowano za pomocą programu Posseld, zgodnie z sugestiami dotyczącymi biopanningu w niniejszym manuskrypcie. Dane te można również zwizualizować na wykresach rozrzutu FITC-H vs FSC-H w pracy Sarkes et al. 2016 ¹⁵ w celu porównania z przedstawionymi tutaj wykresami FITC-A vs FSC-A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Przykład wyniku analizy sekwencji z wykorzystaniem makra „eCPX_Sequencing”. Przedstawiono zrzut ekranu 48 zsekwencjonowanych kolonii z 4. rundy biopanningu wybranej biblioteki bakterii display w celu wyłonienia binderów PA metodą Posselds. Pokazany jest arkusz „Summary Table”. Należy zauważyć, że kolonie zostały ponumerowane w kolejności alfabetycznej nazw plików przypisanych podczas procesu sekwencjonowania, a ramki otaczające sekwencje powtarzające się co najmniej raz są zaznaczone różnymi kolorami w celu ułatwienia analizy danych. Makro eCPX_Sequencing jest dostarczone jako uzupełniający plik z kodem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Dopasowanie sekwencji i wyznaczenie konsensusu dla dwóch różnych białek docelowych. Wszystkie przedstawione tutaj obrazy zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania Jalview z kolorowaniem Clustal_X po dopasowaniu sekwencji za pomocą oprogramowania do analizy online Kalign ⁵¹. A) Dopasowanie powtarzających się sekwencji z 4. rundy biopanningu PA (odpowiada Tabeli 1). B) Dopasowanie powtarzających się sekwencji z 4. rundy biopanningu abrax (odpowiada Rysunkowi 6A). C) Dopasowanie 5 najlepszych kandydatów z 4. rundy biopanningu abrax, wyznaczonych na podstawie analizy FACS poszczególnych kandydatów (odpowiada Rysunkowi 6B). Czerwona linia podkreśla sekwencję konsensusu w A i C, natomiast fioletowa linia w B podkreśla prekursor sekwencji konsensusu wyznaczonej dla wiązania abrax przy analizie wyłącznie powtarzających się sekwencji, co podkreśla potencjalną konieczność przetestowania powinowactwa wiązania za pomocą FACS przed wyznaczeniem konsensusu w niektórych przypadkach. Podobne dopasowania wygenerowane za pomocą innego oprogramowania analitycznego można znaleźć w pracy Sarkes et al. 2015 ¹⁴ oraz Sarkes et al. 2016 ¹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykładowe powinowactwo i specyficzność wiązania poszczególnych kandydatów analizowanych za pomocą FACS. Przedstawiono znormalizowaną medianę intensywności fluorescencji (nMFI) wyznaczoną metodą FACS dla A) sekwencji powtarzalnych oraz B) 5 najlepszych kandydatów, wybranych na podstawie porównawczego powinowactwa wiązania do celu, abrax, z 4. rundy biopanningu. Dane przedstawiają średnią (słupki) i odchylenie standardowe (słupki błędów) z trzech niezależnych eksperymentów powtórzonych. Należy zauważyć, że wszystkie przedstawione kandydaty są wysoce specyficzne dla abrax (abrax-488, zielone słupki) w porównaniu do białka o podobnej strukturze, rivax (Rivax-488, czerwone słupki), oraz negatywnej kontroli streptawidyny (SAPE, czarne słupki). Chociaż dwie z sekwencji powtarzalnych w A (AX-07 i AX-15) znalazły się również wśród 5 najlepszych kandydatów w B, porównanie wyników w A i B wykazuje, że analiza samych sekwencji powtarzalnych może być niewystarczająca do wyizolowania peptydów o najwyższym powinowactwie. Dane przedstawione tutaj zostały zaadaptowane z pracy Sarkes et al. 2016 ¹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Stosunek wiązania specyficznego do wiązania niespecyficznego dla poszczególnych kandydackich sekwencji powtórzeń. W tym przykładzie przedstawiono liczbę sekwencji powtórzonych oraz stosunek nMFI dla PA (celu) do nMFI dla SAPE (kontroli negatywnej) dla kandydackich sekwencji powtórzonych z czwartej rundy biopanningu PA. Dane te posortowano według względnego stosunku nMFI PA do nMFI SAPE i przeanalizowano pod kątem obecności znanej sekwencji konsensus WXCFTC lub sekwencji podobnej, która została zaznaczona pogrubieniem i podkreśleniem. Należy zauważyć, że sekwencje organizują się w taki sposób, iż kandydaci posiadający sekwencję konsensus wykazują najwyższy stosunek nMFI PA do nMFI SAPE, a zatem oddziałują bardziej specyficznie z celem. Przedstawione wyniki pochodzą z pojedynczego eksperymentu FACS. Peptydy o najniższym powinowactwie do celu wykluczono z dodatkowych powtórzeń i analiz opublikowanych w pracy Sarkes. i wsp. 2015 ¹⁴.

Plik uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Biopanowanie bibliotek ekspozycyjnych bakterii okazało się udanym podejściem do izolacji odczynników powinowactwa, a peptydy stanowią użyteczną alternatywę dla przeciwciał do rozpoznawania, gdy wymagane są określone kryteria, takie jak stabilność w ekstremalnych warunkach. Biopanoramacja tych bibliotek została usprawniona przy użyciu opisanych tutaj metod autoMCS, a dostępna na rynku platforma autoMCS rozszerza tę technologię na znacznie szersze grono odbiorców. W porównaniu z tradycyjnymi naprzemiennymi metodami sortowania MCS/FACS dla bakteryjnych bibliotek wyświetlania, metody autoMCS są tańsze, ponieważ nie wymagają inwestycji w droższy przyrząd FACS zdolny do sortowania i izolowania związanych komórek, a nie w typ cytometru przepływowego, który jest w stanie przeprowadzić tylko analizę ¹⁴. Kluczowe kroki dla udanego biopanowania przez autoMCS obejmują wybór programu separacji, sortowanie ujemne w stosunku do potencjalnych reagentów krzyżowych w celu zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich, monitorowanie wzbogacania biblioteki za pomocą FACS w celu określenia, kiedy należy przerwać biopanoramację, oraz inteligentną analizę puli kandydatów w celu uniknięcia kłopotliwych badań przesiewowych setek kandydatów.

Przykłady opisane w niniejszym dokumencie pokazują udane biopanowanie wybranej biblioteki wyświetlania bakterii dla dwóch oddzielnych celów, PA i abrax, chociaż z nieco innymi strategiami analizy ze względu na różnice w sekwencjach peptydowych dla każdej puli kandydatów po czterech rundach biopanowania. PA był prostszym przypadkiem, a analiza sekwencji wykazała wyraźne trendy w sekwencjach peptydowych, które powtarzały się co najmniej raz na 144 kolonie. Samo to wystarczyło do określenia sekwencji konsensusu dla celu PA, a te kolonie, które zawierały konsensus lub podobną sekwencję, były najlepszymi kandydatami pod względem stosunku wiązania do PA w porównaniu z wiązaniem z kontrolą ujemną streptawidyny. Jednak nie zawsze tak będzie. W przypadku celu Abrax sekwencjonowanie 100 kolonii doprowadziło do pięciu powtarzających się sekwencji, ale tendencja w tych sekwencjach była mniej wyraźna, poza tendencją do zawierania reszt aminokwasów aromatycznych i kwasu asparaginowego lub asparaginy. Przewidywany "konsensus" tylko na podstawie powtarzających się sekwencji mógł zostać wyprodukowany i przetestowany pod kątem powinowactwa do abraxu, ale ponieważ żadne sekwencje rodzicielskie nie zawierały dokładnie tej sekwencji konsensusu, wróciliśmy do listy sekwencjonowanych kolonii i zaobserwowaliśmy, że inni kandydaci, którzy mieli więcej wspólnych trendów. W rzeczywistości dwie kolonie zawierały podobną sekwencję do "konsensusu" z samych powtórzeń (FWDTWF zamiast FWAWF), które miały ten sam trend reszt tryptofanu, fenyloalaniny i kwasu asparaginowego, ale z różnymi odstępami. Jeden z tych peptydów był powtarzającą się sekwencją, drugi nie. Te dwie sekwencje, wraz z trzecią sekwencją zawierającą podobny wariant, znalazły się wśród 5 najlepszych testowanych spoiw pod względem powinowactwa do abraxu. Górny segregator ogólny, AX-A05, również wykazywał podobne trendy. Wyniki uzyskane w przypadku abrax pokazują, że w zależności od wybranego celu czasami wymagane będzie podejście, w którym analiza sekwencji przebiega kilkakrotnie naprzemiennie między analizą powinowactwa i swoistości. Wyniki dla celu abrax pokazują również poziom swoistości, który można osiągnąć w przypadku bardzo podobnego białka (rivax ^1,15).

Programy autoMCS wybrane do naszych badań to Posselds i Posseld, które służą do pozytywnej selekcji znakowanych komórek docelowych z niską częstotliwością, mniej niż 5% początkowej populacji. W obu przypadkach komórki przechodzą przez dwie kolumny magnetyczne. Jednak w przypadku programu Posseldsa komórki przechodzą wolniej przez pierwszą kolumnę, aby wydłużyć czas ekspozycji ⁴¹. Oprócz opisów programów podanych przez producenta komercyjnego urządzenia autoMCS (patrz tabela materiałów) ⁴¹, programy te zostały wybrane po wstępnym porównaniu kilku potencjalnych programów. Porównano zdolność każdego programu do unikania wyciągania wyników fałszywie dodatnich z jednorodnej hodowli ujemnych komórek kontrolnych oraz do skutecznego izolowania znanego spoiwa do celu zainteresowania z mieszanej kultury zawierającej ujemne komórki kontrolne wzbogacone o malejący procent znanego składnika wiążącego. W przypadku znacznego odchylenia od opisywanych tutaj aplikacji, podobne porównanie może być pomocne w doborze programu dla nowej aplikacji. Jednak wcześniej opublikowane wyniki porównujące te dwa programy (Posseld i Posselds) do izolacji odczynników powinowactwa peptydów do PA wykazały, że użycie któregokolwiek z tych programów dla wszystkich czterech rund biopanowania doprowadziło do izolacji peptydów o podobnym powinowactwie i swoistości do PA oraz określenia konsensusu WXCFTC. Główne różnice polegały na tym, że Posseld, ze swoim szybszym przepływem, sortował szybciej, a powinowactwo wiązania do celu było zatem wyższe po zaledwie dwóch rundach biopanowania, podczas gdy użycie Posselda prowadziło do bardziej unikalnych sekwencji po czterech rundach biopanowania ¹⁴. Wyciągając z tego wnioski, strategia została nieznacznie zmieniona podczas biopanowania peptydów wiążących abrax, aby uwzględnić obie korzyści: Posselds został użyty w rundzie 1, aby zapewnić więcej czasu ekspozycji podczas tego krytycznego etapu, w którym różnorodność jest najwyższa, ale następnie program został przełączony na Posseld w celu szybszej izolacji spoiw o najwyższym powinowactwie podczas rund 2-4 ^{1, Rozdział 15}. Wydawało się to być idealne dla abrax, zwłaszcza, że nMFI i procentowe wiązanie były wyższe dla 4. rundy sortowania abrax w porównaniu z 4. rundy sortowania PA z dowolnym programem (Rysunek 2 i Rysunek 3 oraz Sarkes i in. 2015 ¹⁴), ale bezpośrednie porównanie przy użyciu jednej strategii z drugą z tym samym celem byłoby wymagane dla bardziej rozstrzygającego porównania. To, który program jest najlepszy dla danej aplikacji, może zależeć od indywidualnego celu, używanej biblioteki sortowania i poziomu ekspresji peptydów, który jest osiągany przy dowolnej zmianie warunków opisanych tutaj.

Nie omówiono tutaj potencjalnych wyników biopanowania z materiałami abiotycznymi, ale użyliśmy również tej samej biblioteki wyświetlania bakterii do biopanoramowania w stosunku do aluminium ² luzem. Badanie to nie zostało przeprowadzone przy użyciu autoMCS, ale podobne badania można przeprowadzić przy użyciu autoMCS, jeśli materiał jest dostępny na kulce magnetycznej, może być pokryty lub sprzężony z nim. W badaniu aluminium analiza poszczególnych aminokwasów i modelowanie struktury drugorzędowej były pomocne w zrozumieniu, co napędzało powinowactwo wiązania izolowanych peptydów, ponieważ nie określono sekwencji konsensusu ². Nawet w przypadku celów biologicznych może to być wymagane do zrozumienia, co napędza powinowactwo wiązania dla niektórych celów, dlatego arkusz kalkulacyjny wygenerowany z makra "eCPX_Sequencing" zawiera zakładkę z indywidualną analizą częstości pozostałości. Jeżeli jednak oprócz braku konsensusu nie zaobserwuje się żadnych powtarzających się sekwencji, a częstość występowania pozostałości nie wykazuje żadnego wzorca, mogą być wymagane inne rodzaje analiz. Ponadto konieczne mogą być dalsze rundy sortowania, aby uniknąć przesiewania znacznie większej liczby kandydatów w celu selekcji w dół tych, którzy mają wystarczające powinowactwo do pożądanego celu.

Wraz z rosnącą dostępnością sekwencjonowania nowej generacji, można przeprowadzić bardziej szczegółowe badania w celu określenia najbardziej obiecujących kandydatów przed przetestowaniem powinowactwa i określenia stopnia wzbogacenia po każdej rundzie biopanowania. Jednak sekwencje przechodzące do etapu analizy wiązania mogą wymagać ponownego utworzenia przez klonowanie, jeśli nie są wystarczająco częste, aby można je było łatwo wyizolować za pomocą rutynowego sekwencjonowania dziesiątek lub setek kolonii. Wraz z postępem tej technologii, która staje się coraz tańsza i bardziej rutynowa, a zwłaszcza dzięki opcji izolacji kolonii, będzie to prawdopodobnie najlepszy sposób analizy danych z biopanoramacji. Może to prowadzić do wyjaśnienia, w jaki sposób ewoluują poszczególne sekwencje i cała biblioteka. Ponadto bakterie w bibliotece sortowania mogą z czasem mutować, co może skłaniać sortowanie w kierunku komórek o szybszym tempie wzrostu lub bakterii z nadekspresją białek genomowych zdolnych do wiązania materiału nawet bez rusztowania wyświetlacza i ekspresji peptydów. Z tego powodu, gdy pojawią się obiecujący kandydaci, warto wyizolować plazmidowe DNA, ponownie przekształcić świeże E. coli i potwierdzić wiązanie peptydu przez FACS. Jeśli planuje się stosowanie peptydu w formacie bezkomórkowym, należy również ocenić powinowactwo do wolnego peptydu. Na przykład odczynniki powinowactwa peptydowego odkryte przez wyświetlacz bakteryjny dla docelowego SEB zostały syntetycznie wyprodukowane poza komórką i przeanalizowane bardziej tradycyjnymi metodami, takimi jak test immunoenzymatyczny (ELISA), a powinowactwo na komórce (za pośrednictwem FACS) i poza komórką (za pośrednictwem ELISA) porównano przy użyciu K_ds określonego obiema metodami ⁷.

Chociaż siła interakcji biotyna-streptawidyna sprawia, że jest to idealna strategia wychwytywania docelowych i związanych peptydów białkowych, procedura ta może być modyfikowana dla innych strategii wychwytywania. Bezpośrednie sprzężenie białka z kulkami magnetycznymi, takimi jak kulki epoksydowe i kwasów karboksylowych, zakończyło się sukcesem i eliminuje etap wiązania. Jednak bezpośrednie przywiązanie może utrudniać potencjalne miejsca wiązania w określony lub niespecyficzny sposób, w zależności od strategii przywiązania. Dodatkową zaletą stosowania kulek streptawidyny jest to, że mniej stabilne cele białkowe mogą być świeżo biotynylowane w ciągu 30 minut lub przechowywane w stanie zamrożonym, jeśli zajdzie taka potrzeba, podczas gdy same kulki zwykle wymagają dłuższej inkubacji z białkiem w celu sieciowania i są zwykle przechowywane w temperaturze 2 - 8°C. Sugerowane stężenie wyjściowe biotynylowanego białka docelowego, 600 nM, sprawdziło się dla wielu celów, ale może być możliwe wyizolowanie odczynników wychwytujących peptydy o zwiększonym powinowactwie, jeśli stężenie to zostanie zmniejszone. Ponadto metoda ta może być rozszerzona i zmodyfikowana dla innych bibliotek wyświetlania bakterii i innych organizmów. Na przykład kroki te można wykonać przy braku tlenu do stosowania z beztlenowcami lub w innych środowiskach do stosowania z ekstremofilami w celu wyizolowania peptydów o unikalnych właściwościach. Peptydy i/lub konsensus określony dla określonego celu zainteresowania mogą być potencjalnie wykorzystane na komórce jako żywy materiał lub wyprodukowane syntetycznie poza komórką. Syntetycznie wytwarzane peptydy mogą być dalej dojrzewane w celu opracowania jeszcze większego powinowactwa i bardziej wytrzymałych środków wychwytywania katalizowanego białkami (PCC) do stosowania w czujnikach lub do innych zastosowań, w których przeciwciała byłyby zwykle używane do wiązania lub rozpoznawania ^38,55. Modelowanie molekularne może być również wykorzystane do określenia miejsca wiązania peptydu z jego celem, jak to zostało ostatnio przeprowadzone dla peptydów wiążących abrax i konsensusu wymienionego na rysunku 5C ¹. Ogólnie rzecz biorąc, biopanoramiczne biblioteki ekspozycyjne bakterii dla odczynników powinowactwa peptydów są szybką, prostą i wydajną alternatywą dla produkcji przeciwciał do rozpoznawania i wykrywania celów białkowych, a to półautomatyczne podejście do biopanoramacji przyniosło wiarygodne wyniki o daleko idących zastosowaniach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545	Automatyczny separator komórek do użytku z kulkami magnetycznymi
Bulion Luria, Miller (LB)	Fisher Scientific	BP1426-500	Pożywka wzrostowa
Chloramfenikol	Fisher BioReagents	BP904-100
Antybiotyk Agar	Fisher Scientific	BP2641-500	Środek
zagęszczający/żelującyeCPX 3.0 Biblioteka peptydów do wyświetlania bakterii	Cytomx Therapeutics	N/A; http://cytomx.com/contact/	Biblioteka wyświetlania peptydów na komórkach. Dostarczone przez współpracowników z USCB.
L-arabinoza	Sigma	A3256-500G	Cukier, do indukcji ekspresji białka
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (PBS)	Amresco	0780-10L	Bufor
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna, No-Weigh	Thermo Scientific	PI21327	Dodaje cząsteczkę biotyny do amin pierwszorzędowych
Zestaw do oznaczania biotyny Pierce	Thermo Scientific	PI28005	Zapewnia, że cząsteczka biotyny jest kowalencyjnie związana z białkiem
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads	Invitrogen	65601	Kulki magnetyczne do wychwytywania białek zawierających biotynę
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Białko	Sigma	A9647-100G	, stosowane jako środek blokujący niespecyficzne wiązanie
D-glukozy	Sigma	G8270-1KG	Cukier, do wzrostu i hamowania indukowalnej ekspresji białek
Ypet Mona,	UCSB i ARL	N/A	Kontrola pozytywna do monitorowania ekspresji eCPX 3.0. Wyprodukowane przez autorów i współpracowników; Patrz odnośniki 12 i 13.
Dylight 488 NHS Ester	Thermo Scientific	46403	Do koniugacji docelowego białka z fluoroforem
Streptawidyny, koniugatem R-fikoerytryny (SAPE)	Thermo Scientific	S866	Kontrola ujemna do monitorowania niespecyficznego wiązania ze streptawidyną
BD FACSFlow	Becton, Dickinson and Company		342003 Bufor do uruchamiania kolumn
autoMACS instrumentu FACS	Miltenyi Biotech	130-021-101	Do separacji MACS
AutoMACS Running Buffer – Bufor separacyjny MACS	Miltenyi Biotech	130-091-221	Do konserwacji urządzeń autoMACS. Zagrożenie: zawiera 0,09% azydku.
autoMACS Pro Roztwór myjący	Miltenyi Biotech	130-092-987	Do konserwacji urządzeń autoMACS
70% etanolu	VWR	E505-4L	Dekontaminacja autoMACS
Glycerol	Sigma	G6279-1L	Do bakteryjnych zamrażarek
Chill 15 rack	Miltenyi Biotec	130-092-952	Do separacji MACS
BD FACSCanto II	Becton, Dickinson i Spółka	744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview	Do oceny wiązania peptydu z docelowym
oprogramowaniem BD FACSDiva	Becton, Dickinson and Company	659523	Do oceny wiązania peptydu z docelowym
koncentratorem cząstek magnetycznych Dynabeads MPC-S	Thermo Scientific	A13346	Laboratoryjny separator komórek do użytku z kulkami magnetycznymi
Sekwencjonowanie kolonii	Genewiz	N/A; https://www.genewiz.com/	Usługi sekwencjonowania DNA i kolonii
Excel	Microsoft	323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400	Do użytku z makro analizy sekwencji
Antygen ochronny wąglika (PA)	Lista Biological Laboratories, Inc.	171	Białko docelowe użyte jako przykład w celu uzyskania reprezentatywnych wyników.
Abrax	ECBC i ARL	N/A	Białko docelowe użyte jako przykład w celu uzyskania reprezentatywnych wyników. Wyprodukowane przez autorów i współpracowników; Patrz odnośniki 1 i 15.
Rivax	ECBC i ARL	N/A	Białko docelowe użyte jako przykład w celu uzyskania reprezentatywnych wyników. Wyprodukowane przez autorów i współpracowników; Patrz odnośniki 1 i 15.