Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D

DOI:

10.3791/56063

⸱

9 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie do badania zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym. W tym miejscu opisujemy protokół wideomikroskopii poklatkowej pierwotnych komórek kory mózgowej, który umożliwia szczegółowe badanie faz odgrywanych podczas progresji linii od pierwotnych nerwowych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i gleju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju kory mózgowej, komórki progenitorowe przechodzą kilka rund symetrycznych i asymetrycznych podziałów komórkowych w celu wytworzenia nowych progenitorów lub neuronów postmitotycznych. Później niektórzy przodkowie przechodzą na los glejogeniczny, dodając do populacji astrocytów i oligodendrocytów. Za pomocą wideomikroskopii poklatkowej kultur komórkowych pierwotnej kory mózgowej możliwe jest badanie mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących tryb podziału komórek i parametry cyklu komórkowego komórek progenitorowych. Podobnie, los komórek postmitotycznych można badać za pomocą specyficznych dla komórki fluorescencyjnych białek reporterowych lub immunocytochemii po obrazowaniu. Co ważniejsze, wszystkie te cechy mogą być analizowane na poziomie pojedynczej komórki, co pozwala na identyfikację komórek progenitorowych zaangażowanych w generowanie określonych typów komórek. Manipulacja ekspresją genów może być również przeprowadzana za pomocą transfekcji za pośrednictwem wirusa, co pozwala na badanie zjawisk autonomicznych i nieautonomicznych komórek. Wreszcie, zastosowanie fuzyjnych białek fluorescencyjnych pozwala na badanie symetrycznego i asymetrycznego rozkładu wybranych białek podczas podziału oraz korelacji z losem komórek potomnych. W tym miejscu opisujemy metodę wideomikroskopii poklatkowej do obrazowania pierwotnych komórek mysich kory mózgowej przez okres do kilku dni i analizy sposobu podziału komórek, długości cyklu komórkowego i losu nowo wygenerowanych komórek. Opisujemy również prostą metodę transfekcji komórek progenitorowych, która może być zastosowana do manipulowania interesującymi genami lub po prostu oznaczania komórek białkami reporterowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) generują neurony i komórki makroglejowe podczas rozwoju kory mózgowej. We wczesnej kortykogenezie NSC przechodzą kilka rund symetrycznego podziału komórek i rozszerzają pulę progenitorów. Następnie NSC dzielą się asymetrycznie, aby generować neurony bezpośrednio lub pośrednio przez intermediates1. Dopiero w środkowej i późnej kortykogenezie przodkowie przełączają się na generowanie astrocytów i oligodendrocytów2,3,4. Jednak pełne mechanizmy kontrolujące proliferację i różnicowanie komórek, a także wkład ograniczonych w losie prekursorów do generowania unikalnych typów neuronów lub komórek makrogleju, pozostają przedmiotem intensywnej debaty4,5,6. Potencjał poszczególnych korowych NSC do generowania neuronów, astrocytów i oligodendrocytów był szeroko badany in vitro i in vivo przy użyciu niezliczonych technik, takich jak: obrazowanie na żywo w hodowlach jednokomórkowych7,8,9,10,11,12,13; Obrazowanie na żywo w kulturach o dużej gęstości Cultures3,14,15; Obrazowanie na żywo w kulturach warstw16,17,18; Analiza klonalna z wykorzystaniem znakowania genetycznego za pośrednictwem wektora wirusowego w kulturach o dużej gęstości14,15,19,20,21; Analiza klonalna in vivo przy użyciu retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; oraz analiza klonalna in vivo z wykorzystaniem zwierząt transgenicznych34.

Każda z tych technik ma swoje wady i zalety. Na przykład śledzenie linii produkcyjnej in vivo jest podatne na błędy grupowania i rozdzielania3, co prowadzi do sprzecznych wniosków na temat potencjału poszczególnych przodków kory mózgowej. Co więcej, zarówno badania in vitro, jak i in vivo oparte na znakowaniu komórek progenitorowych we wczesnych punktach czasowych i późniejszej analizie linii komórkowych mogą mieć wpływ niewykryte wystąpienie śmierci komórki podczas progresji linii35. W związku z tym odpowiedni system do analizy potencjału pojedynczych NSC musi umożliwiać identyfikację wszystkich wygenerowanych komórek, a także odpowiednią charakterystykę losów komórek w obrębie linii. Połączenie pierwotnej hodowli komórkowej i obrazowania na żywo zapewnia to ustawienie. Korzystając z hodowli pojedynczej komórki i mikroskopii wideo poklatkowego, Temple i in. pokazali zmianę w linii poszczególnych prekursorów kory mózgowej od neurogenezy do glejogenezy11. Później użyli tego samego systemu, aby pokazać, że różne typy neuronów są generowane z jednego przodka kory mózgowej12. Jednak ten system przedstawia ważne zastrzeżenie: tylko 1% przodków korowych wyizolowanych we wczesnej kortykogenezie generuje klony 4 lub więcej potomstwa9. Po dodaniu FGF2 częstotliwość generowania przez komórki 4 lub więcej komórek wzrasta do 8 - 10%9. Niemniej jednak liczba ta jest zbyt mała, biorąc pod uwagę, że praktycznie wszyscy przodkowie kory mózgowej są proliferacyjni na tym etapie. Co więcej, nie można wykluczyć potencjalnego wpływu FGF2 na specyfikację losu36. Aby obejść te ograniczenia, użyliśmy hodowli komórkowych o dużej gęstości, które wspierają proliferację zarówno komorowych (eksprymujących Pax6), jak i podkomorowych (wyrażających ekspresję Tbr2) korowych komórek progenitorowych15. Co więcej, obserwacja tych kultur w czasie rzeczywistym wykazała, że kilka cech progresji linii NSC jest odtwarzanych w tych warunkach, takich jak między innymi sposób podziału komórek, wydłużenie cyklu komórkowego, potencjał pojedynczych komórek do generowania neuronów i gleju3,15. Ostatnio użyliśmy również tego systemu, aby pokazać, że sygnalizacja CREB wpływa na przeżycie komórek niedojrzałych neuronów kory mózgowej u myszy37. Dlatego uważamy, że wideomikroskopia poklatkowa pierwotnych mysich komórek kory mózgowej hodowanych w dużej gęstości jest potężnym i dostępnym narzędziem do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów progresji cyklu komórkowego, sposobu podziału komórek, przeżycia komórek i specyfikacji losu komórki. To ostatnie można osiągnąć przy użyciu transgenicznych zwierząt, co pozwala na identyfikację określonych losów komórek w czasie rzeczywistym38,39,40 lub za pomocą immunocytochemii po obrazowaniu3,38,41,42.

Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół przygotowania pierwotnej hodowli komórek kory mózgowej, wspierającej proliferację NSC i późniejszą generację neuronów i komórek makroglejowych. Omawiamy również zastosowanie transfekcji za pośrednictwem retrowirusa do manipulowania ekspresją genów pojedynczych komórek, które można zidentyfikować i śledzić na poziomie pojedynczej komórki za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo. Protokół ten może być wykorzystany do badania pierwotnych komórek kory mózgowej wyizolowanych od początku do końca kortykogenezy u gryzoni, ale może być wymagane kilka korekt zgodnie z stage14. NSC wyizolowane z innych źródeł mogą być również badane za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo kultur 2D, ale odpowiedni system hodowli powinien być określony poprzez porównanie zachowań komórek in vitro i in vivo38,43.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z udziałem żywych zwierząt opisane w tym protokole są przeprowadzane zgodnie z prawem krajowym i międzynarodowym i zostały zatwierdzone przez lokalną Uniwersytecką Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (CEUA/UFRN), na podstawie licencji 009/2014. Poniższy protokół jest wykonywany w sterylnym środowisku. Oczekuje się znajomości podstawowych kultur komórkowych.

1. Mikrodysekcja grzbietowo-bocznej kresomózgowia

  1. Przygotuj pożywkę preparacyjną (100 ml): 98,5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), 0,5 ml 5 M HEPES pH 7,4, 1 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml).
  2. Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę preparacyjną.
  3. Usunąć zarodki zarodkowe w 14. dniu (E14) ciężarnej myszy C57/Bl6 (Mus musculus) w znieczuleniu izofluranem.
    UWAGA: Rozważ E0 jako dzień wykrycia czopa dopochwowego. Rozbior należy zakończyć nie później niż 1 godzinę po usunięciu z ciężarnej myszy. Protokół ten ma również zastosowanie do zarodków E11-E17.
  4. Usunąć zarodki przez histerektomię w sterylnych warunkach.
  5. Przenieść zarodki na szalkę Petriego z zimnym podłożem preparacyjnym (4 °C).
  6. Usuń mózg z czaszki, przecinając wzdłuż podłużnej szczeliny. Liczba zarodków zwykle waha się od pięciu do dziesięciu. Każdy mózg E14 wytwarza około 2 x 106 komórek, w tym neurony progenitorowe i postmitotyczne (stosunek 1:1)
    UWAGA: Użyj mikroskopu stereoskopowego do wykonania następujących czynności.
  7. Usuń opony mózgowe za pomocą kleszczy preparacyjnych. Podziel kresomózgowie pośrodku, aby oddzielić półkule. Aby wyizolować grzbietowo-boczną kresomózgowie, przeciąć wzdłuż krzywej grzbietowo-przyśrodkowej i granicy palijalno-podpalialnej za pomocą kleszczy preparacyjnych. Przenieść grzbietowo-boczną kresomózgowie do probówki o pojemności 2 ml z zimnym podłożem preparacyjnym (4 °C), aż wszystkie mózgi zostaną wypreparowane.

2. Dysocjacja komórek i powlekanie

  1. Przygotuj pożywkę proliferacyjną (50 ml DMEM + 10% FCS): 44 ml Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM), 5 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,5 ml 40% glukozy, 0,5 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml). Filtruj i sterylizuj pożywkę proliferacyjną.
  2. Przygotuj pożywkę różnicującą (50 ml DMEM + 2% B27): 48 ml DMEM, 1 ml B27, 0,5 ml 40% glukozy, 0,5 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml). Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę różnicującą.
  3. Po mikropreparacji grzbietowo-bocznej kresomózgowia od myszy E14, odwirować probówkę z pobraną tkanką i zimnym podłożem preparacyjnym (przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 340 x g) w celu wytrącenia tkanki.
  4. Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) trypsyny-EDTA (0,05%) w celu roztrawienia chemicznego. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 2 ml pożywki proliferacyjnej, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
  5. Wypoleruj końcówkę szklanej pipety Pasteura nad palnikiem gazowym lub palnikiem Bunsena przez kilka sekund, aby nieznacznie zwęzić otwór. Umyj pipetę, zasysając FCS, aby pokryć końcówkę. Unikając pęcherzyków powietrza, należy mechanicznie rozdzielić komórki za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z powłoką FCS.
  6. Odwirować komórki (przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 340 x g). Usunąć supernatant za pomocą pipety. Dodać 1 ml pożywki do proliferacji i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety. Powtórz ten krok raz.
  7. Przygotować zawiesinę komórek w stosunku 1:1 przy użyciu 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Niezdolne do życia komórki będą niebieskie. Policz liczbę żywotnych komórek (niebarwionych) za pomocą komory Neubauera.
  8. Rozcieńczyć komórki w pożywce proliferacyjnej, aby uzyskać 106 komórek/ml. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej (około 2,5 × 105 komórek/cm2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Nie używaj szkiełek nakrywkowych, ponieważ mogą się one przesuwać podczas eksperymentu i zmieniać pole obserwacji. Alternatywnie należy użyć płytek do hodowli tkankowych ze szklanym dnem.
    UWAGA: Jeśli nie używasz wielokanałowej poddanej hodowli komórkowej, ważne jest, aby wstępnie potraktować płytki poli-D-lizyną (50 μg/ml) 2 godziny w temperaturze 37 °C. Płytki poddane działaniu PDL można przechowywać w temperaturze 4 °C po umyciu wodą destylowaną.

3. Transfekcja za pośrednictwem retrowirusa

UWAGA: To jest prosta metoda transfekcji tylko komórek progenitorowych. Jednak inne wektory wirusowe lub transfekcja chemiczna/elektryczna mogą być wykorzystane do wprowadzenia interesujących genów do hodowanych komórek.

  1. Aby manipulować ekspresją genów i oznaczać komórki fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, dodaj retrowirusy przenoszące plazmidy z genami będącymi przedmiotem zainteresowania 2 godziny po posiewie komórek.
    UWAGA: Wektory retrowirusowe integrują się tylko z genomem dzielących się komórek. Dlatego ważne jest, aby infekować komórki, gdy proliferacja jest wysoka.
    UWAGA: Użyliśmy plazmidu zawierającego sekwencję fuzji beta-aktyny / CMV (CAG) i wewnętrzne rybosomalne miejsce wejścia (IRES), a następnie sekwencję kodującą białko zielonej fluorescencji (GFP), oznaczoną jako pCAG-IRES-GFP44. Geny będące przedmiotem zainteresowania mogą być klonowane między promotorem CAG a IRES sequence37.
  2. Rozcieńczyć retrowirusa w pożywce różnicującej, aby uzyskać pożądaną liczbę cząstek na ml. Do każdego dołka dodać 500 μl pożywki różnicującej z retrowirusem.
    UWAGA: Ilość użytych retrowirusów zależy od ich miana i powinna być obliczona tak, aby uzyskać od 50 do 100 zainfekowanych komórek na studzienkę. Miano to pozwala na identyfikację izolowanych klonów wykazujących ekspresję GFP, których pokrewieństwo można dodatkowo potwierdzić poprzez śledzenie obrazów kontrastu fazowego (patrz punkt 6). Miareczkowanie retrowirusa powinno być przeprowadzone przy użyciu tej samej populacji komórek45.

4. Wideomikroskopia poklatkowa

UWAGA: Ten krok wymaga odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z komorą inkubacyjną (zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Po zakażeniu retrowirusem umieścić płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze podłączonym do regulatorów temperatury i CO2 .
    UWAGA: Wstępne podgrzanie komory przez 3 godziny przed rozpoczęciem obrazowania może pomóc zminimalizować dryft i rozogniskowanie podczas akwizycji.
    UWAGA: Komora powinna utrzymywać ogniwa w stałych warunkach 37 °C i 5% CO2 .
  2. Wybierz pozycję na osi XY, która ma służyć jako punkt zerowy (XY = 0). Umożliwi to odniesienie do ponownego znalezienia pozycji w przyszłości, na przykład po badaniu immunocytochemicznym po obrazowaniu (patrz punkt 5).
    UWAGA: Zaleca się narysowanie na tabliczce znaku, który może służyć jako odniesienie do określenia punktu zerowego.
  3. Wybierz pozycje, które mają być obrazowane przy 10-krotnym powiększeniu.
    UWAGA: Wybierz 10-15 pozycji na studzienkę, aby zwiększyć prawdopodobieństwo zaobserwowania komórek transfekowanych retrowirusowo.
    UWAGA: Długodystansowe obiektywy o dużym powiększeniu (20X lub 40X) mogą być używane do uzyskiwania obrazów o wyższej rozdzielczości. W zależności od odległości roboczej obiektywów mogą być wymagane płyty ze szklanym dnem.
  4. Pobieraj obrazy kontrastu fazowego co 5 minut i obrazy fluorescencyjne co 3 godziny, aby zmniejszyć fototoksyczność. Sprawdź i dostosuj ostrość w ciągu pierwszych 3 godzin eksperymentu, ponieważ może się ona zmienić, gdy temperatura się równoważy. Codziennie sprawdzaj i reguluj ostrość.
    UWAGA: Obserwujemy, że ostrość stabilizuje się po pierwszych 24 godzinach. Wskazane jest jednak monitorowanie ostrości. Alternatywnie można skorzystać z programowego systemu autofokusa.
  5. Po 7 dniach należy przerwać pobieranie i przejść do immunocytochemii po obrazowaniu (patrz punkt 5).
  6. Po immunocytochemii wymień płytkę w inkubatorze mikroskopowym, znajdź punkt zerowy, zresetuj XYZ = 0 i ponownie załaduj eksperyment z zapisanymi pozycjami. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne każdej pozycji za pomocą odpowiednich filtrów fluorescencyjnych.

5. Immunocytochemia po obrazowaniu

  1. Po 7 dniach w hodowli utrwalić hodowlę komórkową 4% utrwalaczem paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w dygestoriach chemicznych.
  2. Płukać 0,5 ml PBS 0,1 M przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.
  3. Inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C w 0,5% trytonie i 10% normalnej surowicy koziej w PBS 0,1 M.
    UWAGA: Użyj przeciwciała anty-Microtubule Associated Protein 2 (MAP2), aby potwierdzić fenotyp neuronalny (mysia IgG1, 1:1,000) i anty-GFP do znakowania transdukowanych komórek (przeciwciało kurze, 1:500). Inne przeciwciała mogą być używane do wykrywania komórek progenitorowych lub glejowych.
  4. Płukać 0,5 ml PBS 0,1 M przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.
  5. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 0,5% trytonie i 10% normalnej surowicy koziej w PBS 0,1 M i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Zalecane rozcieńczenie: 1:1,000.
  6. Płukać 0,5 ml PBS 0,1 M przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.
  7. W przypadku barwienia jąder inkubować komórki przez 5 minut z 0,1 μg/ml 4′6′-diamino-2-fenylindonu (DAPI) w PBS 0,1 M.
  8. Płukać 0,5 ml PBS 0,1 M przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.
  9. Przechowywać komórki w PBS 0,1 M i chronić przed światłem (np. owinąć płytkę folią).

6. Śledzenie komórek

UWAGA: Tutaj krótko opisujemy główne kroki do analizy danych z wideomikroskopii poklatkowej za pomocą oprogramowania The Tracking Tool (tTt), które jest dostępne pod linkiem podanym w Tabeli Materiałów.

UWAGA: Jeśli akwizycja obrazu odbywa się za pomocą innego oprogramowania, zaimportuj dane obrazu za pomocą konwertera tTt dostępnego w instalatorze tTt (link podany w Tabeli materiałów). Akceptowane są tylko formaty obrazów png, tif lub jpg. Postępuj zgodnie z instrukcjami pokazanymi na stronie Rysunek 1 A - B po uruchomieniu konwertera tTT.

  1. Uruchom oprogramowanie tTt i wybierz nazwę użytkownika. Kliknij przycisk "dodaj użytkownika" i "kontynuuj" (Rysunek 2A). Przeglądaj i wybierz "TTTWorkFolder" (Rysunek 2B). Drzewa pochodzenia, statystyki i wyeksportowane obrazy zostaną zapisane w tym folderze. Następnie wybierz eksperyment, który chcesz przeanalizować i załaduj go (Rysunek 2B).
  2. Jeśli obrazy zostały wcześniej przekonwertowane przez tTt Converter, kliknij na "LogFileConverter" (Rysunek 3A) i określ liczbę sekund między dwoma kolejnymi punktami czasowymi w oknie LogFileConverter. Kliknij na "Konwertuj pliki dziennika dla całego eksperymentu" (Rysunek 1C).
  3. Z listy obrazów, które pojawiają się w oknie tTt, wybierz żądane obrazy, które ładują się ręcznie lub za pomocą opcji wyświetlanej w programie. Załaduj obrazy (Rysunek 3).
  4. Wybierz Plik> Otwórz > Nowej kolonii. Kliknij "Śledzenie", a następnie "Rozpocznij śledzenie", aby rozpocząć śledzenie w wybranej pozycji.
  5. Pojawi się okno filmu (Rysunek 4). Wybierz komórkę za pomocą okręgu śledzenia i naciśnij 0. Oprogramowanie przejdzie do następnej klatki. Kontynuuj pozycjonowanie okręgu śledzenia wokół śledzonej komórki za pomocą myszy i klikaj 0 w każdej klatce, aby dodać znacznik ścieżki w komórce.
  6. Użyj 1 i 3, aby przejść odpowiednio do poprzedniej lub następnej klatki. Aby usunąć znacznik śladu, po prostu kliknij odpowiednią pozycję, aby go zaznaczyć i naciśnij 0.
  7. Jeśli komórka jest podzielona, wybierz przycisk "podział" (czerwony prostokąt w Rysunek 4). Kontynuuj śledzenie jednej komórki potomnej, naciskając Shift+D. Aby śledzić drugą komórkę potomną, zaznacz ją w edytorze komórek i naciśnij F2.
  8. Jeśli komórka obumarła podczas mikroskopii wideo, wybierz "apoptoza" (niebieski prostokąt w Rysunek 4).
    UWAGA: Chociaż oprogramowanie oznacza zdarzenie jako "apoptozę", inne mechanizmy mogą być odpowiedzialne za śmierć komórki.
  9. Jeśli komórka opuszcza pole obserwacji lub miesza się z sąsiednimi komórkami, uniemożliwiając śledzenie, wybierz "zagubiona" (zielony prostokąt w miejscu Rysunek 4).
  10. Aby zatrzymać śledzenie i kontynuować później, kliknij na "interrupt" (fioletowy prostokąt na Rysunek 4).
    UWAGA: W oknie Edytor komórek zostanie wygenerowane drzewo podczas śledzenia. Aby zapisać drzewo pochodzenia, wybierz pozycję Plik > Zapisz > bieżące drzewo (w oknie Edytor komórek).
  11. Aby rozpocząć śledzenie innej komórki, kliknij komórkę prawym przyciskiem myszy lub wybierz komórkę za pomocą lewego przycisku myszy i kliknij Śledzenie > Rozpocznij śledzenie.
  12. Aby wyeksportować film z danymi śledzenia, oprogramowanie nie powinno być w "trybie śledzenia". Aby wyłączyć tryb śledzenia, wykonaj krok 6.10. W oknie Film wybierz opcję Eksportuj > filmu. Ustaw format, zakres klatek, liczbę klatek na sekundę i szybkość transmisji. Kliknij "Rozpocznij eksport".

7. Kwantyfikacje

UWAGA: Za pomocą danych z mikroskopii wideo można wykonać kilka pomiarów46. W tym miejscu opisujemy trzy możliwości, które zostały zilustrowane w dalszej części sekcji "reprezentatywne wyniki".

  1. Określ ilościowo przeżywalność komórek dla każdej linii komórkowej, dzieląc liczbę komórek żyjących w różnych punktach czasowych przez całkowitą liczbę komórek wygenerowanych przed osiągnięciem tych punktów czasowych w poszczególnych klonach37.
  2. Określ ilościowo proporcję symetrycznego progenitora (SP, obie komórki potomne nadal się proliferują), asymetrycznego (A, jedna komórka potomna nadal się proliferuje, a druga staje się postmitotyczna) lub symetrycznego zakończenia (ST, obie komórki potomne stają się postmitottyczne)15,38.
  3. Zmierz długość cyklu komórkowego, obliczając czas proliferacji komórek między ich powstaniem a podziałem15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne kultury komórek kory mózgowej wyizolowanych z embrionów E14 zawierają zarówno komórki progenitorowe, jak i neuronalne. W okresie obrazowania przodkowie przechodzą kilka rund podziału komórkowego, zwiększając liczbę komórek (Rysunek 5 i Wideo Rysunek 1).

Transfekcja kilku komórek progenitorowych za pośrednictwem retrowirusa ułatwia identyfikację klonów komórkowych (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obserwacja w czasie rzeczywistym pierwotnych komórek kory mózgowej pozwala na analizę proliferacji komórek, sposobu podziału komórek, długości cyklu komórkowego, różnicowania komórek i przeżywalności komórek 3,14,15,37. Co ważniejsze, pozwala na badanie linii jednokomórkowych, prowadząc do identyfikacji faz pośrednich zachodzących podczas progresji od NSC do neuronów3. W...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) i FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Norte).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penicylina/streptomycynaGibco15140122
Dulbecco Zmodyfikowane podłoże orła (DMEM)Gibco12400-024
Surowica cielęca płodu (FCS)Gibco10437028
GlukozaGibcoA2494001
B27Gibco17504044
trypsyna-EDTA (0,05%)Gibco25300054
ParaformaldehydSigma16005
Serum kozieSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
IsofluraneSigma792632
anty-MAP2, myszSigmaM4403
anty-GFP kurczakAves0511FP12
DAPISigmaD9542
Koza anty-mysz alexa 594InvitrogenA11005
Koza anty-kurczak alexa 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH Zurych
Mikroskop obserwatora komórkowegoPipeta Pasteura Zeiss
Pasteur
The Tracking Tool (tTt)link dopobrania
Oprogramowanie PBS https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449(2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76(2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroskopia wideo w odst pach czasuanaliza podzia u kom rekd ugo cyklu kom rkowegolosy kom rek progenitorowychtransfekcja za po rednictwem wirusafluorescencyjne bia ka reporterowepodzia symetryczny i asymetrycznyanaliza na poziomie pojedynczych kom rekneuralne kom rki macierzyste

Powiązane artykuły