Method Article

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kodowanie informacji biologicznej, która jest dostępna dla przyszłych pokoleń, zazwyczaj odbywa się poprzez zmiany w sekwencji DNA. Długotrwałe dziedziczenie zakodowane w konformacji białka (a nie w sekwencji) od dawna było postrzegane jako zmiana paradygmatu, ale rzadkie. Najlepiej scharakteryzowanymi przykładami takich elementów epigenetycznych są priony, które posiadają zachowanie samoorganizujące się, które może napędzać dziedziczną manifestację nowych fenotypów. Wiele archetypowych prionów wykazuje uderzające odchylenie sekwencji bogatej w N/Q i łączy się w fałd amyloidowy. Te niezwykłe cechy stanowiły podstawę dla większości badań przesiewowych mających na celu zidentyfikowanie nowych białek prionowych. Jednak co najmniej trzy znane priony (w tym prion założycielski, PrPSc) nie posiadają tych cech biochemicznych. W związku z tym opracowaliśmy alternatywną metodę badania zakresu dziedziczenia opartego na białkach w oparciu o właściwość działania masowego: przejściowa nadekspresja białek prionowych zwiększa częstotliwość, z jaką uzyskują one konformację samoczynną. W artykule opisano metodę analizy zdolności drożdży ORFeome do wywoływania dziedziczenia na podstawie białek. Korzystając z tej strategii, odkryliśmy wcześniej, że >1% białek drożdży może napędzać pojawienie się cech biologicznych, które są długotrwałe, stabilne i pojawiają się częściej niż mutacje genetyczne. Podejście to może być stosowane w przypadku wysokiej przepustowości w całym ORFeomes lub jako ukierunkowany paradygmat przesiewowy dla określonych sieci genetycznych lub bodźców środowiskowych. Tak jak genetyczne badania przesiewowe definiują liczne szlaki rozwojowe i sygnałowe, tak techniki te zapewniają metodologię badania wpływu dziedziczenia opartego na białkach na procesy biologiczne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy biologiczne często doświadczają przejściowych wahań obfitości białka. Nie jest jasne, czy mają one trwały wpływ na kształtowanie fenotypu organizmu lub przyszłych pokoleń. Najbardziej znane przykłady tej biologii obejmują rzadką klasę białek, priony, które napędzają pojawienie się cech dziedzicznych bez modyfikacji genomu. Zamiast tego, te proteinaceous i infectious cząstki przenoszą fenotypy poprzez samonapędzające się zmiany w konformacji białek1,2. Ten rodzaj dziedziczenia został odkryty jako przyczyna niezwykłych wzorców dziedziczenia wyniszczającej choroby neurodegeneracyjnej. Jednak badania na organizmach od grzybów po ssaki3,4,5,6,7,8,9,10 ujawniły, że pierwiastki podobne do prionów mogą nadawać wartość adaptacyjną. Niemniej jednak priony są postrzegane jako fascynująca, ale rzadka osobliwość biologiczna.

Ta dominująca mądrość jest częściowo utrzymywana, ponieważ charakterystyka dziedziczenia opartego na białkach od dawna jest ograniczona przez mały zestaw przykładów. Niedawne systematyczne badania przesiewowe znacznie poszerzyły ten obraz, identyfikując kilka nowych bona fide prionów11 i prawie dwa tuziny domen białkowych12 o zdolności do napędzania konwersji konformacyjnej podobnej do prionów. Ponieważ jednak podejścia te generalnie koncentrowały się na silnych odchyleniach sekwencji aminokwasów, odkryte priony mają wspólne właściwości biochemiczne prionów drożdży założycielskich [PSI+]13,14, [URE3]15, oraz [RNQ+]11,16. Należą do nich: 1) domeny modułowe, które są bogate w długie odcinki polimerowe asparaginy (N) i glutaminy (Q), 2) składanie się w konformację amyloidu [PRION+]17,18,19, oraz 3) całkowite poleganie na funkcji disaggregazy Hsp104 w celu wiernego rozmnażania od matki do córki13,20,21. Rzeczywiście, wiele prionów działających w dobrej wierze, w tym [GAR+], [Het-s], a nawet oryginalny prion (PrPSc), zostałoby pominiętych przy tak rygorystycznych kryteriach. Być może ważniejsze jest to, że nie byliby w stanie uchwycić żadnych nowych mechanizmów dziedziczenia opartego na białkach22. Tak więc prawdziwy biologiczny zakres takich zjawisk może być znacznie bardziej powszechny w przyrodzie, niż wcześniej zakładano.

Aby zbadać to pytanie, zastosowano strategię o wysokiej przepustowości obejmującą cały proteom. Cechą charakterystyczną wszystkich prionów, w tym PrPSc, [GAR+] i [Het-s], jest to, że przejściowa nadekspresja białek przyczynowych silnie zwiększa szybkość pozyskiwania prionów15,23,24,25,26. Wykorzystaliśmy tę cechę, aby systematycznie pytać, w całym drożdżowym ORFeome, czy stabilne stany epigenetyczne oparte na białkach mogą być inicjowane przez przejściowe indukowanie nadekspresji poszczególnych białek. Powszechnie wiadomo, że nadekspresja białek może zmieniać fenotypy27. Jednak białka prionowe są niezwykłe, ponieważ ich tymczasowa nadprodukcja powoduje zmianę fenotypu, która jest dziedziczna przez wiele setek pokoleń po początkowej nadekspresji. Wcześniej wykorzystaliśmy tę cechę, a także niezwykłe wzorce dziedziczenia elementów genetycznych opartych na białkach, aby zidentyfikować dziesiątki białek, które są zdolne do dziedzicznego ponownego okablowania krajobrazów fenotypowych bez zmiany genome28. Chociaż niektóre zidentyfikowane białka były wcześniej znane jako priony, większość nie była, co podkreśla siłę tego podejścia w odkrywaniu nowych form dziedziczenia opartego na białkach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Początkowe nadwyrażenie

  1. Przekształć komórki drożdży (w tym przypadku haploidy BY4741 MAT a) wcześniej wyhodowane w płynie YPD (10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu i 20 g glukozy na 1 l) z pożądanymi konstruktami kandydującymi z biblioteki FLEXGene ORFeome (drożdżowe ORF pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą w szkielecie plazmidu centromerowego oznaczonym URA3, pBY01129).
  2. Użyj autoklawowanych wykałaczek, aby wybrać cztery oddzielne kolonie z tych transformacji, które posłużą jako repliki biologiczne. Hoduj je przez 48-72 godziny w 150 μl SRaffinose-URA (0,74 g CSM-URA, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów i 20 g rafinozy na 1 l) w 96-dołkowych płytkach. Zaszczepić kolonie z pierwszego ORF w studzience A1 wszystkich płytek, kolonie z drugiego ORF w A2 wszystkich płytek itd.
    UWAGA: Wszystkie etapy wzrostu przeprowadza się w temperaturze 30 °C i przy poziomie atmosferycznym CO2 (407,05 ppm), chyba że zaznaczono inaczej.
  3. Potwierdzić, że kultury są nasycone (komórki widoczne gołym okiem na dnie każdej studzienki) i użyć robota do obsługi cieczy do zaszczepienia 1:4 tablicy 1 μl z każdej płytki 96-dołkowej do 4 oddzielnych dołków płytki 384-dołkowej wypełnionej 45 μl SGal-URA (0,74 g CSM-URA, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów i 20 g galaktozy na 1 l) na studzienkę.
    UWAGA: W ten sposób powstaje płyta kompozytowa, w której 4 powtórzenia biologiczne każdego ORF są ułożone w układ kwadratowy.
  4. W tym samym czasie należy przygotować oddzielne 384-dołkowe płytki zawierające 45 μl SGal-URA z interesującymi czynnikami stresogennymi (np. chlorek manganu w 20 mM) na studzienkę. Zaszczepić tę płytkę w taki sam sposób, jak w kroku 1.3.
    UWAGA: Aby osiągnąć największy zakres dynamiki dla detekcji fenotypowej, zalecana jest 2-krotna seria rozcieńczeń wokół stężenia LD50 danego stresora. Można to zrobić wcześniej, aby określić optymalne stężenie, przy którym można zaobserwować zarówno zwiększony, jak i zmniejszony wzrost.
  5. Jako końcową kontrolę równoległą, zaszczepij trzecią 384-dołkową płytkę w ten sam sposób, z tym samym stresorem zawartym w pożywce, która nie wywoła ekspresji plazmidu. Upewnij się, że płytka zawiera 45 μl SD-URA (0,74 g CSM-URA, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów i 20 g glukozy na 1 l) na studzienkę i jest zaszczepiona jak w krokach 1.3 i 1.4.
  6. Natychmiast umieść płytki z komórkami na układarce mikropłytek i ustaw protokół dla 72-godzinnej pętli ciągłej, mierząc OD600 za pomocą czytnika mikropłytek wyposażonego w układarki w temperaturze pokojowej i atmosferycznym CO2 (407,05 ppm).
    Uwaga: Częstotliwość pomiaru wzrostu będzie zależeć od liczby płytek (ostatecznie określanej przez liczbę genów i warunków, które badacz chce zbadać) użytych w serii. Im więcej użytych płytek, tym więcej czasu zajmie czytnikowi płytek wykonanie pętli, a co za tym idzie, dłuższy czas między pomiarami (czas pomiaru na płytkę wynosi ~45 s, w zależności od zastosowanego oprzyrządowania).
  7. Po pomiarach wzrostu użyj tego samego robota do obsługi cieczy, aby przenieść 1 μl na studzienkę kultur indukowanych przez SGal-URA (tj. tych, w których wystąpiła nadekspresja białka) na nowe 384-dołkowe płytki zawierające 45 μl SD-URA na studzienkę (pożywka, która nie pozwala na ekspresję białka plazmidu).
    1. Równolegle należy przeprowadzić analogiczne inokulacje drugiego zestawu 384-dołkowych płytek zawierających 45 μl SD-URA na studzienkę z kultur, które były hodowane w SD-URA w obecności stresorów (tj. tych z kroku 1.5).
    2. Hodować płytki przez 48 godzin w temperaturze 30 °C do nasycenia w wilgotnej komorze (tj. zamykanym plastikowym pojemniku z wilgotnym ręcznikiem papierowym w środku).
  8. Pobrać płytki z poprzedniego kroku i ponownie zaślepić 1 μl na studzienkę w 384-dołkowych płytkach zawierających 45 μl SD-URA. Następnie wykonaj oddzielną reinokulację 1 μl na studzienkę z tej samej płytki źródłowej do oddzielnej 384-dołkowej płytki zawierającej 45 μl SD-URA ze stresorem.
    UWAGA: Pozwoli to określić, czy fenotypy wrażliwości/odporności na stresor utrzymują się po ustaniu nadekspresji białka.
  9. Natychmiast umieść płytki z komórkami na układarce mikropłytek i ustaw protokół dla 48-godzinnej pętli ciągłej mierzącej OD600 za pomocą czytnika mikropłytek w temperaturze pokojowej i atmosferycznym CO2 (407,05 ppm).
  10. Eksportuj pomiary czasu w funkcji OD600 jako tabelę XY za pomocą oprogramowania do odczytywania płyt. Zgrupuj kolumny OD600 dla każdej kontrpróby biologicznej i oblicz średnią. Utwórz wykres XY czasu w funkcji OD600, aby wygenerować krzywe wzrostu.
    1. Porównaj tempo wzrostu kultur, które zostały poddane nadekspresji w przeszłości (tj. tych pierwotnie indukowanych w pożywce zawierającej galaktozę przed reinokulacją w SD-URA) z kulturami, które tego nie zrobiły (tj. tych, które rozmnażały się w glukozie), jak opisano wcześniej30.
  11. W przypadku kultur, które wykazują znaczące różnice we wzroście w odpowiedzi na dany stresor, w zależności od nadekspresji białka przodków, należy pobrać 1 μl z każdej kontrpróby biologicznej, rozcieńczyć go w 10 ml wody, a następnie umieścić 50 μl na płytkach zawierających 5-FOA (0,74 g CSM-URA, 1 g 5-FOA, 50 mg uracylu, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 g glukozy i 20 g agaru na litr). Rośnie w temperaturze 30 °C przez 3 dni.
    1. Jeśli spowoduje to zbyt wiele lub zbyt mało kolonii na płytce, należy odpowiednio dostosować współczynnik rozcieńczenia.
      Uwaga: 5-FOA jest przekształcany w toksyczny produkt pośredni przez szlak biosyntezy uracylu. Spowoduje to utratę plazmidu ekspresyjnego oznaczonego URA3 przekształconego w pierwszym kroku.
  12. Wybierz 8-32 pojedyncze kolonie za pomocą autoklawowanych wykałaczek i przypnij je do 96-dołkowych płytek zawierających 150 μl SD-CSM. Rosnąć do nasycenia przez 48-72 godziny w wilgotnej komorze w temperaturze 30 °C. Użyj tych kultur do zaszczepienia dwóch nowych zestawów 96-dołkowych płytek zawierających 150 μl SD-CSM, zarówno z czynnikami stresogennymi z kroku 1.11, jak i bez nich.
  13. Umieść płytki na układarce do mikropłytek i ustaw protokół pomiaru OD600 w 48-godzinnej pętli ciągłej.
  14. Przeanalizuj dane jak w kroku 1.10 i potwierdź, że znaczące różnice wzrostu obserwowane w kroku 1.10 utrzymują się po utracie plazmidu.
    UWAGA: Komórki te mają stabilne stany fenotypowe, które mogą wskazywać na dziedziczenie oparte na białkach.
  15. Przetestuj komórki, które utrzymywały indukowane fenotypy, pod kątem klasycznych cech dziedziczenia opartego na białkach (patrz poniżej).

2. Testy na dziedziczenie prionów

  1. "Utwardzanie" za pośrednictwem białka opiekuńczego
    1. Przetestuj zależność od białka opiekuńczego Hsp104.
      1. Wybierz kolonię szczepu drożdży o stabilnym stanie fenotypowym, rozprowadź do pojedynczych kolonii na płytce YPD (10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu, 20 g glukozy i 20 g agaru na 1 l) zawierającej 3 mM GdnHCl i rosnąć w temperaturze 30 °C przez 3 dni. Równolegle w ten sam sposób należy wydzielić kolonię z naiwnego szczepu do pojedynczych kolonii na YPD+ 3 mM GdnHCl jako kontrolę.
      2. Powtórzyć jeszcze 2 razy na świeżych płytkach YPD zawierających 3 mM GdnHCl.
      3. Ponieważ ekspozycja na GdnHCl może zwiększyć częstotliwość, z jaką powstają drobne komórki, wybierz wiele kolonii, które przeszły 3 pasaże na GdnHCl i sprawdź funkcjonalne oddychanie mitochondrialne, badając ich zdolność do wzrostu w widoczne kolonie na płytkach YP-Glycerol (10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu, 20 ml glicerolu i 20 g agaru na 1 l) po 7 dniach.
      4. Wybierz wiele kolonii z płytek YP-Glycerol i przetestuj utrzymanie stabilnych stanów fenotypowych za pomocą wzrostu w obecności stresora w porównaniu z nie"wyleczonymi" i naiwnymi (tj. Komórkami izogenicznymi, które nie mają stanu fenotypowego, takimi jak haploidy BY4741 MATa) w podobny sposób, jak opisano w kroku 1.13.
    2. Przetestuj zależność od białka opiekuńczego Hsp70.
      1. "Wyleczyć" za pomocą plazmidu.
        1. Przekształć zarówno komórki naiwne, jak i komórki o stabilnych stanach fenotypowych za pomocą plazmidów znakowanych URA3 wyrażających dominujący ujemny allel Hsp70 (K69M)25,31 z silnego promotora konstytutywnego (GPD).
        2. Dla każdego z nich należy wybrać pojedyncze transformanty, rozbić na pojedyncze kolonie na płytce SD-URA (0,74 g CSM-URA, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 g glukozy i 20 g agaru na 1 l) i rosnąć przez 3 dni w temperaturze 30 °C i atmosferycznym CO2 .
        3. Powtórz to przejście jeszcze 2 razy na płytkach SD-URA.
        4. Wybierz wiele kolonii i przechodź do pojedynczych kolonii na płytkach 5-FOA, aby wyeliminować plazmid.
        5. Wybrać wiele pojedynczych kolonii dla każdego izolatu i przeprowadzić test na utrzymanie (lub utratę) stabilnych stanów fenotypowych w podobny sposób, jak opisano w kroku 1.13.
      2. "Wyleczyć" poprzez krzyżowanie genetyczne.
        1. Krzyżuj szczepy haploidalne BY4741 MATo stabilnych stanach fenotypowych i naiwne szczepy przeciwnego typu krycia (w tym przypadku BY4742 MATα) zawierające delecje genetyczne w dwóch z czterech paralogów drożdży Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ).
          UWAGA: Ten szczep ma niedobór funkcji opiekuńczej Hsp70.
        2. Do wzrostu diploidów należy wybrać poprzez smugowanie do pojedynczych kolonii na pożywce SD-LYS-MET (0,74 g CSM-LYS-MET, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 g glukozy i 20 g agaru na 1 l) pożywki z podwójnym dropoutem.
        3. Zbieraj pojedyncze diploidalne kolonie i hoduj przez 24 godziny w temperaturze 30 °C w 8 ml pożywki przed zarodnikowaniem (0,8% ekstraktu drożdżowego, 0,3% peptonu, 10% dekstrozy i 100 mg/l siarczanu adeniny).
        4. Wirować kultury przez 3 minuty przy 3,000 xg, odessać pożywkę przed zarodnikowaniem (pre-SPO) i raz umyć granulki sterylną wodą.
        5. Ponownie zawiesić granulki w 2 ml pożywki zarodnikowej (1% octanu potasu, 0,1% ekstraktu drożdżowego, 0,05% glukozy i 0,01% mieszanki uzupełniającej aminokwasy (2 g histydyny, 10 g leucyny, 2 g lizyny i 2 g uracylu)). Rośnie w temperaturze 25°C przez 5 dni.
        6. Przenieść kultury do temperatury 30 °C i inkubować przez dodatkowe 48 godzin.
        7. Oceń skuteczność zarodnikowania, szukając obecności tetrad za pomocą mikroskopu świetlnego32.
        8. Weź 40 μl kultury, wiruj przez 1 minutę przy 3,000 xg w probówce o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić w równej objętości mieszanki enzymów zymoliazy (1 M sorbitol, 0,1 M EDTA i 10 mg / ml zymoliazy 100T)
        9. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
        10. Nałożyć 10 μl strawionej kultury na bardzo suchą, bardzo równą płytkę agarową YPD i pozwolić kulturze powoli rozprowadzić się po płytce w linii prostej.
        11. Pozostaw płytki do wyschnięcia na co najmniej 30 minut w okapie z przepływem laminarnym.
        12. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego rozdziel zarodniki na tetrady i ułóż je na płytce.
        13. Pozwól poszczególnym haploidalnym zarodnikom wyrosnąć w kolonie i przetestuj ich zdolność do wzrostu na płytkach SD-HIS-LEU (0,67 g CSM-HIS-LEU, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 g glukozy i 20 g agaru na 1 l), wskazując, że zawierają one obie delecje genetyczne (ssa1Δ ssa2Δ).
        14. Przetestuj każdy z nich pod kątem utrzymania stanu fenotypowego na tle z niedoborem Hsp70 w podobny sposób, jak opisano w kroku 1.13.
          UWAGA: Skrzyżowanie tych zarodników z powrotem do szczepu typu dzikiego z przywróconą funkcją Hsp70 nie powinno przywrócić fenotypu prionowego.
  2. Testowanie dziedziczenia nie-mendlowskiego.
    1. Krzyżuj szczepy haploidalne BY4741 MATo stabilnych stanach fenotypowych i izogenicznych naiwnych kontrolach z izogenicznym szczepem naiwnym o przeciwnym typie kojarzenia (w tym przypadku BY4742 MATα).
    2. Wybierz wzrost diploidów, przesuwając się do pojedynczych kolonii na pożywce SD-LYS-MET z podwójnym dropoutem.
    3. Zebrać pojedyncze kolonie diploidalne i hodować przez 24 godziny w temperaturze 30 °C w 8 ml pożywki wstępnej do zarodnikowania.
    4. Powtórz kroki 2.2.2.3-2.2.2.12, jak opisano powyżej.
    5. Pozwól poszczególnym haploidalnym zarodnikom wyrosnąć na kolonie i przetestuj każdą z nich pod kątem utrzymania stanu fenotypowego poprzez mejozę, używając testu wzrostu, jak w kroku 1.13.
      Uwaga: Inną cechą charakterystyczną prionów jest to, że mogą one zostać dziedzicznie wyeliminowane poprzez usunięcie oryginalnego, przypadkowego białka. Tak więc, analogiczne skrzyżowanie szczepu prionów ze szczepem zawierającym genetyczną delecję oryginalnego indukowanego białka spowoduje zniesienie fenotypów prionów w zarodnikach, które dziedziczą delecję. Należy również zauważyć, że możliwe jest, aby prion był utrzymywany w stanie "tajemniczym" w takim mutancie, jeśli usunięty gen jest wymagany do manifestacji fenotypu prionowego, ale nie do rozmnażania samego prionu. Aby odróżnić te dwie możliwości, skrzyżuj zarodniki z powrotem do naiwnego szczepu typu dzikiego i sprawdź, czy fenotyp prionów pojawia się ponownie na diploidalnym tle genetycznym, gdzie funkcja genu została przywrócona.
  3. Cytokdukcja.
    1. Wygeneruj początkowy szczep biorcy BY4742.
      1. Poprzez transformację wprowadź wadliwy allel KAR (kar1-15), który zapobiega fuzji jądrowej podczas krycia23.
      2. Spraw, aby ten szczep był "mały" (tj. niekompetentny do oddychania mitochondrialnego), zaszczepiając pojedynczą kolonię w bulionie YPD 0,25% bromkiem etydyny.
      3. Hodować kulturę w temperaturze 30 °C do późnej fazy wykładniczej/stacjonarnej (OD600 ~ 1).
      4. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 w świeżym YPD 0,25% bromkiem etydyny i powtórzyć dwukrotnie.
      5. Gdy hodowla osiągnie późną fazę wykładniczą/wczesną stacjonarną (OD600 0,8-1,2), podaj płytkę do pojedynczych kolonii, rozcieńczając 1:10 000 w sterylnej wodzie i posiewając 50 μl na płytce YPD. Po 3 dniach uprawy w temperaturze 30 °C wybierz wiele kolonii i przetestuj każdą z nich pod kątem niewydolności oddechowej, badając ich zdolność do wzrostu w widoczne kolonie na płytkach YP-Glycerol po 7 dniach.
    2. Wykonaj wstępną cytodukcję do BY4742.
      1. Wymieszaj komórki szczepu dawcy BY4741 o stabilnym stanie fenotypowym z komórkami naiwnego szczepu biorcy BY4742 kar1-15 na powierzchni płytki agarowej YPD.
      2. Rosnąć przez 24 godziny w temperaturze 30 °C i atmosferycznym CO2 (407,05 ppm) i przenieść na pożywkę metioninową zawierającą glicerol (SGly-MET: 0,74 g CSM-MET, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 ml glicerolu i 20 g agaru na 1 l).
        UWAGA: To selekcjonuje oba markery jądrowe BY4742, a także umożliwia przywrócenie funkcjonalnych mitochondriów poprzez wymianę cytoplazmatyczną.
      3. Po 3-5 dniach należy pobrać wiele pojedynczych kolonii i przeprowadzić kolejną rundę selekcji na SD-MET (0,74 g CSM-MET, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 g glukozy i 20 g agaru na 1 l).
      4. Równolegle potwierdź, że kolonie nie są diploidami, przechodząc na pożywce SD-LYS-MET.
    3. Wykonaj odwrotne cytokdukcje.
      1. Wymieszaj nowe szczepy dawców (tym razem udane cytogenanty BY4742 kar1-15) z drobnymi naiwnymi komórkami BY4741 (wygenerowanymi jak powyżej) na agarze YPD.
      2. Powtórz cytokdukcje, jak opisano wcześniej (kroki 2.3.2.1-2.3.2.4), z wyjątkiem wyboru markerów jądrowych biorcy BY4741 na pożywce glicerolowej pozbawionej lizyny (SGly-LYS: 0,74 g CSM-LYS, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 20 ml glicerolu i 20 g agaru na 1 l).
      3. Wybierz wiele cytogenitów i przetestuj utrzymanie stabilnych stanów fenotypowych za pomocą testu wzrostu, jak wcześniej w kroku 1.13.
  4. Przemiana białek.
    1. Przygotuj lizat.
      1. Hodować 50 ml komórek posiadających stabilne stany fenotypowe w YPD przez 18 godzin w temperaturze 30 °C.
      2. Osadzać kultury w temperaturze 3 000 x g przez 4 minuty, a następnie przemyć dwukrotnie: raz w autoklawizowanymH2O, a następnie w 1 M sorbitolu.
      3. Ponownie zawiesić komórki w 200 ml buforu SCE (1 M sorbitol, 10 mM EDTA, 10 mM DTT, 100 mM cytrynian sodu i 1 tabletka inhibitora proteazy bez mini-EDTA na 50 ml, pH 5,8) z 50 U/ml enzymu litycznego drożdży 100T.
      4. Inkubować mieszaninę w temperaturze 35 °C przez 30 minut.
      5. Sonikuj komórki przy 20 kHz i intensywności 20% przez 10 s na lodzie za pomocą dysmembratora sonicznego.
      6. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      7. Przenieść supernatanty do czystej probówki i dodać RNazę I oraz biotynylowaną DNazę przy 3-krotnym nadmiarze (określonym przez jednostki aktywności) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      8. Usunąć DNazę I, dodając nadmiar kulek streptawidyny i agarozy, inkubując przez 5 minut i granulując przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 1,5 min.
      9. Przenieść supernatant do świeżej probówki.
    2. Przygotuj sferoplast biorcy.
      1. Wyhoduj 5 ml naiwnych komórek biorczych w YPD do połowy fazy wykładniczej (OD600 w zakresie 0,5-1).
      2. Zebrać przez odwirowanie (3 000 x g przez 4 min) i przemyć 4 razy: dwa razy w H2O i dwa razy w 1 M sorbitolu.
      3. Ponownie zawiesić komórki w 1 M sorbitolu zawierającym 200 U/ml enzymu litycznego drożdży i inkubować przez 15 minut w temperaturze 35 °C w celu wytrawienia ścian komórkowych.
      4. Zebrane sferoplasty należy delikatnie odwirować przy 600 x g przez 5 minut i przemyć 1 ml 1 M sorbitolu, a następnie ponownie 1 ml buforu STC (1 M sorbitol, 10 mM Tris pH7,5 i 10 mM CaCl 2).
      5. Zawiesić przemyte sferoplasty w 50 μl buforu STC.
        UWAGA: Użyj nożyczek, aby odciąć ostatnie ~0.7 cm końcówki pipety; Stworzy to szersze usta i zapobiegnie lizie sferoplastów.
    3. Przekształć naiwne komórki w białko.
      1. Przekształć 50 μl podwielokrotności sferoplastów z 50 μl lizatu dawcy, 20 μl DNA plemników łososia (2 mg/ml) i 5 μl plazmidu selekcyjnego oznaczonego URA3 (np. pAG426-GFP)28,33.
      2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 °C przez 30 minut.
      3. Wirować przez 5 minut przy 600 x g w celu zebrania sferoplastów i ponownego zawieszenia w 150 μl buforu SOS (1 M sorbitol, 7 mM CaCl2, 0,25% ekstraktu drożdżowego i 0,5% peptonu).
      4. Odzyskiwać przez 30 minut w temperaturze 30 °C.
      5. Umieść całą kulturę na płytkach SD-URA.
      6. Szybko nałożyć na posiażdżoną kulturę ciepłą (~45 °C) SD-URA zawierającą 0,8% agar.
        Uwaga: Zapobiegnie to pękaniu sferoplastów
      7. Inkubować płytki transformacyjne przez 2-3 dni w temperaturze 30 °C.
      8. Za pomocą wykałaczki wybierz pomyślnie rosnące komórki z nałożonej płytki i ponownie rozprowadź je do pojedynczych kolonii na płytkach SD-URA.
      9. Wybierz dziesiątki kolonii dla każdej z nich i rozprowadź smugi na płytkach 5-FOA, aby wyeliminować plazmid nośnikowy oznaczony URA3.
      10. Wybierz kolonie, które rosną na płytkach 5-FOA i przetestuj transfer stabilnych stanów fenotypowych za pomocą testu wzrostu, jak poprzednio (krok 1.13).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że nadekspresja białek radykalnie zmienia fenotypy komórkowe27. Rzeczywiście, dzięki wstępnemu podejściu przesiewowemu, setki nowych fenotypów zostały odtwarzalnie odzyskane z nadekspresji klonów drożdży ORFeome przy użyciu zaledwie dziesięciu stresorów. Jednak opisane powyżej testy pozwalają ocenić, czy komórki zachowują jakiekolwiek długoterminowe stabilne fenotypy po tej nadekspresji. Jednym z białek zdolnych do kodowania takiego stanu jest Psp1. Psp1 j...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwsze priony drożdży zostały zidentyfikowane na podstawie ich niezwykłych fenotypów i kłopotliwych wzorców dziedziczenia. Charakterystykę tych prionów wykorzystano następnie do zbudowania algorytmów i narzędzi obliczeniowych do badań przesiewowych w poszukiwaniu dodatkowych białek prionowych. Opisana tutaj metoda jest natomiast eksperymentalna i opiera się na przejściowej nadekspresji w celu wytworzenia trwałej zmiany - stabilnego stanu - kodowanego w konformacji białka. Jeśli jednak skuteczność "wysiewu" składania pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Sohini Chakrabortee, Sandrze Jones, Davidowi Garcii, Bhupinderowi Bhullarowi, Amelii Chang, Richardowi She, i Susan Lindquist za pomoc w opracowaniu testów użytych w tym artykule, a także recenzentom za ich przemyślane komentarze.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chlorowodorek guanidynySigmaCat#G3272-25GChemiczny
chlorek manganuSigmaCat#M8054-100GChemiczny
bromek etydynySigmaE1510Chemiczny
kwas 5-fluoroorotycznySigmaCat#F5013-50MGChemiczny
BY4741 MATa (his3Δ 1 leu2Δ 0 LYS2 met15Δ 0 ura3 i Delta; 0)Winston i wsp., 1995; Brachmann et al., 1998N/ASzczep drożdży
BY4741 MATα (his3Δ 1 leu2Δ 0 lys2Δ 0 MET15 ura3Δ 0)Winston i wsp., 1995; Brachmann et al., 1998N/ASzczep drożdży
Hsp70 (K69M) Jarosz i wsp., 2014bNie dotyczy
Plazmid FLEXGene bibliotekaHu i wsp., 2007Nie dotyczyBiblioteka plazmidów
Dekstroza (glukoza)Fisher ScientificD16-3Składnik podłoża
RafinozaSigmaR0250-25GSkładnik medialny
GalactoseFisher ScientificBP656-500Składnik mediów
CSMSunrise Science1001-100Komponent medialny
CSM-URASunrise Science1004-100Komponent medialny
CSM-LYSSunrise Science1032-100Komponent medialny
CSM-METSunrise Science1019-100Składnik medialny
CSM-LYS-METSunrise Science1035-100Składnik podłoża
ekstrakt drożdżowyFisher NaukowyBP1422-2Składnik pożywki
peptonResearch Products InternationalP20240-5000Składnik pożywki
baktopeptonBD211677Składnik podłoża
glicerolEMD MilliporeGX0185-2Składnik podłoża
azotowa bez aminokwasówBD291920podłoża
agarIBI Scientific IB49172Składnik medialny
Siarczan adeninySigmaA3159-25GSkładnik podłoża
Octan potasuSigmaP1190-500GSkładnik podłoża
UracilSigmaU0750-100GSkładnik podłoża
HistydynaSigmaH8000-100GSkładnik medialny
LeucynaSigmaL8000-25GKomponent medialny
LizynaSigmaL5501-25GKomponent medialny
RNaza I Thermo Fisher ScientificEN0601
Biotynylowana enzymatyczna DNazaThermo Fisher ScientificAM1906Enzymatyka
zymoliaza 100T (enzym lityczny drożdży)Sunrise ScienceN0766555Czytnik
mikropłytekenzymatycznych BioTekSynergy H1Sprzęt
Układarka do mikropłytekBioTekBioStack3Tabliczka sprzętowa
napełniaczBiotTekEL406Sprzęt
Robot do obsługi cieczyBeckman CoulterBiomek FXSprzęt
drożdże zasada Składnik

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
  2. Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).
  3. Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
  4. True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
  5. Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
  6. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
  7. Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
  8. Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
  9. Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
  10. Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
  11. Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
  12. Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
  13. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  14. Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
  15. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  16. Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
  17. Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
  18. Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
  19. King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
  20. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
  21. Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
  22. Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
  23. Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
  24. Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
  25. Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
  26. Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
  27. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  28. Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
  29. Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
  30. Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766(2016).
  31. Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
  32. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  33. Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).
  34. Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
  35. Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
  36. Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
  37. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
  38. Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
  39. Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
  40. Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
  41. Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
  42. Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
  43. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein based InheritanceYeast ORFeome ScreeningHigh throughput PhenotypingPrion Protein DetectionManganese Chloride StressorHSP104 DisaggregasePSP1 Open Reading FrameNon mendelian InheritanceYeast Prion FieldEpigenetic Screening

Related Articles