Dyspersja nanomateriałów w środowisku wodnym: w kierunku optymalizacji protokołu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół dyspersji nanomateriałów w środowisku wodnym z charakterystyką w czasie rzeczywistym w celu określenia optymalnych warunków sonikacji, intensywności i czasu trwania dla poprawy stabilności i jednorodności dyspersji nanocząstek bez wpływu na integralność próbki.

Streszczenie

Proces sonikacji jest powszechnie stosowany do deaglomeracji i dyspersji nanomateriałów w pożywkach wodnych, niezbędnych do poprawy jednorodności i stabilności zawiesiny. W tym badaniu przeprowadzane jest systematyczne podejście krokowe w celu zidentyfikowania optymalnych warunków sonikacji w celu uzyskania stabilnej dyspersji. Podejście to zostało przyjęte i okazało się odpowiednie dla kilku nanomateriałów (tlenek ceru, tlenek i nanorurki węglowe) zdyspergowanych w wodzie dejonizowanej (DI). Jednak przy każdej zmianie rodzaju nanomateriału lub ośrodka dyspergującego konieczna jest optymalizacja podstawowego protokołu poprzez dostosowanie różnych czynników, takich jak czas sonikacji, moc i typ sonikatora, a także wzrost temperatury podczas procesu. Podejście to szczegółowo rejestruje proces dyspersji. Jest to konieczne do zidentyfikowania punktów czasowych, a także innych wyżej wymienionych warunków podczas procesu sonikacji, w których mogą wystąpić niepożądane zmiany, takie jak uszkodzenie powierzchni cząstek, wpływając tym samym na właściwości powierzchni. Naszym celem jest zaoferowanie zharmonizowanego podejścia, które może kontrolować jakość końcowej, wyprodukowanej dyspersji. Taka wytyczna ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia powtarzalności jakości dyspersji w społeczności nanonaukowej, szczególnie w dziedzinie nanotoksykologii.

Wprowadzenie

Sonikacja to proces generowania kawitacji, który polega na tworzeniu, wzroście i zapadaniu się pęcherzyków (często nazywanych gorącymi punktami) powstałych w cieczy w wyniku naświetlania ultradźwiękami o wysokiej intensywności¹. W warunkach laboratoryjnych metoda sonikacji jest przeprowadzana przy użyciu sonikatora. Istnieją różne sonigatory, z których wszystkie mają ogólną funkcję deaglomeracji cząstek, które rozpraszają się w ciekłym ośrodku jako pojedyncze (lub pierwotne) cząstki. Dzięki zastosowaniu sonikacji, jednorodność próbki może ulec poprawie, potencjalnie osiągając znacznie węższy rozkład wielkości cząstek. Ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę w procesie dyspersji, jest stabilność końcowej dyspersji. W tym przypadku stabilność zawiesiny definiuje się jako sytuację, w której cząstki nie osiadają ani nie osadzają się w stanie rozproszonym, a średnie pomiary średnicy hydrodynamicznej nie różnią się o więcej niż 10% między pięcioma powtórzonymi pomiarami wykonanymi w tym czasie (około 10 minut)^2,3. Istnieje kilka sposobów pomiaru stabilności dyspersji. Obejmuje to oszacowanie potencjału zeta (ZP) poprzez pomiar ruchliwości elektroforetycznej cząstek. Innym jest pomiar charakterystycznej absorpcji nanocząstek w zakresie widma UV⁴.

W dziedzinie nanotoksykologii, możliwość kontroli jakości dyspersji jest bardzo ważna, ponieważ etap dyspersji określi kluczowe właściwości fizykochemiczne, takie jak wielkość/rozkład wielkości cząstek, kształt, agregacja/aglomeracja, ładunek powierzchniowy, itp. To z kolei ostatecznie wpłynie na interakcję cząstek z pożywkami testowymi i wyniki różnych badań in vitro i in vivo eksperymentów w celu określenia potencjalnych zagrożeń związanych z nanomateriałami.

Sonikacja jest zwykle przeprowadzana za pomocą sondy (bezpośredniej) lub kąpieli ultradźwiękowej, lub sondy ultradźwiękowej z głośnikiem wysokotonowym w fiolce (sonikacja pośrednia). Wszystkie rodzaje sonikacji są dostępne w różnych ustawieniach intensywności i mocy wyjściowej, czasami dostosowywane do innego rodzaju sonotrody do określonych procesów lub wymagań, i są odpowiednie dla objętości cieczy w zakresie od 2 do 250 ml. Chociaż wiadomo, że ultradźwięki sondą działają lepiej niż sonikacja w kąpieli ze względu na wysoką miejscową intensywność⁵, sonikacja kąpielą jest często preferowana w stosunku do typu sondy do przygotowania zawiesin do badań toksykologicznych ze względu na możliwe ryzyko zanieczyszczenia końcówki, erozję tytanowej końcówki sondy po długotrwałym użytkowaniu oraz rozbieżności w głębokości zanurzenia sondy. Podobnie, sonda ultradźwiękowa wyposażona w głośnik wysokotonowy z fiolką jest korzystniejsza w stosunku do sondy bezpośredniej ze względu na wyżej wymienione ryzyko zanieczyszczenia, a także łatwość obsługi sprzętu. Kilka fiolek jest sonikowanych w tym samym czasie i z tą samą intensywnością. To nie tylko oszczędza czas, ale także zapewnia, że wszystkie próbki są traktowane jednakowo, co sprawia, że wyniki między próbkami są bardziej wiarygodne i porównywalne. W badaniach nad bezpieczeństwem nanomateriałów zawsze unika się zanieczyszczeń. Jednak sonikator sondy nie spełnia tego wymagania i nie został przetestowany. Wiadomo, że sonikatory sondy powodują pewne nieuniknione skutki uboczne, takie jak zanieczyszczenie próbki z powodu erozji końcówki, a także zmniejszona wydajność energetyczna prowadząca do zmian warunków dyspersji, co pogarsza odtwarzalność danych^6,7,8. Co więcej, próbki są zwykle umieszczane w odkrytych pojemnikach, co prowadzi do utraty cieczy w wyniku parowania, a także osadzania się pyłu. Aby uniknąć tych niezamierzonych zmian, ostatnie badania zalecają alternatywne pośrednie sonikatory oparte na ich efektywnym dostarczaniu energii, jak również zapewnieniu czystości zawiesiny⁶.

Niezoptymalizowana sonikacja może mieć szkodliwy wpływ na wyniki. Potencjalnie może zmienić kluczowe właściwości fizyczne i chemiczne nanomateriałów, takie jak rozmiar, rozkład wielkości, morfologia i ładunek powierzchniowy^2,9. Wcześniejsza literatura donosiła o takich brakach w kontrolowaniu procesu sonikacji i wpływie na parametry cząstek, takich jak nano-TiO₂^5,10,11, nano-ZnO⁶ i nano-copper¹². Co więcej, wcześniejsze badania wykazały, że proces sonikacji nie tylko zmienia charakterystykę cząstek, ale także reguluje wyniki testów toksykologicznych^12,13.

Aby mieć kontrolę nad procesem dyspersji, ważne jest monitorowanie i zrozumienie, jak różne czynniki, takie jak typ sonikatora, moc i czas trwania instrumentu, objętości, itp., mogą wpływać na jakość dyspersji. W związku z tym istnieje potrzeba posiadania systematycznej procedury analizy kluczowych cech fizykochemicznych cząstek w dyspersji w różnych punktach czasowych procesu sonikacji. Chociaż takie rozważania zostały wzięte pod uwagę przez kilku badaczy, prace w tej dziedzinie są ograniczone. Bihari i wsp. badali stabilność dyspersji różnych dyspersji nanomateriałów wykonanych przy użyciu różnych energii ultradźwiękowych z różnymi stabilizatorami dyspersji¹⁴. Niedawny przegląd przeprowadzony przez Hartmannn i in. podkreślił, że chociaż wykonano prace w celu zrozumienia różnych czynników wpływających na jakość dyspersji nanomateriałów, np. rodzaj użytego sonikatora, czas sonikacji itp., nadal nie ma dobrze zdefiniowanej i powszechnie akceptowanej procedury sonikacji, która obecnie wspiera badania i badania nanotoksykologiczne^7,15.

Do monitorowania jakości dyspersji stosuje się kilka technik charakterystyki analitycznej. Obejmują one zastosowanie: dynamicznego rozpraszania światła (DLS), wirowania dyskowego, elektroforetycznego rozpraszania światła (ELS), spektroskopii w ultrafiolecie widzialnym (UV-vis) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), które mierzą odpowiednio rozkład wielkości/wielkości cząstek, potencjał zeta, stabilność dyspersji i charakterystykę morfologii. DLS jest często używany do określania średnicy hydrodynamicznej (średnia Z) cząstek i wskaźnika polidyspersyjności (PdI) dyspersji nanomateriałów. W przypadku multimodalnego rozkładu wielkości za pomocą DLS, uzyskana średnia Z może nie zgadzać się z intensywnością rozkładu wielkości ważoną intensywnością. W związku z tym można podać średnią rozkładu wielkości ważonego intensywnością. PdI odzwierciedla szeroki rozkład wielkości w skali od 0 do 1, gdzie 0 oznacza próbkę monorozproszoną, a 1 próbkę wysoce polidyspersyjną¹⁶. Wirowanie tarczowe to technika separacji stosowana do określania rozkładu wielkości cząstek za pomocą sedymentacji odśrodkowej w ciekłym medium. Cząstki osadzają się w optycznie przezroczystym i obracającym się dysku, a ilość światła rozproszonego przez cząstki, gdy docierają do krawędzi dysku, jest rejestrowana i przekształcana w rozkład wielkości cząstek za pomocą prawa Stokesa. Aby rozwiązać problem multimodalnego rozkładu cząstek, bardziej odpowiednie są techniki takie jak wirówka dyskowa, ponieważ mają one element mechanizmu separacji zintegrowany z urządzeniem. Potencjał Zeta (potencjał ζ) cząstek definiuje się jako potencjał elektryczny w ich płaszczyźnie ścinania lub poślizgu, która jest hipotetyczną granicą w podwójnej warstwie elektrycznej, która oddziela (masową) ciecz wykazującą normalne lepkość od warstwy Sterna, warstwy, która składa się głównie z przeciwjonów i uważa się, że porusza się wraz z cząstką. Potencjał zeta jest bezpośrednio związany z ładunkiem powierzchniowym cząstek, a zatem z oddziaływaniem elektrostatycznym (tj. odpychaniem/przyciąganiem) między cząstkami. Parametr ten jest zatem uważany za podstawowy wskaźnik stabilności dyspersji nanomateriałów. Zgodnie z konwencją, wartość potencjału zeta poniżej -25 mV i powyżej 25 mV jest uważana za stabilną^17,18. Stężenie i rodzaj jonów, a także pH roztworu, silnie wpływają na potencjał zeta¹⁹. ELS służy do pomiaru ruchliwości elektroforetycznej cząstek w dyspersji, a ruchliwość ta jest przekształcana w potencjał zeta za pomocą równania Henry'ego i modeli Smoluchowskiego lub Hückela. Spektroskopia UV-vis to technika stosowana do ilościowego określania światła, które jest pochłaniane i rozpraszane przez próbkę o określonej długości fali. Jest często używany do monitorowania stabilności dyspersji poprzez pomiar charakterystycznej absorpcji nanomateriałów w obszarze UV. Wreszcie, TEM jest często używany do wizualizacji i analizy rozmiaru, rozkładu wielkości, aglomeracji i kształtu nanocząstek^5,14,15,20.

Prezentujemy badanie porównawcze sześciu różnych dyspersji nanomateriałów wykonanych za pomocą kąpieli ultradźwiękowej i sondy ultradźwiękowej wyposażonej w głośnik wysokotonowy z fiolką. Stężenie cząstek, temperatura, typ sonikatora i ustawienia użyte w badaniu są określone w protokole, dzięki czemu można wywnioskować ustawienia eksperymentalne dla podobnych sond i łaźni ultradźwiękowych. Stosowane są następujące nanomateriały: srebro (Ag), tlenek ceru (CeO₂), tlenek (ZnO, NM110-hydrofilowy i NM111-hydrofobowy) oraz nanomateriały na bazie węgla, takie jak nanorurki węglowe (A32 i A106, patrz tabela materiałów).

Ocena jakości dyspersji w różnych punktach czasowych procesu sonikacji jest dokonywana przy użyciu różnych technik charakteryzacji, a mianowicie DLS dla rozkładu wielkości cząstek, Wirowania Dyskowego dla rozkładu wielkości, ELS dla potencjału zeta, spektroskopii UV-vis dla stabilności i TEM dla kształtu i jednorodności cząstek. Ocenie poddano szereg różnych nanomateriałów, od tlenków metali po materiały na bazie węgla. Dla porównania, komercyjną wodną zawiesinę nanocząstek srebra (Ag NPs) stabilizowaną czapeczką cytrynianową stosuje się równolegle, aby wywnioskować oczekiwaną długoterminową stabilność odpowiedniej dostępnej na rynku zawiesiny. Oczywiście, ten model Ag NPs nie jest bezpośrednio związany z żadną z procedur dyspersji, ale działa wyłącznie w celu wskazania na potrzebę ponownej sonifikacji lub ponownej stabilizacji zawiesin po pewnym czasie przechowywania, ponieważ zmiany, takie jak ponowna aglomeracja, muszą wystąpić podczas przechowywania. Zawiesinę przechowuje się w lodówce przez dwa miesiące. W tym okresie dyspersja jest charakteryzowana w celu identyfikacji potencjalnej aglomeracji cząstek. Wstępne wyniki wskazują na niestabilne zawieszenie (jak omówiono w sekcji Wyniki). Następnie dyspersja ta jest dalej poddawana różnym zabiegom sonikacyjnym, podobnie jak w przypadku innych nanomateriałów użytych w badaniu. Celem badania jest potwierdzenie, że możemy zdeaglomerować zawiesinę za pomocą tego samego protokołu sonikacji. Model Ag NPs może być zatem powiązany jako punkt odniesienia dla długoterminowych badań reprezentujących redyspersję cząstek w zoptymalizowanej formie.

Przedstawione tutaj protokoły dyspersji są podobne do tych opublikowanych we wcześniejszej literaturze i zawierają niektóre z niewielu zaleceń wcześniej wydanych przez byłych pracowników7^{,21,22,23,24,25}. W tym badaniu zastosowano systematyczne i etapowe podejście do monitorowania jakości dyspersji w całym protokole dyspersji. Podejście to polega na charakterystyce dyspersji nanomateriałów w czasie rzeczywistym w celu określenia optymalnych warunków dyspersji eksperymentalnej (rysunek 1).

Rysunek 1. Schemat blokowy przedstawiający schemat i sekwencję krokową protokołu dyspersji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

UWAGA: Wszystkie chemikalia są używane w takiej postaci, w jakiej zostały dostarczone, bez dalszego oczyszczania. Przez cały czas trwania badania należy stosować wodę ultraczystą o rezystywności 18 MΩ·cm. Wszystkie przygotowane dyspersje są zazwyczaj przechowywane w temperaturze 5 °C w ciemności w celu dalszej charakterystyki lub przyszłych badań stabilności, ale może się to różnić w zależności od składu materiału i innych powiązanych właściwości, takich jak rozpuszczanie. Na przykład NP Ag są na ogół stabilne przez pewien czas, jeśli są przechowywane w temperaturze od 2 do 5 °C z dala od światła słonecznego; Jednak w zawiesinach z pewnością zajdą dynamiczne zmiany, a dyspersje mimo to ponownie się zbrylą i wiadomo, że z czasem osiadają. Przeanalizuj te materiały za pomocą DLS, UV-vis i TEM w celu weryfikacji jakości przed testami biologicznymi^4,5^,13,14. Do poniższej analizy stosuje się stężenie 0,02 mg/ml. Stężenie próbki nadaje się do analizy za pomocą DLS, UV-vis, wirówki dyskowej, obliczeń potencjału zeta i analizy TEM.

1. Kalibracja mocy dostarczanej przez sonitorów

UWAGA: Efektywna moc akustyczna dostarczana do sonikowanej zawiesiny jest ważnym parametrem w celu uzyskania powtarzalnych dyspersji. Różni się to od elektrycznej mocy wejściowej lub wyjściowej generatora wskazanej przez producenta, ponieważ jest to rzeczywista moc, która jest dostarczana do zawieszenia podczas sonikacji²⁶. Spośród wielu metod obliczania efektywnej mocy dostarczanej, najczęściej stosowaną metodą jest kalorymetria²⁶. Wiadomo, że jest to prosty i wydajny sposób bezpośredniego pomiaru efektywnej mocy dostarczanej do zawieszenia⁷. W tej metodzie wzrost temperatury cieczy przy danym ustawieniu sonikatora jest rejestrowany w czasie, a dostarczana moc efektywna jest obliczana za pomocą następującego równania:

gdzie P jest dostarczaną mocą akustyczną (W), T jest temperaturą (K), t odpowiada czasowi (s), C_P jest ciepłem właściwym cieczy (4,18 J/g·K dla wody), a M jest masą cieczy (g).

1. Kalibracja dostarczanej mocy za pomocą sondy ultradźwiękowej wyposażonej w fiolkę z głośnikiem wysokotonowym
   UWAGA: Metoda została zaadaptowana z Taurozzi i wsp.⁷ i zalecane są następujące kroki.
   1. Umieść pustą plastikową fiolkę na mikrowadze i wytaruj wagę.
   2. Napełnić fiolkę 1,5 ml wody demineralizowanej (rezystywność 18 MΩ·cm) i zanotować masę płynu za pomocą wagi.
   3. Umieścić fiolkę w jednym z sześciu otworów na fiolkę w części wysokotonowej fiolki o dużej intensywności i zanurzyć sondę temperatury podłączoną do cyfrowego miernika temperatury za pomocą zacisku. Upewnij się, że sonda nie dotyka ścianek fiolki i znajduje się około 2 cm poniżej powierzchni płynu.
   4. Ustaw głośnik wysokotonowy fiolki na 24 kHz i 10 W (regulacja amplitudy na 50%) i pracuj w trybie ciągłym.
      UWAGA: Inne testowane tutaj regulacje amplitudy to 70%, 90% i 100%.
   5. Zanotować wzrost temperatury wody przez początkowe 5 minut w odstępie 30 s i upewnić się, że fiolka lub zestaw nie zmieniają pozycji.
   6. Utwórz wykres temperatury w funkcji czasu w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego i uzyskaj najlepsze dopasowanie liniowe do krzywej przy użyciu regresji metodą najmniejszych kwadratów.
   7. Uzyskaj nachylenie wykresu (które jest wzrostem temperatury w czasie) i oblicz moc dostarczaną za pomocą równania 1. Powtórz eksperyment trzy razy i uzyskaj wartość średnią.
   8. Powtórz procedurę z kroków 1.1.1 - 1.1.4 dla ustawień amplitudy 70%, 90% i 100%. Wartość mocy uzyskana przy użyciu tej procedury jest podawana podczas procedury dyspersji.
2. Kalibracja dostarczanej mocy za pomocą kąpieli ultradźwiękowej
   1. Umieść pustą plastikową fiolkę na mikrowadze i wytaruj wagę.
   2. Napełnić fiolkę 1,5 ml wody demineralizowanej (rezystywność 18 MΩ·cm) i zanotować masę płynu za pomocą wagi.
   3. Umieścić fiolkę na środku kąpieli ultradźwiękowej do połowy zanurzonej w wodzie i zabezpieczyć ją zaciskiem. Zanurz sondę temperatury podłączoną do cyfrowego miernika temperatury za pomocą clamp. Upewnij się, że sonda nie dotyka ścianek fiolki i znajduje się około 2 cm poniżej powierzchni płynu.
   4. Ustaw kąpiel ultradźwiękową na 40 KHz i 80 W i pracuj w trybie ciągłym.
   5. Zanotować wzrost temperatury wody przez początkowe 5 minut w odstępie 30 s i upewnić się, że fiolka lub zestaw nie zmieniają pozycji.
   6. Utwórz wykres temperatury w funkcji czasu w programie Excel i uzyskaj najlepsze dopasowanie liniowe do krzywej przy użyciu regresji metodą najmniejszych kwadratów.
   7. Uzyskaj nachylenie wykresu w arkuszu kalkulacyjnym (które jest wzrostem temperatury w czasie) i oblicz moc dostarczaną za pomocą równania 1. Powtórz eksperyment trzy razy i uzyskaj wartość średnią. Wartość mocy uzyskana przy użyciu tej procedury jest podawana podczas procedury dyspersji.

2. Procedura dyspersji w środowisku wodnym przy użyciu sondy ultradźwiękowej wyposażonej w głośnik wysokotonowy w fiolce

1. Odważyć 2 mg każdego z wymaganych nanoproszków za pomocą czystej szpatułki do trzech fiolek z czystego szkła. Oznacz je jako fiolki 1, 2 i 3.
2. Odpipetować 1 ml wody demineralizowanej i dodać wzdłuż ścianek każdej fiolki. Przygotuj gęstą pastę za pomocą czystej, cienkiej szklanej pałeczki, a następnie dodaj resztę wody, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mg/ml. W przypadku próbki hydrofobowej należy przeprowadzić wstępne zwilżanie przy użyciu 1 ml etanolu o stężeniu 0,5% obj. i dodać wodę demineralizowaną w celu uzupełnienia wymaganego stężenia końcowego.
3. Uszczelnić każdą fiolkę nakrętką i dobrze wstrząsnąć poziomymi ruchami okrężnymi, aby usunąć wszelkie nanoproszki przyklejające się do ścianek fiolki.
4. Umieść trzy fiolki w sondzie ultradźwiękowej wyposażonej w głośnik wysokotonowy fiolki i zastosuj pierwszą procedurę sonikacyjną przez 2 minuty przy 1,1 W w trybie pulsacyjnym (1 s/1 s, co oznacza 1 s wł. i 1 s wyłączoną). Spowoduje to wzrost temperatury w dyspersji o około 4 °C.
5. Wyjąć fiolkę nr 1 i odpipetować odpowiednią ilość podwielokrotności z górnej części fiolki, rozcieńczyć ją wodą demineralizowaną do stężenia 0,02 mg/ml. Scharakteryzuj rozcieńczoną dyspersję pod kątem wielkości, rozkładu wielkości cząstek, kształtu, aglomeracji i potencjału zeta, stosując szereg uzupełniających się technik, takich jak DLS, TEM, UV-vis i ELS (omówione w sekcji 4). Dokładnie rejestruj i dokumentuj pomiary.
6. Przerwać na 10 minut od kroku 2.4, aby umożliwić schłodzenie próbki i uniknąć nagłego wzrostu temperatury w systemie. Zastosuj drugi zabieg sonikacyjny do fiolek 2 i 3 przez 4 minuty przy tych samych ustawieniach amplitudy i trybu pulsacyjnego. Wyjmij fiolkę 2, powtórz krok 2.5 i udokumentuj odczyty po 6 minutach sonikacji.
7. Zrób przerwę na 10 minut, zastosuj trzeci zabieg sonikacji do fiolki 3 na kolejne 4 minuty, a następnie postępuj zgodnie z krokiem 2.5. Zapisz i udokumentuj pomiary po 10 minutach sonikacji (omówione w rozdziale 4).
   UWAGA: Podczas pracy z zawiesinami nanocząstek należy nosić fartuchy laboratoryjne, rękawice i gogle. Podczas dłuższych eksperymentów sonikator musi być umieszczony w obudowie akustycznej, a nauszniki o wysokiej ochronie muszą być noszone podczas pracy bliżej źródła ultradźwięków.

3. Procedura dyspersji w środowisku wodnym przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej

1. Zważyć 2 mg każdego z wymaganych nanoproszków za pomocą czystej szpatułki w czterech fiolkach z czystego szkła i oznaczyć je jako fiolki 4, 5, 6 i 7.
2. Odpipetować kilka kropel wody DI i dodać wzdłuż ścianek każdej fiolki i uzyskać gęstą pastę za pomocą czystej, cienkiej szklanej pałeczki. Następnie dodaj resztę wody, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mg/ml w każdej fiolce.
   UWAGA: W przypadku próbki hydrofobowej wstępne zwilżanie przeprowadza się przy użyciu 1 ml etanolu o stężeniu 0,5% obj./obj., a następnie dodaje się wodę demineralizowaną w celu uzupełnienia wymaganego stężenia końcowego.
3. Uszczelnić każdą fiolkę nakrętką i dobrze wstrząsnąć poziomymi ruchami okrężnymi, aby usunąć wszelkie nanoproszki przyklejające się do ścianek fiolki.
4. Umieścić cztery fiolki w środku kąpieli ultradźwiękowej z fiolkami do połowy zanurzonymi w wodzie i zastosować pierwszy zabieg sonikacyjny przy 80 W przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Spowodowałoby to wzrost temperatury w dyspersji o około 3 °C.
5. Wyjąć fiolkę 4 z łaźni ultradźwiękowej i odpipetować odpowiednią ilość podwielokrotności z górnej części fiolki, rozcieńczyć ją wodą demineralizowaną do stężenia 0,02 mg/ml i scharakteryzować próbkę pod względem wielkości, rozkładu wielkości cząstek, kształtu, aglomeracji i potencjału zeta, stosując szereg uzupełniających technik, takich jak DLS, TEM, UV-vis i ELS (omówione w sekcji 4). Rejestruj i dokumentuj pomiary.
6. Zmienić wodę w kąpieli ultradźwiękowej i zastosować drugi zabieg sonikacyjny do fiolek 5, 6 i 7 przez kolejne 15 minut przy tych samych ustawieniach (80 W). Wyjąć fiolkę 5, postępować zgodnie z krokiem 3.5 w celu scharakteryzowania i udokumentować odczyty po 30 minutach sonikacji.
7. Zmienić wodę w łaźni ultradźwiękowej (aby uniknąć dalszego wzrostu temperatury) i zastosować trzecią obróbkę sonikacyjną trwającą kolejne 30 minut do fiolek 6 i 7 przy tych samych ustawieniach z małą przerwą na wymianę wody ponownie po 15 minutach. Wyjąć fiolkę 6 i postępować zgodnie z krokiem 3.5. Zapisz i udokumentuj pomiary po 1 godzinie sonikacji.
8. Ponownie zmieniaj wodę w kąpieli ultradźwiękowej co 15 minut i stosuj czwartą obróbkę sonikacyjną do fiolki 7 przez kolejną godzinę, utrzymując stałe ustawienia. Wyjmij fiolkę 7 i postępuj zgodnie z krokiem 3.5, aby uzyskać pełną charakterystykę, a następnie zapisz pomiary po 2 godzinach od sonikacji.

4. Charakterystyka rozproszonych próbek w różnych punktach czasowych

1. Charakterystyka rozmiaru za pomocą DLS²⁷
   1. Otwórz oprogramowanie DLS. Utwórz plik pomiaru rozmiaru, który można zindywidualizować dla konkretnego nanomateriału (w tym jednego dla wzorca) przy użyciu wartości współczynnika załamania światła z podręcznika Malvern. Ponadto wprowadź wszelkie inne dane wymagane przez oprogramowanie, takie jak wartości absorpcji i lepkości, a także rodzaj dyspergatora.
   2. Wprowadź warunki eksperymentu dla próbki, takie jak 2-minutowy czas równowagi, temperatura 20 °C, typ kuwety jako jednorazowa kuweta o małej objętości i eksperyment działający w trybie automatycznym. Naciśnij przycisk Plik|Zapisz (zapisz z żądaną nazwą).
   3. Naciśnij "Plik|Otwórz nowy pomiar" i przeprowadzić test weryfikacyjny DLS przy użyciu standardowych kulek lateksowych o nominalnym rozmiarze 100 nm, aby zakwalifikować wydajność urządzenia
      1. Użyj jednorazowej kuwety o małej objętości. Wstrzyknąć 1 ml próbki za pomocą strzykawki lub pipet, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
         UWAGA: Przed użyciem wyczyść kuwety etanolem i wodą demineralizowaną.
      2. Włóż kuwetę do urządzenia. Kliknij przycisk "start" w panelu pomiaru pliku. Należy pamiętać, że spowoduje to zrównoważenie próbki przez 2 minuty i wykonanie pomiarów w temperaturze 20 °C.
         UWAGA: Jeśli próbki były wcześniej przechowywane w lodówce, przed użyciem pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową.
      3. Zbierz co najmniej pięć pomiarów w trybie automatycznym i wykonaj średnią z pomiarów, aby zgłosić rozmiar, wybierając wszystkie pomiary i klikając "średnia" w górnym panelu. Wyeksportuj dane do Excela w celu dalszej analizy.
      4. Średnicę hydrodynamiczną należy podać jako średnią Z, przy czym szerokość PdI reprezentuje odchylenie standardowe średniej Z w przypadku rozkładu monomodalnego²⁸. W przypadku znacznej rozbieżności między średnią Z a średnią rozkładu wielkości ważonego intensywnością, która wskazuje na polidyspersyjność lub aglomerację, podaje się średnią wyniku rozkładu wielkości ważonego intensywnością z komentarzem do statusu próbki.
      5. Powtórz krok 4.1.3 dla nowych pomiarów.
         UWAGA: DLS nie jest odpowiednią techniką do analizy próbek nieidealnych. Rozumiemy przez to próbki, które są niesferycznymi cząstkami o wysokiej polidyspersyjności, rozległej aglomeracji, sedymentacji itp. Powtarzające się pomiary mogą skutkować niedokładnymi odczytami z powodu sedymentacji/osiadania cząstek. W takich przypadkach zalecane są inne techniki uzupełniające, takie jak wirowanie dyskowe, które można zastosować do oceny dyspersji w sposób jakościowy.
2. Rozkład wielkości przez wirowanie dyskowe
   1. Otwórz oprogramowanie CPS. Wybierz "Definicja procedury", wpisz nazwę SOP próbki na górze i wypełnij parametry próbki, takie jak minimalna i maksymalna średnica, gęstość cząstek, współczynnik załamania światła, absorpcja i współczynnik niesferyczności²⁹.
      1. Na przykład w przypadku nanocząstek ZnO wprowadź 0,1 mikrona i 1,0 mikrona odpowiednio w zakładkach minimalnej i maksymalnej średnicy, wprowadź 5,61 g/ml w sekcji gęstości cząstek, 2,1 w sekcji indeksu załamania światła, 0,001 w sekcji absorpcji cząstek i 1 w sekcji niesferycznej.
   2. Wypełnij szczegóły wzorca kalibracyjnego w oparciu o wzorzec PVC o średnicy piku 0,377 μm o gęstości cząstek 1,385 g/ml. Wypełnij również parametry płynu (sacharoza, gęstość płynu 1,04 g/ml i współczynnik załamania światła płynu 1,35) oraz nazwij i zapisz procedurę.
   3. Wybierz wybraną procedurę (SOP zapisaną w kroku 4.2.1) i wstrzyknij pierwszy poziom gradientu, 1,6 ml sacharozy (24%) do otworu przez krążek i naciśnij 'start'.
      UWAGA: Rolą sacharozy jest tutaj ustanowienie gradientu gęstości w dysku podczas wirowania ze stałą prędkością. To automatycznie obliczało prędkość tarczy w zależności od zakresu rozmiarów.
   4. Poczekaj, aż oprogramowanie osiągnie automatycznie obliczone obroty na minutę (obroty na minutę). Ustabilizować sedymentację poprzez wstrzyknięcie gradientu sacharozy (8% niskiej gęstości i 24% wysokiej gęstości, patrz Tabela 1), 1,6 ml całkowitej objętości za każdym razem, zaczynając od najwyższej gęstości i kończąc na roztworze o najmniejszej gęstości.
      UWAGA: Tutaj oznaczamy 8% roztwór sacharozy jako niski, a 24% roztwór sacharozy jako wysoki. Miesza się je w kolejnych objętościach (całkowita objętość 1,6 ml za każdym razem) i wstrzykuje do krążka jeden po drugim, aż do powstania gradientu.
      1. Następnie wstrzyknąć 1,0 ml płynu z nasadką dodekanową, która pomaga utrzymać gradient wewnątrz dysku przez co najmniej 6 godzin. Pozwól, aby wirówka dyskowa osiągnęła równowagę przez 1 godzinę.
   5. Wybierz "Obsługuj analizator" i wprowadź identyfikator próbki, a następnie naciśnij start. Wstrzyknąć 0,2 ml wzorca za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml do dysku i jednocześnie nacisnąć spację. Następnie wstrzyknąć 0,2 ml próbki i jednocześnie nacisnąć spację. Poczekaj na zakończenie pomiaru, a następnie kliknij następną próbkę.
   6. Użyj oprogramowania systemu sterowania wirówką dyskową, aby uzyskać i przetworzyć dane. W tym celu kliknij "pobierz dystrybucję" i kliknij nazwę próbki; Spowoduje to otwarcie wykresu rozkładu wielkości dla próbki. Wyeksportuj dane do menedżera arkuszy kalkulacyjnych.
3. Badanie stabilności dyspersji metodą spektroskopii UV-vis
   UWAGA: Spektroskopia UV-vis jest często używana do zrozumienia stabilności i agregacji zawiesiny poprzez uważną obserwację zmian intensywności szczytu, skośności widma, kształtu spektralnego, a także przesunięcia długości fali w widmie absorpcyjnym⁴. Szczegółowe kroki są następujące.
   1. Otwórz oprogramowanie spektrofotometru UV-vis i kliknij "skanowanie widma"³⁰.
   2. Użyj standardowej kuwety kwarcowej (półprostokątna kuweta kwarcowa 100 mm, 190 - 2,700 nm). Wstrzyknąć 2-3 ml próbki za pomocą pipety.
      1. Przed użyciem umyj kuwety 50% kwasem azotowym przez 10 minut, a następnie umyj trzykrotnie oczyszczoną wodą. Następnie spłucz acetonem, usuń nadmiar i wysusz na powietrzu.
   3. Ustaw zakres ustawień przyrządu na długość fali od 700 nm do 200 nm w zakładce długości fali, klikając "Instrument" u góry panelu oprogramowania i klikając "ustaw długość fali".
   4. Kliknij "linia bazowa". Tło odejmuje każde widmo za pomocą odpowiadającego mu "ślepego miejsca", tj. kuwety wypełnionej tylko medium dyspergującym, którym w tym przypadku jest woda.
      UWAGA: W przypadku próbek hydrofobowych jako medium dyspergujące stosuje się podobny stosunek etanolu do wody.
   5. Zbierz co najmniej trzy indywidualne widma na każdej próbce, klikając "Instrument| Właściwość" i wpisać "3" w liczbie widm. Weź średnie wartości do analizy. Zapisz dane i wyeksportuj je do dalszej analizy.
4. Pomiary potencjału Zeta za pomocą ELS
   1. Otwórz oprogramowanie DLS. Utwórz plik pomiaru potencjału zeta, który można zindywidualizować dla konkretnego nanomateriału, korzystając z wartości współczynnika załamania światła z podręcznika Malvern. Wprowadź inne informacje, które można podłączyć do oprogramowania, np. absorpcję, lepkość i rodzaj dyspergatora, jak można znaleźć w zakładce ustawień próbki. Kliknij "Plik|Zapisz" i zapisz pod żądaną nazwą.
   2. Kliknij "Plik|Otwórz nowy pomiar" i sprawdź działanie przyrządu przy użyciu wzorca referencyjnego DTS 1235 (wzorzec potencjału zeta). Jest to standard lateksu polistyrenowego w buforze wodnym o pH 9 i ma potencjał zeta od -42 ± 4,2 mV.
   3. Przygotować próbkę w strzykawce o pojemności co najmniej 1 ml. Użyj jednorazowej składanej celi kapilarnej wyposażonej w elektrodę z każdej strony do pomiarów potencjału zeta. Ostrożnie wstrzyknąć próbkę do komórki kapilarnej przez jeden z portów w komórce kapilarnej, sprawdzając, czy nie ma pęcherzyków.
      1. Gdy próbka zacznie wypływać z drugiego końca, włóż korki i usuń wszelkie płyny, które mogły rozlać się na elektrody. Dokładnie wyczyść kuwety etanolem i wodą DI.
   4. Włóż złożoną komórkę kapilarną do urządzenia. Utrzymywać równowagę przez 2 minuty i dokonywać pomiarów w temperaturze 200 °C, o ile nie określono inaczej. Jeśli próbki dyspersji były wcześniej przechowywane w lodówce, przed użyciem pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową.
   5. Zbierz co najmniej pięć pomiarów w trybie automatycznym i podaj uśrednioną wartość potencjału zeta. Eksportuj dane, analizuj^17,18 (zazwyczaj wartość potencjału zeta poniżej -25 mV i powyżej 25 mV jest uważana za stabilną) i interpretuj online lub offline.
5. Charakterystyka morfologiczna za pomocą TEM
   1. Do przygotowania próbki należy użyć siatek (300 oczek) z dziurawych folii węglowych. Umieść kroplę próbki dyspersji (około 0,1 ml, 0,02 mg/ml) na czystej siatce.
   2. Pozostawić próbkę do wyschnięcia na powietrzu w warunkach otoczenia, zachowując kratki przykryte, aby zapobiec zanieczyszczeniu powietrza.
   3. Umyj kratki ultraczystą wodą, aby usunąć wszelkie efekty wysuszania i poddaj obrazowaniu TEM.
      UWAGA: Dodanie kropli dyspersji na siatce zwiększa koncentrację cząstek na powierzchni siatki, prowadząc w ten sposób do przyciągania sił międzycząsteczkowych. Nierównomierne suszenie może prowadzić do artefaktów. Niewielkie spłukanie ultraczystą wodą eliminuje to ryzyko i jest pomocne w równomiernym suszeniu siatek³¹.
   4. Uzyskaj obrazy w formacie dm3, a następnie przeglądaj je w trybie offline za pomocą oprogramowania TEM.
      UWAGA: Obrazy mogą być używane do wydedukowania uzupełniających informacji dotyczących rozmiaru, struktury i kształtu cząstek. Pliki są konwertowane do formatu tiff, w którym można przeprowadzić kwantyfikację właściwości, takich jak kształt i rozmiar.

Wyniki

Dane kalorymetryczne pokazujące wzrost temperatury w czasie podczas obu typów sonikacji są pokazane w Rysunek 2. Efektywna moc akustyczna dostarczana do dyspersji w sondzie ultradźwiękowej wyposażonej w fiolkę z głośnikiem wysokotonowym (źródło zasilania 200 W) oblicza się na 0,55 ± 0,05 W przy 50% amplitudzie, 0,75 ± 0,04 W przy 70% amplitudzie, 1,09 ± 0,05 W przy 90% amplitudzie i 1,15 ± 0,05 W przy 50% amplitudzie, natomiast dla kąpieli ultradźwiękowej (źródło prądu 80 W), oblicza się go na 0,093 ± 0,04 W przy ustawieniu 100%. Odkrycie jest podobne do poprzednio opublikowanych prac, które pokazują, że moc wyjściowa wyświetlana przez sonikatory jest znacznie mniejsza niż ta dostarczana do zawiesin poddanych zabiegowi^32,33,34.

Rysunek 2. Dane kalorymetryczne pokazujące wzrost temperatury w czasie podczas sonikacji przy użyciu (A) sondy ultradźwiękowej wyposażonej w głośnik wysokotonowy w fiolce i (B) kąpieli ultradźwiękowej. Efektywna moc akustyczna dostarczana do dyspersji w sondzie ultradźwiękowej wyposażonej w fiolkę z głośnikiem wysokotonowym (źródło zasilania 200 W) oblicza się na 0,55 ± 0,05 W przy 50% amplitudzie, 0,75 ± 0,04 W przy 70% amplitudzie, 1,09 ± 0,05 W przy 90% amplitudzie i 1,15 ± 0,05 W przy 50% amplitudzie, natomiast dla kąpieli ultradźwiękowej (źródło prądu 80 W), oblicza się go na 0,093 ± 0,04 W przy ustawieniu 100%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki związane z różnymi dyspersjami nanomateriałów wytworzonymi przez różne protokoły są podsumowane w Tabeli 2. Wyniki pokazują zmienność jakości dyspersji (mierzonej za pomocą DLS, ELS i TEM) związaną z różnymi dyspersjami nanomateriałów wytwarzanymi w różnych warunkach sonikacji. Zgodnie z oczekiwaniami, zmienność danych zależy od kilku czynników, takich jak rodzaj nanomateriału, okres sonikacji oraz to, czy w protokole użyto sondy, czy kąpieli ultradźwiękowej. Widmo UV-vis uzyskane dla każdego nanomateriału jest pokazane na Rysunek 3 i Rysunek 4, a wyniki DLS są pokazane w Rysunek 5 i Rysunek 6.

Celem Tabeli 2 jest nie tylko pokazanie stopnia zmienności danych, ale także umożliwienie identyfikacji zoptymalizowanego protokołu dyspersji dla danej dyspersji nanomateriałów. Gdyby takie dyspersje zostały wykorzystane jako część metody badań nanatoksykologicznych, wówczas idealnym rozwiązaniem byłoby posiadanie stabilnej dyspersji (najlepiej o wielkości co najmniej ± 30 mV), małego PdI wskazującego na węższy rozkład wielkości cząstek (najlepiej o PdI 0,2 lub mniejszym) oraz małej średniej wielkości cząstek DLS, aby wskazać rozpad dużych aglomeratów. W tym przypadku średnia Z jest definiowana jako średnia wielkość nanocząstek oparta na intensywności, a PdI jest miarą szerokości całkowitego rozkładu wielkości (opisanej powyżej we Wprowadzeniu).

. TGLI . . . TGL . . . . . .

Nm	Przykładowy kod	Czas sonikacji	Rozmiar według DLS (nm)	Wskaźnik polidyspersyjności (PdI)	Potencjał Zeta (mV)
Tlenek ceru	CeO2_powder	0	396±130	0,763±0,100	17,2±0,4
	CeO2_B_15min	Czas trwania: 15 min	Numer katalogowy 128±4	0,231±0,015	39,2±1,0
	CeO2_B_30min	Czas trwania: 30 min	Numer katalogowy 117±5	0,210±0,008	38,1±0,5
	CeO2_B_1h	1 godz	95±3	0,209±0,012	46,5±0,5
	CeO2_B_2h	2 godz	92±2	0,203±0,007	46,5±1,4
	CeO2_P_2min	Czas trwania: 2 min	126±7	0,218±0,005	28,8±0,7
	CeO2_P_6min	Czas trwania: 6 min	131±2	0,209±0,014	40,5±0,7
	CeO2_P_10min	Czas trwania: 10 min	122±1	0,184±0,014	44,4±1,3
Tlenek (hydrofilowy)	ZnO_NM110 proszku	0	Numer katalogowy: 1410±120	0,786±0,150	17,1±0,5
	ZnO_NM110_B	15 min	239±2	0.130±0.024	25.4±1.0
	_15min
	ZnO_NM110_B	30 min	251±2	0.166±0.020	21.6±0.3
	_30min
	ZnO_NM110_B	1 h	310±8	0.162±0.025	21.0±0.2
	_1hr
	ZnO_NM110_B	2 godz	274±3	0.243±0.014	25.2±0.7
	_2hr
	ZnO_NM110_P	2 min	377±20	0.267±0.025	21.7±0.4
	_2min
	ZnO_NM110_P	6 min	885±70	0.276±0.023	8.6±0.6
	_6min
	ZnO_NM110_P	10 min	1074±88	0.673±0.058	11.2±1.4
	_10min
Tlenek (hydrofobowy)	ZnO_NM111_	0	758±86	0.823±0.006	-14.6±0.7
	proszek
	ZnO_NM111_	15 min	384±95	0.399±0.074	-17.5±1.0
	B_15min
	ZnO_NM111_	30 min	282±35	0.361±0.009	-22.4±0.5
	B_30min
	ZnO_NM111_	1 h	296±18	0.379±0.031	-22.8±0.5
	B_1hr
	ZnO_NM111_	2 godz	280±54	0.366±0.031	-23.7±1.0
	B_2hr
	ZnO_NM111_	2 min	227±9	0.402±0.032	19.8±0.8
	P_2min
	ZnO_NM111_	6 min	340±58	0.477±0.026	-21.1±0.2
	P_6min
	ZnO_NM111_	10 min	370±72	0.626±0.065	-21.8±0.8
	P_10min
CNT	A32_powder	Czas trwania: 2 min	306±5	0,279±0,029	-23,7±0,5
	A32_B_15min	Czas trwania: 15 min	250±3	0,200±0,007	-18,0±0,4
	A32_B_30min	Czas trwania: 30 min	255±2	0,282±0,036	-20,2±1,1
	A32_B_1hr	1 godz	230±3	0,226±0,021	-21,7±0,5
	A32_B_2hr	2 godz	267±3	0,337±0,019	-20,6±0,6
	A32_P_2min	Czas trwania: 2 min	255±4	0,217±0,011	-22,5±0,4
	A32_P_6min	Czas trwania: 6 min	245±9	0,328±0,029	-23,6±0,8
	A32_P_10min	Czas trwania: 10 min	254±4	0,313±0,029	-23,6±0,5
CNT	A106_powder	Czas trwania: 2 min	580±18	0,305±0,070	-35,9±1,0
	A106_B_15min	Czas trwania: 15 min	573±18	0,404±0,016	-29,5±1,0
	A106_B_30min	Czas trwania: 30 min	Numer telefonu 479±11	0,363±0,013	-28,8±1,4
	A106_B_1hr	1 godz	566±22	0,461±0,054	-25,0±0,7
	A106_B_2hr	2 godz	Numer telefonu 477±10	0,311±0,027	-26,8±0,5
	A106_P_2min	Czas trwania: 2 min	300±58	0,473±0,053	-29,8±1,0
	A106_P_6min	Czas trwania: 6 min	390±10	0,359±0,022	-40,7±0,5
	A106_P_10min	Czas trwania: 10 min	300±85	0,511±0,134	-24,5±0,7
Srebrny	Ag_cit	0	72±50	0,462±0,258	-38,7±1,3
	Ag_B_15min	Czas trwania: 15 min	25±1	0,489±0,008	-39,8±2,2
	Ag_B_30min	Czas trwania: 30 min	25±1	0,532±0,036	-30,7±2,8
	Ag_B_1hr	1 godz	25±1	0,542±0,028	-39,2±1,7
	Ag_B_2hr	2 godz	28±5	0,387±0,015	-35,8±1,8
	Ag_P_2min	Czas trwania: 2 min	29±1	0,300±0,025	-42,0±2,9
	Ag_P_6min	Czas trwania: 6 min	26±2	0,263±0,017	-40,4±1,5
	Ag_P_10min	Czas trwania: 10 min	25±2	0,251±0,011	-47,3±1,4

Tabela 2. Podsumowanie wyników dyspersji NM w wodzie. "P" w kodach próbek oznacza dyspersję przeprowadzoną przy użyciu sondy ultradźwiękowej wyposażonej w głośnik wysokotonowy w fiolce, a litera "B" w kodzie próbki wskazuje dyspersję przeprowadzoną przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej. Wszystkie pomiary zostały wykonane przy 0,02 mg/ml. Sonikacja w czasie 0 oznacza zawiesinę niesonikowaną, tj. po prostu mocne potrząsanie i mieszanie bez żadnej innej pomocy. CNT, które są całkowicie nierozpuszczalne i niedyspergowalne w wodzie DI po fizycznym wstrząsaniu, były sonikowane przez początkowe 2 minuty w sonikatorze kąpieli i również zgłoszone.

Rysunek 3. Widma UV-vis dyspersji (A) CeO₂, (B) ZnO NM110 i (C) ZnO NM111 w wodzie. Spektroskopia UV-vis służy do zrozumienia stabilności i agregacji zawiesiny poprzez uważną obserwację zmian intensywności szczytu, skośności widma, kształtu widma, a także przesunięcia długości fali w widmach absorpcyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Widma UV-vis (A) CNT A106, (B) CNT A32 i (C) Ag_citrate dyspersji w wodzie. Spektroskopia UV-vis służy do zrozumienia stabilności i agregacji zawiesiny poprzez uważną obserwację zmian intensywności szczytu, skośności widma, kształtu widma, a także przesunięcia długości fali w widmach absorpcyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Rozkład wielkości według intensywności uzyskany za pomocą DLS dla (A) CeO₂, (B) ZnO NM110 i (C) ZnO NM111 dyspersji w wodzie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Rozkład wielkości według intensywności uzyskany za pomocą DLS dla (A) CNT A106, (B) CNT A32 i (C) Ag_citrate dyspersji w wodzie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W przypadku zawiesiny nanomateriału CeO₂, zastosowanie sonikacji spowodowało ogólny spadek wielkości cząstek i wartości PDI. Bez żadnej sonikacji, wyniki pokazują multimodalny rozkład intensywności ze średnią Z (396 ± 130 nm) i bardzo wysoką wartością PdI wynoszącą 0,763 ± 0,100 (Tabela 2). Ponadto dyspersja wykazuje wartość potencjału zeta wynoszącą 17,2 ± 0,4 mV. Należy zauważyć, że PdI ≥0,5 wskazuje na wysoce polidyspersyjną zawiesinę. W związku z tym próbkę poddano wirowaniu dyskowemu, a uzyskane dane dotyczące rozkładu wielkości potwierdziły również niejednorodną i niejednorodną próbkę (Rysunek 7a). Morfologia i analiza wielkości próbki przeprowadzona przez TEM potwierdziła ponadto, że cząstki w dyspersji są rzeczywiście wysoce polidyspersyjne (Rysunek 8). Po zdyspergowaniu proszku w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut, wyniki wykazały poprawę ogólnej jakości dyspersji. W szczególności poprawiła się ogólna stabilność (o czym świadczy odpowiadająca jej wartość potencjału zeta) i monodyspersyjność. Wydłużenie czasu sonikacji do 2 godzin skutkowało znacznie lepszą stabilnością i węższym rozkładem wielkości cząstek (Tabela 2). Oczywiste jest, że następuje stopniowa poprawa jakości dyspersji, jeśli stosuje się dłuższy czas sonikacji w kąpieli, co widać po stopniowym zmniejszaniu się średnicy hydrodynamicznej i PdI. Podobne wyniki uzyskano, gdyby procedurę dyspersji przeprowadzono przy użyciu sondy ultradźwiękowej. Ogólnie rzecz biorąc, za pomocą sondy osiągnięto bardziej stabilny i jednorodny stan aglomeracji, co potwierdzają dane DLS i TEM. Co ciekawe, kąpiel ultradźwiękowa okazała się lepszą opcją niż użycie sondy, ponieważ znacznie mniejszy średni rozmiar cząstek i znacznie wyższą wartość potencjału zeta można osiągnąć przy użyciu kąpieli, a nie sondy. Zaobserwowano, że w obu procedurach sonikacji mikrofotografie TEM potwierdziły obecność różnych cząstek pierwotnych, w tym: kul, sześcianów i wielościanów.

Rysunek 7. Rozkład wielkości uzyskany za pomocą wirowania dyskowego dla (A) CeO₂_powder i (B) ZnO NM110_powder dyspersji w wodzie po 0 min. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Obrazy TEM CeO₂ pokazujące wpływ sonikacji na jednorodność i stabilność próbki. Podziałka liniowa wynosi 100 nm dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W przypadku ZnO, w dyspersjach stosuje się dwa rodzaje ZnO, tj. nanomateriały ZnO o różnych profilach powierzchniowych, hydrofilowe (NM110) i hydrofobowe (NM111). Wyniki wskazują na podobne wyniki między tymi dwoma typami ZnO. Oba pokazują, że przy braku sonikacji, jakość dyspersji wskazywała na średnią wielkość dużej cząstki i wysoką polidyspersyjność. NM110 ma średnią Z wynoszącą 1,410 ± 120 nm i PdI 0,786 ± 0,150 nm; NM111 ma średnią Z wynoszącą 758 ± 86 nm i PdI 0,823 ± 0,006. Dane dotyczące rozkładu wielkości uzyskane dla NM110 z wirowania dyskowego również potwierdzają polidyspersyjność i niejednorodność próbki (Rysunek 7b). Rozmiar i polidyspersyjność sonikowanego NM110 wydają się zmniejszać po 15-minutowym leczeniu w kąpieli ultradźwiękowej i osiągają optymalne plateau redukcji po 30-minutowym czasie sonikacji. Dłuższy czas sonikacji wskazuje na ogólny wzrost danych dotyczących wielkości cząstek, potencjalnie spowodowany ponowną aglomeracją cząstek po początkowej deaglomeracji. Z drugiej strony, NM110 wykazuje jednorodną i stabilną dyspersję po 2 minutach obróbki sondą ultradźwiękową. Jednak dłuższe cykle trwające 6 minut i 10 minut wykazują również wzrost wielkości cząstek i wartości PdI, co wskazuje na ponowną aglomerację cząstek. Wyniki TEM (Rysunek 9 i Rysunek 10) oraz UV-vis (Rysunek 3b-c) dodatkowo potwierdzają stan takiej jakości dyspersji. Co ciekawe, bardzo podobne wyniki obserwuje się w przypadku NM111 po potraktowaniu sondą ultradźwiękową. Również w tym przypadku podejście systematyczne wskazuje, że najlepszą dyspersję osiągnięto po 2 minutach, ponieważ ewentualna ponowna aglomeracja może być związana z analogicznymi przypadkami 6 i 10 minut. Gdy zamiast tego zastosowano kąpiel ultradźwiękową, wielkość cząstek dyspersji osiągnęła plateau po 30 minutach sonikacji; Po tym czasie nie obserwuje się dalszego zwiększania ani zmniejszania wartości rozmiaru lub polidyspersyjności. Również mikrofotografie TEM uzyskane dla hydrofobowego NM111 wskazują na obecność różnych artefaktów i innych efektów wysuszania na siatce TEM (Rysunek 10). Pokazuje to, że wstępne zwilżanie etanolem lub innymi rozpuszczalnikami organicznymi może być pomocne w przygotowaniu dyspersji wodnych, ale pojawiły się wyzwania związane z unieruchomieniem hydrofobowych próbek nanomateriałów na siatkach węglowych. Ogólnie rzecz biorąc, jeśli zostanie zidentyfikowany optymalny protokół dyspersji i jeśli jest on regulowany przez najmniejszą odpowiednią wartość PDI, odpowiada to ZnO_NM110_B1 h i ZnO_Nm111_B30 min odpowiednio dla hydrofilowych przypadków NM110 i hydrofobowych NM 111.

Rysunek 9. Obrazy TEM ZnO NM110 pokazujące wpływ sonikacji na jednorodność i stabilność próbki. Podziałka liniowa wynosi 100 nm dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10. Obrazy TEM ZnO NM111 pokazujące wpływ sonikacji na jednorodność i stabilność próbki. Podziałka wynosi 0,1 μm dla ZnO_NM111_B_15 min, ZnO_NM111_B_1 h i ZnO_NM111_P_2 min oraz 0,2 μm dla pozostałych próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W przypadku nanorurek węglowych (CNT), wyniki pokazują, że takie nanomateriały nie są łatwo dyspergowalne w wodzie, w szczególności protokół dyspersji zakłada użycie fizycznego mieszania lub energicznego potrząsania. Dotyczy to zarówno wielościennych nanorurek węglowych (MWCNT) wykorzystanych w tym badaniu. Mikrofotografie TEM w przypadku dyspersji A106 i A32 przeprowadzone w 2 i 15 minutach cyklu sonikacji są pokazane odpowiednio na Rysunek 11 i Rysunek 12. Po wydłużeniu czasu sonikacji, wyniki wskazują na pękanie CNT, co często prowadzi do modyfikacji długości. Takie modyfikacje długości były widoczne zarówno w przypadku sonizacji sondą, jak i ultradźwiękami. Wyniki pokazują, że CNT A106 i A32 mogą być wystarczająco rozproszone po 2-minutowym zabiegu, jeśli używana jest sonda ultradźwiękowa. W tym przypadku wystarczająca dyspersja oznacza krytyczny próg czasu sonikacji, w którym wszystkie wiązki nanorurek węglowych (CNT) są otwarte, a poszczególne probówki są rozdzielane³⁵. Po wydłużeniu czasu sonikacji do 6 min lub 10 min, wyniki wskazują na modyfikację rozkładu długości i znacznie wyższą polidyspersyjność. Wreszcie, dane o rozkładzie intensywności z DLS (Rysunek 6a-b) oraz widma absorpcyjne przez UV-vis (Rysunek 4a-b) również potwierdzają, że dyspersje CNT są bardzo wrażliwe na czas sonikacji i to, czy użyto sondy, czy kąpieli. Zarówno CNT A106, jak i A32 wykazują pik absorbancji między 253 a 310 nm, co jest typowe dla MWCNTs³⁶. Wiadomo, że szczytowa intensywność jest dobrym wskaźnikiem maksymalnej osiągalnej dyspersji w dyspersji MWCNT napędzanej przez sonikację. Widmo UV zarówno A106, jak i A32 wskazuje, że 2 minuty i 15 minut cyklu sonikacji są optymalne dla zawiesiny. Przy długotrwałej sonikacji pik rozszerza się z mniejszą intensywnością piku, a także niszczenie próbki wskazuje na przesunięcie widma absorpcji i skośność widmową (tworzenie się ramion piku).

Rysunek 11. Obrazy TEM CNT A106 pokazujące wpływ sonikacji na jednorodność i stabilność próbki. Podziałka liniowa wynosi 200 nm dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12. Obrazy TEM CNT A32 pokazujące wpływ sonikacji na jednorodność i stabilność próbki. Podziałka liniowa wynosi 200 nm dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec, aby uzyskać pewien stopień porównań, dane są porównywane z dostępną na rynku zawiesiną stabilizowanych przez cytrynian Ag NPs (średnica nominalna 10 nm, 0,02 mg/ml). Dane charakterystyczne wskazują, że dyspersja jest silnie aglomerowana i wysoce polidyspersyjna. Dane DLS pokazują rozkład multimodalny o średnicy hydrodynamicznej 72 ± 50 nm i wysokim PdI wynoszącym 0,46 ± 0,26 (Rysunek 6c). Analiza morfologiczna za pomocą TEM (Rysunek 13) i pik szerokiego rezonansu plazmonowego (SPR) (absorpcja przy 418 nm w obszarze widzialnym) za pomocą UV-vis (Rysunek 4c) dodatkowo potwierdzają wysoce polidyspersyjną próbkę. Co ciekawe, zabieg kąpieli ultradźwiękowej poprawia stabilność dyspersji i PdI, ale tylko wtedy, gdy stosuje się odpowiednio długi okres sonikacji; potrzebny jest 2-godzinny czas sonikacji, aby uzyskać wielkość cząstek DLS 28 ± 5 nm i PdI 0,387 ± 0,015 (Tabela 1). Jeśli jednak zamiast tego zostanie użyta sonda ultradźwiękowa, jednorodność i stabilność próbki znacznie się poprawi przy zaledwie 2-minutowym czasie sonikacji, co skutkuje wielkością cząstek DLS 29 ± 1 nm, PdI 0,300 ± 0,025 i ZP -42 ± 3 mV. Ta poprawa jakości dyspersji jest również widoczna do 10-minutowego ustawienia czasu sonikacji, w którym obserwuje się wielkość cząstek DLS 25 ± 2 nm, PdI 0,251 ± 0,011 i ZP -47,3 ± 1,4 mV. Tutaj, po 10 minutach sonikacji za pomocą głośnika wysokotonowego w fiolce, PdI maleje, a ZP wzrasta. Odpowiednie mikrofotografie TEM w tych odpowiednich punktach czasowych również potwierdzają poprawę jednorodności próbki po zastosowaniu odpowiednich protokołów sonikacji. Następuje szybka poprawa jednorodności próbki i dyspersji cząstek na obrazach TEM. Próbka po 2 minutach wykazuje pewną aglomerację w porównaniu z pojedynczymi cząstkami poddanymi sonifikacji przez 10 minut za pomocą głośnika wysokotonowego w fiolce.

Rysunek 13. Obrazy TEM komercyjnych Ag NP pokazujące wpływ sonikacji na jednorodność i stabilność próbki. Podziałka liniowa wynosi 200 nm dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.

Wysoki (ml)	Niski (ml)
1.4	0,2
Rozdział 1.2	0,4
1	0,6
0,8	0,8
0,6	1
0,4	Rozdział 1.2
0,2	1.4
0	1.6

Tabela 1. Mieszanie w gradiencie gęstości sacharozy daje łączną objętość 1,6 ml. Tutaj oznaczamy 8% roztwór sacharozy jako niski, a 24% roztwór sacharozy jako wysoki. Miesza się je w następujących objętościach (całkowita objętość 1,6 ml za każdym razem) i wstrzykuje do stożka dez jeden po drugim, aż do powstania gradientu.

Dyskusja

Ostatecznym celem badań jest opracowanie strategii, która pozwoliłaby na określenie optymalnych warunków sonikacji do wykonania dyspersji wybranej liczby nanomateriałów w wodzie. W tym miejscu podjęto próbę dokładnego udokumentowania kroków i parametrów protokołu podczas sonikacji, aby wypełnić luki zidentyfikowane wcześniej w przeglądach, a także postępować zgodnie z zaleceniami wydanymi w ciągu ostatnich¹⁵ lat. Optymalne warunki dyspersji określa się poprzez scharakteryzowanie dyspersji po każdym cyklu sonikacji oraz sprawdzenie stabilności i jednorodności próbki. Wpływ procedur sonikacji i stan stabilności ocenia się na podstawie charakterystycznych zmian w kluczowych właściwościach fizykochemicznych nanomateriałów, określonych za pomocą różnych technik analitycznych: DLS, ELS, UV-VIS i TEM. Obecny protokół jest dostosowaną metodologią dyspersji nanomateriałów z wcześniejszej literatury i innych projektów badawczych 21,22,37,38,39 z pewnymi modyfikacjami i udoskonaleniami odnoszącymi się do kluczowych luk, etapów i możliwości ich zastosowania do szerszych nanomateriałów o podobnym profilu powierzchniowym 7 . Konieczne są jednak staranne dostosowania w odniesieniu do czasu ich sonikacji, siły i rodzaju ich zastosowania do innych nanomateriałów. Konieczne są również dalsze prace w celu ustalenia korelacji między procedurą sonikacji a aktywnością biologiczną nanomateriałów. Sześć różnych rodzajów dyspersji nanomateriałów jest ocenianych i porównywanych, przede wszystkim pod kątem ich stabilności, przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej i sondy ultradźwiękowej wyposażonej w głośnik wysokotonowy w fiolce w określonych punktach czasowych. Aby utrzymać czystość zawiesiny i wszelkie niezamierzone zmiany spowodowane zanieczyszczeniem, unika się tutaj sonikacji sondy. W głośniku wysokotonowym fiolki mogą pozostać zamknięte. Eliminuje to wszelkie zanieczyszczenie krzyżowe próbek.

Kalibracja sonikatorów jest kluczowym czynnikiem, ponieważ dostępnych jest szereg sonitorów o różnych częstotliwościach, amplitudzie i mocach. Aby określić efektywną energię akustyczną dostarczaną do zawiesiny, kalibrację sonikatorów przeprowadza się za pomocą kalorymetrii. Moc akustyczna dostarczana dla ustawienia amplitudy 70% dla głośnika wysokotonowego w fiolce, jak również dla ustawienia 100% kąpieli ultradźwiękowej, wynosi odpowiednio <1 W (odpowiednio 0,75 ± 0,04 W i 0,093 ± 0,04 W). Jednak moc wyjściowa wskazana przez producentów dla głośnika wysokotonowego w fiolce i sonografu kąpielowego wynosi odpowiednio 200 W i 80 W. Wskazuje to, że pomimo dużej mocy źródła, większość energii jest tracona podczas wytwarzania pęcherzyków kawitacyjnych, a tylko niewielka część jest faktycznie dostarczana do dyspersji podczas obróbki²⁶. Ostatnie badania podkreśliły znaczenie kawitacyjnej kontroli pomiarowej w porównaniu z mocą wejściową sonikatora dla lepszej kontroli dyspersji podczas sonikacji⁸. Metodologia ta wydaje się obiecująca w zakresie kontrolowanej dyspersji bardzo delikatnych nanomateriałów, takich jak nanorurki węglowe, i jest zalecana do przyszłych badań.

Każda technika zastosowana w badaniu opiera się na innych zasadach, z ograniczeniami dla wszystkich. DLS nie jest idealną techniką dla zawiesin niesferycznych, jak również systemów o wysokiej polidyspersji. W takich warunkach DCS jest zalecany ze względu na wysoką rozdzielczość, dokładność i precyzję⁴⁰. DCS może całkowicie oddzielić bardzo wąskie piki rozkładu rozmiarów, które różnią się zaledwie o 3%. TEM zapewnia bezpośrednie obrazy wizualne nanocząstek i jest doskonałym narzędziem do określania agregacji, dyspersji, rozmiaru i kształtu cząstek, ale technika ta wymaga suszenia próbki, co może prowadzić do artefaktów⁴¹. Można to wyeliminować, myjąc kratki ultraczystą wodą, jak omówiono w kroku 4.5.3.

Metodologia podkreśla między innymi kilka krytycznych etapów, takich jak rodzaj fiolek użytych w protokole, głębokość zanurzenia i położenie fiolek w kąpieli ultradźwiękowej, a także głośnika wysokotonowego fiolki. Ważnym parametrem jest kontrola temperatury układu podczas mieszania. Zaleca się częste wymiany wody w kąpieli ultradźwiękowej i tryb pulsacyjny w przypadku głośnika wysokotonowego w fiolce, aby uniknąć gromadzenia się ciepła podczas sonikacji, a tym samym uniknąć jakichkolwiek zmian próbki. Etap wstępnego zwilżania próbek hydrofobowych, takich jak tlenek, pomaga w dyspersji cząstek, ale może wywołać pewne niepożądane zmiany. Czas i energia sonikacji powinny być wystarczająco wysokie, aby zdeaglomerować cząstki, ale nie na tyle, aby spowodować ich rozbicie. Wyniki wskazują, że pękanie aglomeratu zależy od rodzaju cząstek.

Nasze odkrycia podkreślają znaczenie posiadania szczegółowego protokołu dyspersji, ponieważ wyniki pokazują, że kluczowe właściwości fizykochemiczne mogą potencjalnie ulec zmianie podczas procesu sonikacji, zgodnie z takimi czynnikami, jak typ sonikatora, czas trwania sonikacji i moc wyjściowa. Wyniki wykazały, że integralność próbki jest potencjalnie zagrożona przy mieszaniu o większej intensywności. Wyniki pokazują, że CNT są bardzo wrażliwe na mieszanie, więc istnieje duże prawdopodobieństwo, że pęknięcia wystąpią, gdy czas trwania i siła sonikacji zostaną zmienione. Bliskie optymalnym ustawieniom dyspersji CNT są 2 - 15 minut w kąpieli ultradźwiękowej i tylko 2 minuty przy użyciu sondy ultradźwiękowej. Jednak ultradźwięki nadal mogły spowodować pewne skrócenia nanorurek, których nie można tutaj dokładnie określić ilościowo. DLS może nie być idealną techniką do charakteryzowania CNT, ale nadal może zapewnić średnicę hydrodynamiczną dla nanorurek, a dane te mogą być pouczające o różnicach w rozkładach długości CNT wśród różnych próbek 16,42,43. Wcześniejsze badania pokazują, że protokół dyspersji CNT może być znacznie ulepszony przez dodanie środków powierzchniowo czynnych, ponieważ cząsteczki środka powierzchniowo czynnego są absorbowane na monowarstwie nanorurek, zapewniając w ten sposób barierę dla pękania w wyniku sonikacji ^35,44. Nie można tego jednak bezpośrednio porównać z obecnym protokołem, ponieważ w tym przypadku nie występują żadne środki powierzchniowo czynne. Należy zauważyć, że zapewnienie rozkładu długości i wielkości w przypadku nanorurek węglowych jest bardzo ważne, ponieważ proporcje są często skorelowane z pewną reakcją toksykologiczną. W przeciwieństwie do tego, CeO₂ dał inne wyniki w porównaniu z CNT, w których wydłużony czas sonikacji przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej lub sondy prowadzi do powstawania cząstek pierwotnych. Różnica w wynikach między przypadkami CNT i CeO2 podkreśla znaczenie dostosowania protokołów dyspersji, np. optymalizacji czasu sonikacji i mocy wyjściowej, zgodnie z materiałem wyjściowym, tj. rodzajem proszków nanomateriałów. Każdy rodzaj próbki proszku nanomateriału jest inny, ponieważ w samym proszku będzie występował inny stopień aglomeracji. W niektórych przypadkach proces deaglomeracji z powodzeniem doprowadził do deaglomeracji aż do poziomu cząstek pierwotnych, co widać po pojawieniu się innych kształtów cząstek na obrazach TEM, które nie były widoczne przed etapem sonikacji. Długotrwała sonikacja powodowała ciągłe pękanie aglomeratów tlenku ceru pod różnymi kątami, prowadząc w ten sposób do powstania wieloaspektowych cząstek.

W przypadku zakupionej na rynku wodnej próbki dyspersji Ag NPs, nasze wyniki podkreślają również potrzebę długoterminowej oceny stabilności i jednorodności. Istnieje potrzeba zapewnienia, że dyspersje zostały wystarczająco scharakteryzowane przed użyciem, zwłaszcza w przypadku długotrwałego przechowywania. Nanomateriały mają jednak bardzo krótki okres trwałości. Starzeją się z czasem i mogą zachowywać się inaczej po długotrwałym przechowywaniu w porównaniu ze świeżo przygotowaną dyspersją.

Uzyskane wyniki wskazują na potrzebę opracowania zharmonizowanej strategii w celu zidentyfikowania zoptymalizowanego protokołu dla różnych nanomateriałów. Przedstawiona proponowana strategia polega na przeprowadzeniu różnych wariantów metody sonikacji i zapewnieniu, że dyspersje w różnych punktach czasowych są wystarczająco scharakteryzowane przy użyciu uzupełniających się metod analitycznych. Znaczenie stosowania podejścia wielometodowego do charakteryzowania i monitorowania jakości dyspersji w czasie i w różnych warunkach eksperymentalnych zostało podkreślone przez byłych pracowników⁴⁵. Chociaż w badaniach przedstawiono różne metody sonikacji w celu zaspokojenia specyficznej dyspersji nanomateriałów, potencjalnie mogą one być wykorzystane jako podstawa do dyspersji innych nanomateriałów metali i tlenków metali (o podobnych właściwościach powierzchniowych) w wodzie. Jednak jakakolwiek zmiana zarówno w rodzaju nanomateriału, jak i w ciekłym medium wymaga optymalizacji podstawowego protokołu, co można osiągnąć poprzez staranne dostosowanie różnych czynników, np. czasu sonikacji, siły i typu sonikatora. Niezależnie od tego, jaki protokół zostanie wybrany i uznany za optymalny, zawsze istnieje potrzeba posiadania szczegółowego raportu na temat schematu i sekwencji etapowej procedury dyspersji sonikacji. Jest to ważne dla poprawy interpretowalności i porównywalności. Jednym z zastosowań tego protokołu jest ułatwienie porównywalności danych między innymi laboratoriami, co prowadzi do zharmonizowanego i ustandaryzowanego podejścia do przyszłych badań. Obecna metodologia i parametry kontrolne mogą być wykorzystane do innych mediów dyspergujących poza wodą, a porównania mogą być dokonywane indywidualnie dla każdego przypadku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nanoproszek tlenku ceru	Sigma-Aldrich	544841	< 25  Wielkość cząstek nm (BET)
Tlenek	Wspólne Centrum Badawcze Komisji Europejskiej (JRC)	NM110	hydrofilowy
Tlenek	Wspólne Centrum Badawcze Komisji Europejskiej (JRC)	NM111	hydrofobowe
wielościenne nanorurki węglowe	Projekt NanoMile (Duży wspólny projekt w ramach 7. programu ramowego Komisji Europejskiej)	A32 (MWCNT1)	3.0± 1,8 &mikro; m długości, stosunek O/C 4,5%
Wielościenne nanorurki węglowe	Projekt NanoMile	A106 (MWCNT2)	3,3± 2.4 &mikro; m długości, stosunek O/C 7%
Dyspersja srebra	Sigma-Aldrich	730785	10  Wielkość cząstek nm (TEM), 0,02  mg/mL
Zetasizer nano	Malvern Instruments		Pomiary wielkości cząstek i potencjału zeta
Wirówka dyskowa	CPS instruments Inc.	Model DC 24000	Rozkład wielkości cząstek przez sedymentację odśrodkową
Transmisyjny mikroskop elektronowy	JEOL USA	Jeol 1200EX	TEM Obrazy jasnego pola, wielkość cząstek, kształt, aglomeracja
Sonda ultradźwiękowa wyposażona w fiolkę Głośnik wysokotonowy	Hielscher	UIS250V	Sonicator
Kąpiel ultradźwiękowa	Branson	Model 1510	Fiolki Sonicator
Eppendorf	Eppendorf	2236411-1
Spektrofotometr UV-vis	Kabina lotnicza Jenson	Model 6800	Szczyty SPR, stabilność zawieszenia
Jednorazowa składana komórka kapilarna	Malvern Instruments	DTS 1070	do pomiaru wzorca potencjału elektrycznego
Zeta	Malvern Instruments	DTS 1235
Kuweta kwarcowa	Jasco	1103-0042	Prostokątna kuweta kwarcowa 10 x 100 Spectrosil Kwarc z pokrywką 190 -2700 nm