Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe bioaktywnych nanocząstek w fagocytarnych komórkach odpornościowych pod kątem inhibitorów sygnalizacji receptora toll-podobnego

DOI:

10.3791/56075

⸱

26 lipca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja receptora Toll-podobnego (TLR) odgrywa ważną rolę w patofizjologii wielu chorób zapalnych u ludzi, a regulacja odpowiedzi TLR przez bioaktywne nanocząstki jest korzystna w wielu stanach zapalnych. Komórki reporterowe oparte na komórkach THP-1 stanowią wszechstronną i solidną platformę przesiewową do identyfikacji nowych inhibitorów sygnalizacji TLR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farmakologiczna regulacja odpowiedzi receptora Toll-podobnego (TLR) jest bardzo obiecująca w leczeniu wielu chorób zapalnych. Jednak do tej pory dostępnych było niewiele związków osłabiających sygnalizację TLR i nie było klinicznie zatwierdzonych inhibitorów TLR (z wyjątkiem leku przeciwmalarycznego hydroksychlorochiny) w użyciu klinicznym. W świetle szybkich postępów w nanotechnologii, manipulowanie reakcją immunologiczną za pomocą nanourządzeń może zapewnić nową strategię leczenia tych chorób. W niniejszym artykule przedstawiamy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych do szybkiej identyfikacji nowych bioaktywnych nanocząstek, które hamują sygnalizację TLR w fagocytarnych komórkach odpornościowych. Ta platforma przesiewowa jest zbudowana na komórkach reporterowych opartych na komórkach THP-1 z testami kolorymetrycznymi i lucyferazy. Komórki reporterowe są inżynierowane z ludzkiej linii komórek monocytarnych THP-1 poprzez stabilną integrację dwóch indukowalnych konstruktów reporterowych. Jeden wyraża wydzielany gen embrionalnej fosfatazy alkalicznej (SEAP) pod kontrolą promotora indukowanego przez czynniki transkrypcyjne NF-κB i AP-1, a drugi wyraża wydzielany gen reporterowy lucyferazy pod kontrolą promotorów indukowanych przez czynniki regulatorowe interferonu (IRF). Po stymulacji TLR komórki reporterowe aktywują czynniki transkrypcyjne, a następnie wytwarzają SEAP i/lub lucyferazę, które można wykryć za pomocą odpowiadających im odczynników substratowych. Korzystając z biblioteki hybryd nanocząstek peptydu i złota (GNP) ustalonej w naszych poprzednich badaniach jako przykładu, zidentyfikowaliśmy jedną hybrydę peptyd-GNP, która może skutecznie hamować dwa ramiona kaskady sygnałowej TLR4 wyzwalanej przez prototypowy ligand, lipopolisacharyd (LPS). Wyniki zostały zweryfikowane za pomocą standardowych technik biochemicznych, w tym immunoblottingu. Dalsza analiza wykazała, że ta wiodąca hybryda ma szerokie spektrum hamujące, działając na wiele szlaków TLR, w tym TLR2, 3, 4 i 5. To eksperymentalne podejście pozwala na szybką ocenę, czy nanocząstka (lub inne związki terapeutyczne) może modulować specyficzną sygnalizację TLR w fagocytarnych komórkach odpornościowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory toll-podobne (TLR) są jednym z kluczowych elementów wrodzonego układu odpornościowego, przyczyniając się do pierwszej linii obrony przed infekcjami. TLR są odpowiedzialne za wykrywanie atakujących patogenów poprzez rozpoznawanie repertuaru wzorców molekularnych związanych z patogenami (lub PAMP) i narastanie reakcji obronnych poprzez kaskadę transdukcji sygnału1,2. Zidentyfikowano 10 ludzkich TLR-ów; z wyjątkiem TLR10, dla którego ligand (ligandy) pozostaje niejasny, każdy TLR może rozpoznać odrębną, konserwatywną grupę PAMP. Na przykład TLR2 i TLR4, zlokalizowane głównie na powierzchni komórki, mogą wykrywać lipoproteiny i glikolipidy odpowiednio z bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych; podczas gdy TLR3, TLR7/8 i TLR9, obecne głównie w przedziałach endosomalnych, mogą wykrywać produkty RNA i DNA wirusów i bakterii3. Stymulowane przez PAMP, TLR wywołują niezbędne odpowiedzi immunologiczne poprzez uwalnianie mediatorów prozapalnych, rekrutację i aktywację efektorowych komórek odpornościowych oraz koordynację kolejnych adaptacyjnych zdarzeń immunologicznych4.

Transdukcję sygnalizacji TLR można łatwo podzielić na dwie główne ścieżki5,6. Jeden z nich jest zależny od białka adaptorowego czynnika różnicowania szpiku 88 (MyD88) - szlaku zależnego od MyD88. Wszystkie TLR, z wyjątkiem TLR3, wykorzystują ten szlak do aktywacji czynnika jądrowego kappa-wzmacniacza łańcucha lekkiego aktywowanych komórek B (NF-κB) i kinaz białkowych związanych z mitogenem (MAPK), co prowadzi do ekspresji mediatorów prozapalnych, takich jak TNF-α, IL-6 i IL-8. Drugi szlak wykorzystuje β interferonu indukującego adaptor (TRIF) - szlak zależny od TRIF lub niezależny od MyD88 - do aktywacji czynników regulacyjnych interferonu (IFN) (IRF) i NF-κB, co prowadzi do produkcji IFN typu I. Nienaruszona sygnalizacja TLR ma kluczowe znaczenie dla naszej codziennej ochrony przed infekcjami bakteryjnymi i wirusowymi; defekty w szlakach sygnałowych TLR mogą prowadzić do niedoboru odporności i często są szkodliwe dla zdrowia ludzkiego. 7

Jednak sygnalizacja TLR to 'miecz obosieczny', a nadmierna, niekontrolowana aktywacja TLR jest szkodliwa. Nadaktywne odpowiedzi TLR przyczyniają się do patogenezy wielu ostrych i przewlekłych chorób zapalnych u ludzi8,9. Na przykład sepsa, która charakteryzuje się ogólnoustrojowym stanem zapalnym i uszkodzeniem wielonarządowym, jest przede wszystkim spowodowana ostrymi, przytłaczającymi reakcjami immunologicznymi na infekcje, przy czym TLR2 i TLR4 odgrywają kluczową rolę w patofizjologii sepsy10,11,12. Ponadto stwierdzono, że TLR5 przyczynia się do przewlekłego zapalenia płuc u pacjentów z mukowiscydozą13,14. Co więcej, rozregulowana endosomalna sygnalizacja TLR (np. TLR7 i TLR9) jest silnie związana z rozwojem i progresją kilku chorób autoimmunologicznych, w tym tocznia rumieniowatego układowego (SLE) i reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS)15,16. Te zbieżne linie dowodowe identyfikują sygnalizację TLR jako potencjalny cel terapeutyczny dla wielu chorób zapalnych17.

Chociaż farmakologiczne regulacje odpowiedzi TLR są korzystne w wielu stanach zapalnych, niestety, obecnie istnieje bardzo niewiele klinicznie dostępnych związków hamujących sygnalizację TLR9,17,18. Wynika to częściowo ze złożoności i redundancji szlaków TLR zaangażowanych w homeostazę immunologiczną i patologię choroby. W związku z tym poszukiwanie nowych, silnych środków terapeutycznych ukierunkowanych na wiele szlaków sygnałowych TLR może wypełnić fundamentalną lukę i przezwyciężyć wyzwanie związane z wprowadzeniem inhibitorów TLR do zastosowań klinicznych.

W świetle szybkiego postępu w nanonauce i nanotechnologii, nanourządzenia stają się modulatorami TLR nowej generacji dzięki swoim unikalnym właściwościom19,20,23. Rozmiar w nanoskali pozwala tym nanoterapeutykom na lepszą biodystrybucję i trwałe krążenie24,25,26. Można je dalej funkcjonalizować, aby spełniały pożądane profile farmakodynamiczne i farmakokinetyczne27,28,29. Co bardziej ekscytujące, bioaktywność tych nowatorskich nanourządzeń wynika z ich wewnętrznych właściwości, które można dostosować do konkretnych zastosowań medycznych, a nie tylko działać jako nośnik środka terapeutycznego. Na przykład, nanocząstka podobna do lipoprotein o dużej gęstości (HDL) została zaprojektowana w celu hamowania sygnalizacji TLR4 poprzez oczyszczanie ligandu TLR4 LPS23. Ponadto opracowaliśmy hybrydowy system peptydowo-złoto-nanocząsteczkowy, w którym dekorowane peptydy mogą zmieniać właściwości powierzchniowe nanocząstek złota i umożliwiać im różne bioaktywności30,31,32,33. To sprawia, że są one specjalną klasą leków (lub "nano-leków") jako nano-terapie nowej generacji.

W tym protokole prezentujemy podejście do identyfikacji nowej klasy hybryd peptydowo-złotych nanocząsteczek (peptyd-GNP), które mogą skutecznie hamować wiele szlaków sygnałowych TLR w fagocytarnych komórkach odpornościowych32,33. Podejście to opiera się na dostępnych na rynku liniach reporterowych komórek THP-1. Komórki reporterowe składają się z dwóch stabilnych, indukowalnych konstruktów reporterowych: jeden z nich zawiera wydzielany gen embrionalnej fosfatazy alkalicznej (SEAP) pod kontrolą promotora indukowanego przez czynniki transkrypcyjne NF-κB i białko aktywatora 1 (AP-1); drugi zawiera wydzielany gen reporterowy lucyferazy pod kontrolą promotorów indukowanych przez czynniki regulacyjne interferonu (IRF). Po stymulacji TLR transdukcja sygnału prowadzi do aktywacji NF-κB/AP-1 i/lub IRF, które włączają geny reporterowe do sekretnego SEAP i/lub lucyferazy; Takie zdarzenia można łatwo wykryć za pomocą odpowiednich odczynników substratowych ze spektrofotometrem lub luminometrem. Korzystając z tego podejścia do badań przesiewowych naszej wcześniej ustalonej biblioteki hybryd peptyd-GNP, zidentyfikowaliśmy głównych kandydatów, którzy mogą silnie hamować szlaki sygnałowe TLR4. Aktywność hamującą hybryd peptydu ołowiowego i GNP została następnie zwalidowana przy użyciu innego biochemicznego podejścia immunoblottingu i oceniona na innych szlakach TLR. Takie podejście pozwala na szybkie i skuteczne badania przesiewowe nowych czynników ukierunkowanych na szlaki sygnałowe TLR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek i odczynników do hodowli komórkowych

  1. Przygotuj kompletną pożywkę do hodowli komórkowych R10, dodając suplementy 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu do pożywki RPMI-1640.
    1. Przygotować selekcyjną pożywkę hodowlaną R10-Z, dodając antybiotyk zeocynę (200 μg/ml) do R10 w celu utrzymania ekspresji SEAP pod kontrolą aktywacji NF-κB/AP-1. Aby wybrać komórki wykazujące ekspresję zarówno genów reporterowych SEAP, jak i lucyferazy, dodaj zarówno zeocynę (100 μg/ml), jak i blastycydynę (10 μg/ml) do R10 (jako R10-ZB).
  2. Przygotować roztwór substratu SEAP, rozpuszczając jedną torebkę proszku substratowego (np. QUANTI-Blue) w 100 ml ultraczystej, wolnej od endotoksyn wody w czystej szklanej kolbie o pojemności 125 ml.
    1. Delikatnie zamieszać roztwór i inkubować go w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie substratów.
    2. Przefiltrować roztwór za pomocą membrany 0,2 μm, aby zapewnić jego sterylność (opcjonalnie) i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni przed użyciem.
  3. Przygotować roztwór substratu lucyferazy, rozpuszczając jedną torebkę proszku substratu (np. QUANTI-Luc) w 25 ml ultraczystej, wolnej od endotoksyn wody w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    1. Po całkowitym rozpuszczeniu proszku należy natychmiast zużyć roztwór. Alternatywnie, przed użyciem należy przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C (do tygodnia) lub w temperaturze -20 °C (do miesiąca).
      UWAGA: Oba roztwory podłoża są wrażliwe na światło i należy unikać ekspozycji na światło, gdy tylko jest to możliwe. Wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania roztworu mogą powodować niestabilność podłoża i skracać jego okres przydatności do spożycia.
  4. Przygotować roztwór podstawowy 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) w dimetylosulfotlenku dimetylosulfotlenku (DMSO) klasy cząsteczkowej o stężeniu 500 μg/ml. Sporządzić porcje roztworu podstawowego (10 μl w probówce o pojemności 500 μl) i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotować roztwór podstawowy LPS (E-coli K12) w sterylnej, wolnej od endotoksyn wodzie o stężeniu 5 mg/ml i przygotować porcje do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C. Przygotować roboczy roztwór LPS, rozcieńczając podstawowy LPS w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) o stężeniu 100 μg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przed użyciem><. UWAGA: Przygotowanie odczynnika do hodowli powinno odbywać się w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a wszystkie pojemniki należy wysterylizować przed użyciem. Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania roztworów PMA i LPS.

2. Hodowla makrofagów reporterowych pochodzących z komórek reporterowych THP-1

  1. Użyj dwóch linii komórek reporterowych THP-1: THP-1-XBlue i THP-1-Dual. Pierwszy z nich ma gen reporterowy SEAP kontrolowany przez NF-κB / AP-1, a drugi ma podwójny system genów reporterowych, ten sam gen reporterowy SEAP i gen lucyferazy kontrolowany przez IRF. Ich procedury hodowlane są identyczne, z wyjątkiem pożywek selekcyjnych.
    1. Rozmrozić działający zapas komórek (~5 x 106 komórek) w 10 ml pożywki R10, odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki R10 i przenieść je do kolby hodowlanej T75. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2-3 dni, aż komórki osiągną gęstość 1 x 106 komórek/ml.
    2. Kiedy wzrost komórek osiąga swoją pojemność, komórki pasują, aby zmniejszyć gęstość komórek do zakresu 2-5 x 105 komórek / ml, aby komórki mogły nadal rosnąć.
    3. Po co najmniej 1 pasażu rozpocznij hodowlę komórek w pożywce selekcyjnej: R10-Z dla THP-1-XBlue i R10-ZB dla THP-1-Dual. Po wyhodowaniu komórek za pomocą selekcyjnej pożywki hodowlanej przez co najmniej 1 pasaż, komórki są gotowe do eksperymentu.
      UWAGA: Przerost komórek może prowadzić do znacznej śmierci komórek; Żywotność komórek powinna utrzymać się na poziomie >98%. Zapisuj numer przejścia, ponieważ komórki mogą zachowywać się inaczej po wielu przejściach (> 20 przejściach).
      UWAGA: Kolby do hodowli komórkowych mogą być wielokrotnie używane w celu obniżenia kosztów; Praktyka ta może jednak zwiększać ryzyko ogólnego zanieczyszczenia i zanieczyszczenia krzyżowego między różnymi kolbami (w przypadku jednoczesnego obchodzenia się z różnymi liniami komórkowymi). Podczas wymiany pożywki i pasażu komórkowego wirowanie ustawia się na 300 x g przez 5 minut.
  2. Aby wykonać test komórek reporterowych, umieść komórki w 96-dołkowej płytce hodowli komórek płaskodennych i zróżnicuj je w makrofagi. Procedury są opisane poniżej.
    1. Przenieść komórki z kolby do probówki wirówkowej, odwirować komórki w stężeniu 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w pożywce R10 o stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Dodać podwielokrotności roztworu PMA do zawiesin komórek o końcowym stężeniu 50 ng/ml.
    2. Przenieść 100 μl zawiesin komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C (w inkubatorze do hodowli komórkowych) przez 24 godziny.
    3. Po inkubacji ostrożnie usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą aspiratora próżniowego (lub pipety wielokanałowej) i delikatnie przemyć komórki dwukrotnie PBS (100 μl/studzienkę); dodać 100 μl świeżej pożywki R10 do każdego dołka. Odpocznij komórki przez 2 dni w inkubatorze przed przeprowadzeniem testu reporterowego.
      UWAGA: Krok spoczynku jest bardzo ważny, aby umożliwić komórkom uspokojenie się po stymulacji PMA do ich normalnego stanu ciszy. Może to znacznie zmniejszyć sygnały tła genów reporterowych w warunkach niestymulowanych.
      UWAGA: Po 24 stymulacji PMA, komórki różnicują się w fenotyp podobny do makrofagów, z charakterystyką adhezji komórek na dnie studzienki i morfologiczną cechą pseudopodiów.

3. Badania przesiewowe potencjalnych nano-inhibitorów TLR4 przy użyciu komórek reporterowych

UWAGA: Ponieważ sygnalizacja TLR4 wykorzystuje zarówno ścieżki zależne od MyD88, jak i TRIF, jest ona wybierana jako główny cel, aby objąć szeroki zakres ścieżek sygnałowych TLR. Komórki reporterowe THP-1-XBlue służą głównie do badania aktywacji NF-κB/AP-1, podczas gdy komórki THP-1-Dual służą do aktywacji IRF z transdukcji sygnału zależnej od TRIF.

  1. Określ optymalną dawkę LPS, generując krzywą dawka-odpowiedź przed badaniem przesiewowym.
    1. Rozcieńczyć roboczy roztwór LPS do końcowego stężenia 0,01 - 100 ng/ml w pożywce R10 (rozcieńczyć w skali log10). Ułóż wzór płytki i rozcieńcz ją na 96-dołkowej płytce do hodowli okrągłodennej. Upewnij się, że w każdym studzience znajduje się co najmniej 110 μl roztworu po rozcieńczeniu.
    2. Delikatnie usunąć pożywkę hodowlaną z płytki wysiewanej komórkami (z ppkt 2.2.3) za pomocą aspiratora próżniowego.
    3. Przenieść LPS zawierający pożywkę R10 przygotowaną na płytce rozcieńczającej (3.1.1) do płytki hodowlanej zgodnie z układem próbek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C (w inkubatorze do hodowli komórkowych) przez 24 godziny.
    4. Po 24 godzinach ostrożnie przenieść supernatanty (80 μl/basenik) do nowej 96-dołkowej płytki okrągłodennej. Natychmiast przeprowadzić test luminescencji kolorymetrycznej i/lub lucyferazy na tych roztworach lub przechowywać je w temperaturze 4 °C (kilka godzin) lub -20 °C (dni) przed opracowaniem testu.
      UWAGA: Projekt układu płyt powinien być prosty i przejrzysty do eksperymentów i analizy danych. Dla każdego warunku należy wziąć pod uwagę 2-4 powtórzenia. Zawsze dołączaj ujemną grupę kontrolną (LPS null). Zaleca się stosowanie komórek THP-1-XBlue do aktywacji NF-κB/AP-1, ponieważ komórki Dual mają stosunkowo wysokie tło aktywacji NF-κB/AP-1 po różnicowaniu w makrofagi. Możliwe jest jednak użycie ogniw Dual do zgłaszania zarówno aktywacji NF-κB/AP-1, jak i IRF.
  2. Opracuj test kolorymetryczny do aktywacji NF-κB/AP-1 i test luminescencji lucyferazy do aktywacji IRF.
    1. Aby ocenić aktywację NF-κB/AP-1, przenieść 20 μl supernatantu z każdej próbki do nowej 96-dołkowej płaskodennej płytki hodowlanej i dodać 180 μl wstępnie podgrzanego roztworu substratu SEAP do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny, aby umożliwić rozwój koloru (od różowego do ciemnoniebieskiego). Zebrać absorpcję przy długości fali 655 nm na czytniku płytkowym.
      UWAGA: Czas inkubacji można zmieniać w zależności od rozwoju koloru (30 minut do inkubacji przez noc). Zaleca się poczekać, aż gęstość optyczna (O.D.) najciemniejszego koloru osiągnie powyżej 1, unikając przy tym nasycenia rozwoju koloru (OD >3).
    2. W celu analizy aktywacji IRF przenieść 10 μl supernatantu z każdej próbki do 96-dołkowej, przezroczystej, płaskodennej białej płytki. Dodać roztwór lucyferazy (50 μl) i natychmiast dobrze zebrać luminescencję do studzienki.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się używanie czytnika płytek luminescencyjnych z funkcją automatycznego wstrzykiwania, aby zapewnić spójność odczytu luminescencji od studni do studni i od płytki do płytki. Jeśli roztwory substratów są wstrzykiwane ręcznie, należy zapewnić stały czas inkubacji i konfigurację odczytu dla każdej studzienki.
  3. Przeprowadzić test przesiewowy na różnych hybrydach peptyd-GNP ze stymulacją LPS 10 ng / ml (na podstawie 3.1). Postępować zgodnie z tą samą procedurą opisaną w ppkt 3.2 dla opracowania testu reporterowego.
    1. Zagęścić hybrydy peptydu-GNP do 200 nM w pożywce R10 metodą wirowania. Odwirować 20 objętości roztworu hybrydowego (10 nM) przy 18 000 x g przez 30 minut i ostrożnie wyrzucić supernatanty. Zebrać hybrydy (na dnie probówki) do probówki, umyć je dwukrotnie PBS i ponownie zawiesić hybrydy w jednej objętości pożywki R10.
    2. Zmieszać równe objętości skoncentrowanych hybryd i LPS (20 ng/ml) zawierającego pożywkę R10, aby uzyskać końcowe stężenie hybryd i LPS wynoszące odpowiednio 100 nM i 10 ng/ml.
    3. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki hodowlanej (2.2.3) i dodać 100 μl zmieszanego roztworu do każdego dołka (3 kontrpróby dla każdego warunku); dołączyć kontrolę ujemną (tylko pożywka) i kontrolę LPS (10 ng/ml LPS bez hybryd).
    4. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C, przenieść pożywkę z każdej studzienki do probówki i odwirować probówki o stężeniu 18 000 x g, 4 °C przez 30 minut. Zebrać supernatanty (50-80 μl/probówkę) na 96-dołkową płytkę okrągłodenną i przeprowadzić próbę reporterową zgodnie z opisem w 3.2.
      UWAGA: Wyrzucając supernatanty po odwirowaniu, nie mieszać hybryd na dnie probówki.
      UWAGA: Wirowanie w kroku 3.3.4 jest bardzo ważne dla usunięcia niezinternalizowanych hybryd nanocząstek z pożywki hodowlanej i pozwala uniknąć zakłóceń hybryd z odczytami kolorymetrycznymi/luminescencyjnymi. Dzieje się tak, ponieważ nanocząstki złota mogą pochłaniać szerokie długości fal światła w zależności od ich wielkości i aglomeracji.

4. Walidacja działania hamującego potencjalnych kandydatów

UWAGA: Aby potwierdzić hamujący efekt potencjalnych kandydatów z badania przesiewowego, stosuje się dwa podejścia. Jednym z nich jest zbadanie reakcji na dawkę stymulantów (LPS) przy ustalonym stężeniu hybrydowym (lub na odwrót); drugim jest bezpośrednie przyjrzenie się hamowaniu sygnałów NF-κB/AP-1 i IRF3 poprzez immunoblotting.

  1. W podejściu pierwszym przeprowadzić test reporterowy z 100 nM hybryd ołowiu i dwoma stężeniami LPS przy 1 ng/ml i 10 ng/ml zgodnie z tymi samymi procedurami, co w ppkt 3.3. Uwzględnij nieaktywną hybrydę (na podstawie wyników badań przesiewowych) jako kontrolę hybrydową dla porównania.
  2. W przypadku podejścia opartego na immunoblottingu należy postępować zgodnie ze standardowymi procedurami eksperymentalnymi.
    1. Hoduj komórki THP-1 w pożywce R10, zasiewaj komórki na 12-dołkowej płytce hodowlanej (2 x 106 komórek / dołek) i różnicuj je w makrofagi, traktując komórki 50 ng / ml PMA przez 24 godziny, a następnie odpoczywaj przez 2 dni.
    2. Po różnicowaniu komórek stymuluj komórki 10 ng/ml LPS z/bez hybryd (100 nM) w czasie (do 4 godzin). W różnych punktach czasowych (0, 5, 15, 30, 60, 120 i 240 min) przygotuj lizaty komórkowe do immunoblottingu. Uwzględnij nieaktywną hybrydę jako kontrolkę.
    3. Zbadaj sygnały IκBα, fosforylowanego p65 i fosforylowanego IRF3, aby zbadać hamujący wpływ hybryd ołowiu na aktywację NF-κB i IRF3. Sonduj sygnały β-aktyny i całkowitego IRF3 jako kontrole wewnętrzne.
      UWAGA: Transdukcja sygnału często zachodzi znacznie szybciej (w ciągu kilku godzin) niż ekspresja enzymów reporterowych SEAP i lucyferazy (24 godziny). Zdecydowanie zaleca się również wykonanie testu żywotności badanych hybryd po 24 godzinach jako inną metodę walidacji.

5. Ocena specyficzności TLR

UWAGA: Aby zbadać specyficzność TLR hybrydy peptydu ołowiowego i GNP, testowane są inne szlaki sygnałowe TLR, w tym TLR2, TLR3 i TLR5. TLR7, 8 i 9 są wykluczone, ponieważ makrofagi pochodzące z THP-1 nie reagują dobrze na stymulację tych TLR z powodu braku ekspresji TLR7, 8 i 9 w makrofagach34.

  1. Zbadać różne stężenia (od 1 ng/ml do 25 μg/ml) ligandów specyficznych dla TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I:C) i TLR5 (flagelina) na obu makrofagach pochodzących z komórek reporterowych w celu uzyskania optymalnego stężenia, stosując tę samą procedurę w ppkt 3.1 i 3.2.
  2. Traktować komórki mieszaninami hybrydy ołowianej (100 nM) i każdego liganda TLR w stężeniu uzyskanym z 5.1 w celu oceny swoistości hamującej hybrydy ołowiu zgodnie z procedurą doświadczalną opisaną w ppkt 3.3. Uwzględnij nieaktywną hybrydę jako kontrolkę dla porównania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólne podejście eksperymentalne jest zilustrowane w Rysunek 1. Dwie linie komórek reporterowych THP-1, THP-1-XBlue i THP-1-Dual, są wykorzystywane do szybkiego badania przesiewowego odpowiedzi TLR poprzez sondowanie aktywacji odpowiednio NF-κB / AP-1 i IRF. Aktywacja NF-κB/AP-1 może być wykryta za pomocą testu kolorymetrycznego SEAP, podczas gdy aktywacja IRF jest monitorowana przez luminescencję lucyferazy. Monocytowe komórki THP-1 można łatwo przekształcić...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ TLR są zaangażowane w patogenezę wielu chorób zapalnych, pojawiły się jako cele terapeutyczne w modulacji odpowiedzi immunologicznej i stanów zapalnych. Jednak rozwój kliniczny środków terapeutycznych hamujących szlaki sygnałowe TLR przyniósł do tej pory ograniczone sukcesy. Lek przeciwmalaryczny hydroksychlorochina, który hamuje TLR7 i TLR9, jest w użyciu klinicznym35,36. Podobnie, tylko ograniczona liczba związków przeszła do badań klinicznych, w tym e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Programu dla Profesora Specjalnego Mianowania (Wschodniego Uczonego) w Shanghai Institutions of Higher Learning (H.Y.), funduszu startowego z Shanghai First People's Hospital (H.Y.), wsparcia Gaofeng Clinical Medicine Grant z Shanghai Jiaotong University School of Medicine (H.Y.) oraz finansowania z Crohn's and Colitis Foundation of Canada (CCFC) (S.E.T. i H.Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
THP-1-XBlue komórka reporterowaInvivoGenthpx-sputrzymuje pasaż hodowli komórkowej poniżej 20
THP-1-Podwójna komórka repoterowaInvivoGenthpd-nfisutrzymuje pasaż hodowli komórkowej poniżej 20
RPMI-1640 (bez L-glutaminy)GE Health CareSH30096.02Rozgrzej do 37 & stopni; C przed użyciem; dodaj suplementy, aby uzyskać kompletne podłoże R10
Płodowa surowica bydlęca (kwalifikowana)Thermo Fisher Scientific12484028Inaktywowana termicznie; 10% w RPMI-1640
L-glutaminaThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM w kompletnym podłożu R10
Pirogronian soduThermo Fisher Scientific11360-0701 mM w kompletnym podłożu R10
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, 1X, bez wapnia, magnezuGE Health CareSH30028.02Służy do mycia komórek i przygotowywania odczynników
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1Podłoże SEAP
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Substrat lucyferazy
ZeocinInvivoGenant-zn-1Antybiotyki selekcyjne dla komórek reporterowych
BlasticidinInvivoGenanty-bl-1Selekcja antybiotyków dla komórek reporterowych
Dimetylosulfotlenek (DMSO) do biologii molekularnejSigmal-AldrichD8418-100MLSłuży do przygotowania odczynnika
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) do biologii molekularnejSigmal-AldrichP1585-1MGZastosowanie do różnicowania komórek
Lipopolisacharyd (LPS) z E. coli K12InvivoGentlrl-eklpsLigand TLR4
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsLigand TLR2/1
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-Ligand TLR3
Wiciowca z S. Typhimurium (FLA-ST), ultraczystyInvivoGentlrl-epstflaLigand TLR5
Czytnik mikropłytek SpectraMax Plus 384Urządzenia molekularneNie dotyczy Odczyttestu kolorymetrycznego
Nieskończony wielomodowy czytnik mikropłytek M200 Pro z wtryskiwaczamiTecanN/ACzytaj luminiscience
Wirówka Microfuge 22RBeckman CoulterN/AMikrowirówka z kontrolowaną temperaturą (do 18 000 g)
Wirówka Allegra X-15RBeckman CoulterN/AWirówka ogólnego przeznaczenia z regulacją temperatury (do hodowli komórkowych)
Płytka testowa Costar, 96-dołkowa biała z przezroczystym płaskim dnem, poddana kulturze tkankowejCorning Costar3903Używana do oznaczania luminescencji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461(2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265(2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374(2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewanie nanocz steczekkom rki raportuj ce THP 1test lucyferazy SEAPhybryda peptydowo z otych nanocz steczekaktywacja NF kappaB oraz AP1test lucyferazy IRFwalidacja metod immunoblottinguterapia chor b zapalnych

Powiązane artykuły