Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe bioaktywnych nanocząstek w fagocytarnych komórkach odpornościowych pod kątem inhibitorów sygnalizacji receptora toll-podobnego

DOI:

10.3791/56075

⸱

26 lipca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja receptora Toll-podobnego (TLR) odgrywa ważną rolę w patofizjologii wielu chorób zapalnych u ludzi, a regulacja odpowiedzi TLR przez bioaktywne nanocząstki jest korzystna w wielu stanach zapalnych. Komórki reporterowe oparte na komórkach THP-1 stanowią wszechstronną i solidną platformę przesiewową do identyfikacji nowych inhibitorów sygnalizacji TLR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farmakologiczna regulacja odpowiedzi receptora Toll-podobnego (TLR) jest bardzo obiecująca w leczeniu wielu chorób zapalnych. Jednak do tej pory dostępnych było niewiele związków osłabiających sygnalizację TLR i nie było klinicznie zatwierdzonych inhibitorów TLR (z wyjątkiem leku przeciwmalarycznego hydroksychlorochiny) w użyciu klinicznym. W świetle szybkich postępów w nanotechnologii, manipulowanie reakcją immunologiczną za pomocą nanourządzeń może zapewnić nową strategię leczenia tych chorób. W niniejszym artykule przedstawiamy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych do szybkiej identyfikacji nowych bioaktywnych nanocząstek, które hamują sygnalizację TLR w fagocytarnych komórkach odpornościowych. Ta platforma przesiewowa jest zbudowana na komórkach reporterowych opartych na komórkach THP-1 z testami kolorymetrycznymi i lucyferazy. Komórki reporterowe są inżynierowane z ludzkiej linii komórek monocytarnych THP-1 poprzez stabilną integrację dwóch indukowalnych konstruktów reporterowych. Jeden wyraża wydzielany gen embrionalnej fosfatazy alkalicznej (SEAP) pod kontrolą promotora indukowanego przez czynniki transkrypcyjne NF-κB i AP-1, a drugi wyraża wydzielany gen reporterowy lucyferazy pod kontrolą promotorów indukowanych przez czynniki regulatorowe interferonu (IRF). Po stymulacji TLR komórki reporterowe aktywują czynniki transkrypcyjne, a następnie wytwarzają SEAP i/lub lucyferazę, które można wykryć za pomocą odpowiadających im odczynników substratowych. Korzystając z biblioteki hybryd nanocząstek peptydu i złota (GNP) ustalonej w naszych poprzednich badaniach jako przykładu, zidentyfikowaliśmy jedną hybrydę peptyd-GNP, która może skutecznie hamować dwa ramiona kaskady sygnałowej TLR4 wyzwalanej przez prototypowy ligand, lipopolisacharyd (LPS). Wyniki zostały zweryfikowane za pomocą standardowych technik biochemicznych, w tym immunoblottingu. Dalsza analiza wykazała, że ta wiodąca hybryda ma szerokie spektrum hamujące, działając na wiele szlaków TLR, w tym TLR2, 3, 4 i 5. To eksperymentalne podejście pozwala na szybką ocenę, czy nanocząstka (lub inne związki terapeutyczne) może modulować specyficzną sygnalizację TLR w fagocytarnych komórkach odpornościowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory toll-podobne (TLR) są jednym z kluczowych elementów wrodzonego układu odpornościowego, przyczyniając się do pierwszej linii obrony przed infekcjami. TLR są odpowiedzialne za wykrywanie atakujących patogenów poprzez rozpoznawanie repertuaru wzorców molekularnych związanych z patogenami (lub PAMP) i narastanie reakcji obronnych poprzez kaskadę transdukcji sygnału1,2. Zidentyfikowano 10 ludzkich TLR-ów; z wyjątkiem TLR10, dla którego ligand (ligandy) pozostaje niejasny, każdy TLR może rozpoznać odrębną, konserwatywną grupę PAMP. Na przykład TLR2 i TLR4, zlokalizowane głównie na powierzchni komórki, mogą....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek i odczynników do hodowli komórkowych

  1. Przygotuj kompletną pożywkę do hodowli komórkowych R10, dodając suplementy 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu do pożywki RPMI-1640.
    1. Przygotować selekcyjną pożywkę hodowlaną R10-Z, dodając antybiotyk zeocynę (200 μg/ml) do R10 w celu utrzymania ekspresji SEAP pod kontrolą aktywacji NF-κB/AP-1. Aby wybrać komórki wykazujące ekspresję zarówno genów reporterowych SEAP, jak i lucyferazy, dodaj zarówno zeocynę (100 μg/ml), jak i blastycydynę (10 μg/ml) do R10 (jako R10-ZB).
  2. Przygotować roztwór sub....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólne podejście eksperymentalne jest zilustrowane w Rysunek 1. Dwie linie komórek reporterowych THP-1, THP-1-XBlue i THP-1-Dual, są wykorzystywane do szybkiego badania przesiewowego odpowiedzi TLR poprzez sondowanie aktywacji odpowiednio NF-κB / AP-1 i IRF. Aktywacja NF-κB/AP-1 może być wykryta za pomocą testu kolorymetrycznego SEAP, podczas gdy aktywacja IRF jest monitorowana przez luminescencję lucyferazy. Monocytowe komórki THP-1 można łatwo przekształcić.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ TLR są zaangażowane w patogenezę wielu chorób zapalnych, pojawiły się jako cele terapeutyczne w modulacji odpowiedzi immunologicznej i stanów zapalnych. Jednak rozwój kliniczny środków terapeutycznych hamujących szlaki sygnałowe TLR przyniósł do tej pory ograniczone sukcesy. Lek przeciwmalaryczny hydroksychlorochina, który hamuje TLR7 i TLR9, jest w użyciu klinicznym35,36. Podobnie, tylko ograniczona liczba związków przeszła do badań klinicznych, w tym e.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Programu dla Profesora Specjalnego Mianowania (Wschodniego Uczonego) w Shanghai Institutions of Higher Learning (H.Y.), funduszu startowego z Shanghai First People's Hospital (H.Y.), wsparcia Gaofeng Clinical Medicine Grant z Shanghai Jiaotong University School of Medicine (H.Y.) oraz finansowania z Crohn's and Colitis Foundation of Canada (CCFC) (S.E.T. i H.Y.).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
THP-1-XBlue komórka reporterowaInvivoGenthpx-sputrzymuje pasaż hodowli komórkowej poniżej 20
THP-1-Podwójna komórka repoterowaInvivoGenthpd-nfisutrzymuje pasaż hodowli komórkowej poniżej 20
RPMI-1640 (bez L-glutaminy)GE Health CareSH30096.02Rozgrzej do 37 & stopni; C przed użyciem; dodaj suplementy, aby uzyskać kompletne podłoże R10
Płodowa surowica bydlęca (kwalifikowana)Thermo Fisher Scientific12484028Inaktywowana termicznie; 10% w RPMI-1640
L-glutaminaThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM w kompletnym podłożu R10
Pirogronian soduThermo Fisher Scientific11360-0701 mM w kompletnym podłożu R10
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, 1X, bez wapnia, magnezuGE Health CareSH30028.02Służy do mycia komórek i przygotowywania odczynników
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1Podłoże SEAP
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Substrat lucyferazy
ZeocinInvivoGenant-zn-1Antybiotyki selekcyjne dla komórek reporterowych
BlasticidinInvivoGenanty-bl-1Selekcja antybiotyków dla komórek reporterowych
Dimetylosulfotlenek (DMSO) do biologii molekularnejSigmal-AldrichD8418-100MLSłuży do przygotowania odczynnika
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) do biologii molekularnejSigmal-AldrichP1585-1MGZastosowanie do różnicowania komórek
Lipopolisacharyd (LPS) z E. coli K12InvivoGentlrl-eklpsLigand TLR4
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsLigand TLR2/1
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-Ligand TLR3
Wiciowca z S. Typhimurium (FLA-ST), ultraczystyInvivoGentlrl-epstflaLigand TLR5
Czytnik mikropłytek SpectraMax Plus 384Urządzenia molekularneNie dotyczy Odczyttestu kolorymetrycznego
Nieskończony wielomodowy czytnik mikropłytek M200 Pro z wtryskiwaczamiTecanN/ACzytaj luminiscience
Wirówka Microfuge 22RBeckman CoulterN/AMikrowirówka z kontrolowaną temperaturą (do 18 000 g)
Wirówka Allegra X-15RBeckman CoulterN/AWirówka ogólnego przeznaczenia z regulacją temperatury (do hodowli komórkowych)
Płytka testowa Costar, 96-dołkowa biała z przezroczystym płaskim dnem, poddana kulturze tkankowejCorning Costar3903Używana do oznaczania luminescencji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewanie nanocz steczekkom rki raportuj ce THP 1test lucyferazy SEAPhybryda peptydowo z otych nanocz steczekaktywacja NF kappaB oraz AP1test lucyferazy IRFwalidacja metod immunoblottinguterapia chor b zapalnych

Powiązane artykuły