Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA

Ogólnie, aby zrozumieć interakcje białko-DNA, test Y1H jest preferowanym systemem z powodzeniem stosowanym w warunkach laboratoryjnych ¹. Podstawowy test Y1H obejmuje dwa elementy: a) konstrukt reporterowy z DNA będącym przedmiotem zainteresowania, z powodzeniem sklonowany przed genem kodującym białko reporterowe; oraz b) konstrukt ekspresji, który wygeneruje białko fuzyjne między TF będącym przedmiotem zainteresowania a domeną aktywacji transkrypcji drożdży (AD). DNA będące przedmiotem zainteresowania jest powszechnie określane jako "przynęta", podczas gdy białko fuzyjne jest znane jako "zdobycz". W ubiegłych latach opracowano wiele wersji testu Y1H w celu zaspokojenia konkretnych potrzeb z własnymi zaletami ². Istniejący test Y1H może być z powodzeniem wdrożony do identyfikacji i walidacji interakcji jednego białka na raz z jego przynętą DNA, ale brakuje mu możliwości identyfikacji heterodimerycznych lub multimerycznych interakcji białko-DNA.

Opisana tutaj metoda jest zmodyfikowaną wersją istniejącego Y1H, umożliwiającą badaczom jednoczesne badanie wielu białek wiążących się z ich docelowymi sekwencjami DNA. Celem tego testu jest ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania domeną aktywacyjną (pDEST22: TF) i ocena aktywacji kandydujących regionów DNA połączonych z reporterem w obecności i/lub braku oddziałującego partnera białkowego (pDEST32ΔDBD-TF) w układzie drożdży. Ten test pozwoli nam określić, czy interakcja między tymi dwoma białkami jest wymagana do aktywacji celu. Jest to system kompatybilny z klonowaniem GATEWAY, a zatem możliwy do użycia w zwykłych warunkach laboratoryjnych. Protokół ten opiera się na bezpośredniej transformacji, która zapewnia łatwość kotransformacji różnych TF w systemie drożdży. W związku z tym jest to korzystna strategia walidacji kompleksów białkowych wiążących się z ich możliwymi celami DNA w celu walidacji molekularnej i funkcjonalnej in vitro dla dowolnego systemu. Obecne techniki, takie jak metody tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP), są kosztowne i pracochłonne, ale pozwalają na wykrywanie hetrokompleksów białkowych na dużą skalę ^3,4,5. Ta zmodyfikowana hybryda drożdży może być z powodzeniem wykonywana w zwykłych warunkach laboratoryjnych na małą skalę (Rysunek 1) i jest również opłacalna. Test Y1.5H może ułatwić naukowcom z całej społeczności przetestowanie i walidację ich hipotezy w kierunku zdefiniowania roli wiązania kompleksu białek multimerycznych ze wspólnym celem DNA przy użyciu systemu heterologicznego. Na podstawie uzyskanych wyników hipotezę można zweryfikować in vivo w preferowanym systemie badań. Ostatnio zastosowaliśmy to podejście do zdefiniowania roli TF i jego sposobu działania w celu regulacji kwitnienia u Arabidopsis ⁶.

1. Przygotowanie plazmidu do konstruowania i raportowania

1. PCR amplifikuje regiony / "fragmenty" promotora (najlepiej ~250 - 500 pz) docelowego DNA, które mają być analizowane w celu dalszego klonowania do wektora wejściowego przy użyciu E. coli (TOP10).
2. Po potwierdzeniu sekwencjonowania należy sklonować dodatni klon w zgodnym wektorze wyrażenia pGLacZi ⁷, jak opisano wcześniej ^8,9,10,11.
3. Przekształć szczep drożdży do integracji promotora (YM4271) przez homologiczną rekombinację pGLacZi w celu wygenerowania szczepu reporterowego drożdży, jak opisano wcześniej ^12,13. Etapy transformacji i potwierdzenia szczepu drożdży z regionem DNA wraz z recepturą pożywki nie są tutaj opisane, ponieważ kroki są podobne do klasycznego protokołu Y1H ^{9,10,11,12,13}. Plazmid kontrolny pEXP-AD502 może być używany do celów normalizacji podczas ilościowego określania aktywności β-galaktozydazy, jak opisano wcześniej ⁸.
4. Sklonuj TF lub białko będące przedmiotem zainteresowania, a następnie sklonuj oddziałującego partnera białkowego do wektorów ekspresyjnych pDEST22 i pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus domena wiążąca DNA). Przekształcone fragmenty promotora drożdży i klony TF są następnie wykorzystywane w dalszej części protokołu.

2. Zmodyfikowany protokół Y1.5H

1. W dniu 1 (po południu) rozpocząć od 5 ml kultury w SD-Ura z szalki Petriego lub bulionu glicerolowego i inkubować przez noc w shakerze o temperaturze 30 °C.
   UWAGA: Hodowlę tę można rozpocząć ze świeżo pokrytej płytką lub bezpośrednio z 25% lub 30% glicerolu klonu drożdży z fragmentem DNA.
2. W dniu 2 (po południu) zaszczepić 10 ml pożywki YPDA 500 μl nocnej kultury i inkubować przez noc w shakerze o temperaturze 30 °C.
3. Dzień 3 (wcześnie rano i całe popołudnie): Przygotuj kompetentne komórki (wcześnie rano).
   1. Zaszczepić 100 ml pożywki YPDA 2 ml nocnej kultury i inkubować w wytrząsarce o temperaturze 30 °C. Uprawiaj tę świeżą kulturę, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,4-0,8 (3-5 h).
      UWAGA: Sprawdź OD₆₀₀ nocnej hodowli i upewnij się, że punkt początkowy OD₆₀₀ dla tego kroku wynosi 0,1 - 0,2. Stosowanie nadmiernie lub niedostatecznie wyrośniętych kultur może przedłużyć eksperyment.
   2. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 21 °C. Odrzucić supernatant.
   3. Rozpuść granulki w 10 ml sterylnej wody, używając wiru lub pipetowania w górę iw dół.
   4. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 21 °C. Odrzucić supernatant.
   5. Rozpuść granulki w 2 ml kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (TE)/ octanu litu (LiAc) za pomocą wiru lub pipetowania w górę iw dół.
      UWAGA: Proszę zapoznać się z przepisem na TE/LiAc w Tabeli 1.
   6. Wirować przez 5 minut 1000 x g w temperaturze 21°C. Odrzucić supernatant.
   7. Ponownie zawiesić osad w 4 ml TE/LiAc + 400 μl DNA plemników łososia (10 mg/ml), pipetując w górę iw dół i przejdź do następnego kroku.
4. Kotransformacja: szok cieplny komórek (późnym popołudniem)
   1. Rozprowadzić 20 μl komórek na studzienkę w 96-dołkowej płytce mieszającej (U-bottom).
   2. Dodaj po 150 ng (~1,5 μL) każdego z pDEST22: plazmid TF, pDEST32ΔDBD: plazmid TF i pEXP-AD502 plus pDEST32ΔDBD: TF (kontrola normalizacji) do studzienek.
      UWAGA: Oczekuje się, że optymalne wyniki uzyska się przy ~150 ng każdy z plazmidu pDEST22: TF i pDEST32ΔDBD: TF dla udanej kotransformacji. Może się różnić w zależności od konstruktu i ekspresji plazmidu, dlatego musi być optymalizowany w każdym eksperymencie. Inny element sterujący pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD może być również dołączony według uznania użytkownika.
   3. Dodaj 100 μl TE/ LiAc / glikolu polietylenowego (PEG) na dołek (wymieszaj trzy razy).
      UWAGA: Proszę zapoznać się z przepisem na TE/LiAc/PEG w tabeli 1.
   4. Przykryj płytkę oddychającą uszczelką i inkubuj przez 20 - 30 minut (może być dłużej) w temperaturze 30 °C (bez konieczności mieszania).
   5. Szok termiczny przez 20 min (dokładnie) w temperaturze 42 °C.
5. Ułóż komórki na płytce.
   1. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety wielokanałowej. Dodać 110 μl TE i wymieszać.
   2. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć 100 μl supernatantu za pomocą pipety wielokanałowej. Ponownie zawiesić śrut za pomocą dziurkacza.
   3. Przenieś komórki na płytkach agarowych SD-Trp-Leu. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C do następnego etapu.
6. Dzień 5 (popołudnie): Przenieść komórki na nowe płytki za pomocą dziurkacza/replikatora mikropłytek.
   1. Napełnij sterylną 96-dołkową płytkę mieszającą (U-bottom) 50 μl TE za pomocą pipety wielokanałowej. Wstępnie zwilż dziurkacz w TE.
      UWAGA: Dziurkacz lub replikator mikropłytek należy wysterylizować przed tym krokiem, a następnie w dalszej części protokołu. Można zastosować powszechny sposób sterylizacji dziurkacza, taki jak zanurzenie go w etanolu (100%; nie klasy biologii molekularnej), a następnie spalenie go do płomienia. Odczekaj 1 minutę, aby schłodzić kołki dziurkacza.
      ostrożność: W przypadku wykonywania sterylizacji na stole; Upewnij się, że ławka jest wstępnie oczyszczona etanolem i wolna od wszelkich materiałów palnych w pobliżu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).
   2. Dziurkować kolonie i ponownie zawiesić na płytce wypełnionej TE.
      UWAGA: Jeśli na płytce występuje gładki wzrost, kolonie można przebić bezpośrednio na płytkę wypełnioną TE lub alternatywnie, pojedynczą kolonię (w przypadku wielu kolonii) należy pobrać za pomocą wysterylizowanej wykałaczki do płytki wypełnionej TE, a następnie użyć dziurkacza do następnego kroku.
   3. Przenieś je na nowe płytki agarowe SD-Trp-Leu, aby uzyskać optymalne pokrycie powierzchni. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C do następnego etapu.
7. Dzień 7 (popołudnie): Rozpocznij hodowlę w celu zmierzenia aktywności β-galaktozydazy.
   1. Napełnij sterylną 96-dołkową płytkę mieszającą (U-bottom) 50 μl pożywki SD-Trp-Leu za pomocą wielokanałowej pipety.
   2. Napełnij sterylny blok studzienki o głębokości 96 litrami 180 μl pożywki SD-Trp-Leu za pomocą pipety wielokanałowej.
   3. Wstępnie zwilż dziurkacz w podłożu i przenieś kolonie z płytki do 50 μl podłoża.
   4. Przenieś 20 μl drożdży do 180 μl pożywki SD-Trp-Leu i uszczelnij blok oddychającą uszczelką. Inkubować przez 36 godzin w temperaturze wytrząsającej w temperaturze 30 °C.
8. Dzień 9 (rano): Rozpocznij hodowlę w celu pomiaru enzymatycznego.
   1. Przenieś 100 μl kultury do 500 μl pożywki YPDA w wysterylizowanym bloku 96 głębokich studzienek.
   2. Przykryć wysterylizowaną płytkę z głęboką studzienką oddychającą uszczelką i inkubować przez 3-5 godzin w temperaturze 30 °C z mieszaniem przy 200 obr./min (do OD₆₀₀ 0,3-0,6).
   3. Ponownie zawiesić hodowlę i przenieść 125 μl za pomocą pipety wielokanałowej na płytce spektrofotometru (zmierzyć OD₆₀₀).
      UWAGA: Uwaga: Nie dozuj ostatniej kropli, aby uniknąć pęcherzyków, jeśli OD₆₀₀ jest poniżej 0,3 - 0,6, inkubuj pozostałe komórki przez 1 - 2 godziny więcej w oparciu o odczyt. Kultura o pojemności 125 μl użyta na tym etapie może zostać odrzucona lub przeniesiona z powrotem do pierwotnego bloku studni głębinowej według uznania użytkownika.
   4. Odwirować pozostałe komórki w bloku studzienki głębinowej przez 10 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć supernatant przez odwrócenie.
   5. Dodać 200 μl buforu Z i vortex.
      UWAGA: Proszę zapoznać się z przepisem na bufor Z w tabeli 1.
   6. Wirować przez 5 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć supernatant przez odwrócenie.
   7. Dodać 20 μl buforu Z i odwirować.
   8. Przykryj płytkę folią uszczelniającą, która jest odporna na cykle zamrażania i rozmrażania. Wykonać 4 cykle zamrażania/rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu w dygestorium, a następnie w temperaturze 42 ºC w łaźni wodnej (2 minuty każdy).
   9. Dodać 200 μl buforu Z/beta-merkaptoetanolu (β-ME)/orto-nitrofenylo-β-galaktozydu (ONPG) (odpowiednio 12 ml, 21 μl, 8,4 mg, aby otrzymać 20 ml roztworu; zawsze przygotowuj świeże).
      UWAGA: ONPG potrzebuje trochę czasu, aby prawidłowo się rozpuścić, więc przygotuj roztwór na godzinę przed osiągnięciem tego etapu. ONPG służy jako substrat do pomiaru aktywności β-galaktozydazy.
   10. Inkubować do 17 - 24 godzin w temperaturze 30 °C (sprawdź w międzyczasie, czy kolor rozwinął się wcześniej, przejdź do następnego kroku).
9. Dzień 10 (rano): Przerwij reakcję i zmierz.
   1. Dodaj 110 μL 1M Na₂CO₃ aby zatrzymać reakcję i nagrać czas.
   2. Wirować i wirować przez 10 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C.
   3. Pobrać 125 μl supernatantu za pomocą wielokanałowego i zmierzyć OD₄₂₀,
      UWAGA: Uwaga, nie dozuj ostatniej kropli, aby uniknąć bąbelków.
   4. Obliczać aktywność β-galonów: 1000 x OD₄₂₀ / (czas (min) x objętość (ml) x OD₆₀₀ w arkuszu kalkulacyjnym.

Ogólna procedura ustawiania płytki do kotransformacji regionów DNA w komórkach drożdży z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (Rysunek 2). Ustawienie płytki może być modyfikowane w zależności od potrzeb eksperymentu i liczby badanych regionów/fragmentów DNA. Po 5 dniu protokołu powinna być widoczna dobrze wyrosła i dodatnia płytka, jak w Rysunek 3. W naszym badaniu region promotora o wartości 2600 pz w górę od początku miejsca rozpoczęcia transkrypcji został podzielony na sześć regionów lub fragmentów (FR 1-6) 6. Na reprezentatywnym rysunku (Rysunek 3) regiony DNA 1 i 4 wykazują dodatnią interakcję z kompleksem białek A i B. Po zmierzeniu aktywności β-galaktozydazy (Tabela uzupełniająca 1) tylko fragment-1 wykazuje czterokrotną indukcję aktywności genu reporterowego, podczas gdy fragment-4 nie przekroczył naszego wewnętrznego progu ≥ dwukrotnie.

Rysunek 1: Przegląd zmodyfikowanego testu hybrydy drożdży i jedności (Y1,5H). Układ opisuje krok po kroku procedurę testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Uproszczona reprezentacja ustawienia płytki do kotransformacji komórek drożdży z białkiem (TF) będącym przedmiotem zainteresowania. W ogólnym układzie eksperymentalnym płytkę można ułożyć tak, jak pokazano na rysunku. Kombinacja konstrukcji i kontrolek może być modyfikowana zgodnie z potrzebami i jest całkowicie zależna od uznania użytkownika.

Rysunek 3: Reprezentatywny obraz płytki dodatniej (SD-Trp-Leu) dla replikatu 1 po udanej kotransformacji. Podobny wynik należy zaobserwować w przypadku większej liczby powtórzeń. Fragment 1-6 reprezentuje region DNA; Brak fragmentu jest kontrolą negatywną.

Tabela 1: Przepis na rozwiązania zastosowane w protokole. Tabela zawiera przepis na roztwory podstawowe i robocze głównych stosowanych w teście.

Tabela uzupełniająca 1: Pomiar aktywności β-galaktozydazy. Prezentowany tutaj arkusz arkusza kalkulacyjnego może być wykorzystany jako szablon do pomiaru aktywności β-galaktozydazy za pomocą wzoru podanego w protokole. Kombinacja konstrukcji może być modyfikowana według uznania użytkownika. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.