Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56081

⸱

23 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine Division, Translational Genomics Research Institute, 2Agilent Technologies

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Streszczenie

Wiele typów nowotworów, w tym rak trzustki, ma gęsty zwłóknienie zrębu, które odgrywa ważną rolę w progresji i inwazji guza. Aktywowane fibroblasty związane z rakiem są kluczowym składnikiem zrębu guza, który oddziałuje z komórkami rakowymi i wspomaga ich wzrost i przeżycie. Modele, które podsumowują interakcję komórek nowotworowych i aktywowanych fibroblastów, są ważnymi narzędziami do badania biologii zrębu i opracowywania środków przeciwnowotworowych. W tym miejscu opisano metodę szybkiego generowania solidnej trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i aktywowanych fibroblastów trzustki, które można wykorzystać do kolejnych badań biologicznych. Dodatkowo opisano zastosowanie sferoid 3D w przeprowadzaniu funkcjonalnych testów metabolicznych w celu zbadania szlaków bioenergetyki komórkowej za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w połączeniu z mikropłytką sferoidalną. Komórki raka trzustki (Patu8902) i aktywowane komórki fibroblastów trzustki (PS1) hodowano wspólnie i namagnesowano przy użyciu biokompatybilnego zestawu nanocząstek. Namagnesowane komórki szybko poddano biodrukowi za pomocą napędów magnetycznych w formacie 96 dołków, w pożywkach wzrostowych w celu wygenerowania sferoid o średnicy w zakresie 400-600 μm w ciągu 5-7 dni hodowli. Następnie przeprowadzono funkcjonalne testy metaboliczne z wykorzystaniem sferoidów Patu8902-PS1 przy użyciu technologii strumienia zewnątrzkomórkowego w celu zbadania komórkowych szlaków energetycznych. Metoda opisana w niniejszym dokumencie jest prosta, pozwala na konsekwentne generowanie sferoidalnych kultur komórek rakowych i fibroblastów i może być potencjalnie dostosowana do innych typów komórek nowotworowych po optymalizacji obecnie opisanej metodologii.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady opracowano liczne modele 3D in vitro, które rekapitulują i badają in vivo biologię nowotworu, mikrośrodowisko i warunki wzrostu komórek nowotworowych1,2. Dwuwymiarowe (2D) jednowarstwowe systemy hodowli komórkowych z jednolitą ekspozycją na czynniki biochemiczne i badane związki nie są w stanie odtworzyć natywnych interakcji 3D guz-zręb wystawionych na gradient związków dyfundujących przez białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)3,4. Tak więc, w porównaniu z modelami 2D hodowli tkankowych, pojawiły się modele 3D raka, które wykazują lepszy potencjał w symulowaniu mikrośrodowiska guza i posłużyły jako ważne narzędzia do lepszego zrozumienia cech guza in vivo, takich jak niedotlenienie, desmoplazja, spoczynek, penetracja leku, toksyczność i oporność terapeutyczna5,6. W tym celu modele 3D mają potencjał, aby wypełnić lukę między hodowlą komórkową 2D a całymi modelami zwierzęcymi, naśladując cechy guza in vivo, a jednocześnie są stosunkowo niedrogie i zoptymalizowane pod kątem szybkiego generowania i spójności. Zalety te są wykorzystywane do przyspieszenia badań translacyjnych w wielu dziedzinach, w tym w biologii nowotworów, morfogenezie i inżynierii tkankowej7,8.

W fali ewolucji metod hodowli tkanek 3D, techniki lewitacji magnetycznej zostały ostatnio opracowane i opisane dla wzrostu, oznaczania i obrazowania sferoidów pochodzących z różnych typów komórek9,10,11,12. Magnetyczny biodruk 3D wykorzystuje wykorzystanie sił magnetycznych do inżynierii tkanek poprzez magnesowanie komórek biokompatybilnymi nanocząstkami i drukowanie ich w formatach wielodołkowych. Pozwala to na szybką produkcję spójnych, niemal identycznych sferoid 3D, które mogą być wykorzystane i wykorzystane do wielu dalszych zastosowań w badaniach biochemicznych i biofizycznych10. Tutaj dostosowaliśmy technikę biodruku magnetycznego przy użyciu biokompatybilnego materiału o nazwie Nanoshuttle (NS) składającego się z tlenku żelaza, poli L-lizyny i nanocząstek złota do znakowania komórek raka trzustki i fibroblastów. NS przyłącza się elektrostatycznie do błony plazmatycznej, nie wiadomo, czy wiąże się z żadnymi specyficznymi receptorami i uwalnia się z powierzchni komórki w ciągu tygodnia. Wymaga bardzo niskich sił magnetycznych (30pN), wystarczających do agregacji, ale nie uszkadzania komórek i nie wpływa na żywotność komórek, metabolizm ani proliferację, dzięki czemu jest wyjątkowo biokompatybilny dla kultur 3D10,13,14,15.

W tym badaniu, używając raka trzustki jako przykładu i modelu, opisujemy proces generowania i badania metabolicznego sferoidów 3D komórek rakowych i fibroblastów. Zaczynając od komórek hodowanych w naczyniach 2D, ilustrujemy hodowlę i warunki wzrostu sferoidów kokulturowych guza trzustki i fibroblastów za pomocą biodruku magnetycznego. Hodowane sferoidy wykorzystano następnie w funkcjonalnych testach metabolicznych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, technologii, która jak wykazano, jednocześnie mierzy dwa główne szlaki wytwarzania energii, glikolizę i oddychanie mitochondrialne, w różnych żywych komórkach i tkankach16,17,18,19,20. Glikolizę mierzono jako zmianę szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), podczas gdy oddychanie mitochondrialne lub fosforylację oksydacyjną mierzono jako wskaźnik zużycia tlenu (OCR). Proponujemy, aby ta metoda opracowana dla sferoid guza trzustki mogła służyć jako szkielet do optymalizacji i translacji generowania i oznaczania sferoidów guza 3D na inne typy komórek / tkanek.

Protokół

1. Hodowla sferoid 3D raka trzustki przy użyciu biodruku magnetycznego

  1. Stosując standardową technikę aseptycznej hodowli tkankowej, hoduj interesujące komórki w kolbie T75 do zbiegu 70-80% w odpowiednich pożywkach wzrostowych.
    UWAGA: Zazwyczaj pobiera się 5-7 × 106 komórek z 70-80% zlewającej się kolby T75. W tym badaniu wykorzystano dwa różne typy komórek - Patu8902 (komórki nowotworowe trzustki) i komórki PS1 (aktywowane komórki gwiaździste trzustki21). Obie linie komórkowe hodowano w pożywce Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1× penicyliny-streptomycyny (p / s).
  2. Umyj komórki raz 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco.
  3. Oderwij komórki od plastikowej powierzchni przez trypcynizację 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdź, czy komórki nie odrywają się pod mikroskopem.
  4. Dezaktywuj trypsynę przez dodanie 8 ml pożywki wzrostowej do oderwanych komórek. Unikaj nadmiernej trypsynizacji, ponieważ może to niekorzystnie wpłynąć na zdrowie/żywotność komórek.
  5. Pipped komórek w górę iw dół, aby wygenerować zawiesinę pojedynczej komórki i policzyć gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
  6. W międzyczasie należy zrównoważyć fiolkę z NS do temperatury otoczenia.
  7. Obliczyć ilość komórek potrzebną do wysiewu żądanej liczby sferoid (dołków) i podwielokrotności do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Na przykład, aby zasiać całą 96-dołkową płytkę z 5,000 komórek / studzienkę, podwielokrotność co najmniej 5,5 × 105 komórek.
  8. Zebrać komórki, odwirowując przy 500 x g przez 3 minuty. Ostrożnie odessać lub zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1,0 x 106 komórek/ml w pożywce wzrostowej. Delikatnie pipetować za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem, aby uniknąć ścinania. Na przykład ponownie zawieś 5,5 x 105 komórek w 550 μl pożywki wzrostowej.
  9. Namagnesuj żądaną liczbę komórek za pomocą zrównoważonego NS (krok 1.6).
    1. Bezpośrednio dodać NS do zawiesiny komórkowej w pożywce wzrostowej i delikatnie wymieszać. Do wydajnego znakowania magnetycznego komórek należy użyć 10 μL NS na 100 μL komórek (zawieszonych w 1 x 106 komórek/ml).
      UWAGA: W typowym eksperymencie oznacz 5,5×105 komórek Patu8902 w 550 μl 55 μl NS i 1,1×106 komórek PS1 w 1100 μl, (oddzielnie) 110 μl NS.
    2. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy, aby zapewnić zawieszenie komórek. Tymczasowo przenieś mieszaninę komórki-NS do pojedynczego dołka na 24-dołkowej płytce. Zrób to osobno dla każdego typu ogniwa, które ma być namagnesowane. Przykryj płytkę i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, delikatnie wstrząsając, aby umożliwić NS związanie się z powierzchnią komórki.
      UWAGA: Hodowla i oznaczanie sferoid rozpoczynających się od samych komórek Patu8902 lub PS1, oprócz sferoid z kohodowli zaczynających się od obu typów komórek wstępnie zmieszanych przed wydrukowaniem na napędach magnetycznych, udało się osiągnąć przy użyciu tej metody w niezależnych eksperymentach. Metoda generowania sferoid kokulturowych z komórek Patu8902 i PS2 została opisana poniżej w kolejnych krokach.
  10. Delikatnie pipetuj namagnesowane komórki w górę iw dół, aby równomiernie wymieszać i przygotuj mieszankę wzorcową zawierającą żądaną liczbę komórek. Do wysiewu sferoid użyj łącznie 15 000 komórek (5 000 Patu8902 + 10 000 PS1) i dostosuj do całkowitej objętości 150 μl na dołek 96-dołkowej płytki.
    UWAGA: Końcowa objętość dozowana do każdej studzienki musi być taka sama, niezależnie od liczby użytych komórek.
  11. Umieść 96-dołkową płytkę odstraszającą komórki na 96-dołkowym magnetycznym napędzie sferoidalnym i dozuj 150 μl mieszanki komórek do każdej studzienki. Obserwuj, jak komórki powoli zbierają się do środka studni nad magnesem. Przykryć płytkę i inkubować ją przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 ustawionym na temperaturę 37 °C z nadal podłączonym magnetycznym napędem sferoidalnym. Usuń napęd magnetyczny i inkubuj w celu dalszego wzrostu do 7 dni.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać płytek wzrostowych odstraszających komórki do drukowania sferoidów za pomocą magnetycznych napędów sferoidalnych. Upewnij się, że używany jest napęd sferoidalny z cieńszymi mniejszymi magnesami, a nie napęd przytrzymujący.
  12. Monitoruj wzrost sferoid każdego dnia. Uzupełniaj świeżą pożywką wzrostową co trzy dni, umieszczając płytkę wzrostową zamontowaną na magnetycznym napędzie przytrzymującym pod kątem i używając wielokanałowej pipety do wyciągania zużytej pożywki.
    UWAGA: Komórki Patu8902 i PS1 wysiane jednocześnie w 15 000 komórek / studzienkę wyrosną na sferoidy 3D o średnicy 400-600 μm w ciągu 5-7 dni. W tym momencie sferoidy są gotowe do charakterystyki metabolicznej, oceny leków i innych dalszych zastosowań.

2. Test metaboliczny sferoid 3D guza trzustki dla szlaków bioenergetycznych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Uwaga: W tej sekcji opisana jest analiza funkcji metabolicznych sferoid za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego z mikropłytkami testowymi specjalnie zaprojektowanymi dla sferoid 3D.

  1. Mycie i przenoszenie sferoid z płytek wzrostowych na mikropłytki do testów sferoidalnych.
    UWAGA: Sferoidy mogą być używane do testów metabolicznych, gdy osiągną średnicę ~500 μm.
    1. Dzień przed wykonaniem testu należy uwodnić sondę lub wkład czujnika kalibrem testowym (200 μl/studzienkę) na dostarczonej płytce użytkowej i inkubować przez noc (4-18 godzin) w nawilżanym inkubatorze (bezCO2) ustawionym na temperaturę 37 °C.
    2. Przygotować odpowiednią pożywkę do oznaczania dla pożądanego testu metabolicznego, uzupełniając pożywkę bazową (patrz tabela materiałów) 2 mM L-glutaminy do testu wysiłkowego glikolizy (GST) lub 1 mM pirogronianu, 2 mM L-glutaminy i 10 mM glukozy do testu wysiłkowego mitochondrialnego (MST).
      Uwaga: Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego mierzy zarówno oddychanie mitochondrialne (OCR), jak i glikolizę (ECAR) żywych komórek w formacie 96-dołkowej płytki. Wskaźniki te zapewniają przegląd funkcji metabolicznych komórek w badanych próbkach. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w instrukcji w zestawach testowych.
    3. Po dodaniu dodatków specyficznych dla testu (patrz krok 2.1.1), ogrzać uzupełnioną pożywkę do oznaczania w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i dostosować pH do 7,4 ± 0,1 za pomocą 0,1N NaOH. Utrzymuj podłoże w cieple do momentu użycia.
    4. Odczynniki z zestawu do oznaczania należy rozpuścić w skalibrowanym podłożu testowym do zalecanych stężeń podstawowych.
      UWAGA: Są one wytwarzane przy 10× końcowego stężenia pożądanego w studzienkach. Podstawowe stężenia glukozy, oligomycyny i 2-deoksy-glukozy (2-DG) wynoszą odpowiednio 100 mM, 100 μM i 500 mM.
    5. Obserwuj sferoidy na płytce wzrostowej pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić morfologię sferoidów i ogólną jednorodność, pod względem kształtu i struktury sferoidów.
    6. Przenieś płytkę wzrostową na magnetyczny napęd przytrzymujący i ostrożnie zassaj ~120 μl pożywki wzrostowej. Delikatnie przemyć sferoidy ~120 μL podgrzanego i wstępnie skalibrowanego podłoża testowego, odessać i powtórzyć płukanie dwukrotnie. Sprawdź ponownie sferoidy pod mikroskopem, aby upewnić się, że sferoidy nie zostały zmyte.
    7. Przygotować mikropłytkę do testu sferoidalnego, dodając 180 μl ciepłej pożywki do oznaczania do każdej studzienki.
    8. Ustaw mikropipetę P20 na 10 μl i dopasuj do niej końcówkę z szerokim otworem. Jeśli końcówki z szerokimi otworami nie są dostępne, odetnij końcówki zwykłych końcówek do pipet czystymi nożyczkami lub skalpelem, aby poszerzyć otwór.
      Uwaga: Powinno to zmniejszyć ścinanie i zachować ogólną morfologię sferoid podczas przenoszenia na płytki testowe.
    9. Użyj ciepłej (37 °C) powierzchni do przeprowadzenia transferu sferoid. Użyj powierzchni wizjera kliszy rentgenowskiej ogrzanej lampą światła białego, aby zwiększyć kontrast i ułatwić wizualizację sferoid podczas procesu przenoszenia.
    10. Ostrożnie odessać pojedynczą wstępnie umytą sferoidę z płytki wzrostu odstraszającej komórki za pomocą mikropipety P20 wyposażonej w końcówkę o szerokim otworze i delikatnie przenieść sferoidę bezpośrednio do środka każdej studzienki sferoidalnej płytki testowej w celu przeprowadzenia testu metabolicznego. Pozwól, aby każda sferoida delikatnie wpadła do centralnej mikrokomory każdej studzienki za pomocą czystej grawitacji, aby wypełnić płytkę testową.
      UWAGA: Zwykle potrzeba 5-8 s, aby każda sferoida wpadła do środka studni pod wpływem grawitacji. Nie wyciągaj pipety, dopóki sferoidy nie osiądą w mikrokomorze. Nie umieszczaj sferoid w 4 dołkach narożnych płytki testowej (A1, A12, H1, H12), ponieważ będą one używane jako studzienki tła.
    11. Monitoruj morfologię i położenie każdej sferoidy, aby upewnić się, że każda sferoida znajduje się w środku każdej studzienki. W razie potrzeby przesuń się do środka studni, odsysając sferoidę za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze, a następnie osadzając ją grawitacyjnie.
    12. Po przeniesieniu wszystkich sferoid umieścić płytkę testową w inkubatorze z wilgotnym powietrzem o temperaturze 37 °C (bezCO2) na jedną godzinę przed badaniem.
  2. Ładowanie wkładu czujnika związkami i wykonanie testu
    1. Przygotować 10× skoncentrowanych odczynników specyficznych dla testu w pożywce specyficznej dla testu opisanej w kroku 2.1.2. Na przykład, aby przeprowadzić GST, należy odtworzyć glukozę, oligomycynę i 2-DG w zalecanych ilościach, o których mowa w instrukcji oznaczania. Zarówno testy GST, jak i MST przeprowadzono przy użyciu sferoid Patu8902-PS1.
    2. Prawidłowo ustaw wkład czujnika w rzędach oznaczonych AH po lewej stronie i umieść prowadnicę ładowania na górze wkładu czujnika. Upewnij się, że żądany port jest prawidłowo załadowany, ustawiając prowadnicę załadunku tak, aby litera odpowiadająca portowi, który ma być załadowany, znajdowała się w lewym górnym rogu.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj odczynniki bezpośrednio do portów iniekcyjnych. Trzymaj prowadnice załadowcze w odpowiedniej pozycji za pomocą opuszków palców przez cały czas trwania procedury.
      Uwaga: Każdy odczynnik zostanie wstrzyknięty do zalecanego portu, o którym mowa w instrukcji testów. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza, ale nie stukaj żadną częścią wkładu w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
    4. Wyjmij prowadnicę załadowczą i umieść na wysokości oczu z wkładem, aby wizualnie sprawdzić porty iniekcyjne pod kątem równomiernego ładowania.
    5. Należy utworzyć projekt testu eksperymentalnego/protokół przyrządu za pomocą oprogramowania Wave sterownika przyrządu (zwanego dalej oprogramowaniem do analizy), jak opisano w sekcji 2.3.
  3. Projektowanie i wykonywanie testów za pomocą oprogramowania analitycznego
    1. Tworzenie szablonu testu dla eksperymentu
      1. Otwórz oprogramowanie analityczne i kliknij "Szablony" lub wybierz jeden z istniejących szablonów testów. Kliknij dwukrotnie "Pusty szablon".
      2. Zdefiniuj grupy i warunki eksperymentalne.
        1. Zdefiniuj strategie iniekcji dla portów A, B i C. Pozostaw port D pusty.
          UWAGA: W przypadku testu GST tylko te porty zostaną załadowane glukozą, oligomycyną i 2-DG. W przypadku testu MST zostanie załadowana oligomycyna, FCCP i rotenon.
        2. Określić obróbkę wstępną, jeśli sferoidy były traktowane jednym lub więcej badanymi związkami i grupą kontrolną. Zdefiniuj podłoże testowe, aby uwzględnić źródło, suplementy i inne informacje.
        3. Zdefiniuj jeden lub więcej typów komórek (np. Patu8902, PS1), wyświetlając informacje o gęstości i liczbie przejść.
      3. Kliknij "Generuj grupy".
      4. Kliknij zakładkę "Mapa płyt" i przypisz grupy do płytki testowej odpowiadającej projektowi doświadczalnemu.
      5. Wybierz cztery studzienki narożne jako studzienki tła. Upewnij się, że w tych studzienkach nie ma sferoid.
  4. Uruchamianie testu na analizatorze
    1. Kliknij na zakładkę Instrument Protocol (Protokół przyrządu). Zachowaj domyślne polecenia protokołu, zaznaczając opcje "Kalibruj", "Równoważ" i "Podstawowy cykl pomiarowy".
    2. Kliknij "Wtryski" i zdefiniuj związek dla każdego portu. Edytuj cykle pomiarowe na 6 cykli z domyślnych 3 cykli dla sferoid. Zachowaj domyślne 3-minutowe mieszanie, 0 min oczekiwania i 3-minutowe czasy pomiaru.
      Uwaga: Domyślne czasy mieszania, oczekiwania i pomiaru to odpowiednio 3 minuty, 0 minuty i 3 minuty. Przed wstrzyknięciem pierwszego związku testowego zwykle wykonuje się trzy pomiary dawki podstawowej. Pomiary te można kalibrować i ponownie korygować zgodnie z projektem eksperymentalnym.
    3. Protokół przeglądu i podsumowanie grupy.
    4. Zapisz szablon projektu testu.
    5. Przejdź do kalibracji przed testem po załadowaniu portów iniekcyjnych substratami testowymi. Przenieść wkład z tabliczką użytkową do analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.
      UWAGA: Zwykle odbywa się to w ciągu 15-20 minut i kalibruje czujniki w celu przeprowadzenia pomiarów OCR i ECAR.
    6. Po kalibracji wkładu należy wymienić tabliczkę użytkową na wstępnie podgrzaną płytkę testową zawierającą sferoidy 3D i rozpocząć test. Po zakończeniu pomiarów wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyki, aby przeanalizować dane.

Wyniki

Ogólny schemat biodrukowania magnetycznego i analizy przepływu zewnątrzkomórkowego w przypadku sferoidów 3D
Rysunek 1 przedstawia przegląd całego procesu opisanego w niniejszym protokole. Komórki raka trzustki (Patu8902) oraz aktywowane komórki gwiaździste (PS1) hodowano w kolbach do hodowli tkankowej zawierających odpowiednie pożywki wzrostowe do osiągnięcia konfluencji na poziomie 70-80%. Komórki oddzielono od naczynia z kulturą 2D i przemyto, określono ich gęstość, a następnie resuspenderowano w pożywce wzrostowej w stężeniu 1×106 komórek/mL. Do namagnesowania komórek użyto NS, kompleksu nanocząstek składającego się ze złota, tlenku żelaza i poli-L-lizyny. Indywidualnie namagnesowane komórki Patu8902 i PS1 zmieszano i wydrukowano na 96-dołkowych płytkach wzrostowych z powłoką odpychającą komórki, zamontowanych na magnetycznym napędzie sferoidów. Zoptymalizowaliśmy całkowitą liczbę komórek do siewania w pojedynczym dołku na poziomie 15 000 (5 000 komórek Patu8902 zmieszanych z 10 000 komórek PS1 w celu wytworzenia pojedynczego sferoidu). Po inkubacji w odpowiednich warunkach hodowli tkankowej przez 5-7 dni uzyskano sferoidy trójwymiarowe, monitorując i rejestrując w tym czasie ich wzrost. Po przemyciu pożywką do testów sferoidy przeniesiono fizycznie na mikropłytkę do sferoidów, aby przeprowadzić testy metaboliczne za pomocą analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego w celu jednoczesnego pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego.

Hodowla i wzrost sferoidów z komórek guza trzustki i fibroblastów
Aby uzyskać funkcjonalne i stabilne sferoidy, linię komórkową raka nabłonkowego Patu8902 oraz aktywowane komórki gwiaździste PS1 hodowano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą. Komórki Pat8902 i PS1 uprzednio namagnesowane za pomocą NS zmieszano w stosunku 1:2, tak aby wysiać łącznie 15 000 komórek na studzienkę w płytce hodowlanej. W ciągu 24 h od naniesienia komórek na napędy magnetyczne, komórki skupiły się w centrum studzienki, dokładnie nad każdym z magnesów znajdujących się pod studzienkami. Wzrost sferoidów Patu8902-PS1 monitorowano za pomocą obrazowania w 2., 4., 7. i 9. dniu po wysianiu komórek. Rycina 2 przedstawia ilościowe określenie średnicy reprezentatywnych sferoidów w powyższych punktach czasowych. Średnica sferoidów zwiększa się z 414 µm w 2. dniu do 596 µm w 7. dniu po naniesieniu. Nie stwierdzono istotnej różnicy w wzroście między 7. a 9. dniem, w związku z czym wszystkie dalsze eksperymenty ograniczono do 7 dni wzrostu sferoidów. Zauważono, że sferoidy przyjmują bardziej wyraźną morfologię, zwłaszcza wokół krawędzi zewnętrznych, a NS ulega stopniowo bardziej równomiernej dyfuzji w całej objętości sferoidu wraz z liczbą dni hodowli. Oszacowano również sferyczność 10 sferoidów na podstawie długości ich osi głównej i pomocniczej. Średnia sferyczność wyniosła 0,92 ± 0,04 dla samych komórek Patu8902 (guz), 0,95 ± 0,04 dla samych komórek PS1 (stroma) oraz 0,94 ± 0,02 dla sferoidów z kokultury.

Funkcjonalny test metaboliczny trójwymiarowych sferoidów trzustki z użyciem analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego
Aby przetestować funkcjonalność sferoidów, zastosowaliśmy analizę metaboliczną i bioenergetyczną w celu zbadania ścieżek energetycznych w sferoidach. Przeprowadziliśmy test stresu glikolitycznego (GST) na sferoidach hodowanych zgodnie z opisaną powyżej procedurą. W tym celu testowi poddano sferoidy wytworzone z komórek Patu8902 lub PS1, a także te powstałe z kokultury obu typów komórek. Co ciekawe, wszystkie trzy typy sferoidów, niezależnie od tego, czy pochodziły z pojedynczych czy zmieszanych populacji komórek, wykazały biologicznie funkcjonalną odpowiedź w teście GST. Po wstrzyknięciu nasycającego stężenia glukozy, badane typy sferoidów wykazały wzrost aktywności ścieżki glikolitycznej, co potwierdzono poprzez wzrost ECAR (Rycina 3). Gdy produkcję ATP w mitochondriach zahamowano za pomocą oligomycyny, produkcja energii przesunęła się w stronę glikolizy, co zmusiło komórki do osiągnięcia maksymalnej wydolności glikolitycznej, co objawiło się dalszym wzrostem ECAR. Hamowanie glikolizy za pomocą 2-DG, analogu glukozy, który konkurencyjnie wiąże heksokinazę glukozową, doprowadziło do spadku ECAR, co potwierdziło, że wcześniejszy wzrost ECAR był wynikiem aktywności glikolitycznej. Zauważyliśmy, że sferoidy testowane w tej próbie reagowały w ten sposób, choć sferoidy składające się z samych komórek PS1 (średnica średnia 250 µm) wykazywały stosunkowo słabszy sygnał, co prawdopodobnie wynikało z ich mniejszego rozmiaru i niższej wydolności glikolitycznej w porównaniu z komórkami nowotworu Patu8902 (średnica średnia 600 µm). W generalnym ujęciu, wyższy sygnał ECAR z sferoidów pochodzących z komórek nowotworowych w porównaniu do sferoidów pochodzących ze stosunkowo mniejszych fibroblastów PS1 można prawdopodobnie przypisać wrodzonej skłonności metabolicznej komórek nowotworowych do glikolizy22,23. Wszystkie trzy typy sferoidów uzyskano poprzez wysianie tej samej liczby komórek, choć zauważyliśmy różnice w rozmiarze sferoidów pomiędzy poszczególnymi typami; najmniejsze były sferoidy z samych komórek PS1, następnie sferoidy z kokultury, a największe sferoidy z samych komórek Patu8902.

Aby przetestować funkcję mitochondriów w sferoidach 3D, poddaliśmy sferoidy kokultury analizie MST. MST mierzy kluczowe parametry funkcji mitochondriów poprzez bezpośredni pomiar OCR komórek (Rysunek 4A oraz 4B). W celu pomiaru kluczowych parametrów mitochondrialnych, takich jak produkcja ATP, oddychanie maksymalne i oddychanie niemitochondrialne, zastosowano sekwencyjne wstrzykiwanie związków (oligomycyny, FCCP oraz mieszaniny rotenonu i antymycyny A). Parametry te oraz bazowe tempo oddychania zostały następnie wykorzystane do obliczenia przecieku protonów i rezerwowej wydolności oddechowej (Rysunek 4C). Spadek OCR w odpowiedzi na oligomycynę, inhibitor syntazy ATP (kompleks V), koreluje z oddychaniem mitochondrialnym związanym z komórkową produkcją ATP. Sferoidy inkubowano z oligomycyną przez dłuższy czas, aby umożliwić maksymalną penetrację i efektywny czas odpowiedzi. Drugie wstrzyknięcie z odsprzęgaczem FCCP stymuluje maksymalne zużycie tlenu i odpowiadający temu wzrost OCR. OCR stymulowany FCCP wykorzystano do obliczenia rezerwowej wydolności oddechowej, która jest miarą zdolności komórki do reagowania na zwiększone zapotrzebowanie energetyczne. Trzecie wstrzyknięcie; mieszanina rotenonu (inhibitora kompleksu I) i antymycyny A (inhibitora kompleksu III), blokuje oddychanie mitochondrialne, co objawia się gwałtownym spadkiem OCR (Rysunek 4B).

Ogólnie nasze obserwacje potwierdzają funkcjonalność hodowlanych sferoidów z wykorzystaniem analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego jako miary ich śladu/aktywności metabolicznej, zarówno w odniesieniu do potencjału glikolitycznego, jak i mitochondrialnego, zgodnie z powyższym opisem.

Schemat hodowli komórek nowotworowych i fibroblastów; biodruk, inkubacja sferoidów, konfiguracja analizatora strumienia.
Rysunek 1Schematyczna reprezentacja metodologii hodowli i analizy sferoidów komórek raka trzustki/fibroblastów. Komórki Patu8902 i PS1 hodowano, trypsynizowano, przemywano i przeliczano. W celu wysiania każdego sferoidu, komórki Patu8902 (5 000 komórek/dołek) oraz fibroblasty PS1 (10 000 komórek/dołek) namagnesowano przy użyciu NS i naniesiono pierwszego dnia na płytkę hodowlaną o właściwościach antyadhezyjnych. Po wysianiu płytkę hodowlaną zamocowano w magnetycznym napędzie do sferoidów (z jednym magnesem pod każdym dołkiem płytki hodowlanej w formacie 96-dołkowym) i inkubowano przez 2–7 dni w celu uzyskania sferoidów 3D. Uzyskane sferoidy przemyto i przeniesiono na mikroplatek do analizy sferoidów, aby przeprowadzić testy metaboliczne przy użyciu analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wzrostu sferoidów; wykresy średnicy w funkcji dni, obrazy mikroskopowe i wyniki sferyczności.
Rysunek 2. Wzrost sferoidów z komórek guza trzustki i fibroblastów. (A) Na górze przedstawiono reprezentatywny obraz sferoidu z kokultury Patu8902-PS1 odpowiadający dniu hodowli, a poniżej ilościowo określono średnicę sferoidu (µm). Pomiędzy 2. a 7. dniem widoczny jest progresywny wzrost rozmiaru sferoidów oraz dyfuzja cząsteczek NS (ciemne kropki) w całej ich objętości. Sferoidy utrzymywano w hodowli przez dodatkowe 2 dni, co nie spowodowało istotnego wzrostu średnicy sferoidów. (B) Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia sferoidów pochodzących z komórek nowotworowych (Patu8902), komórek zmywy (PS1) oraz kokultury komórek (Patu8902 + PS1). (C) Przedstawiono dane dotyczące sferyczności z 10 pojedynczych sferoidów z każdej grupy. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe (SD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy analizy glikolizy; zmiany ECAR w czasie i porównanie warunków; wykres słupkowy szczegółowo przedstawiający parametry glikolityczne.
Rycina 3. Test stresu glikolitycznego (GST) z wykorzystaniem sferoidów trzustkowych. (A) Schematyczny obraz typowego testu funkcji glikolitycznej z przedstawieniem różnych parametrów pomiaru. (B) Przykład testu GST wykonanego na sferoidach trzustkowych hodowanych zgodnie z opisaną metodologią. Iniekcja glukozy zwiększa glikolizę, co objawia się wzrostem ECAR, a dalszy wzrost następuje po dodaniu oligomycyny w celu zahamowania oddychania mitochondrialnego. ECAR spada w odpowiedzi na 2-DG, konkurencyjny analog glukozy, poprzez zablokowanie glikolizy. Odnotowano, że wszystkie sferoidy wykazują funkcjonalną odpowiedź w teście GST. (C) Wynik testu GST wygenerowany za pomocą programu producenta, przedstawiający trzy główne parametry testu GST. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza OCR oddychania mitochondrialnego, wykresy oddychania podstawowego, maksymalnego oraz tempa wycieku protonów.
Rycina 4. Test stresu mitochondrialnego (MST) z wykorzystaniem sferoidów Patu8902-PS1. (A) Przedstawiono schematyczny opis typowego testu funkcji mitochondrialnych z różnymi parametrami analizy. (B) Pokazano przykład MST na sferoidach guza trzustki i fibroblastów. (C) Sferoidy 3D w ko-kulturze wykazują funkcjonalną odpowiedź w teście MST. Zgodnie z oczekiwaniami, spadek funkcji mitochondrialnych, mierzony jako spadek OCR, zaobserwowano po podaniu sferoidom oligomycyny, inhibitora syntazy ATP. Zastosowanie FCCP w celu zwiększenia przepływu elektronów doprowadziło do maksymalnego OCR, który gwałtownie spadł po zahamowaniu oddychania mitochondrialnego przy użyciu koktajlu inhibitorów kompleksów mitochondrialnych. Słupki błędu reprezentują standardowy błąd średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Wykorzystując raka trzustki,trzecią najczęstszą przyczynę zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych24, jako przykład i model, opracowano szybką i spójną metodę hodowli i oznaczania sferoid 3D przy użyciu kohodowli komórek raka trzustki i aktywowanych fibroblastów trzustki. Za pomocą biodruku magnetycznego uzyskano sferoidy o średnicy od 400 do 600 μm. Zostały one poddane testom metabolicznym, aby skutecznie przetestować funkcjonalność hodowanych sferoid 3D. Ta metoda jest prosta, spójna i można ją łatwo dostosować do innych typów komórek.

Chociaż metodologia ta przyspieszy i zwiększy wartość translacyjną testów przeprowadzanych za pomocą sferoid 3D, można ją udoskonalić, opracowując techniki, które umożliwiają multipleksowanie manipulacji sferoidami i obsługi. Powinno to jeszcze bardziej skrócić całkowity czas, koszty i nakład pracy wymagane do przeprowadzenia testu. Dodatkowo, objętości sferoidalne mogą być używane do normalizacji sygnałów OCR zgłaszanych przez innych6. Objętość sferoidalna znormalizowana przez średnią objętość komórki może być wykorzystana do określenia OCR na komórkę, ale ponieważ wzrost sferoid nie będzie identyczny, obliczenie bezwzględnego OCR na komórkę może być trudne. Obecnie metodologia ta jest ograniczona ze względu na brak skutecznego narzędzia do obsługi sferoidów multipleksowych i transferu z płytek wzrostowych do środowiska testowego.

Opisana metoda została zmodyfikowana i zaadaptowana z technologii biodruku magnetycznego, a następnie zwalidowana w celu wykazania znaczenia funkcjonalnego poprzez zastosowanie hodowanych sferoid do dalszego testu metabolicznego. Metoda ta stanowi ważne narzędzie do generowania wytrzymałych, żywotnych i funkcjonalnych sferoid, które zawierają dwa główne typy komórek występujące w większości tkanek nowotworowych, komórek rakowych i fibroblastów związanych z rakiem, które można wykorzystać do innych testów eksperymentalnych, takich jak badania przesiewowe leków. Względna łatwość i skuteczność metodyki NS stanowi znaczną poprawę w porównaniu z innymi metodami25, takimi jak metoda wiszącej kropli 2,26 w odniesieniu do generowania sferoidów.

Wytrzymałe sferoidy wygenerowane w ten sposób zapewniają model guza in vitro , który obejmuje komórki zrębu, których często brakuje w wielu badaniach kultur 3D. Możliwości zastosowania tak generowanych modeli sferoidalnych 3D są ogromne. Na przykład, takie modele mogą być wykorzystywane do badania interakcji między komórkami, zmian bioenergetycznych oraz do badania podatności genetycznej i zależności różnych schematów terapeutycznych. Sferoidy 3D, które podsumowują mikrośrodowisko guza in vivo , służą jako bardzo istotne i użyteczne narzędzie w badaniach przesiewowych leków oraz w badaniach nad mechanizmami działania obecnych i nowatorskich środków terapeutycznych. Testy metaboliczne badające szlaki energetyczne przy użyciu kultur sferoidów ze zmutowanymi komórkami mogą pomóc rzucić nowe światło na rolę tych genów i powiązanych szlaków w patobiologii w odpowiednim modelu 3D raka, takim jak sferoidy opisane w tym badaniu.

Skuteczne zastosowanie tej metody zależy przede wszystkim od zdrowia komórek potrzebnych do druku magnetycznego, dlatego komórki rosnące w fazie logarytmicznej powinny być zbierane i namagnesowywane. Bardzo ważne jest, aby do drukowania namagnesowanych komórek używać magnetycznego napędu sferoidalnego, a nie napędu przytrzymującego, który powinien być używany tylko podczas etapów mycia sferoidów i uzupełniania pożywki opisaną metodą. Innym najbardziej krytycznym aspektem dla pomyślnego odczytu testów metabolicznych jest utrzymanie morfologii sferoid podczas procesu przenoszenia z płytki wzrostowej na płytkę testową.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten został opracowany dla generowania sferoid 3D, które zawierają zarówno komórki rakowe, jak i zrębowe, po późniejszym teście metabolicznym sferoid za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Kluczowymi cechami tej metody jest to, że jest szybka, łatwo adaptowalna i spójna, odpowiednia i naśladuje mikrośrodowisko guza in vivo , jest stosunkowo niedroga i może służyć jako nowe narzędzie do badania biologii guza i opracowywania środków przeciwnowotworowych.

Oświadczenia

Autorzy, George W. Rogers i Andrew Neilson, są pracownikami/udziałowcami firmy Agilent Technologies, która produkuje odczynniki i przyrządy używane w tym artykule. Wszyscy pozostali autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Samuelowi Zirbelowi za pomoc w optymalizacji warunków hodowli i monitorowaniu wzrostu sferoidów. Jesteśmy wdzięczni firmie Agilent Technologies za dostarczenie analizatora SeaHorse XFe96, odczynników testowych i wglądu technicznego. Dziękujemy również dr Hemantowi Kocherowi z Barts Cancer Institute w Wielkiej Brytanii za dostarczenie komórek PS1. Praca ta była częściowo wspierana przez Seena Magowitz Foundation for Pancreatic Cancer Research oraz Stand Up To Cancer-Cancer Research UK-Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Research Grant (numer grantu: SU2C-AACR-DT-20-16). Stand Up To Cancer to program Fundacji Przemysłu Rozrywkowego. Granty badawcze są zarządzane przez American Association for Cancer Research, partnera naukowego SU2C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna EDTASigma25300-054
96-dołkowa płytka odstraszająca komórkiUSA Scientific/ Griener Bio-One655970sferoidalna płytka wzrostowa
Celometria Szkiełka do liczenia komórekNexcelom CHT4-SD100-002
D-GlucoseSigmaD9434
DPBSGibco14190-144
Zestaw do testów warunków skrajnych glikolizyAgilent Technologies103020-100
L-glutaminaSigma59202C
Mitochondrial Zestaw do testów warunków skrajnychAgilent Technologies103015-100
n3D Magnetyczny napęd sferoidalnyNano3D Bioscience655841Część Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetyczny napęd sferoidalnyNano3D Bioscience655841Część Spheroid Bioprinting Zestaw
n3D NanoShuttle-PL Nano3D Bioscience655841częścią Bioprinting sferoidalnego Kit:  przechowuj pod adresem 4 ° Komórki C
Patu8902Laboratorium MagazynKomórki gruczolakoraka przewodowego trzustki
Komórki PS1Laboratorium Zasobyaktywowane komórki gwiaździste trzustki
RPMI1640Gibco11875-093growth media dla komórek, sferoidy
SeaHorse XFe96 analizator strumienia zewnątrzkomórkowegoAgilent Technologiesanalizator strumienia zewnątrzkomórkowego
Pirogronian soduSigmaS8636
XF Podłoże bazoweAgilent Technologies102365-100podłoże bazowe do testów metabolicznych na XFe96

Bibliografia

  1. Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).
  2. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  3. Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).
  4. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).
  5. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  6. Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  8. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  9. Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).
  10. Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).
  11. Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987(2015).
  12. Tseng, H., et al. Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. , Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).
  13. Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).
  14. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
  15. Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
  16. Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
  17. Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  18. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  19. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).
  20. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918(2016).
  21. Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).
  22. Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).
  23. Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).
  24. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

3D kokultura sferoidówaktywowane fibroblastymontaż nanocząsteczek magnetycznychanalizator strumienia zewnątrzkomórkowegotest stresu glikolitycznegooddychanie mitochondrialnebiodruk sferoidówoddziaływanie stromy nowotworowej
Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.