Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56083

⸱

18 września 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.

Streszczenie

Angiogeneza to złożony, wysoce regulowany proces odpowiedzialny za zapewnienie i utrzymanie odpowiedniej perfuzji tkanek. Niewystarczające utrzymanie naczyń krwionośnych i patologiczne wady rozwojowe mogą prowadzić do ciężkich chorób niedokrwiennych, podczas gdy zbyt obfity rozwój naczyń wiąże się z rakiem i zaburzeniami zapalnymi. Obiecującą formą terapii proangiogennej jest wykorzystanie źródeł komórek angiogennych, które mogą zapewnić czynniki regulacyjne, a także fizyczne wsparcie dla nowo rozwijającego się układu krwionośnego.

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) są szeroko badanymi kandydatami do regeneracji naczyń krwionośnych ze względu na ich działanie parakrynne oraz zdolność do wykrywania i domowania niedokrwiennych lub zapalnych tkanek. W szczególności ludzkie komórki okołonaczyniowe pępowiny w pierwszym trymestrze ciąży (HUCPVC FTM) są bardzo obiecującym kandydatem ze względu na ich właściwości podobne do pericytów, wysoki potencjał proliferacyjny i wieloliniowy, właściwości uprzywilejowane immunologicznie i solidny profil parakrynny. Aby skutecznie ocenić potencjalnie angiogenne komórki regeneracyjne, konieczne jest przetestowanie ich w wiarygodnych i "przekładalnych" testach przedklinicznych. Test pierścienia aortalnego jest modelem angiogenezy ex vivo, który pozwala na łatwą ocenę ilościową struktur śródbłonka kanalików, zapewnia dodatkowe komórki podporowe i macierz zewnątrzkomórkową (ECM) od gospodarza, wyklucza składniki zapalne oraz jest szybki i niedrogi w konfiguracji. Jest to korzystne w porównaniu z modelami in vivo (np. test rogówki, test czopa Matrigel); Test pierścienia aortalnego może śledzić podawane komórki i obserwować interakcje międzykomórkowe, unikając odrzucenia ksenoimmunologicznego.

Prezentujemy protokół dla nowatorskiego zastosowania testu pierścienia aortalnego, który obejmuje ludzkie MSC w kokulturach z rozwijającymi się sieciami śródbłonka aorty szczura. Test ten pozwala na analizę udziału MSC w tworzeniu i rozwoju rurki poprzez fizyczne interakcje podobne do perycytów oraz ich siły do aktywnej migracji do miejsc angiogenezy, a także na ocenę ich zdolności do wykonywania i pośredniczenia w przetwarzaniu ECM. Protokół ten dostarcza dalszych informacji na temat zmian w fenotypie MSC i ekspresji genów po kohodowli.

Wprowadzenie

Złożony proces angiogenezy poprawia i utrzymuje perfuzję tkanek, promując rozwój nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych1. Jest to proces ściśle regulowany, zrównoważony przez czynniki proangiogenne i antyangiogenne. Każdy niedobór w tym systemie może prowadzić do niewystarczającego utrzymania lub wzrostu naczyń, powodując poważne choroby niedokrwienne, w tym chorobę mięśnia sercowego, udar mózgu i zaburzenia neurodegeneracyjne. Jednak przesadny rozwój naczyń krwionośnych jest charakterystyczny dla schorzeń, takich jak rak i choroby zapalne2.

Opracowanie terapii, które mają na celu kontrolowanie angiogenezy w celu uzyskania korzystnej regeneracji tkanek, ma kluczowe znaczenie. Pomimo szeroko zakrojonych badań przedklinicznych i klinicznych, próby stymulacji angiogenezy za pomocą czynników proangiogennych i mikroRNA nie przyniosły pożądanych rezultatów3,4,5. Możliwe przyczyny przejściowych efektów to: ograniczona trwałość białek angiogennych i kwasów nukleinowych oraz skończona liczba docelowych czynników wzrostu6,7. Chociaż rozpuszczalne czynniki angiogenne są niezbędne do zainicjowania angiogenezy, utrzymanie i funkcjonalność układu naczyniowego zależą od typów komórek wspierających, w tym perycytów i komórek mięśni gładkich8. Dziedzina terapii proangiogennych bada obecnie potencjalne źródła komórek macierzystych i progenitorowych, które mogą lokalnie dostarczać czynniki angiogenne, jednocześnie fizycznie wspierając nowo powstałe naczynia krwionośne, samoodnawiające się lub nawet różnicujące w komórki podobne do śródbłonka9,10. Znalezienie optymalnych typów komórek angiogennych, które są w stanie spełnić te wymagania funkcjonalne, jest wielką obietnicą dla niedokrwiennej regeneracji tkanek.

Aby skutecznie przełożyć potencjalne terapie komórkowe na badania kliniczne, badania przedkliniczne muszą wykazać ich skuteczność i podkreślić leżące u ich podstaw mechanizmy angiogenne. Pomimo dużej liczby uznanych testów angiogenezy, w tej dziedzinie brakuje "złotego standardu" testu in vitro, który mógłby wiarygodnie ocenić skuteczność potencjalnych typów komórek kandydujących11,12,13. Większość testów angiogenezy in vitro (w tym testy proliferacji śródbłonka, migracji i tworzenia rurek) zazwyczaj ocenia wpływ komórek lub związków na zmiany fenotypowe komórek śródbłonka lub różnicowanie się w struktury kanalikowe i sieciowe14,15. Chociaż cechy te mają kluczowe znaczenie dla angiogenezy, test "translacyjny" powinien również oceniać: 1) augmentację lub wymianę typów komórek podporowych, w tym perycytów lub komórek mięśni gładkich, 2) przetwarzanie ECM i / lub błony podstawnej oraz 3) skuteczność w promowaniu tworzenia funkcjonalnego mikrokrążenia. Modele angiogenezy in vivo, w tym test rogówki i test czopa Matrigel, podsumowują unikalne mikrośrodowisko in vivo, ale stanowią wyzwanie związane ze śledzeniem podawanych komórek w celu obserwacji interakcji fizycznych. Co więcej, w modelach in vivo, odrzucenie ksenoimmunologiczne może wystąpić podczas testowania potencjalnych kandydatów na allogeniczną terapię komórkową16. Modele angiogenezy ex vivo, w szczególności test pierścienia aortalnego, mogą zapewnić: 1) łatwą obserwację i kwantyfikację struktur rurkowych, 2) dodatkowe komórki podporowe, 3) ECM od gospodarza i sztuczne źródła, 4) wykluczenie składników zapalnych oraz 5) szybką i niedrogą konfigurację17,18. Zazwyczaj test pierścienia aortalnego może przetestować potencjał angiogenny małych białek wydzielniczych, środków farmakologicznych i transgenicznych modeli gryzoni19,20,21.

MSCs są obiecującymi kandydatami do regeneracji naczyń krwionośnych, głównie ze względu na ich efekty za pośrednictwem parakrynny22,23,24. Wykazano, że MSCs wydzielają kluczowe czynniki angiogenne, w tym czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (IGF-1), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i angiopoeitynę-1 (Ang-1)25,26. MSCs mogą również wykrywać i domieszkować tkanki niedokrwienne lub zapalne, jednak dokładne mechanizmy są nadal badane. Coraz częściej literatura potwierdza hipotezę, że większość MSCs powstaje z komórek okołonaczyniowych, współekspresji markerów perycytów i może zachowywać się jak pericytes27. HUCPVC są młodym źródłem MSC pochodzących z obszaru okołonaczyniowego ludzkiej pępowiny. Reprezentują one populację MSCs o właściwościach podobnych do perycytów i zostały scharakteryzowane zarówno na podstawie FTM, jak i pępowiny. HUCPVC FTM wykazują wysoką ekspresję markerów perycytów, w tym CD146 i NG2, wysoki potencjał proliferacyjny i wieloliniowy, właściwości uprzywilejowane immunologicznie i wykazują solidny profil parakrynny28. HUCPVC FTM są idealnym typem komórek kandydujących do wspomagania regeneracji uszkodzonej tkanki poprzez promowanie nowego układu naczyniowego poprzez ich właściwości podobne do perycytów.

Aby przetestować potencjał angiogenny i właściwości podobne do perycytów ludzkich MSC, dostępna jest bardzo ograniczona liczba testów angiogenezy, w których można badać pozytywną migrację angiotropową (zwaną dalej "naprowadzaniem"), przetwarzanie ECM i rozwój fizycznych interakcji między typami komórek, jednocześnie uzyskując dane ilościowe na temat rozwoju mikrokrążenia.

Niniejszym prezentujemy protokół, który opisuje nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego. Ludzkie MSCs hodowano wspólnie z rozwijającymi się sieciami śródbłonka aorty pochodzącymi od szczurów, aby ocenić ich wkład w powstawanie, dojrzewanie i homeostazę rurek. Ta wersja testu pierścienia aortalnego ocenia zdolność i siłę działania kandydatów na terapię komórkową do lokalizacji miejsc angiogenezy, wykonywania i pośredniczenia w przetwarzaniu ECM oraz przyczyniania się do rozwoju kanalików śródbłonkowych poprzez ustanawianie interakcji fizycznych podobnych do perycytów. Oprócz ilościowego określenia wpływu netto MSCs na tworzenie sieci śródbłonka in vitro i obserwacji interakcji międzykomórkowych, zoptymalizowaliśmy również protokół izolowania MSC od kokultur. Wykonując cytometrię przepływową i qPCR, możliwe jest scharakteryzowanie zmian w fenotypie MSC i ekspresji genów po kohodowli. Jako modelowe typy komórek porównaliśmy ontogenetycznie wczesne (prenatalne) i późne (dorosłe) źródła ludzkich MSC: odpowiednio HUCPVC FTM i MSC pochodzące ze szpiku kostnego (BMSC) w teście pierścienia aortalnego. Proponujemy, aby test pierścienia aortalnego można było wykorzystać do badania potencjału angiogennego dowolnego fizycznie wspierającego typu komórki, gdy jest on badany pod kątem angiogennych zastosowań regeneracyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone i zgłoszone zgodnie z wytycznymi ARRIVE29. Wszystkie badania zostały przeprowadzone za zgodą instytucjonalnej komisji bioetycznej ds. badań naukowych (numer REB 4276). Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia (Toronto, Kanada), a wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8 (National Institutes of Health 2011).

1. Konfiguracja testu pierścienia aortalnego

  1. Odizoluj aortę szczura.
    1. Eutanazja 8 - 10-tygodniowych szczurów Sprague-Dawley za pomocą uduszenia CO2: Ustaw komory CO2 na 20% wymianę gazu (natężenie przepływu = 0,2 x objętość komory/min). Potwierdź przez brak odruchu szczypania i bicie serca przez badanie palpacyjne klatki piersiowej.
    2. Zwilż sierść na klatce piersiowej za pomocą wysterylizowanej gazy z 70% etanolem. Użyj wysterylizowanych kleszczy i nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej klatki piersiowej i przeciąć warstwy skóry i mięśni.
    3. Po odsłonięciu klatki piersiowej odetnij klatkę piersiową z każdej strony i złóż w górę około 5 mm od mostka z każdej strony. Spodziewane jest pewne krwawienie z tętnic międzyżebrowych u świeżych zwłok.
    4. Wypchnij tkankę płucną i serce na anatomiczną prawą stronę, aby odsłonić aortę. Aorta to białe naczynie znajdujące się w sąsiedztwie kręgosłupa.
    5. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć aortę (za łukiem aorty) i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać pierwsze nacięcie, trzymając aortę kleszczami. Po przecięciu aorty jama klatki piersiowej szybko wypełni się krwią, dlatego bardzo ważne jest, aby pracować szybko, aby uzyskać aortę przed krzepnięciem krwi.
    6. Użyj kleszczy, aby przytrzymać aortę i delikatnie oderwij aortę w dół, z dala od kręgosłupa. Pociągnięcie spowoduje przecięcie tętnic międzyżebrowych bez dalszych nacięć. Uzyskać około 10 cm tkanki i/lub zanim aorta podzieli się na dwie gałęzie w jamie brzusznej i wyciąć aortę z tuszy. W razie potrzeby popchnij przeponę w kierunku ogonowym, aby uzyskać dostęp do dolnych odcinków aorty.
      UWAGA: Delikatnie obierz aortę, ponieważ intensywna siła może spowodować jej rozerwanie. Jeśli aorta pęknie, pozwól na krzepnięcie krwi przez kilka sekund i użyj ręcznika papierowego, aby usunąć zakrzepłą krew, umożliwiając widoczność pozostałej aorty.
    7. Umieść aortę w probówce o pojemności 15 ml z 10 ml lodowatego roztworu soli Hanka (HBSS) uzupełnionego 1% penicyliną/streptomycyną (P/S). Trzymaj probówki na lodzie.
      UWAGA: Tkanka aorty może wytrzymać 1-2 godziny na lodzie, ale najlepiej jest ją przetworzyć tak szybko, jak to możliwe.
  2. Przygotować pożywkę do oznaczania pierścienia aortalnego w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
    1. Przygotować pożywkę do wzrostu śródbłonka (EGM) za pomocą jednostki filtrującej do przefiltrowania 500 ml śródbłonka podłoża podstawowego (EBM) uzupełnionego 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% gentamycyną i czynnikami wzrostu (patrz tabela materiałów). Umieścić 50 ml przefiltrowanego podłoża w kulce lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Użyj innej jednostki filtracyjnej, aby przefiltrować 100 ml EBM uzupełnionego 2% FBS i 1% P/S, aby przygotować EBM 2% FBS (EBM-FBS) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Pokryj 12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych ekstraktem z błony bazowej (BME) podczas pracy na lodzie.
    1. Umieść 12-dołkową płytkę na zimnej powierzchni (duży worek z lodem lub taca). Dodaj 200 μl/dołek świeżo rozmrożonego BME za pomocą schłodzonych końcówek pipet i zakręć BME, aby zapewnić równomierne pokrycie. Pracuj szybko, aby uniknąć nierównomiernej polimeryzacji BME.
      UWAGA: Typowe wycięcie aorty daje 20 pierścieni aortalnych. Aby uwzględnić zmienność między testami pierścienia aortalnego, należy skonfigurować co najmniej trzy testy pierścienia aortalnego na grupę leczoną i uwzględnić kontrolę. Jeśli pozwala na to źródło, zaleca się 6 pierścieni na grupę leczoną.
    2. Umieść powlekane płytki w nawilżonych inkubatorach (95% wilgotności względnej, 37 °C, 5% CO2 ; warunki te dotyczą wszystkich kolejnych etapów nawilżanego inkubatora) na 30 minut. Umieść końcówki do pipet o pojemności 1 000 μl z powrotem w temperaturze -20 °C dla kroku 1.5.3.
      UWAGA: Podczas gdy podstawowy ekstrakt błonowy jest stosowany w stężeniu wyjściowym, jego konsystencja i sztywność są ściśle kontrolowane przez czas polimeryzacji. Upewnij się, że zachowałeś dokładnie te same czasy polimeryzacji dla wszystkich równoległych i niezależnych eksperymentów.
  4. Przekrój aortę na jednolite pierścienie.
    1. Wyjmij aortę z probówki o pojemności 15 ml i umieść ją w 10-centymetrowym naczyniu z 10 ml świeżego HBSS uzupełnionego 1% P/S.
    2. Użyj dwóch zestawów kleszczy, aby ostrożnie oddzielić nadmiar tkanki łącznej, tkanki tłuszczowej i użyj skalpela do pozostałych gałęzi tętnic międzyżebrowych połączonych z aortą. Zmniejsza to zmienność między jednostkami pierścieniowymi w oparciu o różne poziomy pozostałej tkanki. Usuń resztki zakrzepłej krwi z wnętrza aorty.
    3. Umieść linijkę lub siatkę pod 10-centymetrową szalką, aby precyzyjnie wyciąć odcinki aorty o szerokości 1 - 2 mm za pomocą sterylnego skalpela i kleszczyków. Wytnij sekcje tak dokładnie, jak to możliwe, aby zmniejszyć zmienność między jednostkami.
  5. Osadź pierścienie aortalne w BME.
    UWAGA: Jeśli cięcie pierścieni aortalnych nie zostanie zakończone przed inkubacją polimeryzacji BME, usuń powlekane płytki z nawilżanych inkubatorów i dodaj 100 μl EBM do każdej studzienki, aby zakończyć polimeryzację. Dokładny czas ma kluczowe znaczenie, ponieważ nadmierna polimeryzacja BME może zakłócać rozwój sieci śródbłonka i migrację komórek. Po przygotowaniu pierścieni aortalnych wyjmij EBM z dołków i kontynuuj od kroku 1.5.2.
    1. Wyjąć studzienki pokryte BME z nawilżanych inkubatorów i powrócić do BSC.
    2. Ostrożnie podnieś poszczególne pierścienie aortalne za pomocą kleszczy i umieść jeden na środku każdej studzienki pokrytej BME. Powtórz dla pozostałych pierścieni aortalnych.
      UWAGA: Media przenoszone wraz z pierścieniem aortalnym powinny być utrzymywane na minimalnym poziomie, aby uniknąć nieprawidłowości polimeryzacji.
    3. Użyj schłodzonych (-20 °C) końcówek do pipet o pojemności 1 000 μl, aby dodać 300 μl BME na wierzch każdego pierścienia aortalnego i równomiernie rozprowadzić BME wokół studzienki.
    4. Umieść osadzone pierścienie aortalne z powrotem w nawilżanych inkubatorach na 30 minut.
    5. Wyjąć płytki z osadzonym pierścieniem aortalnym z nawilżanych inkubatorów i powoli dodać 1 000 μl EGM (przygotowanego i ogrzanego w kroku 1.2.1), przykładając końcówkę pipety do ścianki dołka hodowli.
      UWAGA: Bezpośrednie pipetowanie pożywki do BME może zakłócić spolimeryzowany BME i utrudnić ciągły rozwój sieci śródbłonka. Użyj odpowiedniej pipety wielokanałowej, jeśli jest dostępna.
    6. Po upływie 24 godzin usunąć 1 000 μl EGM i zastąpić 1 000 μl EBM-FBS przygotowanym w kroku 1.2.2, ponownie powoli pipetując do boku dołka hodowli.
  6. Utrzymać test pierścienia aortalnego, zastępując 500 μl EBM-FBS 500 μl świeżego EBM-FBS (37 °C) co 48 h.
    UWAGA: Patrz punkt 2, aby rozpocząć ekspansję hodowli MSC w tym samym dniu, w którym ustanowiono test pierścienia aortalnego. Zapewni to, że MSCs będą gotowe do wspólnej hodowli, gdy sieci śródbłonka będą gotowe.
  7. Użyj mikroskopii jasnego pola, aby śledzić rozwój sieci śródbłonka w teście pierścienia aorty (patrz Rysunek 1 jako odniesienie dla optymalnego rozwoju sieci). Gdy aspekt sieci śródbłonka jest taki, jak pokazano na Rysunek 2, przystąp do ustawiania testu pierścienia aortalnego - kohodowle MSC (sekcja 3). Patrz krok 4.1, aby uzyskać więcej informacji na temat obrazowania sieci śródbłonka.

2. Hodowla tkankowa

  1. Przygotować roztwory podstawowe pożywek do hodowli tkankowych.
    1. Hodowle FTM HUCPVC (wcześniej ustalone, n ≥ 3 niezależne linie dla każdej)30 i dostępne na rynku BMSC w alfa-MEM uzupełnione o 10% FBS i 1% P/S.
    2. Wysterylizuj pożywkę za pomocą butelek filtrujących o wielkości porów 0,2 μm.
    3. Przygotowane roztwory pożywek przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
  2. Utrzymuj kultury FTM, HUCPVC i BMSC w nawilżanych inkubatorach i pasażuj przy zbieganiu 70 - 80%, określonym za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego. Należy użyć odpowiednich objętości pożywki do wielkości użytego naczynia do hodowli tkankowej (np. 10 ml w naczyniu o średnicy 10 cm). Wykorzystaj te warunki hodowli do utrzymania i pasażowania MSC.
  3. Dysocjować monowarstwy MSC do pasażowania lub testu pierścienia aortalnego - kokultur MSC przy użyciu roztworu enzymu dysocjacyjnego (szalka 4 ml/10 cm) i inkubować w nawilżanych inkubatorach przez 3 minuty. Zapewnić oderwanie komórek za pomocą mikroskopii w jasnym polu; w razie potrzeby inkubować przez dodatkowe 1 - 2 minuty.
  4. Przenieść zdysocjowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
  5. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej (kompletna pożywka alfa-MEM do komórek pasażujących lub EBM-FBS do testu pierścienia aortalnego/kokultur MSC) w celu zliczenia przy użyciu licznika komórek.

3. Przygotowanie testu pierścienia aortalnego/kokultur MSC

  1. Zasiać 104 MSCs na każdym osadzonym pierścieniu aortalnym (9 000 komórek/cm płytka2/12-dołkowa). Opierając się na liczbie testów pierścienia aortalnego, wstępnie wybarwić MSCs żywym, nieprzenoszalnym barwnikiem fluorescencyjnym. Utrzymuj co najmniej trzy studzienki pierścieni aortalnych bez MSC dla grupy kontrolnej.
    1. Aby wybarwić 105 MSCs/ml pożywki EBM-FBS, dodaj 2,5 μl żywego, nieprzenoszalnego barwnika fluorescencyjnego/ml pożywki (5 μM) do probówki o pojemności 15 ml i umieść w nawilżanym inkubatorze na 30 min. Delikatnie wymieszaj probówkę w połowie inkubacji.
    2. Po 30 minutowej inkubacji dodać 1 objętość świeżego EBM-FBS do wybarwionych komórek i wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut.
    3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki EBM-FBS. Potwierdź pomyślne barwienie MSCs za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Wyjąć płytki zawierające pierścień aortalny z nawilżanego inkubatora i usunąć 500 μl EBM-FBS z każdej studzienki.
  3. Ostrożnie wysiewać10-4 MSCs w 500 μl EBM-FBS na każdym osadzonym pierścieniu aortalnym, równomiernie pipetując wokół sieci śródbłonka. Zapewnij równomierne rozprowadzenie, delikatnie potrząsając płytką hodowlaną.
    1. Dodaj dodatkowe EBM-FBS, aby upewnić się, że całkowita objętość pożywki w teście pierścienia aortalnego/kokulturach MSC wynosi 1,000 μL.
  4. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby uwidocznić znakowane fluorescencyjnie MSCs w teście pierścienia aortalnego.

4. Mikroskopia

  1. Użyj mikroskopii jasnego pola, aby zobrazować sieci śródbłonka szczura przed testem pierścienia aortalnego/kokulturami MSC w celu podstawowych (dzień 0) pomiarów właściwości sieci śródbłonka (np. długość sieci, pętle sieciowe). Obraz 4 ćwiartki na studzienkę od pierścienia aorty do najdalszego odcinka sieci śródbłonka w tym kwadrancie.
    1. Wyobraź sobie sieci pierścieni aortalnych po teście pierścienia aortalnego/kokulturach MSC w dniach 3, 5 i 7. Wykorzystaj te obrazy do ilościowego określenia wpływu MSC na rozwój sieci śródbłonka.
  2. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej do zobrazowania wstępnie znakowanych MSCs w teście pierścienia aortalnego.
    1. Po 24 godzinach testu pierścienia aortalnego/kohodowli MSC, użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby uwidocznić naprowadzanie, wydłużenie i integrację MSC z sieciami śródbłonka. Nakładaj obrazy fluorescencyjne MSC na obrazy jasnego pola komórek śródbłonka, aby obserwować kolokalizację obu typów komórek.
    2. Wyobraź sobie MSCs zlokalizowane w rozwiniętych sieciach śródbłonka proksymalnie do tkanki pierścienia aorty oraz MSCs zlokalizowane w nowo rozwijających się sieciach dystalnie do tkanki pierścienia aorty (Ryc. 2).

5. Cytometria przepływowa i qPCR

  1. Na dzień przed dysocjacją sieci śródbłonka pierścienia aortalnego rozmrozić zamrożoną dypazę w temperaturze 4 °C O/N. Sekcja 5.3 jest identyczna zarówno dla cytometrii przepływowej, jak i qPCR.
  2. Ciepłe 50 ml dypazy i 50 ml 0,5% trypsyny w kulce lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Pobrać komórki do analizy z kokultur testu pierścienia aortalnego/MSC.
    1. Po 1 tygodniu jednoczesnej hodowli pierścienia aortalnego/MSC usuń pożywkę hodowlaną i powoli dodawaj 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki przez 3 minuty i usuń. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    2. Dodać 800 μl wstępnie podgrzanej dypazy do każdej studzienki i inkubować w nawilżanych inkubatorach przez 15 minut.
    3. Wyjąć płytki z nawilżanych inkubatorów i zawiesić dypazę przez pipetowanie (5 - 10 razy) w celu rozdrobnienia BME, a następnie przenieść zawartość każdej studzienki do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml.
    4. Powtórzyć krok 5.3.3 ponownie ze świeżą, wstępnie podgrzaną dypazą, aż do momentu, gdy w basenie hodowlanym nie zaobserwuje się pozostałości BME. Dodać 1 objętość PBS uzupełnioną 3% FBS do zawiesiny komórek dyspazy, aby dezaktywować dypazę. Usunąć pierścienie aortalne unoszące się w zawiesinie komórek za pomocą końcówek pipet.
    5. Wirować zawiesiny komórek w temperaturze 400 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając 3 ml zawiesiny komórek w probówce o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Oczywista, stała osadka może nie być widoczna, ale komórki i BME są obecne.
    6. Dodać 3 ml podgrzanej 0,5% trypsyny do zawiesiny komórkowej i energicznie zawiesić (5 - 10x pipetując) komórki. Inkubować trypsynizowane roztwory komórkowe w nawilżanych inkubatorach przez 10 minut.
    7. Usunąć trypsynizowane zawiesiny komórek z nawilżanych inkubatorów i dodać 6 ml PBS uzupełnionego 3% FBS i kilkakrotnie zawiesić. Wirować zawiesiny komórek w temperaturze 400 x g przez 5 minut.
    8. Ostrożnie usunąć cały supernatant, pozostawiając osad komórek w probówce i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS uzupełnionym 3% FBS w każdej probówce.
    9. Przefiltrować zawiesinę komórek o pojemności 1 ml za pomocą sitka o wielkości 70 μm, aby usunąć zagregowane komórki i resztki BME z zawiesiny komórek. Policz komórki w 1 ml zawiesiny komórkowej za pomocą licznika komórek.
  4. Przygotuj komórki do cytometrii przepływowej.
    1. Zawiesiny komórkowe inkubować (10-5 komórek w 200 μl PBS uzupełnionych 3% FBS) z przeciwciałami pierwszorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem (FITC lub APC) o stężeniu (TRA-1-85-, CD146, CD31) = 1:40) w temperaturze 4 °C przez 30 minut, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Cytometria przepływowa dla MSCs została zoptymalizowana przez Hong et al., 201328. Do dokładnych odczytów wymagane jest co najmniej 10 000 komórek.
    2. Po 30 minutowej inkubacji ponownie zawiesić komórki w 2 ml PBS uzupełnionym 3% FBS i odwirować (400 x g, 5 min).
    3. Przechowywać komórki w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej (co najmniej 1 x 104 zdarzenia) w ciągu 1 godziny. Aby zapoznać się ze strategią bramkowania, zobacz rysunek uzupełniający 1. Sortowanie ludzkich MSCs za pomocą anty-TRA-1-85 (APC) (stężenie: 1:40 i w 0,5% FBS/PBS) i sortowanie komórek do 350 μl buforu do lizy komórek do analizy qPCR.
      UWAGA: Lizowane komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy w celu przyszłej analizy qPCR.
  5. Przygotuj komórki do analizy qPCR.
    1. Wyizoluj RNA z lizanych komórek za pomocą zestawów do izolacji RNA opartych na kolumnach i określ stężenie i jakość RNA.
    2. Przygotuj cDNA z maksymalnie 5 μg RNA na 100 μl reakcji odwrotnej transkryptazy. Wykonaj etap wstępnej amplifikacji, jeśli wydajność RNA jest niska (< 10 ng/μl). Użycie mniej niż 100 ng RNA spowoduje wysoki odsetek wyników fałszywie ujemnych.
      UWAGA: Matryce cDNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do dalszej analizy przez okres do 4 miesięcy.
    3. Wykonaj qPCR przy użyciu matryc profilera ekspresji angiogenezy w celu wykrycia zmian w ekspresji genów. Użyj 5 ng cDNA na reakcję (40 cykli, wyżarzanie/rozszerzanie w temperaturze 60 °C). Ekspresowa zmiana ekspresji krotności w porównaniu z niezróżnicowanymi próbkami cDNA pochodzącymi z MSC. Przeprowadzić odpowiednie kontrole ujemne (pierścień aortalny bez ludzkich MSCs).

6. Kwantyfikacja sieci po teście pierścienia aortalnego/kokulturach MSC

  1. Pobierz oprogramowanie do obrazowania, takie jak ImageJ, wraz z wtyczką Angiogenesis Analyzer31.
  2. Zaimportuj wykonane obrazy sieci śródbłonka i otwórz je za pomocą oprogramowania.
  3. Przekonwertuj skale obrazu na podstawie specyfikacji używanego mikroskopu.
  4. Użyj narzędzia liniowego, aby zmierzyć wzrost sieci promieniowej.
  5. Policz pętle sieci śródbłonka za pomocą narzędzia do liczenia komórek (pętle o co najmniej 4 bokach powinny być określone ilościowo).
  6. Aby uzyskać dodatkową kwantyfikację właściwości sieci, użyj wtyczki Angiogenesis Analyzer lub innych podobnych wtyczek do analizy segmentów głównych, całkowitej długości segmentu, całkowitej liczby obszarów sieci i liczby połączeń. Użyj narzędzia rozmytej maski, aby rozmyć tkankę pierścienia aorty i puste przestrzenie, aby uniknąć fałszywie dodatnich obliczeń.
  7. Przenieś wartości do programu statystycznego i narysuj wykres właściwości sieci śródbłonka zgodnie z testem pierścienia aortalnego/kokulturami MSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny przebieg procesu ustanawiania testu kokultury pierścienia aorty z MSC przedstawiono na Rysunku 1. Główne etapy obejmują: izolację aorty szczura, sekcjonowanie i zatapianie pierścieni aortalnych, monitorowanie kiełkowania śródbłonka i rozwoju sieci oraz w końcowej fazie znakowanie i podawanie MSC. Harmonogram analizy sieci śródbłonka określa okna czasowe, w których możliwe są analizy dla każdego okresu kokultury: dzień 1, 5 i 7. Dodatkowe uwagi za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje kilka krytycznych etapów przygotowania udanego eksperymentu z kohodowlą pierścienia aortalnego MSC. Po pierwsze, najważniejszymi krokami podczas izolowania i cięcia aorty są: 1) uzyskanie wyłącznie piersiowego odcinka aorty; 2) staranne usuwanie rozgałęzionych naczyń krwionośnych, tkanki łącznej i tłuszczowej oraz; 3) Cięcie równych odcinków aorty (~1 mm) w celu ograniczenia zmienności między każdym testem. Po drugie, pomyślne osadzenie pierścieni aortalnych w BME ma kluczowe znaczenie dla tego testu. Jeśli BME ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr Clifford L. Librach jest współautorem patentu: Metody izolacji i wykorzystania komórek pochodzących z tkanki pępowinowej pierwszego trymestru. Przyznany w Kanadzie i Australii.

Podziękowania

Autorzy dziękują następującym pracownikom i pracownikom naukowym: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai i Sarah Laronde.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alpha-MEMGibco12571071Do pożywek hodowlanych FTM, HUCPVC i BMSC.
Sprzężony z APC anty ludzki TRA-1-85R& D SystemsFAB3195ASpecyficzny dla człowieka marker komórkowy do cytometrii przepływowej i sortowania komórek Ekstrakt
błony podstawowej (BME) (Matrigel)Corning354234Do osadzania aorty
Zestaw pociskówLonzaCC-3162Zawiera: gentamycyna/amfoterycyna-B
(GA) ludzki czynnik wzrostu naskórka
(hEGF); Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego
(VEGF); R3-
Insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (R3-IGF-1);
Kwas askorbinowy; Hydrokortyzon;
Ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-beta (hFGF-β); Heparyna; Płodowa surowica bydlęca
(FBS). Wymagane do przygotowania NWZ
CellTracker Green CMFDA DyeThermo-fisherC2925Do barwienia MSCs kolor zielony jest optymalnie wychwytywany przez MSCs
Mikroskop hodowlany CKX53OlympusDo obrazowania w jasnym polu rozwoju sieci śródbłonka
Hrabina Automatyczny licznik komórekInvitrogenC10227Zliczanie komórek do hodowli MSC, cytometrii przepływowej i qPCR
DispaseTechnologie StemCell7923Do dysocjacji kokultur pierścienia aortalnego i MSC (wstępnie ogrzane w temperaturze 37 &; C)
Jednorazowe sterylne skalpeleVWR21909-654Do cięcia aorty
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu
Śródbłonkowe podłoże podstawowe (EBM)LonzaCC-3156Pożywka podstawowa wymagana do hodowli testu pierścienia aortalnego - kokultury MSC (ciepłe w 37 & stopni; C przed użyciem). Wymagane dla EGM i EBM-FBS
Etanol, 70%, klasa biotechnologicznaVWR97064-768Do sterylizacji powierzchni
EVOSLife TechnologiesWłasny mikroskop fluorescencyjny do śledzenia migracji i integracji MSC
Surowica bydlęca płodu (FBS) (hyklon)GE HealthcareSH3039603Składnik surowicy pożywki do hodowli komórkowej
Przeciwciało anty-CD31 sprzężone z FITC558068Ludzki marker śródbłonka do cytometrii przepływowej
Przeciwciało anty-CD146 sprzężone z FITC560846Ludzki marker perycytów do cytometrii przepływowej
KleszczeAlmedic7727-A10-704Do przenoszenia tkanki szczura. Można używać dowolnych podobnych kleszczy
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175-0941X Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu
HERAcell 150i Inkubator CO2Thermo Fisher Scientific51026410Do inkubacji komórek
Ludzka angiogeneza RT2 profiler Matryca PCRQiagenPAHS-024ZSpecyficzny dla człowieka i zawiera startery dla 84 genów zaangażowanych w angiogenezę. Każda studzienka to 1 reakcja startera
ImageJOprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym. Wymagaj wtyczki analizatora angiogenezy
LSR IIBDUHN SickKids FC Facility. Do cytometrii przepływowej.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. Do sortowania komórek.
Penicylina/streptomycynaGibco15140122Składnik antybiotykowy do i pożywki do hodowli komórkowych
RNeasy Mini KitQiagen74104Do oczyszczania RNA. Zawiera bufor do lizy komórek
RT2Easy Zestaw pierwszej niciQiagen330421Do przygotowania cDNA do qPCR
Zestaw do syntezy cDNA RT2PreAMPQiagen330451Wstępna amplifikacja cDNA w przypadku RNA o niskiej wydajności
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14059-11Do cięcia skóry, mięśni i aorty
Sterylna gazaVWR3084Do zwilżania i sterylizacji futra na klatce piersiowej
TrypleEThermo Fisher Scientific 12605036Enzym dysocjacyjny MSC wstępnie podgrzany w temperaturze 37 & stopni; C
0,2 μ m jednostka filtracji porówThermo Fisher Scientific566-0020Do sterylizacji pożywek do hodowli tkankowych
0,25% Trypsyna / EDTAGibco25200056Do dysocjacji komórek wstępnie podgrzej w temperaturze 37 &; C
10 cm szalki do hodowli tkankowychCorning25382-428Do czyszczenia i cięcia aorty i hodowli komórkowej MSC
12 płytek do hodowli komórkowychCorning-Sigma AldrichCLS3513Do zakładania testu pierścienia aortalnego-Współhodowle MSC
Probówka 15 mlBD Falcon352096Do ogólnych procedur hodowli tkankowych
70 μ m sitko komórkoweFisherbrand22363548Aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki przed cytometrią przepływową lub sortowaniem
z

Bibliografia

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946(2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Test pierścienia aortalnegotechnika kokulturytworzenie sieci śródbłonkowejmikroskopia w jasnym polumikroskopia fluorescencyjnacytometria przepływowaanaliza qPCRtraktowanie dyspazątrawienie trypsyną
Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.