Method Article

Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych iwakaftoru, jego głównych metabolitów i lumakaftoru w płynach biologicznych pacjentów z mukowiscydozą

DOI:

10.3791/56084

⸱

October 15th, 2017

 ,  ,  , 
1Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, 2Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Microbiology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ivacaftor i kombinacja iwakaftoru-lumakaftora to dwa nowe leki na mukowiscydozę. Jednak nadal brakuje wiedzy na temat ich farmakokinetyki / choroby farmakologicznej i farmakologii. Przedstawiamy zoptymalizowaną technikę HPLC-MS do jednoczesnej analizy iwakaftoru i jego głównych metabolitów oraz lumakaftoru.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wady w błonowym regulatorze przewodnictwa (CFTR) mukowiscydozy są przyczyną mukowiscydozy (CF), choroby z zagrażającymi życiu objawami płucnymi. Kombinacja iwakaftoru (IVA) i iwakaftoru i lumakaftora (LUMA) to dwa nowe, przełomowe leki na mukowiscydozę, które bezpośrednio modulują aktywność i transport wadliwego białka CFTR. Nadal jednak brakuje wiedzy na temat parametrów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych oraz farmakologii iwakaftoru i lumakaftoru. Technika HPLC-MS do jednoczesnej analizy stężeń iwakaftoru, hydroksymetylo-iwakaftoru, karboksylanu iwakaftora i lumakaftoru w płynach biologicznych u pacjentów otrzymujących standardową terapię iwakaftorem lub terapią skojarzoną iwakaftor-lumakaftor została wcześniej opracowana przez naszą grupę i częściowo zwalidowana zgodnie ze standardami FDA. Jednak, aby umożliwić wysokoprzepustową analizę większej liczby próbek pobranych od pacjentów, nasza grupa zoptymalizowała opisaną metodę poprzez zastosowanie kolumny chromatografii z odwróconymi fazami o mniejszej wielkości porów (2,6 μm, C8 100 A; 50 x 2,1 mm) i gradientowego systemu rozpuszczalnikowego (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2,7 min: utrzymywany na poziomie 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2,8-4,0 min: pranie 90% B; 4,0-4,1 min: 90-40% B; 4,1-6,0 min: utrzymywane na poziomie 40% B) zamiast elucji izokratycznej. Celem tego badania było radykalne skrócenie czasu analizy HPLC-MS na próbkę z ~15 minut do zaledwie 6 minut na próbkę, co jest niezbędne do analizy dużej liczby próbek pacjentów. Ta celowa metoda będzie bardzo przydatna w badaniach nad zależnościami między ekspozycją a reakcją tych przełomowych leków na mukowiscydołę.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukowiscydoza (CF) jest powszechną chorobą genetyczną obejmującą zewnątrzwydzielnicze gruczoły śluzowe płuc, wątroby, trzustki i jelit, powodującą postępującą niewydolność wielonarządową, taką jak pogorszenie czynności płuc i niewydolność trzustki1,2,3. Ivacaftor (IVA) jest pierwszym zatwierdzonym przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA-USA) i Europejską Agencję Leków (EMA) lekiem nasilającym transbłonowy regulator przewodnictwa (CFTR) w mukowiscydozie, o udowodnionej skuteczności klinicznej powodującej znaczną poprawę czynności płuc w porównaniu z placebo w niewielkiej podgrupie pacjentów z mukowiscydozą z mutacją missense G551D-CFTR [glicyna (G) w pozycji 551 jest zastąpiona przez kwas asparaginowy (D)] (~4-5% populacji mukowiscydozy)4,5. Ten doustnie podawany lek zwiększa otwarcie kanału CFTR, zwiększając tym samym przepływ jonów chlorkowych i działając na główny defekt, który prowadzi do klinicznych objawów CF4,6. Niestety, monoterapia IVA nie jest skuteczna u pacjentów z bardziej powszechną homozygotyczną mutacją F508del [w ramkowej delecji genu CFTR, która powoduje utratę fenyloalaniny (F) w pozycji 508], co skutkuje nieprawidłowym fałdowaniem CFTR, co obserwuje się u ~50% populacji CF7,8.

Niedawno, FDA wydała zgodę na połączenie IVA z lekiem korygującym CFTR lumakaftorem. Sprytna strategia polegająca na połączeniu korektora CFTR (lumakaftor, LUMA), który ratuje F508del-CFTR na powierzchni komórki, z modulatorem (IVA), który nasila aktywność kanału CFTR, skutecznie rozszerza okno leczenia na większość populacji CF5. Pozostają pytania, czy te leki spełnią swoją obietnicę, ponieważ pojawiło się wiele sprzecznych doniesień, które poddają w wątpliwość ich skuteczność kliniczną9,10. Ponadto poprawa czynności płuc była tylko niewielka (2,6-4% dla kombinacji iwakaftora-lumakaftoru) w porównaniu z sukcesem osiągniętym po monoterapii IVA u pacjentów z mutacją G551D (10,6-12,5%)8. Potencjalne antagonistyczne interakcje lek-lek pomiędzy IVA i LUMA, które potencjalnie ograniczają skuteczność kliniczną kombinacji iwakaftor-lumakaftor, wynikają z jego nieidealnych właściwości farmakokinetycznych 7,11. IVA jest intensywnie metabolizowany przez enzymy cytochromu P450 (CYP), głównie do aktywnego metabolitu hydroksymetylo-IVA (IVA-M1, M1) i nieaktywnej formy karboksylanu IVA (IVA-M6, M6)7,12. Z drugiej strony, induktor CYP3A4 LUMA nie jest intensywnie metabolizowany i jest w dużej mierze wydalany w postaci niezmienionej w kale11. Ponieważ induktory CYP3A4 indukują metabolizm cytochromu, stężenie iwakaftoru (substratu CYP3A4) może być zmniejszone. Co więcej, zarówno IVA, jak i LUMA są cząsteczkami bardzo hydrofobowymi i są związane w ~99% z białkami osocza, co znacznie ogranicza stężenie wolnego (aktywnego) leku1,13.

Łącznie, te czynniki mogą się łączyć, aby ograniczyć kliniczną skuteczność kombinacji iwakaftora i lumakaftoru. Nie wiadomo, czy przy obecnym schemacie dawkowania iwakaftor i lumakaftor są osiągane optymalne stężenia w osoczu, czy też próg terapeutyczny jest utrzymany8. Obecnie brakuje informacji na temat parametrów farmakokinetycznych takich jak szczytowe i stacjonarne stężenie iwakaftoru lub iwakaftoru-lumakaftoru w osoczu w stanie stacjonarnym. Biorąc pod uwagę odnotowany metabolizm iwakaftoru i lumakaftoru, konieczne jest monitorowanie zależności ekspozycja-odpowiedź w celu uzyskania optymalnych schematów dawkowania iwakaftoru lub iwakaftoru i lumakaftoru. Nasza grupa opublikowała niedawno pierwszą metodę HPLC/LC-MS do monitorowania zależności ekspozycja-odpowiedź IVA i LUMA14. Dotychczas nie zgłoszono żadnych alternatywnych metod pomiaru stężeń iwakaftoru, jego metabolitów i lumakaftoru. Aby umożliwić wysokoprzepustową analizę większego zbiorowi pacjentów i radykalnie skrócić czas analizy, nasza grupa zoptymalizowała raportowaną metodę poprzez zastosowanie kolumny chromatograficznej z odwróconymi fazami o mniejszym rozmiarze porów i gradientowego systemu rozpuszczalnikowego, który zmniejsza koszty i czas pracy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zatwierdzenie etyki uzyskano od Komitetu Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Monash (MUHREC).

1. Zastosowanie testu: Pobieranie próbek od pacjentów

  1. Należy zanotować czas, w którym pacjent przyjmuje standardową dawkę 150 mg iwakaftoru lub iwakaftoru 125 mg / lumakaftor 200 mg.
  2. Zanotuj dokładny czas pobrania próbki krwi pacjenta.
    UWAGA: Zalecamy pobranie 4-5 próbek w ciągu 24 godzin. Jeżeli możliwe jest pobranie tylko jednej próbki, wskazany punkt czasowy to 2,5-4 godziny po podaniu iwakaftoru lub dawki skojarzonej iwakaftoru i lumakaftoru, ponieważ stężenia Cmax w stanie stacjonarnym będą możliwe do osiągnięcia po >5 dniach kolejnego leczenia.
  3. Zbierz 4-5 ml krwi do dostępnych w handlu nieleczonych niebieskich probówek.
  4. Po pobraniu krwi pełnej pozwól krwi skrzepnąć, pozostawiając ją w spokoju w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zwykle zajmuje to 15-30 minut.
  5. Usunąć skrzep przez odwirowanie w temperaturze 1 000-2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem. Oznaczyć otrzymany supernatant jako osocze.
  6. Po odwirowaniu natychmiast przenieść supernatant (osocze) do czystej probówki polipropylenowej za pomocą pipety Pasteura. Oznacz probówkę osococza identyfikatorem pacjenta (np. Pacjent 1), podawanym lekiem (np. połączenie iwakaftora-lumakaftoru) oraz czasem pobrania próbki od pacjenta (np. 2,5 godziny po podaniu).
  7. Podczas obchodzenia się z próbkami należy utrzymywać temperaturę 2–8 °C. Po zakończeniu obchodzenia się z próbkami należy przechowywać je w temperaturze –20 °C.
  8. W razie potrzeby wyślij próbki zatwierdzonym kurierem do instytutu analizującego.
    UWAGA: Próbki należy wysyłać w suchym lodzie do momentu przybycia i należy je przechowywać w temperaturze –80°C do czasu analizy.

2. Przygotowanie i przetwarzanie pobranych próbek i wzorców

UWAGA: Osocze od zdrowych dawców, którzy nigdy nie stosowali terapii iwakaftorem/lumakaftorem, uzyskano z Australijskiego Czerwonego Krzyża. Aby zapewnić integralność, wszystkie próbki/wzorce powinny być przechowywane w temperaturze 2-8 °C podczas pobierania i przetwarzania. Po zakończeniu obchodzenia się z próbkami należy przechowywać je w temperaturze –20 °C.

  1. Odważyć IVA, IVA-karboksylan, hydroksymetylo-IVA i LUMA, które posłużą jako odniesienie dla wzorców wewnętrznych.
  2. Przygotować dwa niezależne roztwory podstawowe każdego analitu (IVA, M1, M6 i LUMA) w metanolu klasy LC-MS w stężeniu 100 μg/ml i 10 μg/ml.
    Uwaga: Związki tracą ważność po 10 dniach na stole.
  3. Świeżo przygotować wzorce kalibracyjne LC-MS przed każdym przebiegiem analitycznym poprzez rozcieńczenie roztworów podstawowych wzorców kalibracyjnych w osoczu ludzkim, aby osiągnąć następujące stężenia: 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 i 10,0 μg/ml. Próbki te są określane jako wzorce.
  4. Aby wytrącić białka, przygotuj 0,1% kwas mrówkowy (FA) w acetonitrylu (klasa ACN, LC-MS) i pozostaw w lodówce do czasu, aż będzie potrzebny.

3. Wstępna obróbka pobranych próbek i wzorców

  1. Pozwolić, aby zarówno pacjent, jak i ślepa próba osocza osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej.
  2. Wirować, aby mieszać każdą próbkę osocza przez 15 s na próbkę.
  3. Przenieść 100 μl podwielokrotności ślepej próby osocza do wzorców lub próbek pacjenta do analizy do probówki do mikropropylenu o pojemności 1,5 ml.
  4. Dodaj wzorzec wewnętrzny IVA do każdej z probówek wzorcowych (np. 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 i 10,0 μg/ml, aby pokryć potencjalny zakres stężeń), zamknij pokrywkę i wiruj przez 2-3 s. Należy pamiętać, że wzorzec wewnętrzny jest dodawany tylko do ślepej próby osocza, a do próbek pacjenta nie dodaje się żadnego wzorca wewnętrznego.
  5. Powtórz krok 3.4. dla innych wzorców wewnętrznych M1, M6 i LUMA.
  6. Odkręć krótko każdą tubkę, aby upewnić się, że na pokrywie nie ma kropel.
  7. Dodać 200 μl mieszaniny 0,1% FA w ACN do każdej probówki, aby wytrącić białka osocza.
  8. Energicznie mieszaj mieszaninę przez około 15 sekund.
  9. Pozostaw probówki na 10 minut w lodówce.
  10. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, jeśli to możliwe.
  11. Przefiltrować 200 μl podwielokrotności supernatantu przez 13-milimetrowy filtr strzykawkowy do fiolki o pojemności 1,5 ml do HPLC.
  12. Przenieść 100 μl supernatantu do fiolki LC-MS w celu przeprowadzenia analizy HPLC-MS.

4. Analiza HPLC-MS

UWAGA: Analiza HPLC-MS została przeprowadzona na systemie LC-MS sprzężonym z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym (Tabela 1).

  1. Włącz system LC-MS, umieść tackę z próbkami w automatycznym próbniku.
  2. Przymocuj kolumnę do kolumny ochronnej i podłącz do systemu LC-MS.
  3. Podłącz obie butelki z fazami ruchomymi (butelka A: 100% ACN; butelka B: 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie) i zrównoważyć system LC-MS.
  4. Włącz następujące parametry do protokołu LC-MS.
    1. Podzielić przepływ fazy ruchomej przed wprowadzeniem do spektrometru mas w stosunku 2:1 (odpad: wlot MS).
    2. Przeprowadzić elucję gradientową przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min przy użyciu fazy ruchomej składającej się ze 100% ACN i 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (punkt początkowy 40:60, v/v). Należy zauważyć, że procent objętości fazy ruchomej zmienia się w trakcie analizy.
    3. Uruchomić spektrometr masowy w trybie dodatniej jonizacji elektronatryskowej.
    4. Upewnij się, że ustawienia LC-MS są następujące: napięcie rozpylania jonów 4,5 kV, energia zderzenia 295,9 V, gaz nebulizujący: azot o stężeniu 3 l/min; gaz zderzeniowy: argon; przepływ gazu suszącego 20 l/min, napięcie soczewki Q3: - 22 V, temperatura desolwatacji 250 °C przy temperaturze bloku grzewczego 400 °C.
    5. Wstrzyknąć 10 μl objętości na próbkę.
    6. Wykrywanie analitów za pomocą monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM). Monitoruj przemiany jonowe m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 i m/z 452.40 → 453 odpowiednio dla IVA, IVA-M1, IVA-M6 i LUMA.
      UWAGA: Nowo zoptymalizowana metoda nie została jeszcze w pełni zwalidowana zgodnie ze standardami FDA.

5. Krzywe kalibracyjne

  1. Skonstruuj krzywe kalibracyjne LC-MS przed każdym przebiegiem analitycznym, wykorzystując zależność między stosunkami powierzchni pików każdego z czterech analitów do wzorca wewnętrznego a nominalnymi stężeniami iwakaftora w wzorcu kalibracyjnym (IVA-M1, IVA-M6 lub LUMA) w programie ustawień LC-MS.
    UWAGA: Dokładne kroki budowy krzywej kalibracyjnej zależą od modelu używanego sprzętu LC-MS. Informacje te mogą być dostępne w instrukcji obsługi sprzętu.
  2. Przeprowadzić liniową analizę regresji metodą najmniejszych kwadratów, ważąc 1/C2 zgodnie z odwrotnością stężeń.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno opisaliśmy metodę, częściowo zatwierdzoną do standardów FDA, na potrójnym kwadrupolowym LC-MS i systemie detektorów HPLC, przy użyciu kolumny C8 (5 μm, 3.9 mm x 50 mm wen.) z fazą ruchomą składającą się ze 100% ACN i 0.1% kwasu mrówkowego w wodzie (40:60, v/v) przy natężeniu przepływu 1 mL/min. Zaobserwowano liniową korelację pików w zakresie stężeń od 0,01 do 10 μg/ml w ludzkim osoczu dla wszystkich metabolitów: iwakaftoru, Iva-M1, Iva-M6 i lumakaftoru14. W tym przypadku metoda ta został...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak wcześniej informowaliśmy, nasza grupa po raz pierwszy opracowała i zwalidowała metodę HPLC i LC-MS do szybkiego wykrywania i oznaczania ilościowego iwakaftora i jego głównych metabolitów hydroksymetylo-IVA M1 (aktywnego) i karboksylanu IVA M6 (nieaktywnego); i lumakaftor w osoczu i plwocinie pacjentów z mukowiscydozą14. Test opisany wcześniej przez naszą grupę został z powodzeniem wykorzystany do ilościowego określenia stężenia LUMA, IVA, IVA-M1 i IVA-M6 w osoczu i plwocinie pacjentów z mukowi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.L. i T.V. są wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) Narodowych Instytutów Zdrowia (R01 AI111965). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych lub Narodowych Instytutów Zdrowia. MC jest australijskim głównym pracownikiem naukowym NHMRC. J. L. jest starszym pracownikiem naukowym Australijskiej Narodowej Rady ds. Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC), a T.V. jest australijskim pracownikiem naukowym NHMRC Industry Career Development Level 2. E.K.S został mianowany Młodym Ambasadorem 2017 przez ASM (American Society for Microbiology) i jest wspierany przez Australian Postgraduate Award.
Część tej pracy została zaprezentowana na 12 Australijskiej Konferencji na temat Mukowiscydozy w Melbourne (5-8 sierpnia 2017 r.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
IVA (Kot#S114) SelleckChem (Stany Zjednoczone). 
LUMA (Kot#S1565) SelleckChem (Stany Zjednoczone). 
Karboksylan IVA (Cat# 510242247CS) Clearsynth (Kanada). 
hydroksymetylo-IVA (Kat# 510240849CS) Clearsynth (Kanada). 
Metanol (klasa MeOH, LC-MS), Acetonitryl Sigma-Aldrich
(klasa ACN, LC-MS) Sigma-Aldrich
(FA) Sigma-Aldrich
trzykwadrupolowy Shimadzu 8030 LC-MS 
Phenomenex Kinetex (2.6 &mikro; m C8 100 & Aring; 50 i razy; 2,1 mm)
(filtr liniowy KrudKatcher Ultrea HPLC 0,5 m filtr głębokości x 0,004 cala). 
Probówka do mikrowirówek z polipropylenu o pojemności 1,5 ml (VWR). 
Eppendorf Centrifuge 5430
13-milimetrowy filtr strzykawkowy (0,45 &mikro; m nylon, GRACE, Stany Zjednoczone) 
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &mikro; L, PTFE/przegroda silikonowa]. 
Kwas mrówkowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneider, E. K., et al. Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor. J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).
  2. Solomon, M., Leatte, P. N. Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).
  3. O'Sullivan, B. P., Flume, P. The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).
  4. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  5. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
  6. Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).
  7. FDA. FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).
  8. Holmes, D. False dawn for cystic fibrosis disease modifiers? Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).
  9. Veit, G., et al. Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).
  10. Cholon, D. M., et al. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).
  11. EMA, Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).
  12. VERTEX. Vertex prescribing infomation. , (2015).
  13. Matthes, E., et al. Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor). Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).
  14. Schneider, E. K., et al. Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO. J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).
  15. Su, Q., et al. An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ivacaftor AnalysisLumacaftor DetectionLC MS MS MethodHigh throughput AnalysisClinical SamplesBiological FluidsGradient ElutionPhenomenex C8 ColumnSample PreparationTherapeutic Drug Monitoring

Related Articles