Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Podsumowanie

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Streszczenie

Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) charakteryzuje się uporczywym ograniczeniem przepływu powietrza i niszczeniem miąższu płuc. Występuje bardzo często w starzejących się społeczeństwach. Obecne konwencjonalne terapie POChP koncentrują się głównie na lekach modyfikujących objawy; W związku z tym pilnie potrzebne jest opracowanie nowych terapii. Kwalifikowane modele zwierzęce POChP mogą pomóc w scharakteryzowaniu mechanizmów leżących u podstaw POChP i mogą być wykorzystane do badań przesiewowych nowych leków. Obecne modele POChP, takie jak lipopolisacharyd (LPS) lub model rozedmy płuc wywołanej elastazą trzustkową świń (PPE), generują zmiany podobne do POChP w płucach i drogach oddechowych, ale poza tym nie przypominają patogenezy POChP u ludzi. Model wywołany dymem papierosowym (CS) pozostaje jednym z najpopularniejszych, ponieważ nie tylko symuluje zmiany podobne do POChP w układzie oddechowym, ale także opiera się na jednym z głównych materiałów niebezpiecznych, które powodują POChP u ludzi. Jednak czasochłonne i pracochłonne aspekty modelu indukowanego przez CS znacznie ograniczają jego zastosowanie w badaniach przesiewowych nowych leków. W tym badaniu udało nam się wygenerować nowy model POChP, wystawiając myszy na wysoki poziom ozonu. Model ten wykazał, co następuje: 1) zmniejszona natężona objętość wydechowa 25, 50 i 75 / natężona pojemność życiowa (FEV₂₅ / FVC, FEV₅₀ / FVC i FEV₇₅ / FVC), co wskazuje na pogorszenie czynności płuc; 2) powiększone pęcherzyki płucne, ze zniszczeniem miąższu płuc; 3) skrócenie czasu zmęczenia i dystansu; i 4) zwiększony stan zapalny. Podsumowując, dane te pokazują, że model narażenia na ozon (OE) jest wiarygodnym modelem zwierzęcym, który jest podobny do człowieka, ponieważ nadmierna ekspozycja na ozon jest jednym z czynników etiologicznych POChP. Dodatkowo, w oparciu o nasze wcześniejsze prace, stworzenie modelu OE zajęło tylko 6-8 tygodni, podczas gdy potrzeba 3-12 miesięcy na wywołanie modelu dymu papierosowego, co wskazuje, że model OE może być dobrym wyborem do badań nad POChP.

Wprowadzenie

Oszacowano, że POChP, w tym rozedma płuc i przewlekłe zapalenie oskrzeli, może być trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie w 2020 roku^1,2. Potencjalna częstość występowania POChP w populacji powyżej 40 roku życia szacowana jest na 12,7% u mężczyzn i 8,3% u kobiet w ciągu najbliższych 40 lat³. Obecnie nie są dostępne żadne leki, które mogłyby odwrócić postępujące pogorszenie stanu zdrowia u pacjentów z POChP⁴. Wiarygodne modele zwierzęce POChP nie tylko wymagają naśladowania procesu patologicznego choroby, ale także wymagają krótkiego okresu pokoleniowego. Obecne modele POChP, w tym LPS lub model indukowany przez PPE, mogą wywoływać objawy podobne do rozedmy płuc^5,6. Jednorazowe podanie lub tygodniowa prowokacja LPS lub PPE myszom lub szczurom powoduje wyraźną neutrofilię w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), zwiększa mediatory prozapalne (np. TNF-α i IL-1β) w BALF lub surowicy, wytwarza powiększone przestrzenie powietrzne w postaci zniszczenia miąższu płuc i ogranicza przepływ powietrza^5,6,7,8,9,10. Jednak LPS lub PPE nie są przyczynami POChP u ludzi, a zatem nie naśladują procesu patologicznego¹¹. Model indukowany przez CS spowodował trwałe ograniczenie przepływu powietrza, zniszczenie miąższu płuc i zmniejszoną funkcjonalną wydolność wysiłkową. Jednak tradycyjny protokół CS wymaga co najmniej 3 miesięcy na wygenerowanie modelu POChP^12,13,14,15. Dlatego ważne jest, aby wygenerować nowy, bardziej wydajny model zwierzęcy, który spełnia te dwa wymagania.

Ostatnio, oprócz palenia papierosów, zanieczyszczenie powietrza i narażenie zawodowe stały się częstszymi przyczynami POChP^16,17,18. Ozon, jako jedno z głównych zanieczyszczeń (choć nie główny składnik zanieczyszczenia powietrza), może bezpośrednio reagować z drogami oddechowymi i uszkadzać tkankę płucną zarówno dzieci, jak i młodych dorosłych^{19,20,21,22,23,24,25}. Ozon, a także inne stymulatory, w tym LPS, PPE i CS, są zaangażowane w poważne biochemiczne szlaki stresu oksydacyjnego płuc i uszkodzenia DNA oraz są związane z inicjacją i promocją POChP^26,27. Innym czynnikiem jest to, że objawy u niektórych pacjentów z POChP pogarszają się po ekspozycji na ozon, co wskazuje, że ozon może zaburzać czynność płuc^18,28,29. Dlatego wygenerowaliśmy nowy model POChP, wielokrotnie wystawiając myszy na działanie wysokich stężeń ozonu przez 7 tygodni; Spowodowało to wady przepływu powietrza i uszkodzenie miąższu płuc podobne do tych z poprzednich badań^30,31,32. W tym badaniu rozszerzyliśmy protokół OE na samice myszy i z powodzeniem odtworzyliśmy rozedmę płuc zaobserwowaną u samców myszy w naszych poprzednich badaniach^30,31,32. Ponieważ śmiertelność z powodu POChP zmniejszyła się u mężczyzn, ale wzrosła u kobiet w wielu krajach³³, potrzebny jest model POChP u kobiet, aby zbadać mechanizmy i opracować metody terapeutyczne dla kobiet chorych na POChP. Możliwość zastosowania modelu OE do wszystkich płci stanowi dodatkowe wsparcie dla jego stosowania jako modelu POChP.

Protokół

UWAGA: Model OE został wygenerowany i wykorzystany w wcześniej zgłoszonych badaniach^30,31,32. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Jiaotong w Szanghaju.

1. Myszy

1. Wolne od patogenów, 7- do 9-tygodniowe samice myszy BALB/c trzymane są w indywidualnych wentylowanych klatkach w pomieszczeniu dla zwierząt w kontrolowanej temperaturze (20 °C) i wilgotności (40 - 60%). Zapewnij 12 godzin światła i 12 godzin ciemności w obiekcie. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.

2. Narażenie na ozon lub powietrze

1. Wytwarzanie ozonu za pomocą generatora elektrycznego w akrylowej skrzynce uszczelniającej (np. Perspex). Wydmuchaj powietrze ze skrzynki za pomocą małej dmuchawy powietrza przez rurę odpowietrzającą, która jest podłączona po wewnętrznej i zewnętrznej stronie skrzynki. Monitorować stężenie ozonu w pojemniku za pomocą sondy ozonu. Poczekaj, aż stężenie ozonu w pudełku osiągnie 2,5 części na milion (ppm).
   UWAGA: Sonda ozonu może automatycznie włączać i wyłączać generator ozonu i może utrzymywać poziom ozonu w pudełku na poziomie 2.5 ppm.
2. Umieść myszy w pudełku, gdy poziom ozonu osiągnie 2,5 ppm. Trzymaj myszy w pudełku przez 3 godziny za każdym razem, aby wystawić je na działanie ozonu.
   UWAGA: Pudełko może utrzymać poziom ozonu 2,5 ppm w ciągu 3 godzin, automatycznie włączając lub wyłączając generator ozonu i wydmuchując CO₂ wytwarzany przez myszy po wyjęciu z pudełka.
3. Poddać dwie ekspozycje na ozon (każde z nich trwało 3 godziny) tygodniowo (raz na 3 dni) przez 7 tygodni; wystawić myszy kontrolne na działanie powietrza w tym samym czasie i przez ten sam okres.

3. Tomografia mikrokomputerowa

1. Pod koniec 7. tygodnia znieczulij myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g), dostosuj dawkę do indywidualnych sytuacji, aby upewnić się, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi. Monitoruj i utrzymuj mysz na stałej częstotliwości oddychania; i upewnij się, że podczas zabiegów nie ma żadnych dobrowolnych ruchów.
2. Umieść znieczulone myszy w komorze mikrotomografii komputerowej (μCT).
3. Skalibruj μCT przy użyciu standardowego protokołu i instrukcji producenta. Ustaw lampę rentgenowską na 50 kV, a prąd na 450 μA.
   UWAGA: Zarówno promieniowanie rentgenowskie, jak i detektor obracają się wokół myszy.
4. Wykonaj analizę μCT, uzyskując 515 projekcji o efektywnym rozmiarze piksela 0,092 mm, czasie naświetlania 300 ms dla jednego wycinka i grubości warstwy 0,093 mm.
5. Zrekonstruuj płuco na podstawie uzyskanych obrazów za pomocą oprogramowania. Dostosuj jasność obrazu w skali szarości, ustawiając minimum i maksimum skali szarości odpowiednio na -750 i -550 jednostek Hounsfielda.
   UWAGA: Oprogramowanie automatycznie obliczy objętość miąższu płuca i obszar o niskim tłumieniu (LAA)^34,35.
6. Oblicz procentową zawartość LAA (LAA%), dzieląc objętość LAA przez całkowitą objętość płuc.

4. Test na bieżni

1. Poddaj myszy testowi adaptacyjnemu z prędkością 10 m/min przez 10 minut na uruchomionej bieżni. Uwaga: Prąd jest zawsze wyłączony podczas przeprowadzania zabiegu.
2. Przeprowadź test zmęczeniowy na myszach.
   1. Rozgrzewaj myszy z prędkością 10 m/min przez 5 minut.
   2. Zwiększ prędkość do 15 m/min na 10 min.
   3. Zwiększ intensywność ćwiczeń: zwiększ prędkość o 5 m/min, zaczynając od 20 m/min, co 30 minut, aż myszy nie będą w stanie kontynuować biegu³⁶.
3. Zapisz całkowity dystans biegu i czas biegu odpowiednio jako dystans zmęczenia i czas zmęczenia.

5. Pomiary funkcji płuc

1. Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g), dostosować dawkę do indywidualnych sytuacji, aby zobaczyć, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi i poczekać, aż myszy utrzymają spontaniczny oddech. Monitoruj i utrzymuj mysz na stałej częstotliwości oddychania; i upewnij się, że podczas zabiegów nie ma żadnych dobrowolnych ruchów.
2. Ostrożnie przeprowadź tracheostomię myszy i umieść je w pletyzmografie ciała, który jest podłączony do respiratora sterowanego komputerowo.
   UWAGA: Wentylacja jest sterowana za pomocą zaworu umieszczonego proksymalnie do rurki dotchawiczej. Konfiguracja zapewnia różne manewry półautomatyczne, w tym manewr quasi-statycznej objętości ciśnienia i manewr szybkiej objętości przepływu.
3. Nałóż znieczuloną mysz na średnią częstotliwość oddychania 150 oddechów/min poprzez wentylację sterowaną ciśnieniem, aż do uzyskania regularnego wzorca oddychania i całkowitego wydechu przy każdym cyklu oddychania.
4. Wykonać manewr quasi-statyczne ciśnienie-objętość za pomocą urządzenia, wykorzystując podciśnienia generowane w pletyzmografie.
5. Wykonaj manewr szybkiego przepływu w quasi-statycznych pętlach ciśnienie-objętość, aby zarejestrować FVC i FEV. Napompuj płuco do +30 cm H₂O i natychmiast po tym podłącz je do silnie ujemnego ciśnienia, aby wymusić wydech, aż objętość resztkowa osiągnie -30 cm H₂O. Zapisz FEV w pierwszych 25, 50 i 75 ms wydechu (odpowiednio FEV₂₅, FEV₅₀ i FEV₇₅). Odrzuć nieoptymalne manewry. Dla każdego testu z każdą pojedynczą myszą należy wykonać co najmniej trzy dopuszczalne manewry, aby uzyskać wiarygodną średnią dla wszystkich parametrów numerycznych.

6. Kolekcja BALF

1. Po znieczuleniu końcowym za pomocą pelltobarbitalum natricum ((1%, 1,8-2,4 ml/100 g) dostosuj dawkę do indywidualnych sytuacji, aby zobaczyć, że mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi i traci oddech), przepłucz myszy 2 ml PBS przez rurkę dotchawiczą o średnicy 1 mm, a następnie pobierz BALF¹⁰.
2. Pobrane porcje płukania należy połączyć i odwirować w temperaturze 4 °C i 250 x g przez 10 minut.
3. Zebrać sklarowany osad do natychmiastowego użycia i przechowywać pozostałą część w temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie.
4. Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
5. Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS, a następnie odwirować (1 400 x g, 6 min) 250 μl zawieszonych komórek na szkiełkach za pomocą wirówki do szkiełkowania.
6. Nałóż barwienie Wrighta na komórki na szkiełkach zgodnie z protokołem producenta.
7. Policz 200 komórek na mysz; zidentyfikuj komórki jako makrofagi lub neutrofile, zgodnie ze standardową morfologią, pod 400-krotnym powiększeniem; i policz ich liczbę.

7. Pobieranie próbek krwi z serca

1. Zbierz krew przez nakłucie serca, załaduj ją do probówek o pojemności 1,5 ml i trzymaj na lodzie przez 30 minut.
2. Odwirować próbki krwi przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.
3. Przenieść supernatant (surowicę) do nowej probówki i przechowywać go w temperaturze -80 °C lub ciekłego azotu.
4. Przygotuj surowicę do testów wykrywania IL-1β, IL-10 i TNF-α przy użyciu odpowiednich zestawów ELISA.

8. Analiza morfometryczna płuc

1. Wypreparuj płuca i tchawice myszy.
   1. Umieść każdą uśpioną mysz na desce chirurgicznej natychmiast po złożeniu jej w ofierze.
   2. Wypreparuj platysmę i przednie mięśnie tchawicy, aby uwidocznić i uzyskać dostęp do pierścieni tchawicy.
   3. Otwórz klatkę piersiową. Wypreparuj płuca i tchawicę, ale nie oddzielaj serca od płuc.
2. Podłączyć cewnik dotchawiczy do strzykawki zawierającej 4% paraformaldehydu przez rurkę polietylenową PE90.
   Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nosić rękawice i okulary ochronne i używać roztworu wewnątrz dygestorium.
3. Całkowicie napompuj płuca za pomocą 4% paraformaldehydu (10 kropli, ~200 μL) przez cewnik dotchawiczy. Usuń serce po zakończeniu pompowania.
4. Utrzymuj płuca w 15 ml probówce zawierającej 10 ml 4% paraformaldehydu przez co najmniej 4 godziny.
5. Osadź płuca w parafinie. Uzyskać skrawki 5 μm przez cięcie bloku parafinowego za pomocą mikrotomu obrotowego. Podczas cięcia należy odsłonić maksymalną powierzchnię tkanki płucnej w obszarze drzewa oskrzelowego.
6. W celu analizy morfometrycznej należy wykonać barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) na skrawkach.
7. Zobrazuj skrawki za pomocą pionowego mikroskopu jasnego pola (soczewka obiektywowa, 20x; czas naświetlania, 1,667 ms).
8. Niech dwóch badaczy zaślepionych protokołem leczenia niezależnie policzyć skrawki histologiczne. Użyj średniej odległości przecięcia liniowego (L_m) jako parametru do pomiaru odległości ściany przegrody międzypęcherzykowej. Określ L_m, wykonując następujące czynności:
   1. Otwórz obrazy sekcji w Photoshopie i narysuj siatkę siatki na obrazie z pięcioma liniami o długości 550 μm.
   2. Policz liczbę pęcherzyków płucnych w poprzek linii siatki.
   3. Oblicz L_m, dzieląc długość linii siatki przez liczbę pęcherzyków płucnych. Aby określić ilościowo, narysuj pięć sekcji na mysz. Zdobądź dziesięć obrazów każdej sekcji (po jednym obrazie na pole) i oceń losowo. Podczas selekcji pól należy unikać pól dróg powietrznych i naczyń, przesuwając jedno pole do przodu lub w innym kierunku.
      Uwaga: Dane przedstawiono jako średnią ± S.E.M. Przeprowadzono niesparowany test t w celu porównania myszy narażonych na działanie powietrza i myszy narażonych na działanie ozonu. Do obliczenia istotnej różnicy wykorzystano trzy zwierzęta z każdej grupy. Wartość p wynosząca <0,05 została uznana za istotną.

Wyniki

Przykłady obrazów 3D μCT każdej grupy są wyświetlane w Rysunek 1a. Myszy narażone na działanie ozonu miały znacznie większą całkowitą objętość płuc (Rysunek 1a i b) i LAA% (Figura 1c) niż myszy kontrolne wystawione na działanie powietrza. Objętość płuc i LAA% pozostały podwyższone po sześciu tygodniach ekspozycji na ozon^31,

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono wiarygodną metodę generowania nowego modelu POChP. W porównaniu z innymi modelami (tj. modelami LPS lub PPE), ten model OE podsumowuje proces patologiczny pacjentów z POChP. Ponieważ dym papierosowy jest głównym materiałem niebezpiecznym, który powoduje POChP u ludzi⁴⁰, model CS pozostaje najpopularniejszym modelem POChP^41,42. Jednak model CS wymaga od 3 do 12 miesięcy okresu badawczo-rozwojowego d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
myszy BALB / c	Slac Laboratory Animal, Szanghaj, Chiny	tym badaniu wykorzystano 7-dniowe do 9-tygodniowe samice myszy BALB/c.
Indywidualne klatki wentylowane	Suhang, Szanghaj, Chiny	Numer modelu: MU64S7	Klatki służyły do trzymania myszy w pomieszczeniu dla zwierząt.
Uszczelnienie pudełka z pleksiglasu	Suhang, Szanghaj, Chiny	Nie dotyczy	Pudełko zostało użyte  do przechowywania generatora ozonu. Myszy były wystawione na działanie ozonu w pudełku.
Generator elektryczny	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Niemcy	Model 500	Urządzenie służyło do wytwarzania ozonu.
Sonda ozonu	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, Wielka Brytania	Ozon 300	Urządzenie służyło do monitorowania i kontrolowania wytwarzania ozonu.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Myszy znieczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pelltobarbitalum natricum.
Mikrotomografia komputerowa	GE Healthcare, Londyn, ON, Kanada	RS0800639-0075	To urządzenie służyło do pozyskiwania obrazów płuc.
Micro-view 2.01 Oprogramowanie ABA	GE Healthcare, Londyn, ON, Kanada	Micro-view 2.01	Urządzenie to służyło do rekonstrukcji płuca i analizy objętości LAA płuca.
Maszyna do bieżni	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, Chiny	DSPT-208	Ta maszyna została przeprowadzona do testu zmęczeniowego.
Pletyzmograf ciała	eSpira™ System wymuszonych manewrów, EMMS, Edynburg, Wielka Brytania	System wymuszonych manewrów	Urządzenie to służyło do badania spirometrycznej czynności płuc.
Respirator	eSpira&handel; System wymuszonych manewrów, EMMS, Edynburg, Wielka Brytania	System wymuszonych manewrów	Urządzenie to służyło do badania spirometrycznej czynności płuc.
Wirówka do szkiełkowania Denville	Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	Służył do obracania komórek BALF na szkiełkach.
Wright Staining	Hanhong, Szanghaj, Chiny	RE04000054	Używano go do barwienia makrofagów, neutrofili w zawieszonym BALF.
Hemocytometr	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	Służył do liczenia komórek.
IL-1 i beta;	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	Użyto ich do przetestowania odpowiednich czynników w surowicy.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	Użyto ich do przetestowania odpowiednich czynników w surowicy.
TNF-&alfa;	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	Wykorzystano je do przetestowania odpowiednich czynników w surowicy.
Paraformaldehyd	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	Płuco było napompowane 4% paraformaldehydem.
Parafina	Hualing, Szanghaj, Chiny	56#	Służyła do osadzania płuc.
Mikrotom obrotowy	Leica, Wetzlar,  Hesja, Niemcy	RM2255	Służył do cięcia płuc.
Hgaematoksylina i eozyna (H& E) roztwór barwiący	Solarbio, Pekin, Chiny	G1120	H& Barwienie E wykonano do analizy morfometrycznej.
Pionowy mikroskop jasnego pola	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	Służył do obrazowania H& Szkiełka do barwienia E.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Adobe Photoshop 12	Służył do liczenia pęcherzyków płucnych na H& E poplamione obrazy.
GraphPad pryzmat 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad pryzmat 5	Był używany do analizy danych i tworzenia liczb.