Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56101

⸱

3 października 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

W tym artykule

Podsumowanie

Kanał wydalniczy C. elegans jest unikalnym modelem jednokomórkowym do wizualnej analizy in vivo biogenezy błony spolaryzowanej de novo. Protokół ten opisuje połączenie standardowych podejść genetycznych/RNAi i obrazowania, które można dostosować do identyfikacji i charakterystyki cząsteczek kierujących jednokomórkową tubulingenezą oraz biogenezą błony wierzchołkowej i światła.

Streszczenie

Cztery kanały wydalnicze C. elegans to wąskie rurki przedłużone przez całą długość zwierzęcia z pojedynczej komórki, z prawie równie daleko rozciągniętymi wewnątrzkomórkowymi endorurkami, które budują i stabilizują światło za pomocą błony i subbłonowego cytoszkieletu o charakterze wierzchołkowym. Komórka wydalnicza rozszerza swoją długość około 2000 razy, aby wytworzyć te kanały, co czyni ten model unikalnym do oceny in vivo biogenezy błony spolaryzowanej de novo, morfogenezy światła wewnątrzkomórkowego i tubulingenezy jednokomórkowej. Przedstawiony tutaj protokół pokazuje, jak połączyć standardowe znakowanie, genetyczne zakłócenia przyrostu i utraty funkcji lub interferencję RNA (RNAi) oraz mikroskopijne podejście do wykorzystania tego modelu do wizualnej analizy i funkcjonalnej analizy tych procesów na poziomie molekularnym. Jako przykład podejścia opartego na znakowaniu, protokół przedstawia tworzenie transgenicznych zwierząt z fluorescencyjnymi białkami fuzyjnymi do analizy tubulogenezy na żywo. Jako przykład podejścia genetycznego podkreśla kluczowe punkty wizualnego ekranu interakcji opartego na RNAi, zaprojektowanego w celu modyfikacji fenotypu kanału torbielowatego o wzmocnieniu funkcji. Konkretne opisane metody to: znakowanie i wizualizacja kanałów poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych; skonstruowanie ukierunkowanej biblioteki RNAi i opracowanie strategii badań przesiewowych RNAi w celu analizy molekularnej morfogenezy kanałów; wizualnie oceniać modyfikacje fenotypów kanałów; oceniaj je, analizując mikroskopię fluorescencyjną; scharakteryzować składniki kanałów subkomórkowych w wyższej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej; i określić ilościowo parametry wizualne. Podejście to jest przydatne dla badacza, który jest zainteresowany wykorzystaniem kanału wydalniczego C. elegans do identyfikacji i charakteryzowania genów zaangażowanych w filogenetycznie zachowane procesy wewnątrzkomórkowego światła i morfogenezy rurki jednokomórkowej.

Wprowadzenie

Wszystkie organy wewnętrzne składają się z rurek, kluczowych dla ich wielu różnych funkcji, takich jak transport i wymiana gazów, płynów i składników odżywczych oraz wydalanie produktów przemiany materii. Ich spolaryzowany charakter, z wyraźnymi błonami wierzchołkowymi i świetlnymi, jest przystosowany do tych specyficznych funkcji, a defekty w biogenezie ich systemów błon endo- i plazmatycznych są częstą przyczyną chorób u ludzi1,2. Większość rurek naczyniowych i narządów wewnętrznych jest wielokomórkowa i tworzy światło międzykomórkowe; Jednak rurki jednokomórkowe, które tworzą światło wewnątrzkomórkowo, mogą na przykład stanowić nawet 30–50% ludzkich łożysk naczyń włosowatych2. Spolaryzowane błony rurek wielo- i jednokomórkowych mają podobny skład, chociaż ich mikrodomeny mogą się różnić w zależności od specyficznej funkcji rurki (np. kanaliki kanału wydalniczego kontra mikrokosmki jelitowe u Caenorhabditis elegans; patrz artykuł towarzyszący na temat tubuogenezy jelitowej C. elegans)3. Zasady biogenezy błony spolaryzowanej i tubuogenezy są zachowane wśród metazoan, a podobna maszyneria molekularna nimi kieruje1,2,4.

System wydalniczy C. elegans składa się z pięciu komórek: komórki wydalniczej (EC), komórki przewodu (DC), komórki porowej (PC) i dwóch komórek gruczołowych. Ablacja EC, DC lub PC powoduje gromadzenie się płynu w jamie ciała i zwierzęta umierają we wczesnym stadium larwalnym5. Co ciekawe, te trzy jednokomórkowe rurki wytwarzają swoje światło na trzy różne sposoby: poprzez drążenie komórek (EC); owijanie komórek w połączeniu z tworzeniem połączeń autokomórkowych (PC); oraz przez owijanie komórek sprzężone z autofuzją (DC); Różne mechanizmy morfogenezy światła, które są filogenetycznie zachowane6,7. EC, znajdujący się po lewej bocznej stronie tylnej opuszki gardłowej, wysyła dwa boczne przedłużenia, z których cztery kanały rozgałęziają się, aby rozciągać się do przodu i do tyłu (zarówno po prawej, jak i lewej stronie) odpowiednio do czubka nosa i ogona robaka (Rysunek 1)5,6,8. EC rozciąga się od około 1 μm do 2 x 1 000 μm, co czyni go największą komórką u zwierzęcia. Na poziomie subkomórkowym kanał wydalniczy jest prostą rurką, utworzoną z błony podstawnej skierowanej w stronę pseudocoelom i tunelowaną przez błonę świetlną (endotube). Błona świetlna kanału łączy się z błoną świetlną przewodu w jego jedynym połączeniu międzykomórkowym; kanały są poza tym bezłączeniowe na całej swojej długości (Rysunek 1). Błona świetlna kanału wydalniczego i jej podbłonowy cytoszkielet są wierzchołkowe, określone przez ich skład molekularny, który przypomina skład błony wierzchołkowej i cytoszkieletu subbłonowego rurek wielokomórkowych, takich jak jelito, oraz innych (np. płaskich) nabłonków. Organelle cytoplazmatyczne, w tym endosomalne pęcherzykowe i inne (np. Golgiego) endobłony, są rozmieszczone wzdłuż długości kanału. Ponadto przez kanał cytoplazmy przewleczonych jest wiele pęcherzyków kanałowych - połączonych z błoną świetlną i/lub połączonych ze sobą lub izolowanych - przewleczonych przez kanał cytoplazma7,8,9,10. To dynamiczne połączenie plazmato-błona/kanał dodatkowo rozszerza system błonowy kanału i przyczynia się zarówno do morfogenezy światła, jak i osmoregulacji10. Kanał wydalniczy składa się zatem prawie wyłącznie z błon endo- i plazmatycznych, co stanowi doskonały model do analizy biogenezy błony spolaryzowanej i regulacji granicy faz błony endo- i plazmatycznej. Gwałtowne rozszerzanie się błony wierzchołkowej podczas morfogenezy kanału - w tym układzie jednokomórkowym zbiegające się z wydłużeniem światła - pozwala również na analizę problemów architektonicznych wynikających z konieczności stabilizacji i wyśrodkowania wewnątrzkomórkowej błony świetlnej. Protokół ten koncentruje się na analizie strukturalnej morfogenezy rurki kanałowej i światła oraz dynamiki błony wewnątrzkomórkowej wymaganej w tym procesie, a nie na sygnałach kierujących ruchami komórki, które generują pozycję EC w układzie wydalniczym i konstruują jej skomplikowane połączenia z innymi elementami komórkowymi (recenzja w6).

Kolejną zaletą systemu kanałów jednokomórkowych C. elegans do analizy biogenezy spolaryzowanej błony i światła wewnątrzkomórkowego jest jego zdolność do oddzielania, poprzez okres rozwoju, generowania różnych składników swoich błon i połączeń. EC rodzi się w momencie zamknięcia brzusznego i osiada brzuszno-bocznie gardła podczas środkowej embriogenezy5,6,8, w którym to czasie dochodzi do bocznego wydłużenia kanału i rozgałęzienia. Po tym następuje rozszerzenie kanału przednio-tylnego podczas późnej embriogenezy, proces, który trwa do stadium larwalnego L1 (Ryc. 1). U nowo wyklutej larwy tylny wierzchołek kanału sięga mniej więcej do środka robaka, w pełni rozciągając się do ogona pod koniec stadium L1, po którym to czasie kanał wydłuża się wraz z robakiem8. Aktywny wzrost kanałowy z prędkością większą niż tempo wzrostu zwierzęcia kończy się zatem na pierwszym stadium larwalnym, jednak dalszy wzrost następuje równolegle ze wzrostem całego zwierzęcia w dodatkowych stadiach larwalnych (L2–4). To ustawienie daje możliwość analizy różnych etapów biogenezy błony spolaryzowanej de novo, niezależnie od spolaryzowanego podziału lub migracji komórek. Co więcej, pozwala na oddzielenie tego procesu od składania się połączeń (które zachodzą w zarodku przed inicjacją światła); Ich dokładne wymagania dotyczące polaryzacji membrany są nadal otwarte w dziedzinie polaryzacji. Wreszcie, w unikalny sposób oddziela ekspansję błony wierzchołkowej od podstawnej, przy czym ten drugi proces poprzedza ten pierwszy w kanałach wydalniczych10. Model kanału wydalniczego C. elegans jest zatem szczególnie pouczającym uzupełnieniem modelu jelitowego, który dzieli wiele z tych zalet dla analizy biogenezy spolaryzowanej błony, ale realizuje ją w warunkach wielokomórkowych (patrz towarzyszący artykuł na temat kanaliki jelitowej3).

Chociaż kanały typu dzikiego są ultracienkimi kanalikami w tym maleńkim robaku, ich światło może być bezpośrednio widoczne przez optykę Nomarskiego u tego przezroczystego zwierzęcia. W rzeczywistości zmutowane morfologie kanałów torbielowatych można scharakteryzować u nieoznakowanych zwierząt za pomocą mikroskopii preparacyjnej o małym powiększeniu, która została wykorzystana z dużym skutkiem w zaawansowanych badaniach genetycznych do identyfikacji genów zaangażowanych w tubulingenezę11. Lepsza wizualizacja morfologii kanałów i rozróżnienie ich spolaryzowanych błon, składników cytoszkieletu, różnych organelli wewnątrzkomórkowych i innych struktur subkomórkowych wymaga jednak znakowania oraz fluorescencyjnego preparowania o większej mocy i mikroskopii konfokalnej. Chociaż delikatna struktura kanałów stwarza szereg trudności w znakowaniu i mikroskopii, błony i składniki subkomórkowe można odróżnić za pomocą specyficznych cząsteczek unikalnych dla każdego przedziału, a zwierzęta można bezpiecznie przystosować do mikroskopii, jeśli zostaną podjęte pewne środki ostrożności w celu uniknięcia wprowadzenia artefaktów (patrz Protokół i dyskusja). Znakowanie można przeprowadzić za pomocą immunohistochemii w utrwalonych próbkach lub poprzez generowanie transgenicznych robaków eksprymujących fluorescencyjne białka fuzyjne pod kontrolą własnych lub specyficznych dla kanału wydalniczego promotorów do obrazowania in vivo. Protokół ten opisuje tę ostatnią technikę znakowania (patrz towarzyszący artykuł na temat tubuogenezy jelitowej dla barwienia przeciwciałami3).

Możliwość łączenia badań in vivo nad utratą lub zyskiem funkcji z analizą obrazowania in vivo na poziomie pojedynczej komórki w trakcie rozwoju sprawia, że kanał wydalniczy C. elegans jest szczególnie silnym modelem do molekularnej i komórkowej analizy jednokomórkowej tubulingenezy. Genetyczne badania przesiewowe do przodu lub do tyłu można przeprowadzić, zaczynając od zwierzęcia transgenicznego typu dzikiego lub znakowanego, w celu zidentyfikowania fenotypów morfogenezy kanałów (na przykład torbieli) i leżących u ich podstaw wad genowych. Alternatywnie, takie badania przesiewowe mogą rozpocząć się od zmutowanego fenotypu (np. kanału torbielowatego) i zidentyfikować supresory lub wzmacniacze tego fenotypu w celu zidentyfikowania genów, które funkcjonalnie oddziałują z genem powodującym zmutowany fenotyp. Defekt genetyczny powodujący zmutowany fenotyp może indukować utratę (np. poprzez delecję genu) lub zysk (np. poprzez mutację aktywującą lub wprowadzenie nadmiaru kopii genów) badanej funkcji. Mutageneza do przodu lub systematyczne badania przesiewowe RNAi nie przyjmują uprzedzeń dotyczących funkcji genów i pozwalają na bezstronną identyfikację genów zaangażowanych w funkcję będącą przedmiotem zainteresowania. Biorąc pod uwagę dostępność bibliotek odżywiania RNAi w całym genomie, prawie każdy gen może być łatwo powalony przez RNAi u C. elegans, tak że każdy pojedynczy gen lub dowolna grupa genów (np. w ukierunkowanych badaniach przesiewowych) może być również szybko zbadana pod kątem ich wpływu w podejściu genetyki odwrotnej. Aby zademonstrować możliwą kombinację podejść, opisujemy tutaj ukierunkowane badanie przesiewowe interakcji RNAi, zaczynając od mutanta torbielowatego kanału wydalniczego o wzmocnieniu funkcji, znakowanego zielonym białkiem fluorescencyjnym kanału cytoplazmatycznego (GFP). Zmutowany fenotyp został wygenerowany przez nadekspresję erm-1, wysoce konserwatywnego ortologa C. elegans z rodziny łączników błonowo-aktynowych Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), który jest zaangażowany w morfogenezę światła i organizację błony u wielu gatunków12. C. elegans (C. elegans) ERM-1 lokalizuje się w błonach świetlnych narządów wewnętrznych, takich jak kanał wydalniczy i jelito, i jest wymagany do tworzenia światła w obu13. Nadekspresja ERM-1 rekrutuje nadmiar aktyny i pęcherzyków do błony świetlnej kanału, zwiększając strumień do światła i generując krótki kanał torbielowaty i zaciśniętą błonę świetlną z zagęszczonym podszerstkiem aktyny9. Protokół opisuje, w jaki sposób generować transgeniczne szczepy z białkami fuzyjnymi znakowanymi w kanale wydalniczym (lub innymi białkami); jak wykonywać celowane badania przesiewowe RNAi, zaczynając od takich szczepów, w celu identyfikacji modyfikatorów fenotypu kanałowego; oraz jak wizualnie analizować wyniki takich badań przesiewowych za pomocą analizy fluorescencyjnej i mikroskopii konfokalnej, w tym prostych sposobów ilościowego określania informacyjnych fenotypów tubuogenezy. Alternatywne techniki znakowania i szczegóły dotyczące RNAi, dostosowane do często śmiertelnych genów tubuogenezy, można znaleźć w dołączonym artykule na temat tubuogenezy jelitowej3. Wszystkie metody mogą być stosowane w różnych kombinacjach do badania innych zagadnień dotyczących kanaliki kanałowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oznaczanie kanału wydalniczego C. elegans za pomocą fluorescencyjnych białek fuzyjnych14

Uwaga: Zobacz załączony artykuł na temat cewkowości jelitowej3 do oznaczania za pomocą procedur barwienia przeciwciał in situ, które można dostosować do kanału wydalniczego. W Tabeli 1 przedstawiono przykłady cząsteczek, które okazały się przydatne do wizualizacji błon endo- i plazmatycznych kanału wydalniczego C. elegans, w Tabeli 2 przedstawiono przykłady promotorów kierujących ekspresją do kanału wydalniczego, a w Tabeli 3 przedstawiono zasoby dotyczące bardziej wszechstronnych zbiorów markerów i promotorów, w tym odniesień omawiających wybór różnych fluoroforów.

  1. Budowa specyficznych tkankowo plazmidów markerów fluorescencyjnych poprzez klonowanie oparte na enzymach restrykcyjnych15
    Uwaga: Zobacz Dyskusję, aby zapoznać się z alternatywnymi technikami konstruowania fluorescencyjnych białek fuzyjnych.
    1. Zidentyfikuj sekwencję promotora (w przypadku fuzji transkrypcyjnych) lub całego genu będącego przedmiotem zainteresowania wraz z jego promotorem (w przypadku fuzji translacyjnych) w WormBase44.
      Uwaga: W przypadku promotorów około 1-3 kilozasad (kb) jest wystarczające dla większości genów C. elegans. Translacyjne białka fuzyjne można również konstruować poprzez umieszczenie interesującego genu pod promotorem specyficznym dla kanału wydalniczego (patrz Tabela 2).
    2. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu do amplifikacji promotora (do fuzji transkrypcyjnych) i/lub pełnego genu z promotorem (do fuzji translacyjnych). Dodaj łączniki enzymów restrykcyjnych na końcach 5' i 3' starterów.
      Uwaga: Wybierz enzymy restrykcyjne, które są obecne w plazmidzie wektorowym (np. pPD95.79)16. W przypadku fuzji translacyjnych łącznik 3' powinien być zaprojektowany tak, aby po trawieniu enzymu restrykcyjnego i ligacji z wektorem, ramka kodonu insertu była ciągła z kodonami fluoroforu, np. GFP. Może być konieczne dodanie 1 lub 2 dodatkowych zasad do typowych łączników enzymów restrykcyjnych14; Uważaj, aby nie utworzyć kodonu stop.
    3. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu amplifikacji promotora lub genu o pełnej długości przy użyciu żywych robaków lub genomowego DNA typu dzikiego lub cDNA jako matrycy15.
      Uwaga: W przypadku używania robaków jako szablonu, najpierw lizują robaki w buforze do lizy (bufor PCR plus proteinaza K)17. Robaki w stadium mieszanym mogą być używane jako szablon. Wygłodzone robaki można wykorzystać, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnym DNA.
    4. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym (1%) na produktach PCR, aby określić prawidłowy rozmiar amplifikowanego produktu.
      Uwaga: Jeśli rozmiar obwodu jest prawidłowy, przejdź do następnego kroku. Jeśli generowanych jest wiele pasm, popraw warunki wzmocnienia, aby uzyskać pojedyncze pasmo. Jeśli to nie zadziała, odetnij odpowiednią opaskę z żelu i oczyść DNA standardowymi metodami15, a następnie przejdź do następnego kroku.
    5. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne na produkcie PCR i plazmidzie wektorowym, który zawiera fluorofor (np. pPD95.79) w oddzielnych probówkach za pomocą standardowych metod15.
    6. Oddzielić strawione DNA za pomocą elektroforezy żelowej i wymyć produkt PCR oraz pasma DNA wektora w oddzielnych probówkach.
    7. Oczyść DNA z plastrów żelu standardowymi metodami15. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
    8. Zwiąż produkt PCR i wektorowe DNA za pomocą standardowych metod i przekształć rekombinowane DNA w kompetentne komórki za pomocą standardowych metod15.
    9. Rozprowadzić 10 μl, 50 μl i 100 μl przekształconych komórek na trzech oddzielnych płytkach Luria Broth (LB) uzupełnionych 50 μg/ml ampicyliny.
      Uwaga: Rozłóż różne ilości komórek na różnych płytkach, aby uzyskać spektrum wydajności transformacji. Na przykład zbyt gęste posiewy mogą nie pozwolić na izolację kolonii, jeśli transformacja jest wydajna.
    10. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego ranka wyjmij płytki z inkubatora.
      Uwaga: Jeśli kolonie są bardzo małe, inkubuj jeszcze przez kilka godzin.
    11. Przygotuj plazmidowe DNA z pojedynczych kolonii za pomocą standardowych metod15. Wymieszaj matrycę DNA i startery i wyślij do sekwencjonowania (zwykle wykonywanego w centrum usług podstawowych).
    12. Odczytaj sekwencje i sprawdź integralność konstruktu fuzji.
      Uwaga: KRYTYCZNE: Potwierdź prawidłową ramkę kodonu między wstawionym genem a genem markera fluorescencyjnego dla fuzji translacyjnych. Najlepiej zsekwencjonować cały gen, aby potwierdzić, że podczas procedur PCR i ligacji nie została wprowadzona żadna mutacja.
    13. Wygeneruj więcej plazmidowego DNA (używając kroku 1.1.11) do wstrzyknięcia w kroku 1.2.
  2. Generowanie zwierząt transgenicznych przez mikroiniekcję DNA w celu transformacji linii zarodkowej18
    Uwaga: Zobacz dyskusję na temat alternatywnych technik wprowadzania transgenów. Przedstawione procedury można wykorzystać do generowania zwierząt transgenicznych, które są nosicielami fluorescencyjnego białka fuzyjnego lub dowolnego innego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, białko egzogenne może być nowo wprowadzone (np. Heterologiczny ortolog) lub białko endogenne może być ponownie wprowadzone (np. do odpowiadającego mu mutanta linii zarodkowej w celu uratowania) lub nadekspresja w celu wygenerowania fenotypu (np. wstrzyknięcie erm-1 zastosowano do wygenerowania fenotypu kanału torbielowatego z nadekspresją, który służy jako cel do modyfikacji przez ekran interakcji RNAi opisany poniżej).
    1. Zmieszaj DNA konstrukcyjne (1–50 ng/μl) z markerowym plazmidowym DNA (zwykle 100 ng/μl), na przykład dominującym markerem rol-6 (su1006) (patrz 1.2.3 dla opcji markerów).
      Uwaga: KRYTYCZNE: Stężenie wstrzykniętego DNA musi być określone empirycznie, aby uniknąć wprowadzenia artefaktowych fenotypów (torbiele, wady wydłużenia, śmiertelność) podczas ekspresji genów w kanałach wydalniczych, które są szczególnie wrażliwe na ekspresję transgenów. Można na przykład sporządzić kilka mieszanin plazmidów o stężeniach 1 ng/μL, 10 ng/μL, 50 ng/μL i 100 ng/μL za pomocą 100 ng/μL rol-6(su1006), aby przetestować zakres stężeń w celu wytworzenia żywotnego szczepu o pożądanej ekspresji lub fenotypie (wysokie stężenia prawdopodobnie nie będą specyficznie toksyczne dla morfogenezy kanałów i mogą być śmiertelne).
    2. Przefiltruj mieszaninę DNA przez filtr probówkowy wirówki spin-x o wielkości porów 0,22 μm (mikrometra).
      Uwaga: Nie pozostawiaj otwartej pokrywy tubki, aby uniknąć kurzu, który może zablokować igły do mikroiniekcji.
    3. Mikroiniekcja rekombinowanych plazmidów do gonady robaków typu dzikiego lub zmutowanego za pomocą standardowych metod transformacji linii zarodkowej (szczegóły procedury znajdują się w referencji18).
      Uwaga: Standardowe plazmidy markerowe to na przykład: rol-6 (su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Dominujące transgeny, takie jak rol-6 (su1006), są wprowadzane do robaków typu dzikiego, podczas gdy ratujące transgeny są wprowadzane do odpowiednich mutantów. Plazmidy markerowe są wstrzykiwane jednocześnie w celu łatwego utrzymania linii transgenicznych, ponieważ transgeny pozachromosomalne są losowo tracone podczas podziału komórki (patrz 1.2.8). Podczas wstrzykiwania genów kodujących fuzje fluoroforów, można również użyć fluoroforu, GFP, jako markera. ROL-6 indukuje robaki do toczenia się wokół siebie, co często jest korzystne dla oceny fenotypów morfogenezy.
    4. Przenieś wstrzyknięte robaki na płytki pożywki wzrostu nicieni (NGM) wysiewane przez Escherichia coli (np. 5 robaków/płytkę) (patrz odniesienie19 dla standardowych procedur hodowli i konserwacji C. elegans oraz Tabeli Materiałów).
    5. Inkubować płytki i pozwolić potomstwu rozwijać się w temperaturze 20 °C przez około 3 dni.
    6. Zbadać potomstwo F1 pod mikroskopem preparacyjnym pod kątem robaków Rol (toczących się) (lub innego specyficznego markera do wstrzykiwań, np. GFP) i rolki pobierające do poszczególnych płytek.
    7. Wybrać płytki z toczącymi się zwierzętami F2 i potwierdzić obecność fluorescencji pod preparacyjnym mikroskopem fluorescencyjnym (zwykle wszystkie zwierzęta walcowe są GFP-dodatnie).
      Uwaga: Rolki F2 wskazują na pomyślne wygenerowanie linii transgenicznej. Poszczególne linie mogą się różnić, np. pod względem szybkości transmisji transgenów. Dlatego przydatne jest utrzymywanie i przechowywanie kilku linii.
    8. Utrzymanie linii transgenicznych poprzez wzbogacenie nowych płytek dla zwierząt z dodatnim markerem.
      Uwaga: Wstrzyknięte DNA jest włączane do linii zarodkowej jako macierz pozachromosomalna. Szybkość transmisji dla macierzy pozachromosomalnych jest zmienna, ale na ogół wynosi około ~50%. Aby nie stracić odkształcenia, tak ważne jest ręczne wzbogacanie linii znacznikami dominującymi (np. liniami niezabezpieczonymi przez selekcję negatywną).
    9. Zamrażanie linii transgenicznych za pomocą standardowych technik zamrażania w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C19.
      Uwaga: Transgeny na matrycach pozachromosomalnych mogą być również zintegrowane z linią zarodkową przez naświetlanie UV w dodatkowym kroku, aby uzyskać jednorodne linie18. Na przykład erm-1 został zintegrowany z linią zarodkową przez naświetlanie promieniami UV w celu uzyskania szczepu ERM-1[++] fgIs2[erm-1p::erm-1; ROL-6P::ROL-6(SU1006)], gdzie każde zwierzę jest nosicielem transgenu, co jest wymogiem do jego użycia w ekranie interakcji opartym na RNAi opisanym poniżej. Szczep ten został dodatkowo oznaczony przez cytoplazmatyczny kanał wydalniczy GFP poprzez krzyżowanie w szczepie zawierającym transgen vha-1p::GFP (wygenerowany przez te same procedury, jak opisano powyżej; zobacz reference20 dla podstawowych procedur genetycznych, takich jak krzyżówki) i jest określany jako ERM-1[++]; vha-1p::GFP szczep poniżej.

2. Budowa biblioteki docelowego RNAi i projektowanie ekranu interakcji RNAi w celu modyfikacji fenotypu kanału

Uwaga: Opisano ukierunkowane badanie interakcji genetycznej oparte na RNAi, które wykorzystuje fenotyp kanału torbielowatego z nadekspresją do poszukiwania oddziałujących genów morfogenezy kanału wydalniczego. Szczep ERM-1[++] (patrz krok 1.2.9) służy jako example9. Podejście to przedstawia tylko jedno z wielu możliwych podejść do analizy genetycznej morfogenezy światła kanału wydalniczego (zobacz Wprowadzenie i Dyskusję dla innych podejść genetycznych). Zobacz towarzyszący artykuł na temat cewkowości jelitowej3 i referencje17,21,22 aby uzyskać informacje o RNAi, szczegóły procedur RNAi, modulację siły RNAi (dostosowaną do często śmiertelnych genów tubulogenezy) oraz dyskusję na temat problemów technicznych związanych z RNAi. Zobacz reference19 dla standardowej hodowli i konserwacji robaków oraz Tabeli materiałów.

  1. Szukaj cząsteczek oddziałujących z ERM-1 (lub innym interesującym genem) w bazach danych i opublikowanych artykułach.
    Uwaga: Potencjalne interakcje ERM-1 obejmowałyby wszystkie cząsteczki, co do których eksperymentalnie wykazano, że oddziałują funkcjonalnie, genetycznie lub fizycznie z białkami ERM u dowolnego gatunku i/lub przewidywano, że będą to robić za pomocą dowolnego podejścia in silico, wysokoprzepustowego lub biologii systemowej (patrz tabela 3 dla przykładów baz danych i zasobów).
  2. Wygeneruj listę wszystkich genów i znajdź homologi C. elegans tam, gdzie jest to wymagane.
    Uwaga: Rozważ rozszerzenie listy zidentyfikowanych genów do klas genów, która uwzględnia funkcję genu będącego przedmiotem zainteresowania i poszerza sieć identyfikacji interaktorów (np. dla łącznika błona-aktyna ERM-1 wybierz wszystkie aktyny i cząsteczki związane z aktyną).
  3. Zidentyfikuj odpowiednie klony bakteryjne odżywiające RNAi w dostępnych na rynku bibliotekach bakteryjnego RNAi obejmujących cały genom dla wszystkich genów (np. Ahringer genomic C. elegans RNAi feeding library21; Tabela materiałów)
  4. Wygeneruj arkusz kalkulacyjny dla wszystkich genów i odpowiadającej im płytki RNAi oraz liczby studzienek.
  5. Wybierz i rozprowadź ~50 klonów RNAi na płytkach LB / ampicyliny / tetracykliny (wybór antybiotyku zależy od konstrukcji biblioteki) dziennie i kontynuuj, aż zostanie wygenerowana docelowa biblioteka RNAi.
    Uwaga: W zależności od rozmiaru biblioteki i przewidywanego przepływu pracy pomiń generowanie pełnej biblioteki i przejdź bezpośrednio do analizy wsadowej. Talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C, nie dłużej niż około 2 tygodni (w razie potrzeby po tym czasie ponownie nałożyć na nowe płytki). I odwrotnie, można generować większe zamrożone biblioteki w replikowanych formatach 96-dołkowych lub 384-dołkowych do długoterminowego przechowywania w temperaturze -80 °C.
  6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego ranka wyjąć płytki z inkubatora i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Pobrać bakterie RNAi z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki, wymieszać bakterie z bulionem 600 μl LB/ampicyliny (50 ng/μL) w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, inkubować probówki w temperaturze 37 °C, wstrząsać przez 6 godzin
    Uwaga: Zaszczepij bakterie RNAi w bulionie, pocierając wykałaczką (wykałaczką lub końcówką mikropipety) wzdłuż boku mikroprobówki.
  8. Wysiewać 70 μl wyhodowanych bakterii do każdej studzienki 6-dołkowych płytek RNAi w podwójnych lub potrójnych zestawach. Inkubować płytki RNAi w temperaturze 22 °C przez noc.
    Uwaga: Płytki RNAi są generowane według standardowych procedur (Tabela materiałów i odniesienia3,17,21) i tutaj używane w formacie 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w celu uzyskania podejścia o wyższej przepustowości, które nadal pozwala na mikroskopową ocenę morfogenezy kanałów u żywych zwierząt na płytkach.
  9. Następnego ranka wybierz 3 L4 stage ERM-1[++]; vha-1p::GFP robaki na każdej studzience płytek RNAi.
    1. Aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami OP50 (patrz reference19), które zakłócają działanie RNAi, najpierw wysiewaj robaki na płytkę NGM bez bakterii i pozwól zwierzętom czołgać się przez około 10 minut. Używaj tylko zdrowych zwierząt, które nie są głodzone.
  10. Inkubować płytki w temperaturze 22 °C przez 3 dni, aby umożliwić zwierzętom wydanie potomstwa.
  11. Zbadaj fenotypy kanałów u potomstwa F1 pod preparacyjnym mikroskopem fluorescencyjnym.

3. Obrazowanie in vivo kanału wydalniczego C. elegans za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i oceny fenotypów tubuogenezy

  1. Przygotuj arkusz punktacji fenotypu (przykład pokazany w Tabeli 4 i Rysunek 5).
  2. Umieść płytkę agarową z robakami bezpośrednio pod mikroskopem fluorescencyjnym preparacyjnym, otwórz pokrywę płytki w celu oceny, użyj mniejszego powiększenia, aby ustawić ostrość.
    Uwaga: Ten protokół opisuje użycie lunety z obiektywami 1,5x i 10x oraz zakresem zoomu od 3,5 do 45 (tabela materiałów).
  3. Oceń zwierzęta, skupiając się na każdym dołku osobno, zaczynając od dołka 1, i przesuwaj się w dół płytki.
    Uwaga: Zawsze zaczynaj od oceny kontroli. Na przykład pozorowana (pusty wektor) kontrola negatywna (bakterie RNAi HT115 (patrz referencje17,21) bez lub z niepowiązaną insercją genu) i odpowiednie kontrole pozytywne, np. w tym ekranie interakcji, erm-1 RNAi (hamuje fenotyp ERM-1 [++]) i sma-1 / spektryna RNAi (wzmacnia fenotyp kanału ERM-1 [++]).
  4. Najpierw zbadaj ogólne fenotypy widoczne w jasnym świetle (na przykład: Let/lethal, Clr/clear, Emb/embrionalny lethal, Ste/sterile, Unc/uncoordinated, Dpy/dumpy itp.), określ ilościowo fenotyp, licząc całkowitą liczbę zwierząt i liczbę zwierząt z fenotypem, zapisz liczby (patrz Tabela 4).
    Uwaga: W przypadku knockdownów genów powodujących defekty, które mogą wpływać na ocenę fenotypów kanałów (np. Emb, Ste), rozważ powtórzenie eksperymentu z warunkowym, postembrionalnym RNAi (patrz artykuł towarzyszący procedurom3).
  5. Po drugie, zbadaj fenotypy kanału wydalniczego w świetle fluorescencyjnym, oceń ilościowe fenotypy (np. długość kanału, szerokość światła, torbiele), zapisz liczby i opisz fenotypy na arkuszu punktacji (patrz Tabela 4, Rysunek 5).
    Uwaga: Większe powiększenie z zakresem zoomu jest wymagane do oceny bardziej subtelnych fenotypów kanałów. Poruszaj się tam i z powrotem między małym i dużym powiększeniem, aby dokładnie ocenić długość i szerokość kanału oraz każdy inny fenotyp morfogenezy kanału. W celu oceny ilościowej lub półkwantyfikacji prostych fenotypów należy policzyć 100 zwierząt (np. L4 w tym docelowym badaniu przesiewowym RNAi; fenotypy: długość kanału 1/4, 1/2, 3/4 i pełne przedłużenie kanałów tylnych oraz średnica światła kanałów tylnych, małe torbiele (< 1/3 szerokości zwierzęcia), duże torbiele (> 1/3 szerokości zwierzęcia); patrz tabela 4).
  6. Uzyskanie obrazów dominujących fenotypów od co najmniej 3 różnych zwierząt za pomocą zamontowanej na mikroskopie kamery cyfrowego urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) i odpowiedniego oprogramowania do obrazowania (patrz tabela materiałów)
    1. Aby uzyskać obrazy, najpierw włącz aparat, włącz podłączony komputer, kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania do przechwytywania obrazu, ręcznie ustaw ostrość obszar płytki ślimakowej w małym powiększeniu i otwórz migawkę aparatu.
    2. Kliknij ikonę "podglądu na żywo" w oprogramowaniu do przechwytywania obrazu na ekranie komputera, aby wyświetlić robaki na ekranie komputera, ręcznie dostosuj ostrość, aby wyraźnie zwizualizować robaki na ekranie, a następnie kliknij ikonę "snap", a następnie kliknij ikonę "zapisz".
      Uwaga: Zwierzęta będą poruszać się szybciej w świetle fluorescencyjnym, dlatego trzymaj jedną rękę na myszy komputerowej w gotowości, a drugą przesuwaj płytkę w obszar zainteresowania. Następnie natychmiast kliknij ikonę "snap", aby uzyskać obraz. Zwykle udaje się uzyskać dobry obraz przy kilku próbach.
    3. Zapisz pozyskane obrazy z odpowiednią nazwą pliku (w tym nazwą szczepu, nazwą klonu RNAi i datą).
      Uwaga: Szybciej poruszające się robaki typu dzikiego z cienkimi i długimi kanałami są trudniejsze do zobrazowania niż mutanty. Mutanty z kanałami torbielowatymi i/lub innymi fenotypami prawdopodobnie poruszają się powoli, co ułatwia obrazowanie. Plazmidy markerowe, takie jak Rol, mogą być przydatne do obrazowania, utrzymując zwierzęta "na miejscu", a nie poruszając się do przodu, a także mogą zapewnić lepszy widok na fenotyp, gdy zwierzę toczy się wokół siebie.

4. Obrazowanie kanału wydalniczego C. elegans w wysokiej rozdzielczości za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej

  1. Montaż żywych zwierząt
    1. Umieść niewielką ilość tłuszczu lub wazeliny na czubku bawełnianego wacika lub na czubku palca wskazującego i rozprowadź smar, aby wytworzyć ultracienki okrąg o średnicy ~ 6–8 mm na środku czystego szklanego szkiełka.
    2. Umieścić 6 μl 5% roztworu lidokainy (środek znieczulający) do koła za pomocą mikropipety.
      Uwaga: Podstawowy roztwór lidokainy można przygotować przez rozpuszczenie proszku lidokainy w wodzie. Rozcieńczyć do 5% za pomocą M9 buffer19 (Tabela materiałów). Bardzo ważne jest, aby w analizie kanału wydalniczego uniknąć powszechnych roztworów unieruchamiających (takich jak azydek sodu), które powodują pękanie torbieli i indukują fenotypy kanałów.
    3. Wybierz kilka zwierząt z płytki RNAi i umieść je w roztworze lidokainy, wprowadzając do roztworu robaka pick19.
      Uwaga: Najlepiej wybierać zwierzęta specyficzne dla danego etapu, które ułatwią równomierne dosiadanie dzięki jednolitej grubości. Zwierzęta mogą być wstępnie wybrane pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    4. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm na szkiełku podstawowym i pozwól mu delikatnie osiąść na kółku smaru.
      Uwaga: Nie należy wywierać żadnego fizycznego nacisku na szkiełko nakrywkowe, które może uszkodzić morfologię kanału, szczególnie u mutantów lub robaków traktowanych RNAi z kanałem i ewentualnie innymi fenotypami. Dlatego ważne jest, aby unikać grubego koła smaru; Idealnie byłoby, gdyby zwierzęta były delikatnie umieszczane między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
    5. Napisz nazwę próbki na matowej stronie szkiełka podstawowego. Natychmiast zabierz szkiełko do mikroskopu konfokalnego w celu analizy fenotypu kanału i uzyskania obrazów.
      Uwaga: Opóźnienia mogą spowodować uszkodzenie torbieli kanałów lub zmianę morfologii światła kanału.
  2. Pozyskiwanie obrazów konfokalnych
    1. Umieść szkiełko na stoliku na próbki mikroskopu konfokalnego, ustaw ostrość robaki w małym powiększeniu (10X).
    2. Przeglądaj i wybieraj zwierzęta pod obiektywami 60X i/lub 100X, badaj fenotypy komórkowe i subkomórkowe kanału wydalniczego, np. kształt i średnicę światła, rozmiar i kształt torbieli; lub składniki subkomórkowe oznaczone do analizy, np. błona wierzchołkowa/świetlna, błona podstawna, cytoplazma, pęcherzyki endosomalne i kanalikowe, inne organelle (patrz Dyskusja, Rysunek 2 i Rysunek 4).
    3. Zdobądź obrazy określonego fenotypu, który Cię interesuje.
      Uwaga: Niniejszy protokół opisuje użycie laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (Tabela materiałów). Aby rozdzielić składniki subkomórkowe w cienkich kanałach wydalniczych C. elegans, wymagane są obiektywy o większym powiększeniu (od 60X do 100X). Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem może być używany do pozyskiwania obrazów poklatkowych, ale zapewnia mniejszą konfokalność (patrz Dyskusja).
      1. Aby uzyskać obrazy konfokalne, włącz komputer, kliknij dwukrotnie oprogramowanie mikroskopu konfokalnego i wybierz laser, klikając określoną ikonę lasera.
      2. Kliknij ikonę "skanuj", aby wyświetlić skupionego robaka na ekranie komputera, dostosuj intensywność lasera za pomocą oprogramowania i ponownie kliknij ikonę "skanuj", aby zatrzymać skanowanie, a następnie kliknij ikonę "przechwyć", aby przechwycić obraz, a następnie kliknij ikonę "zapisz".
      3. Zapisz obrazy z odpowiednią nazwą pliku i dołącz nazwę klonu RNAi, nazwę szczepu i datę.
        Uwaga: Obrazy mogą być uzyskiwane jako pojedyncze i wielokrotne sekcje (np. 10–15 sekcji wzdłuż osi z). Przekroje umożliwiają wizualizację 3D. Pobieraj obrazy projekcyjne i zapisuj je oddzielnie w razie potrzeby (w zależności od mikroskopu). Aby uzyskać optymalną rozdzielczość, użyj ustawień lasera o niskim wzmocnieniu, nie otwieraj zbyt mocno otworu i dodaj kilka średnich na obraz (zobacz referencje23,24 w celu ogólnego omówienia obrazowania konfokalnego). Należy pamiętać, aby rejestrować obrazy z jasnością poniżej poziomu nasycenia, aby w razie potrzeby można je było modyfikować za pomocą oprogramowania do obrazowania (najlepiej używać niezmodyfikowanych obrazów).
      4. Uzyskuj obrazy podwójnie lub wielokrotnie znakowanych kanałów (np. zielonych, czerwonych i niebieskich) w ten sam sposób, klikając wiele ikon lasera, ale użyj skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć krwawienia między kanałami (krytyczne dla badań kolokalizacyjnych).
        Uwaga: Może być konieczne uwzględnienie czasu potrzebnego na skanowanie sekwencyjne (co również skutkuje odpowiednim wzrostem wybielania zdjęć) i zmodyfikowanie ustawień skanera. Nie skanuj zwierząt z jednego szkiełka maksymalnie przez 30 minut, aby uniknąć niespecyficznego wpływu na morfologię kanałów. Zamontuj nowy slajd, jeśli wymagane jest dłuższe skanowanie.
      5. Uzyskaj odpowiednie obrazy optyki interferencyjnej różnicowej (DIC)/Nomarskiego, szczególnie w przypadku ilościowego określania długości kanału i średnicy światła w odniesieniu do długości i średnicy ciała robaka. Nakładaj obrazy fluorescencji i Nomarskiego, klikając ikonę "nakładki", aby zademonstrować punkty orientacyjne (Rysunek 1D i Rysunek 4A–D).
    4. W celu ilościowego określenia zmierz intensywność fluorescencji znakowanego składnika będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą oprogramowania ImageJ25 (Rysunek 5C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania kanałów wydalniczych C. elegans do wizualnej i molekularnej analizy jednokomórkowej tubulogenezy oraz wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła w pojedynczej komórce. Podczas swojego wydłużania się od etapu środkowej embriogenezy aż do dorosłości, cztery kanały wydalnicze stale rozszerzają swoje błony bazolateralne i apikalne/światłowe wraz z kanalikowym i endosomalnym systemem endomembranowym, stanowiąc unikalny model dla analizy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wszechstronność genetyczna C. elegans, przejrzystość, prosty plan ciała i niezmienna linia komórkowa sprawiają, że jest to doskonały model do analizy morfogenezy. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe manipulacje genetyczne i badania obrazowe, aby wykorzystać kanały wydalnicze C. elegans o grubości 2 mikronów do badania biogenezy światła spolaryzowanej błony i wewnątrzkomórkowego w pojedynczej rurce komórkowej.

Etykietowania
Kanały wyd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy M. Buechnerowi (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, Nowy Jork, USA) oraz Caenorhabditis Genetics Center, finansowanemu przez National Institutes of Health, Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Prace te były wspierane przez granty NIH GM078653, MGH IS 224570 i SAA 223809 dla V.G.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klonowanie
Plasmid pPD95.75AddgeneCat. Nr 37464
Zestaw do PCRQiagenKat. Nr 27106
Zestaw do podwiązywaniaNew England BiolabsKat. Nie. E2611L
Marker DNAThermo ScientificCat. Nie. SM1331
Klasa DNA agarozyFisher ScientificCat. Nie. BP164-100
Kompetentne komórkiNew England BiolabsKat. Nie. C2987H
TrisFisher ScientificCat. Nie. BP154-1
EDTASigmaNr kat. Nie. ED-1KG
Kwas octowyFisher ScientificCat. Nie. A38S-500
Bromek etydynyFisher ScientificCat. Nie. BP1302-10
Equipments
PCR machine MJ ResearchKat. Nie. PTG-200 
WirówkaEppendorf kot. No. 5415C
Kąpiel wodnaPrecyzyjna Naukowa kot. Nr 666A3 
Żelowy przyrząd do bieganiaFisher ScientificCat. Nr 09-528-165
Zasilacz do pracyżelowej Fisher ScientificCat. Nr 45-000-465
Obrazownik molekularny  Żel Doc XR SystemBio-RadKat. Nr 1708195EDU
Spektrofotometr NanodropThermo ScientificKat. Nie. ND1000
C. elegans powiązany11patrz odniesienie19 dla standardowych procedur hodowli i konserwacji C. elegans.
LB Medium i płyty22patrz referat19 dla protokołów.
Trypton Acros OrganicsNr kat. 611845000
Ekstraktdrożdżowy BD BiosciencesNr kat. 212750
NaClSigmaNr kat. S7653
Bacto Agar BD BiosciencesNr kat. 214040
AmpicillinSigmaNr kat. A0116
TetracyklinaFisher ScientificNr kat. BP912
M9 Medium22patrz referat19 dla protokołów.
NaClSigmaNr kat. S7653
KH2PO4SigmaNr kat. P0662
Na2HPO4SigmaNr kat. S7907
MgSO4SigmaNr kat. M2773
NGM 22patrz Reference19 dla protokołów.
NaClSigmaNr kat. S7653
Pepton BD BiosciencesNr kat. 211677
Trypton Acros OrganicsNr kat. 611845000
Bacto Agar BD BiosciencesNr kat. 214040
MgSO4SigmaNr kat. M2773
CaCl2SigmaNr kat. C3881
Cholesterol SigmaNr kat. C8667
K2HPO4 SigmaNr kat. P3786
KH2PO4SigmaNr kat. P0662
RNAi plates33patrz sygnatura 21 dla protokołów.
NaClSigmaNr kat. S7653
Pepton BD BiosciencesNr kat. 211677
Trypton Acros OrganicsNr kat. 611845000
Bacto Agar BD BiosciencesNr kat. 214040
MgSO4SigmaNr kat. M2773
CaCl2SigmaNr kat. C3881
Cholesterol SigmaNr kat. C8667
K2HPO4 SigmaNr kat. P3786
KH2PO4SigmaNr kat. P0662
IPTG US BiologicznyNr kat. I8500
CarbenicillinFisher ScientificNr kat. BP2648
NaOHFisher Scientific Nrkat. SS266-1
Podchloryn soduFisher ScientificNr kat. 50371500
Bacteria
OP50 bacteriaCGC
HT115 bacteriaCGC
Biblioteki RNAi obejmujące cały genom
Biblioteka karmienia RNAi w całym genomie Ahringer (ref21,58,59)Źródło: BioScience
C. elegans ORF-RNAi biblioteka żywieniowa (ref60)Źródło: BioScience
Imaging related
LidocaineMP Biomedicals,LLGCat. no. 193917
Materiały
Smar próżniowy SilikonBeckmanNr kat. 335148
Szkiełka mikroskopowe Fisher ScientificNr kat. 4448
Płytka do hodowli tkankowej, 6 dołków Corning Inc.Nr kat. 08-772-33
Equipment
SMZ-U mikroskop preparacyjny SZX12
wyposażony w przystawkę do fluorescencji stereo o dużej mocy (Kramer Scientific), kamerę CCD z oprogramowaniem do przechwytywania Q i świetlówką X-Cite (Photonic Solutions).
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny TCS SL (Leica Microsystem)
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny C2 zamontowany na odwróconym mikroskopie ECLIPSE Ti-E (Nikon)
(Olympus),

Bibliografia

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35(2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).
  16. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  17. Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  18. Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  19. Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  20. Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  21. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  22. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  23. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. (2006).
  24. Hibbs, A. R. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. US. (2004).
  25. Bankhead, P. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  26. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  27. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  29. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  30. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  31. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  32. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  34. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  35. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  36. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  37. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  38. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449(2015).
  39. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  40. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  41. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  42. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  43. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  44. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  49. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  50. GeneMANIA. , http://genemania.org/ (2017).
  51. AceView. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ (2017).
  52. iHOP. , http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / (2017).
  53. Saccharomyces Genome Database. , http://www.yeastgenome.org (2017).
  54. Flybase. , http://www.flybase.org (2017).
  55. Mouse Genome Database. , http://www.informatics.jax.org (2017).
  56. Human Genome Database. , http://www.gdb.org (2017).
  57. BLAST. , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).
  58. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  59. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  60. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Jednokomórkowa tubulogenezaznakowanie fuzją GFPobrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnejfluorescencyjna mikroskopia sekcyjnagenerowanie zwierząt transgenicznychanaliza oceny fenotypowej
Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.