Horizontal Whole Mount: nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubych, trójwymiarowych przekrojów tkanek skóry

Summary

Ta praca przedstawia nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubej, trójwymiarowej analizy przekroju poprzecznego tkanki, który umożliwia pełne wykorzystanie modalności obrazowania konfokalnego. Protokół ten zachowuje antygenowość i stanowi solidny system do analizy histologii skóry i potencjalnie innych typów tkanek.

Abstract

Przetwarzanie interesującej tkanki w celu wygenerowania mikroskopijnego obrazu, który wspiera argument naukowy, może być wyzwaniem. Akwizycja wysokiej jakości obrazów mikroskopowych nie jest całkowicie zależna od jakości mikroskopu, ale także od metod przetwarzania tkanek, które często obejmują wiele krytycznych działań lub etapów. Co więcej, typy komórek mezenchymalnych w skórze i innych tkankach stanowią nowe wyzwanie dla przygotowania tkanek i obrazowania. Tutaj przedstawiamy kompletny proces, od pobrania tkanek po mikroskopię. Nasza technika, zwana "poziomym mocowaniem całościowym", to taka, w której nowicjusze mogą szybko osiągnąć biegłość i która pozwala na zachowanie i wykrycie antygenu w odcinkach o grubości 60-300 μm wyciętych za pomocą kriostatu. Przekroje o tej grubości zapewniają lepszą wizualizację mikroarchitektury tkanek w środowisku trójwymiarowym. Ponadto protokół zachowuje komórki mezenchymalne w sposób, który poprawia jakość obrazu w porównaniu ze standardowymi skrawkami kriostatu lub parafiny, zwiększając w ten sposób skuteczność i wiarygodność barwienia immunologicznego. Wierzymy, że ten protokół przyniesie korzyści wszystkim laboratoriom, które wizualizują skórę i ewentualnie inne tkanki i narządy.

Introduction

Rewolucja w mikroskopijnym sprzęcie do obrazowania dostarcza wyrafinowanych instrumentów do obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Jednak w przypadku uzyskania mikroskopowego obrazu pełnego trójwymiarowego (3D) przekroju poprzecznego tkanki, przygotowanie próbki stanowi poważne wyzwanie i może być czynnikiem ograniczającym w określaniu jakości obrazu. Każdy oddzielny etap zasługuje na staranne rozważenie w celu zachowania morfologii tkanek i antygenowości docelowych białek, zminimalizowania artefaktów wywołanych przetwarzaniem i maksymalizacji końcowej jakości obrazu. Na przykład tradycyjna analiza skóry wymaga obrazu z widokiem naskórka i skóry właściwej, z mieszkami włosowymi, które są odpowiednio zorientowane, co pozwala na anatomiczną analizę udziału kompartmentów komórek macierzystych w homeostazie skóry^1,2. Wymaga to dokładnej koncentracji na tym, w jaki sposób skóra jest osadzona i podzielona na sekcje. Co ważne, mieszki włosowe mogą być grubsze niż 100 μm, co znacznie przewyższa standardową grubość parafiny lub zamrożonego przekroju, co skutkuje niższym standardem analizy w porównaniu z całymi mocowaniami lub grubymi przekrojami ^3,4,5.

Razem wzięte, każdy etap przygotowania próbki do analizy mikroskopowej jest krytycznym wyznacznikiem, który wpłynie na analizę obrazu. W tym miejscu przedstawiono nowatorski protokół przetwarzania do analizy grubych przekrojów poprzecznych tkanek 3D, który nazywamy "poziomym mocowaniem całego ciała". Protokół w wysokim stopniu zachowuje antygenowość i umożliwia pełne wykorzystanie grubych odcinków skóry przy użyciu standardowego sprzętu do obrazowania konfokalnego. Jest to kompletny przewodnik po wykorzystaniu skóry do przetwarzania i obrazowania grubych przekrojów tkanek, w tym pobierania tkanek i kriokonserwacji wspomaganej paraformaldehydem (PFA) (krok 1), generowania przekrojów tkanek o grubości 100 μm za pomocą kriostatu (krok 2) oraz znakowania i montażu immunofluorescencyjnego (kroki 3 i 4). Reprezentatywne wyniki porównują obrazy konfokalne dwóch różnych technik przygotowania histologicznego - klasycznej kriosekcji i grubego przekroju poprzecznego tkanek 3D - podkreślając zalety "poziomych całych mocowań" dla potencjalnego użytkownika tego protokołu.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach podlegały lokalnej aprobacie etycznej i były przeprowadzane na warunkach licencji brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.

1. Pobieranie skóry i kriokonserwacja

1. Preparaty.
   1. Przygotuj jedną 100-milimetrową naczynie hodowlane z 25 ml 4% PFA i dwie 100-milimetrowe szalki hodowlane z 25 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   2. Prostokątne krioformy typu peel-away należy wypełnić w dwóch trzecich środkiem o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.).
   3. Umieść metalową płytkę, na której kriobloki można umieścić w późniejszym etapie, w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
2. Zbieranie, utrwalanie i kriokonserwacja skóry.
   1. Przyciąć grzbietową część zwłok zwierzęcia suchą golarką elektryczną.
      UWAGA: W tym przykładzie użyto myszy typu dzikiego po urodzeniu w 21 dniu.
   2. Zbierz interesujące obszary na skórze.
      UWAGA: Grzbietowo-przyśrodkowy obszar skóry myszy (Ryc. 1a) zawiera najwyższy procent mieszków włosowych, które są równomiernie rozmieszczone i wyrównane, co pozwala na optymalną orientację do cięcia. Usunięcie leżącej pod spodem tkanki nieskórnej nie jest konieczne, ale można je wykonać w razie potrzeby.
   3. Zebraną skórę należy przyciąć na prostokątne kawałki o odpowiedniej wielkości, aby zmieściły się na dnie krioformy, biorąc pod uwagę kierunkowy wzrost ziarna mieszków włosowych.
      UWAGA: Mniejsze plasterki skóry mogą być łatwiejsze w obsłudze dla nowicjuszy, ponieważ są mniej podatne na plątanie się podczas procesu inkubacji i montażu. Pokazany tutaj przykład to obszar skóry grzbietowej o wymiarach ~1^cm2, który mieści się w kriomoldzie o wymiarach 22 x 30 x 20 mm (Rysunek 2a).
   4. Utrwal skórę w temperaturze pokojowej w 25 ml 4% PFA przez 10-30 minut, w zależności od grubości próbek skóry (Rysunek 1b).
   5. Umyj próbki skóry dwa razy w 25 ml PBS przez co najmniej 5 minut każda (Rysunek 1b).
   6. Próbki skóry należy przetrzeć ręcznikiem papierowym, aby ostrożnie osuszyć tkankę z nadmiaru PBS, co może spowodować krystalizację podczas procesu zamrażania i wpłynąć na wyniki kriosekcji.
      UWAGA: Standardowy gradient sacharozy nie jest wymagany. Może to jednak zostać również włączone do protokołu według uznania użytkownika.
   7. Należy zwrócić uwagę na orientację mieszków włosowych dla każdej próbki skóry. Użyj mikroskopu preparacyjnego w celu uzyskania pomocy wizualnej (szczególnie dla każdego, kto wykonuje protokół po raz pierwszy). Włożyć próbkę skóry do kriomoldu wypełnionego O.C.T. i zrównoważyć wszystkie obszary skóry za pomocą O.C.T., usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza przyczepione do powierzchni przyciętych włosów za pomocą kleszczy (rysunki 2a i 2b).
   8. Dociśnij skórę do dolnej części bloku wypełnionego OCT tak, aby leżała równo z dnem.
      UWAGA: Skóra może być zorientowana w dowolnym kierunku, o ile ziarno mieszka włosowego jest zaznaczone dla prawidłowych procedur cięcia. Krioformy zostaną ponownie zorientowane, gdy bloki zostaną przymocowane do kriostatu w celu kriosekcji. Zaznacz orientację mieszków włosowych na krioformie, ponieważ ten krok określa późniejszą orientację cięcia kriostatu.
   9. Przenieś kriobloki na metalową płytkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby uniknąć unoszenia się i przemieszczenia tkanki.
   10. Monitoruj proces zamrażania, aby utrzymać orientację skóry na dnie krioformy, ponieważ niewidoczne pęcherzyki powietrza mogą spowodować unoszenie się skóry na powierzchnię krioformy.
       UWAGA: Krioformy z zamrożoną tkanką mogą być przechowywane przez ponad rok w temperaturze -80 °C i mogą być ponownie wykorzystane do dodatkowych sekcji.

Rysunek 1. Zbiór i utrwalanie skóry myszy.
a) Tkanka skórna została pobrana z grzbietowo-przyśrodkowej części zwłok zwierzęcia. Mieszki włosowe w tym obszarze są równomiernie rozmieszczone i wyrównane, dzięki czemu pozwalają na optymalną orientację podczas cięcia, jak wskazują strzałki. (b) Po wycięciu kwadratów o odpowiedniej wielkości, która mieści się w krioformie, tkankę skórną utrwalono w 4% PFA przez 15 minut i przemyto dwukrotnie w PBS przez 5 minut każdy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przekrój grubej tkanki

1. Przygotowanie i orientacja tkanki do zamontowania na kriostacie.
   1. Przygotuj naczynie hodowlane o średnicy 100 mm z 15 ml PBS. Umieść go w łatwo dostępnym miejscu na kriostacie. Ponadto przygotuj 12-dołkową płytkę z 2,5 ml PBS na studzienkę; Oznaczyć etykietę zgodnie z próbkami do długotrwałego przechowywania skrawków w temperaturze 4 °C. Do obsługi skrawków używać kleszczy.
   2. Ustaw temperaturę kriostatu na -20 °C.
      UWAGA: Temperatura może mieć wpływ na cięcie, ale dobrym przewodnikiem jest rozpoczęcie od -20 °C.
   3. Aby uzyskać skrawki o grubości około dwóch mieszków włosowych, wyreguluj kriostat tak, aby obciąć sekcje o grubości 150 μm.
      UWAGA: Grubość przekroju może być zmieniana, w zależności od potrzeb użytkownika i ograniczeń mikroskopu, który będzie używany do analizy.
      UWAGA: Orientacja próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania odcinków skóry z mieszkami włosowymi w odpowiedniej orientacji. Osiąga się to poprzez odpowiedni montaż na bloku kriostatu. Upewnij się, że płaszczyzna przekroju jest równoległa do orientacji mieszków włosowych (Rysunek 2c). Jak wspomniano wcześniej, prawidłowa orientacja płaszczyzny przekroju w próbce skóry jest kluczowym krokiem do określenia jakości obrazów, które zostaną uzyskane w późniejszym kroku.

Rysunek 2. Osadzanie, krioprezerwacja i sekcjonowanie.
oraz Oznaczenie kierunku mieszków włosowych (HF) na krioformie, wskazywanego czarnymi strzałkami, jest ważne dla prawidłowej orientacji podczas kriosekcji. (b) Płaszczyzna przekroju musi być wyrównana z orientacją mieszków włosowych, aby wytworzyć sekcje, w których cała długość mieszków włosowych pozostaje nienaruszona. (c) Sekcje zostały przycięte zgodnie z orientacją mieszków włosowych, która była wskazywana przez czarne strzałki na krioformie. (d) Grube przekroje tkanek pobrano za pomocą metalowych kleszczy i (e) przeniesiono do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego 1x PBS. (f) W temperaturze pokojowej PBS rozpuszcza związek O.C.T., który otacza grube przekroje poprzeczne tkanek, jak wskazują białe strzałki. Sekcje następnie swobodnie unoszą się w PBS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Kriosekcja.
   1. Wytnij sekcję za pomocą kriostatu. Użyj kleszczy, aby zebrać O.C.T., który zawiera osadzony kawałek skóry (Rysunek 2d).
      UWAGA: Użyj kriostatu, który umożliwia niezależny ruch i regulację wzdłuż osi X, Y i Z w celu optymalnego pozycjonowania próbki. Pozwala to na generowanie idealnie dopasowanych przekrojów tkankowych.
   2. Przenieść fragment z kriostatu do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm wypełnionego PBS i kontynuować z następnym plasterkiem. Nie pobieraj próbek na szkiełku (Rysunek 2e).
      UWAGA: W temperaturze pokojowej PBS rozpuści O.C.T., pozostawiając plastry skóry, które są łatwe do obsługi za pomocą kleszczy (Rysunek 2f).
      UWAGA: Świeży PBS może być potrzebny w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm po rozpuszczeniu wielu odcinków tkanek o grubości 100 μm i można go odpowiednio zmienić.
   3. Użyj kleszczyków, aby przenieść pływające sekcje skóry do prawidłowo oznakowanej studzienki na 12-dołkowej płytce wypełnionej 2,5 ml PBS (Rysunek 3a, po lewej).
      UWAGA: W temperaturze 4 °C próbki można przechowywać przez co najmniej dwa dni. W celu długotrwałego przechowywania bloków O.C.T. zawierających skórę po pocięciu, należy uszczelnić powierzchnię cięcia kroplą świeżego O.C.T. Po zamrożeniu kropli O.C.T. owiń zużyty blok O.C.T. w parafilm i umieść go z powrotem w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

3. Znakowanie immunofluorescencyjne.

1. Przygotuj bufor PB (PBS uzupełniony o 0,5% odtłuszczonego mleka w proszku, 0,25% żelatyny ze skór ryb i 0,5% Triton X-100) co najmniej 2 godziny wcześniej, jak opisano wcześniej⁵,
   UWAGA: Azydek sodu można dodać do buforu PB w celu zachowania przeciwciał przed wielokrotnym użyciem buforu barwiącego.
2. Oznaczyć 1,5 ml probówek do mikrowirówek i dodać 500 μl buforu PB na probówkę. Ostrożnie użyj kleszczyków, aby przenieść plastry skóry z PBS do oddzielnych probówek zawierających bufor PB do blokowania (Rysunek 3a, po prawej). Upewnij się, że wszystkie plasterki skóry są całkowicie zanurzone. Umieść probówki do mikrowirówek na huśtawce z prędkością nie wyższą niż 10 oscylacji na minutę, które nie powinny naruszyć integralności tkanki, na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby prędkość na huśtawce nie przekraczała 10 oscylacji na minutę, ponieważ spowoduje to splątanie.
   1. Chociaż możliwe jest dodanie więcej niż jednego plasterka na probówkę mikrowirówkową, aby zaoszczędzić przeciwciała, umieść tylko jeden plasterek na probówkę. Aby zmniejszyć zużycie przeciwciał, użyj objętości 250 μL.
      UWAGA: W razie potrzeby zastąp probówki do mikrowirówek np. płytkami 96-dołkowymi. Jednak umieszczenie grubych przekrojów tkanek w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml pozwala na najbardziej efektywną penetrację przeciwciał do tkanki ze względu na zwiększone zaburzenia płynu.
3. Oznaczyć oddzielne probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml dla każdego wycinka skóry i dodać 500 μl buforu PB oraz odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego. Po 1 godzinie blokowania przenieś plastry skóry do świeżo przygotowanych probówek zawierających przeciwciała. Plastry inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   UWAGA: W tym przykładzie użyto następujących przeciwciał pierwszorzędowych: FITC szczura anty-ludzkiego CD49f w stężeniu 1:50 i kozia integryna alfa 8 przeciwko myszy/szczurowi w stężeniu 1:100.
4. Następnego dnia przygotuj dwie oddzielne probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierające 500 μl PBS na próbkę. Umyj plastry skóry dwa razy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Przygotować oddzielne probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierające 500 μl buforu PB o odpowiednim stężeniu odpowiednich przeciwciał drugorzędowych i 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI).
   UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe użyte w tym przykładzie to Alexa Fluor 488 anty-szczurzy IgG i Alexa Fluor 555 anty-kozi IgG osła w stężeniu 1:500. DAPI stosowano w stężeniu 1:100.
6. Ostrożnie przenieść próbki skóry do buforu PB, który zawiera przeciwciało drugorzędowe i DAPI, a następnie inkubować plastry skóry w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z niską prędkością na rotatorze lub wytrząsarce.
7. Przechowywać plastry w temperaturze 4 °C w buforze PB zawierającym przeciwciało drugorzędowe i DAPI przez okres do czterech dni i ewentualnie dłużej, jeśli do PBS dodaje się azydek sodu.

Rysunek 3. Znakowanie immunofluorescencyjne i montaż.
a) Pływające przekroje tkanek mogą być przechowywane w płytkach 12-dołkowych przez co najmniej dwa dni w temperaturze 4 °C. Przed znakowaniem immunofluorescencyjnym (IF) należy przenieść interesujące nas przekroje tkanek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających bufor PB w celu zablokowania, jak wskazano strzałką 1. W przypadku etykietowania IF należy postępować zgodnie z wieloetapową procedurą opisaną w kroku 3. Każda część kroku 3 wymaga starannego przeniesienia przekrojów tkanek do świeżo przygotowanych probówek mikrowirówek zawierających pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, drugorzędowy roztwór przeciwciała lub bufor do mycia, który jest oznaczony strzałką 2. (b) Po znakowaniu IF, przekroje poprzeczne tkanek są rozplątywane i spłaszczane w kropli glicerolu, przy pomocy mikroskopu preparacyjnego. (c) Gdy przekrój poprzeczny tkanki zostanie całkowicie spłaszczony na spodzie szkiełka nakrywkowego, do zamontowania przekroju używa się zwykłego szkiełka mikroskopowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Montaż do wizualizacji mikroskopowej

1. Przed obrazowaniem należy przenieść plastry skóry do oddzielnych probówek mikrowirówkowych zawierających 500 μl PBS w celu wypłukania przeciwciał drugorzędowych i DAPI.
2. Użyj pipety o pojemności 1 000 μl, ale odetnij pierwsze 0,5 cm końcówki pipety, aby umożliwić prawidłowe pipetowanie glicerolu o dużej lepkości. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 50 mm na ciemnym tle pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 3b).
3. Dodać jedną kroplę 100% glicerolu na szkiełko nakrywkowe (Rysunek 3b). Przenieś plasterek skóry z probówki do mikrowirówki na kroplę glicerolu. Użyj mikroskopu preparacyjnego i spiczastych kleszczy, aby ostrożnie odwinąć zwinięte plastry skóry.
   UWAGA: Gdy plasterek unosi się w kropelce glicerolu, można go rozplątać, nakłaniając naturalną skłonność tkanki do powrotu do normalnego kształtu. Nie zmuszaj do nienaturalnego prostowania plastra, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki.
4. Zamocować tkankę, gdy cała długość odcinka skóry jest prawidłowo zorientowana i spłaszczona na szkiełku nakrywkowym; użyj zwykłego szkiełka mikroskopowego. Ten krok jeszcze bardziej wyprostuje plasterek skóry.
   UWAGA: Unikaj uwięzienia w powietrzu (Rysunek 3c).
5. Zobrazuj skrawki skóry zamontowane na glicerolu w ciągu najbliższych dwóch dni.
   UWAGA: Długotrwałe przechowywanie negatywnie wpłynie na jakość tkanek i obrazowania. W tym przykładzie wszystkie obrazy zostały uzyskane za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego przy użyciu obiektywu 20x.

Results

Aby podkreślić zalety naszej techniki, porównaliśmy naszą technikę przekroju poprzecznego grubych tkanek 3D, "poziome mocowanie całości", do klasycznych zamrożonych sekcji. Klasyczne zamrożone sekcje zostały wycięte zgodnie z wcześniejszym opisem⁵. Aby zapewnić wizualną strukturę naskórka na obrazach mikroskopowych, przeprowadziliśmy barwienie immunologiczne integryny alfa-6 (Itga6), która jest składnikiem zakotwiczającym komórki naskórka w leżącej poniżej błonie podstawnej⁶. Oznaczyliśmy również mięsień arrector pili (APM), który jest odpowiedzialny za piloerekcję (znaną również jako "gęsia skórka"), integryną alfa-8⁷. W klasycznych zamrożonych sekcjach większość mieszków włosowych uwidocznionych za pomocą Itga6 nie została podzielona na całą długość, generując głównie niekompletne mieszki włosowe na sekcję, w porównaniu z poziomymi całymi mocowaniami (Rysunek 4a-4d). Grube przekroje tkanek umożliwiają uzyskanie większej liczby warstw stosu Z w porównaniu z konwencjonalnymi przekrojami 10 μm, co pozwala na uzyskanie pełniejszego obrazu 3D. Staje się to jeszcze bardziej widoczne, gdy bada się integralność APM, które są związane z mieszkami włosowymi i leżącą nad nimi błoną podstawną. W klasycznych kriosekcjach zdecydowana część APM była frakcjonowana (Rysunek 4a-4d). Dodatkowo, integralność tkankowa przedziału podskórnego jest zachowana w poziomych całych mocowaniach, w porównaniu do niszczenia adipocytów, gdy kriosekcje są przymocowane do ciepłych szkiełek szklanych, co jest dobrze znanym artefaktem zamrażania i rozmrażania (Rysunek 4a-b, porównaj regiony podskórne)8.

Rysunek 4. Poziome mocowanie całego ciała w porównaniu z klasyczną kriosekcją.
(a) Klasycznie uzyskane kriosekcje skóry o grubości 10 μm i (b) przekroje tkanek 3D o grubości 100 μm znakowano integryną alfa-6 (Itga6) i integryną alfa-8 (Itga8) w celu uwidocznienia odpowiednio przedziału naskórkowego i mięśni arrector pili. Obrazy przekrojów grubych tkanek są reprezentowane jako maksymalne rzuty dużego stosu Z. Białe ramki wskazują obszary, które są powiększone, wyświetlane w (c) klasycznej i (d) poziomej całej sekcji montażowej. (e) Nienaruszone mieszki włosowe i (f) nienaruszone mięśnie arrector pili oznaczono ilościowo zarówno w klasycznych, jak i poziomych odcinkach całego montażu. Podziałka skali wskazuje 100 μm. Dane są reprezentowane jako średni ± błąd standardowy średniej (SEM). Określono ilościowo jeden przekrój na kontrpróbę biologiczną (n=3). Niesparowany test t *P<0,05, ***P<0,0005. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym miejscu przedstawiamy technikę "poziomego montażu całościowego", która ma kilka zalet w porównaniu z klasycznymi sekcjami mrożonymi. Jedną z zalet naszej techniki jest to, że można ją łatwo wykonać za pomocą standardowego sprzętu histologicznego i mikroskopu konfokalnego. Po drugie, integralność tkanek jest zachowana w lepszy sposób w porównaniu ze standardowymi kriosekcjami. Na przykład adipocyty w warstwie podskórnej (tj. białe adipocyty skórne (DWAT)⁾⁹ są poważnie zakłócone w standardowych kriosekcjach, co uniemożliwia badanie tkanek obciążonych tłuszczem. Nasza technika pozwala na pełną analizę adipocytów w tej warstwie i może być dostosowana do innych tkanek o wysokiej zawartości adipocytów. Co więcej, pozwala to na lepsze wykrywanie komórek mezenchymalnych w badaniach śledzenia linii ^2,10.

Standardowe kriosekcje, ze względu na swoją naturę, nigdy nie mogą ujawnić prawdziwych aspektów 3D tkanki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Oznacza to, że grubsze odcinki są korzystne w analizie skóry, ponieważ mieszki włosowe, a także ich podstruktury, mogą pokonywać głębokość przekraczającą standardową grubość 10 μm stosowaną w klasycznych kriosekcjach. Jesteśmy zaintrygowani, że inne tkanki, takie jak na przykład jelito i mózg, mają podobne wyzwania w odniesieniu do postrzegania tkanki jako struktury 3D 2,7,11,12,13. Co ciekawe, wykazano już, że nasza technika jest korzystna do stosowania w niektórych zastosowaniach w jelitach¹⁴. Wierzymy, że nasz poziomy protokół montażu całego ma potencjał do zastosowania do każdej innej tkanki wymagającej analizy 3D.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS			domowa
żelatyna, ze skóry ryb zimnowodnych	Sigma	G7765	250ML
Glicerol BDH	Materiały laboratoryjne	444482V
Związek OCT	Chemikalia VWR	361603E
Formy do zatapiania Peel-A-Way	Sigma	E6032-1CS	Square S-22
Beztłuszczowe mleko w proszku	Bio Podstawowa spółka z ograniczoną odpowiedzialnością	NB0669
Triton X-100	Sigma	T9284	500ML
;,6-diamidino-2-fenyloindol, dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571
FITC Rat Anti-Human CD49f	BD Pharmingen	555735
Mysz/Szczur Integryna alfa 8 Przeciwciało	R& D Systems	AF4076
Alexa Fluor 488 osioł anty-szczurzy IgG	Life Technologies	A21208
Alexa Fluor 555 osł anty-kozy IgG	Life Technologies	A21432
CryoStar NX70	Thermo Fisher Scientific
100mm Naczynia
Skalpele jednorazowe	Swann-Morton	Ref 0501
spiczaste metalowe kleszcze
1,5 ml mikroprobówki wirówkowe	VWR	211-2130
12-dołkowe płytki	Sigma	CLS3513
Mikroskop preparacyjny	Nikon
20 ul i 1000 ul Pipeta	Gilson
1000µ l Końcówka filtra XL z podziałką TipOne (sterylna)	Star Lab	S1122-1830
20 i mikro; l Skośna końcówka filtra TipOne (sterylna)	Star Lab	S1120-1810
Kołysząca się płyta
Szkiełka mikroskopowe, menzel Glaeser	Thermos Scientific	631-9483	Superfrost Plus
, Termos Scientific MENZBB024060AB Menzel Glaeser	Scientific		24 x 60 mm
konfokalny	Nikon