Ta praca przedstawia nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubej, trójwymiarowej analizy przekroju poprzecznego tkanki, który umożliwia pełne wykorzystanie modalności obrazowania konfokalnego. Protokół ten zachowuje antygenowość i stanowi solidny system do analizy histologii skóry i potencjalnie innych typów tkanek.
Artykuł metodologiczny
Horizontal Whole Mount: nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubych, trójwymiarowych przekrojów tkanek skóry
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przetwarzanie interesującej tkanki w celu wygenerowania mikroskopijnego obrazu, który wspiera argument naukowy, może być wyzwaniem. Akwizycja wysokiej jakości obrazów mikroskopowych nie jest całkowicie zależna od jakości mikroskopu, ale także od metod przetwarzania tkanek, które często obejmują wiele krytycznych działań lub etapów. Co więcej, typy komórek mezenchymalnych w skórze i innych tkankach stanowią nowe wyzwanie dla przygotowania tkanek i obrazowania. Tutaj przedstawiamy kompletny proces, od pobrania tkanek po mikroskopię. Nasza technika, zwana "poziomym mocowaniem całościowym", to taka, w której nowicjusze mogą szybko osiągnąć biegłość i która pozwala na zachowanie i wykrycie antygenu w odcinkach o grubości 60-300 μm wyciętych za pomocą kriostatu. Przekroje o tej grubości zapewniają lepszą wizualizację mikroarchitektury tkanek w środowisku trójwymiarowym. Ponadto protokół zachowuje komórki mezenchymalne w sposób, który poprawia jakość obrazu w porównaniu ze standardowymi skrawkami kriostatu lub parafiny, zwiększając w ten sposób skuteczność i wiarygodność barwienia immunologicznego. Wierzymy, że ten protokół przyniesie korzyści wszystkim laboratoriom, które wizualizują skórę i ewentualnie inne tkanki i narządy.
Wprowadzenie
Rewolucja w mikroskopijnym sprzęcie do obrazowania dostarcza wyrafinowanych instrumentów do obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Jednak w przypadku uzyskania mikroskopowego obrazu pełnego trójwymiarowego (3D) przekroju poprzecznego tkanki, przygotowanie próbki stanowi poważne wyzwanie i może być czynnikiem ograniczającym w określaniu jakości obrazu. Każdy oddzielny etap zasługuje na staranne rozważenie w celu zachowania morfologii tkanek i antygenowości docelowych białek, zminimalizowania artefaktów wywołanych przetwarzaniem i maksymalizacji końcowej jakości obrazu. Na przykład tradycyjna analiza skóry wymaga obrazu z widokiem naskórka i skóry właściwej, z mieszkami włosowymi, które są odpowiednio zorientowane, co pozwala na anatomiczną analizę udziału kompartmentów komórek macierzystych w homeostazie skóry1,2. Wymaga to dokładnej koncentracji na tym, w jaki sposób skóra jest osadzona i podzielona na sekcje. Co ważne, mieszki włosowe mogą być grubsze niż 100 μm, co znacznie przewyższa standardową grubość parafiny lub zamrożonego przekroju, co skutkuje niższym standardem analizy w porównaniu z całymi mocowaniami lub grubymi przekrojami 3,4,5.
Razem wzięte, każdy etap przygotowania próbki do analizy mikroskopowej jest krytycznym wyznacznikiem, który wpłynie na analizę obrazu. W tym miejscu przedstawiono nowatorski protokół przetwarzania do analizy grubych przekrojów poprzecznych tkanek 3D, który nazywamy "poziomym mocowaniem całego ciała". Protokół w wysokim stopniu zachowuje antygenowość i umożliwia pełne wykorzystanie grubych odcinków skóry przy użyciu standardowego sprzętu do obrazowania konfokalnego. Jest to kompletny przewodnik po wykorzystaniu skóry do przetwarzania i obrazowania grubych przekrojów tkanek, w tym pobierania tkanek i kriokonserwacji wspomaganej paraformaldehydem (PFA) (krok 1), generowania przekrojów tkanek o grubości 100 μm za pomocą kriostatu (krok 2) oraz znakowania i montażu immunofluorescencyjnego (kroki 3 i 4). Reprezentatywne wyniki porównują obrazy konfokalne dwóch różnych technik przygotowania histologicznego - klasycznej kriosekcji i grubego przekroju poprzecznego tkanek 3D - podkreślając zalety "poziomych całych mocowań" dla potencjalnego użytkownika tego protokołu.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną i przeprowadzone zgodnie z warunkami licencji Home Office rządu Wielkiej Brytanii.
1. Pobieranie i krio konserwacja skóry
- Przygotowania.
- Przygotować jedną szalkę hodowlaną 100-mm z 25 mL 4% PFA oraz dwie szalki hodowlane 100-mm z 25 mL 1x roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).
- Wypełnić prostokątne, zrywalne formy do kriotomii w dwóch trzecich związkiem O.C.T. (optimal cutting temperature compound).
- Umieścić metalową płytę, na której w późniejszym kroku zostaną umieszczone kriobloki, w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
- Pobieranie skóry, fiksacja i krio konserwacja.
- Ogolić grzbiet truchła zwierzęcia suchą maszynką elektryczną.
UWAGA: W tym przykładzie wykorzystano myszy typu dzikiego w 21. dobie po urodzeniu. - Pobrać interesujące obszary skóry.
UWAGA: Grzbietowo-przyśrodkowy obszar skóry myszy (Rysunek 1a) zawiera najwyższy odsetek równomiernie rozmieszczonych i wyrównanych mieszków włosowych, co pozwala na optymalną orientację podczas krojenia. Usunięcie tkanki niepochodzącej z skóry znajdującej się pod spodem nie jest konieczne, ale można je przeprowadzić w razie potrzeby. - Przyciąć pobraną skórę na prostokątne kawałki o odpowiedniej wielkości, aby pasowały do dna formy do kriotomii, biorąc pod uwagę kierunek wzrostu mieszków włosowych.
UWAGA: Mniejsze wycinki skóry mogą być łatwiejsze w obsłudze dla początkujących, ponieważ rzadziej plączą się podczas inkubacji i montażu. Przykład przedstawiony tutaj to obszar skóry grzbietowej o powierzchni ~1 cm2, który mieści się w formie do kriotomii o wymiarach 22 x 30 x 20 mm (Rysunek 2a). - Fiksować skórę w temperaturze pokojowej w 25 mL 4% PFA przez 10-30 min, w zależności od grubości próbek skóry (Rysunek 1b).
- Przemyć próbki skóry dwukrotnie w 25 mL PBS przez co najmniej 5 min za każdym razem (Rysunek 1b).
- Osuszyć próbki skóry ręcznikiem papierowym, aby ostrożnie usunąć nadmiar PBS z tkanki, ponieważ może on prowadzić do krystalizacji podczas procesu mrożenia i wpływać na wyniki krio sekcjonowania.
UWAGA: Standardowy gradient sacharozy nie jest wymagany. Może on jednak zostać włączony do protokołu według uznania użytkownika. - Zwrócić uwagę na orientację mieszków włosowych dla każdej próbki skóry. W celu ułatwienia wizualnego należy użyć mikroskopu stereoskopowego (zwłaszcza osoby wykonujące protokół po raz pierwszy). Włożyć próbkę skóry do wypełnionej O.C.T. formy do kriotomii i wyrównać wszystkie obszary skóry z O.C.T., usuwając pęsetą wszelkie pęcherzyki powietrza przyczepione do powierzchni ściętych włosów ( Rysunki 2a i 2b).
- Docisnąć skórę do dna bloku wypełnionego O.C.T., tak aby przylegała ściśle do spodu.
UWAGA: Skóra może być zorientowana w dowolnym kierunku, pod warunkiem odnotowania kierunku mieszków włosowych w celu właściwego przeprowadzenia cięcia. Formy do kriotomii zostaną ponownie zorientowane podczas montażu bloków w kriotomie do krio sekcjonowania. Zaznaczyć orientację mieszków włosowych na formie, ponieważ krok ten determinuje późny kierunek cięcia w kriotomie. - Przenieść kriobloki na metalową płytę w zamrażarce -80 °C, aby zapobiec wypływaniu i przemieszczaniu się tkanki.
- Monitorować proces mrożenia, aby utrzymać orientację skóry na dnie formy do kriotomii, ponieważ niewidoczne pęcherzyki powietrza mogą spowodować wypłynięcie skóry na powierzchnię formy.
UWAGA: Formy do kriotomii z zamrożoną tkanką mogą być przechowywane przez ponad rok w temperaturze -80 °C i mogą być ponownie wykorzystane do wykonania dodatkowych sekcji.
- Ogolić grzbiet truchła zwierzęcia suchą maszynką elektryczną.
Rycina 1. Pobieranie i fiksacja skóry myszy.
(a) Tkankę skóry pobrano z obszaru grzbietowo-przyśrodkowego truchła zwierzęcia. Mieszki włosowe w tym regionie są rozmieszczone równomiernie i wyrównane, co pozwala na optymalną orientację podczas krojenia, co wskazują strzałki. (b) Po wycięciu kwadratów o odpowiedniej wielkości, pasującej do formy do mrożenia, tkankę skóry utrwalono w 4% PFA przez 15 min i przemyto dwukrotnie w PBS po 5 min każde. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Przygotowanie grubych przekrojów tkankowych
- Przygotowanie i orientacja tkanki do zamocowania w kriotomie.
- Przygotować 100-mm płytkę hodowlaną z 15 mL PBS. Umieścić ją w łatwo dostępnym miejscu na kriotomie. Dodatkowo przygotować płytkę 12-dołkową z 2,5 mL PBS w każdym dołku; opisać ją zgodnie z próbkami w celu długoterminowego przechowywania skrawków w temperaturze 4 °C. Do manipulowania skrawkami używać pęsety.
- Ustawić temperaturę kriotomu na -20 °C.
UWAGA: Temperatura może wpływać na proces krojenia, jednak dobrą praktyką jest rozpoczęcie pracy od -20 °C. - Aby uzyskać skrawki o grubości około dwóch mieszków włosowych, ustawić kriotom na grubość cięcia 150 µm.
UWAGA: Grubość skrawka może być zmieniana w zależności od potrzeb użytkownika oraz ograniczeń mikroskopu wykorzystywanego do analizy.
UWAGA: Orientacja próbki jest kluczowa dla uzyskania skrawków skóry z mieszkami włosowymi w odpowiednim ustawieniu. Osiąga się to poprzez prawidłowe zamocowanie próbki na bloku kriotomu. Należy upewnić się, że płaszczyzna cięcia jest równoległa do orientacji mieszków włosowych (Rysunek 2c). Jak wspomniano wcześniej, prawidłowa orientacja płaszczyzny cięcia w próbce skóry jest kluczowym krokiem warunkującym jakość obrazów, które zostaną pozyskane na późniejszym etapie.
Rycina 2. Osadzanie, krioterapia i krojenie.
(a) Oznaczenie kierunku mieszków włosowych (HF) na krioformie, wskazane czarnymi strzałkami, jest istotne dla prawidłowej orientacji podczas kriosekcji. (b) Płaszczyzna cięcia musi być wyrównana z orientacją mieszków włosowych, aby uzyskać przekroje, w których zachowana jest pełna długość mieszków włosowych.(c) Przekroje wycinano zgodnie z orientacją mieszków włosowych wskazaną czarnymi strzałkami na krioformie. (d) Grube przekroje poprzeczne tkanki zbierano za pomocą metalowej pęsety i (e) przenoszono do 100 mm szalki hodowlanej zawierającej 1x PBS. (f) W temperaturze pokojowej PBS rozpuszcza związek O.C.T. otaczający grube przekroje poprzeczne tkanki, co wskazano białymi strzałkami. Przekroje swobodnie unoszą się następnie w PBS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
- Kriosekcjonowanie.
- Wyciąć przekrój za pomocą kriotomatu. Użyć pęsety do zebrania O.C.T. zawierającego zatopiony fragment skóry (Rysunek 2d).
UWAGA: Należy użyć kriotomatu umożliwiającego niezależny ruch i regulację wzdłuż osi X, Y i Z w celu optymalnego ustawienia preparatu. Pozwala to na uzyskanie idealnie wyrównanych przekrojów tkanek. - Przenieść przekrój z kriotomatu do 100 mm naczynia hodowlanego wypełnionego PBS i kontynuować wycinanie kolejnych plastrów. Próbek nie należy zbierać na szkiełku (Rysunek 2e).
UWAGA: W temperaturze pokojowej PBS rozpuści O.C.T., pozostawiając plastry skóry, które można łatwo manipulować pęsetą (Rysunek 2f).
UWAGA: Po rozpuszczeniu wielu przekrojów tkanek o grubości 100 µm w 100 mm naczyniu hodowlanym może być konieczne użycie świeżego PBS, który należy wówczas wymienić. - Za pomocą pęsety przenieść pływające przekroje skóry do odpowiednio oznakowanej studzienki w płytce 12-dołkowej wypełnionej 2,5 mL PBS (Rysunek 3a, lewa).
UWAGA: W temperaturze 4 °C próbki można przechowywać przez co najmniej dwa dni. W celu długoterminowego przechowywania bloków O.C.T. zawierających skórę po sekcjonowaniu, powierzchnię cięcia należy zabezpieczyć kroplą świeżego O.C.T. Po zamrożeniu kropli O.C.T. używany blok O.C.T. należy owinąć parafilmem i umieścić z powrotem w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
- Wyciąć przekrój za pomocą kriotomatu. Użyć pęsety do zebrania O.C.T. zawierającego zatopiony fragment skóry (Rysunek 2d).
3. Znakowanie immunofluorescencyjne.
- Przygotować bufor PB (PBS uzupełniony o 0,5% odtłuszczonego mleka w proszku, 0,25% żelatyny ze skóry rybiej oraz 0,5% Triton X-100) z co najmniej 2-godzinnym wyprzedzeniem, zgodnie z wcześniejszym opisem5.
UWAGA: Do buforu PB można dodać azotek sodu w celu konserwacji przeciwciał, co umożliwi wielokrotne wykorzystanie buforu do barwienia. - Oznakować probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i dodać do każdej 500 µL buforu PB. Ostrożnie, używając pincety, przenieść skrawki skóry z PBS do osobnych probówek zawierających bufor PB do blokowania (Rysunek 3a, prawa strona). Upewnić się, że wszystkie skrawki skóry są całkowicie zanurzone. Umieścić probówki na mieszalniku typu see-saw przy prędkości nieprzekraczającej 10 oscylacji na minutę, aby nie naruszyć integralności tkanki, na 1 h w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Krytyczne jest, aby prędkość na mieszalniku see-saw nie przekraczała 10 oscylacji na minutę, ponieważ może to doprowadzić do zaplątania próbek.- Choć możliwe jest umieszczenie więcej niż jednego skrawka w probówce, w celu oszczędności przeciwciał należy umieścić tylko jeden skrawek w każdej probówce. Aby zmniejszyć zużycie przeciwciał, można zastosować objętość 250 µL.
UWAGA: W razie potrzeby probówki do mikrocentryfugi można zastąpić np. płytkami 96-dołkowymi. Jednak umieszczenie grubych przekrojów tkanki w probówkach 1,5 mL zapewnia najskuteczniejszą penetrację przeciwciał do tkanki dzięki zwiększonemu zaburzeniu cieczy.
- Choć możliwe jest umieszczenie więcej niż jednego skrawka w probówce, w celu oszczędności przeciwciał należy umieścić tylko jeden skrawek w każdej probówce. Aby zmniejszyć zużycie przeciwciał, można zastosować objętość 250 µL.
- Oznakować osobne probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL dla każdego skrawka skóry, dodać 500 µL buforu PB oraz odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego. Po 1 h blokowania przenieść skrawki skóry do świeżo przygotowanych probówek z przeciwciałami. Inkubować skrawki w temperaturze 4 °C przez noc.
UWAGA: W tym przykładzie zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: FITC szczurze anty-ludzkie CD49f w stężeniu 1:50 oraz kozie anty-mysie/szczurze integryna alfa 8 w stężeniu 1:100. - Następnego dnia przygotować dwie osobne probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierające 500 µL PBS na każdą próbkę. Przemyć skrawki skóry dwukrotnie przez 1 h w temperaturze pokojowej.
- Przygotować osobne probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierające 500 µL buforu PB z odpowiednim stężeniem właściwych przeciwciał wtórnych oraz 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI).
UWAGA: Przeciwciała wtórne użyte w tym przykładzie to Alexa Fluor 488 osiołkowe anty-szczurze IgG oraz Alexa Fluor 555 osiołkowe anty-kozie IgG w stężeniu 1:500. DAPI zastosowano w stężeniu 1:100. - Ostrożnie przenieść próbki skóry do buforu PB zawierającego przeciwciało wtórne i DAPI, a następnie inkubować skrawki skóry w temperaturze pokojowej przez 1 h przy niskiej prędkości na rotatorze lub wytrząsarce.
- Przechowywać skrawki w temperaturze 4 °C w buforze PB zawierającym przeciwciało wtórne i DAPI do czterech dni, a potencjalnie dłużej, jeśli do PBS dodano azotek sodu.
Rycina 3. Markowanie immunofluorescencyjne i montowanie.
(a) Wolne w cieczy przekroje poprzeczne tkanki można przechowywać w płytkach 12-dołkowych przez co najmniej dwa dni w temperaturze 4 °C. Przed markowaniem immunofluorescencyjnym (IF) przenieść interesujące przekroje poprzeczne tkanki do probówek mikrocentryfużowych o pojemności 1,5 mL zawierających bufor PB do blokowania, zgodnie z oznaczeniem strzałką 1. W przypadku markowania IF należy przestrzegać wieloetapowej procedury szczegółowo opisanej w kroku 3. Każda część kroku 3 wymaga ostrożnego przeniesienia przekrojów poprzecznych tkanki do świeżo przygotowanych probówek mikrocentryfużowych zawierających roztwór przeciwciał pierwszorzędowych, roztwór przeciwciał drugorzędowych lub bufor płuczący, co wskazano strzałką 2. (b) Po markowaniu IF przekroje poprzeczne tkanki są rozwijane i spłaszczane w kropli glicerolu przy pomocy mikroskopu sekcyjnego. (c) Gdy przekrój poprzeczny tkanki zostanie całkowicie spłaszczony na spodzie szkiełka nakrywki, do zamontowania przekroju używa się standardowego szkiełka przedmiotowego. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
4. Montowanie do wizualizacji mikroskopowej
- Przed obrazowaniem przenieść skrawki skóry do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi zawierających 500 µL PBS, aby wypłukać przeciwciała wtórne i DAPI.
- Użyć pipety 1 000 µL, lecz odciąć pierwsze 0,5 cm końcówki pipety, aby umożliwić prawidłowe pobieranie wysoce lepki glicerolu. Umieścić szkiełko zakrywkowe o wymiarach 22 x 50 mm na ciemnym tle pod mikroskopem sekcyjnym (Rysunek 3b).
- Nanieść jedną kroplę 100% glicerolu na szkiełko zakrywkowe (Rysunek 3b). Przenieść skrawek skóry z probówki do mikrocentryfugi na kroplę glicerolu. Używając mikroskopu sekcyjnego i pęsety z ostrym końcem, ostrożnie rozwinąć zwinięte skrawki skóry.
UWAGA: Ponieważ skrawek unosi się w kropli glicerolu, można go rozplątać, wykorzystując naturalną tendencję tkanki do powrotu do pierwotnego kształtu. Nie należy wymuszać nienaturalnego prostowania skrawka, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia tkanki. - Zamontować tkankę po tym, jak cała długość sekcji skóry zostanie odpowiednio zorientowana i spłaszczona na szkiełku zakrywkowym; użyć zwykłego szkiełka przedmiotowego. Ten krok dodatkowo wyprostuje skrawek skóry.
UWAGA: Należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza (Rysunek 3c). - Wykonawcze obrazowanie sekcji skóry zamontowanych w glicerolu należy przeprowadzić w ciągu kolejnych dwóch dni.
UWAGA: Przedłużone przechowywanie negatywnie wpłynie na stan tkanki i jakość obrazowania. W niniejszym przykładzie wszystkie obrazy zostały pozyskane za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego z użyciem obiektywu 20x.
Wyniki
Aby podkreślić zalety naszej techniki, porównaliśmy naszą metodę wykonywania grubych, trójwymiarowych przekrojów tkanki, tzw. „poziomych preparatów całych” (horizontal whole mount), z klasycznymi seryjnymi cięciami mrożonymi. Klasyczne cięcia mrożone wykonywano zgodnie z wcześniejszym opisem5. Aby zapewnić widoczną strukturę naskórka na obrazach mikroskopowych, przeprowadziliśmy immunobarwienie integryny alfa-6 (Itga6), która jest składnikiem kotwiczącym komórki naskórka do leżącej pod nimi błony podstawnej6. Oznaczyliśmy również mięsień przywłoskowy (APM), odpowiedzialny za piloerekcję (znaną również jako „gęsia skórka”), za pomocą integryny alfa-87. W klasycznych cięciach mrożonych większość mieszków włosowych zwizualizowanych za pomocą Itga6 nie została przekrojona wzdłuż całej ich długości, co skutkowało obecnością głównie niepełnych mieszków włosowych w każdym przekroju, w porównaniu do poziomych preparatów całych (Rysunek 4a-4d). Grube przekroje tkanki umożliwiają uzyskanie większej liczby warstw stosu Z (Z-stack) w porównaniu do konwencjonalnych cięć o grubości 10-µm, co pozwala na stworzenie bardziej kompletnego obrazu 3D. Staje się to jeszcze bardziej widoczne podczas badania integralności APM, które są powiązane z mieszkami włosowymi i nadkładającą je błoną podstawną. W klasycznych krioprzekrojach znaczna część APM została pofragmentowana (Rysunek 4a-4d). Dodatkowo, w poziomych preparatach całych zachowana jest integralność tkanki przedziału podskórnego, w przeciwieństwie do destrukcji adipocytów podczas przyklejania krioprzekrojów do ciepłych szkiełek przedmiotowych, co jest dobrze znanym artefaktem zamrażania i rozmrażania (Rysunek 4a-b, porównaj obszary podskórne)8.
Rycina 4. Poziomy preparat całego zamontowania w porównaniu z klasycznym krioprzekrojem.
(a) Klasycznie przygotowane krioprzekroje skóry o grubości 10 µm oraz (b) 3D przekroje tkanki o grubości 100 µm zostały znakowane integryną alfa-6 (Itga6) i integryną alfa-8 (Itga8) w celu wizualizacji odpowiednio przedziału epidermy oraz mięśni przywłosowych. Obrazy grubych przekrojów tkankowych przedstawiono jako projekcje maksymalne dużego stosu Z. Białe ramki wskazują obszary powiększone, wyświetlone w (c) klasycznych i (d) poziomych przekrojach całego zamontowania. (e) Nienaruszone mieszki włosowe oraz (f) nienaruszone mięśnie przywłosowe zostały skwantyfikowane zarówno w klasycznych, jak i poziomych przekrojach całego zamontowania. Paski skali oznaczają 100 µm. Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Skwantyfikowano jeden przekrój na powtórzenie biologiczne (n=3). Nieparzysty test t *P<0,05, ***P<0,0005. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy technikę "poziomego montażu całościowego", która ma kilka zalet w porównaniu z klasycznymi sekcjami mrożonymi. Jedną z zalet naszej techniki jest to, że można ją łatwo wykonać za pomocą standardowego sprzętu histologicznego i mikroskopu konfokalnego. Po drugie, integralność tkanek jest zachowana w lepszy sposób w porównaniu ze standardowymi kriosekcjami. Na przykład adipocyty w warstwie podskórnej (tj. białe adipocyty skórne (DWAT))9 są poważnie zakłócone w standardowych kriosekcjach, co uniemożliwia badanie tkanek obciążonych tłuszczem. Nasza technika pozwala na pełną analizę adipocytów w tej warstwie i może być dostosowana do innych tkanek o wysokiej zawartości adipocytów. Co więcej, pozwala to na lepsze wykrywanie komórek mezenchymalnych w badaniach śledzenia linii 2,10.
Standardowe kriosekcje, ze względu na swoją naturę, nigdy nie mogą ujawnić prawdziwych aspektów 3D tkanki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Oznacza to, że grubsze odcinki są korzystne w analizie skóry, ponieważ mieszki włosowe, a także ich podstruktury, mogą pokonywać głębokość przekraczającą standardową grubość 10 μm stosowaną w klasycznych kriosekcjach. Jesteśmy zaintrygowani, że inne tkanki, takie jak na przykład jelito i mózg, mają podobne wyzwania w odniesieniu do postrzegania tkanki jako struktury 3D 2,7,11,12,13. Co ciekawe, wykazano już, że nasza technika jest korzystna do stosowania w niektórych zastosowaniach w jelitach14. Wierzymy, że nasz poziomy protokół montażu całego ma potencjał do zastosowania do każdej innej tkanki wymagającej analizy 3D.
Oświadczenia
Autorzy pragną ujawnić, że publikacja tego manuskryptu została sfinansowana przez Thermo-Fisher Scientific Inc.
Podziękowania
Autorzy dziękują za sponsoring ze strony Thermo-Fisher Scientific i dziękują Centrum Obrazowania Nikona w Kings College London za wsparcie podczas akwizycji obrazu konfokalnego.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PBS | domowa | ||
| żelatyna, ze skóry ryb zimnowodnych | Sigma | G7765 | 250ML |
| Glicerol BDH | Materiały laboratoryjne | 444482V | |
| Związek OCT | Chemikalia VWR | 361603E | |
| Formy do zatapiania Peel-A-Way | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
| Beztłuszczowe mleko w proszku | Bio Podstawowa spółka z ograniczoną odpowiedzialnością | NB0669 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
| ;,6-diamidino-2-fenyloindol, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
| Mysz/Szczur Integryna alfa 8 Przeciwciało | R& D Systems | AF4076 | |
| Alexa Fluor 488 osioł anty-szczurzy IgG | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 555 osł anty-kozy IgG | Life Technologies | A21432 | |
| CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 100mm Naczynia | |||
| Skalpele jednorazowe | Swann-Morton | Ref 0501 | |
| spiczaste metalowe kleszcze | |||
| 1,5 ml mikroprobówki wirówkowe | VWR | 211-2130 | |
| 12-dołkowe płytki | Sigma | CLS3513 | |
| Mikroskop preparacyjny | Nikon | ||
| 20 ul i 1000 ul Pipeta | Gilson | ||
| 1000µ l Końcówka filtra XL z podziałką TipOne (sterylna) | Star Lab | S1122-1830 | |
| 20 i mikro; l Skośna końcówka filtra TipOne (sterylna) | Star Lab | S1120-1810 | |
| Kołysząca się płyta | |||
| Szkiełka mikroskopowe, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
| , Termos Scientific MENZBB024060AB Menzel Glaeser | Scientific | 24 x 60 mm | |
| konfokalny | Nikon |
Bibliografia
- Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
- Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).
- Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis. Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis. Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).
- Niculescu, C., et al. Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation. Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144 (4), 577-589 (2011).
- Desciak, E. B., Maloney, M. E. Artifacts in frozen section preparation. Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).
- Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. Defining dermal adipose tissue. Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment. Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).
- Sada, A., et al. Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin. Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
Przedruki i uprawnienia
