Wykorzystanie kapsułek do negatywnego barwienia próbek wirusa w obrębie zabezpieczeń biologicznych

Summary

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące próbek wirusa o negatywnym zabarwieniu, które mogą być łatwo wykorzystane w laboratoriach BSL-2, -3 lub -4. Obejmuje on zastosowanie innowacyjnej kapsuły procesowej, która chroni siatkę transmisyjnej mikroskopii elektronowej i zapewnia użytkownikowi łatwiejszą obsługę w bardziej burzliwych środowiskach w obrębie hermetyzacji biologicznej.

Abstract

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) służy do obserwacji ultrastruktury wirusów i innych patogenów mikrobiologicznych z rozdzielczością nanometrów. Większość materiałów biologicznych nie zawiera gęstych pierwiastków zdolnych do rozpraszania elektronów w celu stworzenia obrazu; Dlatego wymagane jest barwienie ujemne, które umieszcza gęste sole metali ciężkich wokół próbki. Aby uwidocznić wirusy w zawiesinie pod TEM, należy je nanieść na małe siatki pokryte przezroczystą powierzchnią o grubości zaledwie nanometrów. Ze względu na niewielkie rozmiary i kruchość siatki te są trudne w obsłudze i łatwo przenoszone przez prądy powietrza. Cienka powierzchnia łatwo ulega uszkodzeniu, co sprawia, że próbka jest trudna lub niemożliwa do zobrazowania. Zakaźne wirusy muszą być przenoszone w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC), a niektóre wymagają środowiska laboratoryjnego z zabezpieczeniem biologicznym. Barwienie wirusów na poziomach bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-3 i -4 jest szczególnie trudne, ponieważ środowiska te są bardziej burzliwe, a technicy są zobowiązani do noszenia środków ochrony osobistej (PPE), co zmniejsza zręczność.

W tym badaniu oceniliśmy nowe urządzenie, które pomaga w negatywnym zabarwieniu wirusów w zabezpieczeniu biologicznym. Urządzenie jest kapsułką, która pełni funkcję specjalistycznej końcówki do pipet. Po załadowaniu siatek do kapsułki, użytkownik po prostu zasysa odczynniki do kapsułki, aby dostarczyć wirusa i barwniki do zamkniętej siatki, eliminując w ten sposób obsługę siatek przez użytkownika. Chociaż technika ta została zaprojektowana specjalnie do stosowania w zabezpieczeniu biologicznym BSL-3 lub -4, może ułatwić przygotowanie próbki w dowolnym środowisku laboratoryjnym, umożliwiając łatwe barwienie ujemne wirusa. Ta sama metoda może być również zastosowana do przygotowania ujemnych próbek TEM nanocząstek, makrocząsteczek i podobnych próbek.

Introduction

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest skutecznym narzędziem do oglądania morfologii i ultrastruktury próbek biologicznych, które są zbyt małe, aby można je było zobaczyć za pomocą tradycyjnego mikroskopu świetlnego ^1,2,3,4. TEM wystrzeliwują elektrony przez bardzo cienką próbkę, tworząc obraz o wyższej rozdzielczości, ponieważ elektrony mają znacznie krótszą długość fali niż światło. Obszary próbki, które zakrzywiają lub blokują elektrony, wydają się ciemne, podczas gdy obszary, które są przezroczyste dla elektronów, wydają się białe.

Brak gęstej materii elektronowej sprawia, że wirusy są trudne do zobaczenia w TEM, ponieważ nie mogą rozpraszać elektronów. Barwienie ujemne jest najczęstszą metodą stosowaną do tworzenia kontrastu i oglądania wirusów za pomocą TEM. Pierwsza procedura barwienia ujemnego została zaproponowana przez Brennera i Horne'a w 1959 roku, w oparciu o eksperyment, w którym Hall (1955) i Huxley (1957) obserwowali wygląd struktur biologicznych w odwrotnym kontraście po zanurzeniu w substancji o dużej gęstości elektronów ⁵. Proces barwienia negatywnego pozostał praktycznie niezmieniony w ciągu ostatniego półwiecza. Barwienie ujemne polega na krótkim nałożeniu roztworu soli metalu ciężkiego na próbkę na siatce TEM w celu otoczenia wirusa gęstym materiałem bez infiltracji wirusa ⁶. Tworzy to ciemną obwódkę i odsłania kształt cząstki ⁵. W badaniu wykorzystano dwa odczynniki do barwienia ujemnego, octan uranylu (UA) i kwas fosforofosforanu potasu (PTA). Oba te barwniki są powszechnie używane do negatywnego barwienia małych próbek biologicznych, takich jak wirusy, kompleksy białkowe i nanocząstki ^7,8,9.

Konwencjonalną techniką barwienia ujemnego jest ręczna technika barwienia ujemnego kropelkami⁷. Metoda ta wymaga precyzyjnego obchodzenia się z małymi, delikatnymi siatkami TEM za pomocą kleszczy w celu nałożenia niewielkich ilości próbki wirusa, barwienia i płukania. Typowy protokół przygotowania polega na nałożeniu kropli zawiesiny próbki na powierzchnię pokrytej folią siatki TEM (Rysunek 1A). Po przymocowaniu próbki do powierzchni folii, siatka jest płukana w celu usunięcia nieprzywierających wirusów i barwiona UA lub PTA przez kilka sekund do minuty, w zależności od rodzaju próbki. Nadmiar cieczy jest odprowadzany z siatki poprzez dotknięcie kawałka bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki.

Metoda ręcznego kropelowania wymaga, aby każda siatka była wykonana indywidualnie. Jeśli nie obchodzisz się z nimi ostrożnie, powlekane siatki TEM łatwo się przebijają, wyginają lub zanieczyszczają. Przetwarzanie wielu próbek może prowadzić do trudności w śledzeniu siatek i zapewnieniu spójnego barwienia dla każdej próbki. Ta ręczna procedura barwienia jest znacznie trudniejsza, gdy jest przeprowadzana w laboratoriach biologicznych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-3 i -4, ze względu na wymagane środki ochrony osobistej (PPE) wymagane w tych środowiskach. Środki ochrony osobistej są uciążliwe, a środowisko hermetyczności biologicznej jest znacznie bardziej burzliwe w porównaniu ze zwykłym laboratorium. Personel pracujący w laboratoriach bezpieczeństwa biologicznego BSL-3 jest zobowiązany do noszenia 2 par rękawic i pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Ta podwójna warstwa rękawic zmniejsza wrażliwość dotykową i ogranicza drobne ruchy motoryczne. Przepływ powietrza przez BSC, który chroni użytkownika i pomaga zapobiegać zanieczyszczeniu próbki, może powodować zbyt szybkie wysychanie próbek i plam, co wpływa na jakość plamy. Silny turbulentny przepływ powietrza w BSC może również szybko zdmuchnąć siatkę, która nie jest dobrze zabezpieczona. W laboratoriach bezpieczeństwa biologicznego BSL-4 obowiązują dodatkowe wymagania bezpieczeństwa. Personel jest zobowiązany do noszenia skafandra nadciśnieniowego, który dodatkowo ogranicza ruchy fizyczne i zdolność do wyraźnego widzenia i manipulowania siatkami. Technik pracujący w BSL-4 nosi również co najmniej 2 pary rękawic, przy czym zewnętrzna para to gruba rękawica, która znacznie zmniejsza zręczność i wrażenia dotykowe. Wreszcie, kleszcze używane do obsługi siatek TEM są ostre, co stanowi zagrożenie dla technika ze względu na ich zdolność do przebijania rękawic. W przypadku kapsułek zawierających siatki, kleszcze nie są konieczne, co stanowi bezpieczną, wolną od kleszczy alternatywę do manipulowania siatkami w zabezpieczeniu biologicznym. Wreszcie, kapsułki zapewniają również skuteczny sposób przechowywania siatek podczas przetwarzania, odkażania parami osmu oraz podczas przechowywania; dzięki temu siatki są uporządkowane i zabezpieczone przed uszkodzeniem.

W tym raporcie wprowadzamy nową metodę barwienia ujemnego siatek TEM w laboratoriach biobezpieczeństwa, która wykorzystuje kapsułki mPrep/g, urządzenie oparte na kapsułkach do obsługi i barwienia siatki ^10,11,12. Kapsuła mieści dwie kratki TEM, minimalizuje bezpośrednią obsługę i zmniejsza ryzyko uszkodzenia siatki. Kapsułkę mocuje się bezpośrednio do pipety jedno- lub wielokanałowej w taki sam sposób, jak końcówka do pipety, co umożliwia nakładanie różnych płynów na znajdujące się w niej siatki. Umożliwia to jednoczesne przygotowanie wielu próbek ze zduplikowanymi siatkami (rysunek 1B). Aby uzyskać ujemne zabarwienie kapsułkami, próbkę wirusa zasysa się do kapsułki i utrzymuje przez 10 minut, aby wirusy mogły adsorbować się na powierzchni siatki. Siatki z zaadsorbowanym wirusem są następnie przemywane wodą dejonizowaną (dI) i barwione UA lub PTA przez kilka sekund do 1 minuty. W tym procesie wykorzystuje się te same kroki protokołu i odczynniki, co ręczna metoda kropelkowa; Różnica polega na tym, że cała praca odbywa się wewnątrz kapsuły, bez fizycznej obsługi siatek. (Rysunki 1C, 1D).

Celem tego badania było sprawdzenie kapsułek jako nowej metody negatywnego barwienia próbek wirusa w środowiskach zabezpieczonych biologicznie. W badaniu tym zbadano również jakość obrazów TEM uzyskanych z dwóch różnych procedur inaktywacji wirusa: 1) szybkiej inaktywacji za pomocą 1% pary tetratlenku osmu oraz 2) 24-godzinnej inaktywacji 2% aldehydu glutarowego. Oba te zabiegi przeprowadzono przy użyciu kapsułek. Na koniec oceniliśmy dwie powszechnie stosowane barwniki negatywowe, UA i PTA, do stosowania w kapsułce. ¹³

Protocol

1. Przygotowanie eksperymentu w środowisku BSL-2 przed rozpoczęciem pracy z próbkami wirusa

1. Przygotuj lub kup siatki miedziane TEM Formvar i powlekane węglem, zwykle 200-400 oczek.
2. Włóż powlekane siatki TEM do kapsułek.
   1. Użyj powiększonego obiektywu, aby ułatwić ten proces. Do każdej kapsułki można włożyć jedną lub dwie siatki. W razie potrzeby można kupić wstępnie załadowane kapsułki, aby wyeliminować ten krok.
3. Przenieść kapsułki z włożonymi siatkami pokrytymi TEM, wraz z innymi materiałami eksploatacyjnymi i odczynnikami, do bezpiecznego przechowywania biologicznego, gdzie wirusy będą barwione ujemnie.

2. Metoda kapsułkowa do barwienia ujemnego w zabezpieczeniu biologicznym przy użyciu wodnego aldehydu glutarowego i 1% inaktywacji parami tetratlenku osmu

1. Wewnątrz BSC zabezpieczenia biologicznego odessać 40 μl zawiesiny wirusa do kapsułki dołączonej do pipety.
   UWAGA: Pipeta pozostaje przymocowana do kapsułki do momentu zakończenia procesu. Przygotowanie wirusa odbywa się zgodnie z naszą poprzednią publikacją¹⁴.
2. Umieść pipetę na boku na 10 minut z kratkami ustawionymi poziomo. Ma to na celu zapewnienie równomiernego rozprowadzenia cząsteczek wirusa na powlekanych siatkach.
3. Wirus dezaktywowany w torebce wewnątrz BSC zabezpieczenia biologicznego.
   1. Podnieść pipetę i wcisnąć tłok, aby dozować roztwór wirusa do pojemnika na odpady.
   2. Odessać 40 μl 2% utrwalacza aldehydu glutarowego do kapsułek.
      Uwaga: Aldehyd glutarowy jest niebezpieczną substancją chemiczną i wymaga odpowiedniej ochrony. Aldehyd glutarowy może być stosowany przez krótki czas w normalnym BSC, ale rozszerzony otwarty odczynnik wymaga pracy w kanałowym BSC lub okapie oparów chemicznych.
   3. Ułóż pipetę na boku na 20 minut. Ma to na celu upewnienie się, że próbki są dobrze utrwalone.
   4. Wydalić utrwalacz i odessać 40 μl wody dI do kapsułek, aby zmyć utrwalacz. Powtórz ten krok prania, w sumie przez 3 cykle płukania.
4. Odessać 40 μl 1% octanu uranylu (UA) lub 1% kwasu fosforomanganowego potasu (PTA) do kapsułek i pozostawić na 30 s.
   UWAGA: Czas barwienia może wynosić od 10 s do 1 minuty w zależności od próbki wirusa.
   Uwaga: UA jest emiterem alfa i toksyną kumulatywną. Obchodź się z nim z odpowiednią ochroną.
5. Wyjąć kapsułkę z pipety i osuszyć siatki, dotykając kawałka bibuły filtracyjnej do krawędzi kratki, podczas gdy kratki pozostają w kapsułce.
6. Procedura inaktywacji par tetratlenku osmu.
   1. Umieścić kapsułkę z otwartą pokrywką w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej bibułę filtracyjną nasączoną 1% roztworem tetratlenku osmu .
      Uwaga: Tetrtlenek osmu jest wyjątkowo toksyczny przy niskiej prężności par. Musi być używany w kanałowym BSC lub okapie oparowym chemikaliów. Obchodź się z nim z odpowiednią ochroną. Umieść informacje ostrzegawcze w obszarze roboczym.
   2. Uszczelnij probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na 1 godzinę, aby umożliwić całkowite przenikanie oparów tetratlenku osmu. Następnie należy odkazić i przenieść probówkę z zabezpieczenia biologicznego do obiektu BSL-2 EM.
7. Usuń siatki EM z kapsułki.
   1. W urządzeniu BSL-2 EM wyjmij kapsułkę z probówki wirówkowej i umieść ją na pipecie.
   2. Zassać 40 μl wody dI do kapsułki i trzykrotnie dozować wodę do pojemnika na odpady.
   3. Wyjmij kapsułkę z pipety i osusz siatkę za pomocą bibuły filtracyjnej, aby dotknąć krawędzi kratki.
   4. Po wyschnięciu na powietrzu przechowuj siatki do późniejszego obrazowania TEM.

3. Metoda kapsułkowa do inaktywacji w zabezpieczeniu biologicznym z 2% aldehydem glutarowym, a następnie barwienie ujemne w laboratorium BSL-2

1. Procedura inaktywacji wirusa.
   1. Wewnątrz zabezpieczonego biologicznie BSC dobrze wymieszać zawiesinę wirusa z tą samą objętością 4% aldehydu glutarowego, aby uzyskać końcowe stężenie 2% aldehydu glutarowego.
      Uwaga: Aldehyd glutarowy jest niebezpieczną substancją chemiczną i wymaga odpowiedniej ochrony. Aldehyd glutarowy może być stosowany przez krótki czas w normalnym BSC, ale rozszerzony otwarty odczynnik wymaga pracy w kanałowym BSC lub okapie oparów chemicznych.
   2. Dezaktywować wirusy za pomocą utrwalacza przez co najmniej 24 godziny przed zapakowaniem, odkażeniem i przetransportować do zakładu BSL-2 EM.
2. W urządzeniu BSL-2 EM odessać mieszaninę wirusa i utrwalacza do kapsułki zawierającej dwie siatki TEM, przymocowanej do pipety.
3. Pipetę należy ustawić poziomo na 10 minut, z kratkami ustawionymi poziomo.
   UWAGA: Ma to na celu zapewnienie równomiernego rozmieszczenia cząstek wirusa na siatkach TEM.
4. Podnieść pipetę i nacisnąć tłok, aby usunąć wirusa do pojemnika na odpady. Odessać 40 μl wody dI do kapsułek i wyrzucić ją do pojemnika na odpady na 3 cykle płukania.
5. Odessać 40 μl 1% UA lub 1% PTA do kapsułek przez 30 s.
   UWAGA: Czas barwienia wahał się od 10 s do 1 min w zależności od próbki wirusa.
   Uwaga: UA jest emiterem alfa i toksyną kumulatywną. Obchodź się z nim z odpowiednią ochroną.
6. Wyjmij kapsułkę z pipety i osusz siatki, dotykając krawędzią kratki kawałka bibuły filtracyjnej. Wysuszyć siatki na powietrzu i przechowywać je do późniejszego obrazowania TEM.

Results

Metoda kapsułkowa zapewnia dobrej jakości barwienie negatywowe do obrazowania TEM:

Po pierwsze, oceniliśmy jakość obrazów generowanych przy użyciu zarówno metody ręcznej kropelki, jak i metody kapsułek dla negatywnego barwienia wirusa ebola z Zairu. Wirusy Ebolawirusy należą do rodziny Filoviridae, podobnie jak wirus Marburg. Wirus Ebolavirus ma zwykle średnicę od 80 do 100 nm i może mieć ponad 1000 nm długości. Z wirusem ...

Discussion

Barwienie ujemne jest cenną techniką TEM do oceny i wymiarowania wirusów, kompleksów białkowych i nanocząstek. Przygotowanie kropelkowe tych próbek poprzez ręczne przesuwanie siatek z odczynnika do barwienia ujemnego jest klasycznym protokołem od ponad pół wieku. Jest to prosty proces, ale do pomyślnego zakończenia wymaga wiedzy zdobytej podczas szkolenia. Doskonałe barwienie negatywowe jest nadal uważane za najnowocześniejszy zestaw umiejętności i bardzo pożądane w wielu laboratoriach TEM. Metoda kapsułkowa ma kilka wyr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siatki TEM powlekane formvarem/węglem	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g kapsułki	EMS	85010-01	pudełko
mPrep/f łączniki	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% roztwór, klasa EM
Tetratlenek osmu	EMS	19190	4% roztwór wodny
Octan uranylu	EMS	22400	w proszku
Kwas potasowo-fosforungrowy		Bibuła	19500
	Whatman	1450-090	rozmiar 50
Mikroskop elektronowy transmisyjny	JEOL	JEM-1011	TEM