Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56124

⸱

14 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Streszczenie

Komary Aedes aegypti eksperymentalnie zainfekowane Wolbachia są wykorzystywane w programach do kontroli rozprzestrzeniania się arbowirusów, takich jak denga, chikungunya i Zika. Komary zakażone Wolbachią mogą zostać wypuszczone na pole w celu zmniejszenia liczebności populacji poprzez niekompatybilne krzyżowanie lub przekształcenia populacji z komarami, które są odporne na przenoszenie wirusa. Aby te strategie odniosły sukces, komary wypuszczone na pole z laboratorium muszą być konkurencyjne w stosunku do komarów rodzimych. Jednak utrzymywanie komarów w laboratorium może skutkować chowem wsobnym, dryfem genetycznym i adaptacją laboratoryjną, co może zmniejszyć ich przydatność w terenie i może zakłócić wyniki eksperymentów. Aby przetestować przydatność różnych infekcji Wolbachia do zastosowania w terenie, konieczne jest utrzymanie komarów w kontrolowanym środowisku laboratoryjnym przez wiele pokoleń. Opisujemy prosty protokół utrzymywania komarów Ae. aegypti w laboratorium, który jest odpowiedni zarówno dla komarów zakażonych Wolbachią, jak i komarów typu dzikiego. Metody minimalizują adaptację laboratoryjną i wdrażają krzyżowanie w celu zwiększenia znaczenia eksperymentów z komarami terenowymi. Dodatkowo kolonie są utrzymywane w optymalnych warunkach, aby zmaksymalizować ich przydatność do wypuszczania na otwartym polu.

Wprowadzenie

Komary Aedes aegypti są odpowiedzialne za przenoszenie niektórych z najważniejszych arbowirusów na świecie, w tym dengi, Zika i chikungunya1. Wirusy te stają się coraz większym zagrożeniem dla zdrowia na całym świecie, ponieważ powszechne rozprzestrzenianie się Ae. aegypti w tropikach nadal się rozwija2,3,4. Samice Ae. aegypti preferencyjnie żywią się ludzką krwią5 i dlatego mają tendencję do życia w bliskim sąsiedztwie ludzi, szczególnie na obszarach miejskich, gdzie populacje są najgęściej. Dzięki temu ścisłemu powiązaniu z ludźmi przystosowały się również do rozmnażania w sztucznych siedliskach, w tym w oponach, doniczkach, rynnach i zbiornikach na wodę6,7. Ae. aegypti łatwo przystosowują się również do środowisk laboratoryjnych, w których mogą być utrzymywane bez żadnych specjalnych wymagań po zebraniu bezpośrednio z pola, w przeciwieństwie do niektórych innych gatunków z rodzaju Aedes8,9,10. Łatwość ich konserwacji sprawiła, że były szeroko badane w laboratoriach w szerokim zakresie dziedzin, ostatecznie mając na celu kontrolowanie chorób przenoszonych przez komary.

Tradycyjnie, kontrola arbowirusów opiera się głównie na użyciu środków owadobójczych w celu zmniejszenia populacji komarów. Rośnie jednak zainteresowanie podejściami, w których zmodyfikowane komary są hodowane w laboratorium, a następnie wypuszczane do naturalnych populacji. Wypuszczone komary mogą być modyfikowane genetycznie11,12,13, biologicznie14,15, poprzez napromieniowanie16, obróbka chemiczna17,18, lub za pomocą technik kombinowanych19 Albo stłumić populacje komarów, albo zastąpić je komarami, które są odporne na przenoszenie arbowirusów20.

Wolbachia to bakterie, które są obecnie używane jako środek kontroli biologicznej dla arbowirusów. Kilka szczepów Wolbachia zostało niedawno wprowadzonych do Ae. aegypti eksperymentalnie przy użyciu mikroiniekcji embrionalnej21,22,23,24. Szczepy te zmniejszają zdolność arbowirusów do rozprzestrzeniania się i replikacji w komarach, zmniejszając ich potencjał transmisyjny23,25,26,27,28. Zakażenia Wolbachia są przenoszone z matki na potomstwo, jednak niektóre szczepy wywołują bezpłodność, gdy zakażone samce kojarzą się z niezakażonymi samicami22. Samce zakażone Wolbachią mogą być zatem uwalniane w dużych ilościach w celu stłumienia naturalnych populacji komarów, jak ostatnio wykazano u innych gatunków Aedes15,29. Ponieważ jednak Wolbachia hamuje również przenoszenie arbowirusów u Ae. aegypti, komary mogą być również uwalniane w celu zastąpienia rodzimych populacji uboższymi wektorami. Ae. aegypti zakażone eksperymentalnie Wolbachia są obecnie uwalniane do terenu w kilku krajach przy użyciu tego ostatniego podejścia14,30,31.

Oparte na Wolbachii podejścia do kontroli arbowirusów opierają się na solidnym zrozumieniu interakcji między Wolbachią, komarem i środowiskiem. Wolbachia występuje naturalnie u szerokiej gamy owadów, a szczepy wprowadzone do komarów są zróżnicowane pod względem działania32. W związku z tym, że do Ae. aegypti24 wprowadzane są nowe typy infekcji Wolbachia, konieczne jest scharakteryzowanie każdego szczepu pod kątem ich wpływu na kondycję, reprodukcję i interferencję arbowirusową komarów w różnych warunkach. W związku z tym konieczne są rygorystyczne eksperymenty w laboratorium, aby ocenić potencjał szczepów Wolbachia do odniesienia sukcesu w terenie.

Uwolnienia Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia na otwartym polu często mogą wymagać od tysięcy do dziesiątek tysięcy komarów na strefę wypuszczenia do hodowli każdego tygodnia14,30,31. Sukces pierwszych wydań można poprawić, wypuszczając komary o dużych rozmiarach, aby zmaksymalizować ich płodność33 i sukces krycia34,35. Komary powinny być również przystosowane do warunków, z jakimi będą miały do czynienia w terenie, jednak długotrwała hodowla laboratoryjna może powodować zmiany w zachowaniu i fizjologii, które mogą mieć wpływ na wydajność w terenie36,37,38.

Opisujemy prosty protokół hodowli Ae. aegypti w laboratorium przy użyciu podstawowego sprzętu. Protokół ten jest odpowiedni zarówno dla komarów typu dzikiego, jak i zakażonych Wolbachią, przy czym te ostatnie mogą wymagać szczególnej uwagi, ponieważ niektóre szczepy Wolbachia mają znaczący wpływ na cechy historii życia komarów39,40. Warunki chowu pozwalają uniknąć przeludnienia i konkurencji o pożywienie w celu wytworzenia komarów o stałej wielkości, co ma kluczowe znaczenie dla eksperymentów z kompetencjami wektorów i sprawnością oraz zapewnia, że komary są zdrowe do wypuszczenia w terenie41. Podejmujemy również środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji laboratoryjnej i chowu wsobnego, zmniejszając presję selekcyjną i zapewniając, że następne pokolenie jest pobierane z dużej, losowej puli. Jednak środowiska laboratoryjne wyraźnie różnią się od warunków polowych, a długotrwała konserwacja w zrelaksowanych warunkach może zmniejszyć kondycję komarów po wypuszczeniu na pole37,42,43. W związku z tym okresowo krzyżujemy samice z linii laboratoryjnych do samców zebranych w terenie, w wyniku czego powstają kolonie, które są genetycznie podobne do porównań eksperymentalnych i które są dostosowane do docelowej populacji terenowej39. Metody te nie wymagają specjalistycznego sprzętu i mogą być skalowane do hodowli dziesiątek tysięcy osobników tygodniowo w celu wypuszczenia na pole. Protokół nadaje również priorytet przydatności komarów w obrębie pokoleń i między pokoleniami, co jest ważnym czynnikiem w przypadku owadów przeznaczonych do osiedlenia się w naturalnych populacjach. Protokół jest odpowiedni dla większości laboratoriów, które wymagają utrzymania Ae. aegypti, szczególnie w przypadku porównań eksperymentalnych, w których ważna jest stała jakość komarów i odniesienie do terenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Żywienie komarów krwią pobieraną od ludzi zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań z Udziałem Ludzi Uniwersytetu w Melbourne (numer zatwierdzenia: 0723847). Wszyscy ochotnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Hodowla larw

UWAGA: Komary utrzymuje się w temperaturze 26 ± 0.5 °C oraz 50–70% wilgotności względnej, z fotoperiodem 12:12 h (światło:ciemność) w ramach niniejszego protokołu utrzymania kolonii. Warunki te są zbliżone do średnich warunków klimatycznych w Cairns w Australii i mieszczą się w optymalnym zakresie termicznym dla Ae. aegypti przeżycie i rozwój44,45,46Wysokie temperatury mogą prowadzić do utraty Wolbachia zakażenia z kolonii komarów i należy ich unikać47Utrzymujemy co najmniej 50 osobników w każdej populacji, aby zminimalizować chów wsobny; utrzymywanie kolonii o mniejszej liczebności może mieć wpływ na dostosowanie organizmów [Ross i wsp. nieopublikowane]. W tych warunkach i przy założeniu odpowiedniego odżywienia średni czas generacji wynosi 28 dni (patrz Tabela 1).

  1. Zanurz jaja na podłożu w kuwetach (Rysunek 1A) zawierających 3 L wody (woda z odwróconej osmozy lub odstana woda wodociągowa, przygotowana poprzez pozostawienie wody w kuwetach na 24 h przed użyciem), ~30 mg pokarmu dla ryb (jedna rozkruszona tabletka, patrz Tabela materiałów) oraz kilka ziaren aktywnych suchych drożdży, aby zaindukować wyklucie48.
  2. Jeden dzień po wykluciu, za pomocą szklanej pipety przenieś około 500 larw do kuwet zawierających 4 L wody (Rysunek 1B), przeliczając je za pomocą licznika mechanicznego. Do każdej kuwety dodaj dwie rozkruszone tabletki pokarmu dla ryb. W razie potrzeby użyj pojemników o różnych rozmiarach do hodowli larw (Rysunek 1A), ale utrzymuj gęstość larw poniżej 0,5 larwy/mL, aby uniknąć przeludnienia.
  3. Codziennie sprawdzaj kuwety, aby upewnić się, że larwy mają wystarczającą ilość pokarmu; co dwa dni dodawaj do kuwet około dwie tabletki pokarmowe. Podawaj pokarm ad libitum, ale upewnij się, że w tym okresie dostępne jest 0,5 mg/larwa/dzień, aby zapewnić synchronizację rozwoju i jednolitość rozmiaru ciała, w przeciwnym razie wyniki eksperymentów mogą być obarczone błędem (patrz Wyniki reprezentatywne).
  4. Należy uważać, aby nie przekarmiać larw, szczególnie w mniejszych pojemnikach hodowlanych o mniejszej powierzchni lustra wody i mniejszej objętości. Jeśli woda stanie się mętna lub wystąpi znaczna śmiertelność larw, wymień ją na świeżą wodę; przy optymalnym karmieniu śmiertelność powinna być pomijalna.

2. Wyklucie osobników dorosłych

UWAGA: Larwy zaczną przepacać od piątego dnia po wykluciu, jeśli będą odpowiednio karmione, a większość z nich powinna przepacić do siódmego dnia po wykluciu. Imago zaczną się wykluwać około dwóch dni po przepaczeniu, jeśli będą utrzymywane w optymalnej temperaturze 26 °C (patrz Reprezentatywne Wyniki). Rozwój larwalny zazwyczaj nie jest zaburzony przez infekcje Wolbachia , gdy zapewniona jest obfita ilość pokarmu23,39,49.

  1. Siedem dni po wykluciu przelać całą zawartość tacy przez gęste sito (rozmiar oczek 0,4 mm). Przefiltrowaną wodę z larwami zachować do późniejszego wykorzystania w naczyniach do składania jaj (patrz sekcja „Karmienie krwią i składanie jaj”). Odwrócić sito i zanurzyć je w plastikowym pojemniku z 20 mL wody, aby przenieść poczwarki. Jeśli w situ pozostały larwy, podać im dodatkowy pokarm.
  2. Przygotować klatki do wykluwania osobników dorosłych (Rycina 1C>, umieszczając w nich dwa kubki z 10% roztworem sacharozy (Rycina 1F>) oraz dwa kubki z wilgotną watą bawełnianą w celu zapobiegania wysychaniu (Rycina 1E>).
  3. Jeśli poczwarki nie wymagają segregacji według płci, umieścić zamknięte pojemniki z poczwarkami w klatce, pozostawiając pokrywki lekko uchylone, aby osobniki dorosłe mogły wykluwać się bezpośrednio do klatki. Alternatywnie, na pojemniku można umieścić odwrócony lejek, aby zminimalizować ryzyko utonięcia. Przed usunięciem pojemnika z klatki upewnić się, że wszystkie osobniki dorosłe się wykluły, aby uniknąć selekcji przeciwko osobnikom o wolniejszym tempie rozwoju.

3. Wyznaczanie płci poczwarek w celu krzyżowania zewnętrznego

  1. Jeśli poczwarki muszą zostać posortowane według płci (np. w celu krzyżowania wstecznego), przenosić poczwarki pipetą z tacek dla larw i rozdzielać płeć (Rysunek 2) do plastikowych pojemników (Rysunek 1A) zawierających 20 mL wody co 24 h, aż do uzyskania pożądanej liczby osobników każdej z płci. Zamknąć pojemniki pokrywkami i pozostawić je zamknięte.
  2. Imago wyklują się do pojemników; potwierdzić ich płeć przed przeniesieniem do klatek (Rysunek 2C). Usunąć za pomocą aspiratora wszelkie błędnie określone osobniki w ciągu 24 h od wyklucia, zanim osiągną dojrzałość płciową. Po potwierdzeniu płci przenosić imago do klatek co 24 h.
  3. Aby uzyskać kolonie zainfekowane Wolbachia o podobnym tle genetycznym do populacji naturalnej, przeprowadzić krzyżowanie wsteczne, dodając samice zainfekowane Wolbachia z kolonii laboratoryjnych do klatek z niezinfekowanymi samcami pochodzącymi z jaj zebranych w terenie za pomocą pułapek owitrapowych39, utrzymując zalecaną gęstość 50 osobników na populację.
    1. Powtarzać krzyżowanie wsteczne przez co najmniej trzy kolejne pokolenia, aby uzyskać kolonie, które są w co najmniej 87,5% podobne genetycznie do populacji polowej39. Krytyczne: Należy upewnić się, że płeć została prawidłowo określona na tym etapie (patrz krok 3.1).
  4. Samice Ae. aegypti są zazwyczaj oporne na ponowne zapłodnienie w ciągu kilku godzin od kopulacji50. Podczas krzyżowania kolonii pozwolić samicom i samcom dojrzeć w oddzielnych klatkach przez dwa dni, a następnie przenieść samice aspiratorem do klatki z samcami, aby zapewnić wszystkim samcom równą szansę.

4. Żywienie krwią i składanie jaj

  1. Przed karmieniem krwią należy odczekać co najmniej trzy dni od momentu wylochania ostatniej samicy, aby zapewnić odpowiedni czas na dojrzewanie. Karmienie krwią samic powinno odbyć się w ciągu dwóch tygodni od wylochania, aby zapobiec nadmiernej śmiertelności, szczególnie w przypadku komarów zainfekowanych Wolbachia, co negatywnie wpływa na długość życia2,24,49. Dzień przed karmieniem należy usunąć kubeczki z cukrem, aby zwiększyć efektywność żerowania.
    1. Poproś wolontariusza o włożenie przedramienia do klatki, aby umożliwić samicym komarów pobranie krwi. Większość samic powinna nasycić się w ciągu 5 min, jednak aby ograniczyć selekcję przeciwko osobnikom żerującym wolniej, należy pozostawić przedramię w klatce przez 15 min lub do momentu, gdy wszystkie samice będą widocznie przepełnione; opcjonalnie, ale zaleca się użycie rękawiczki lateksowej w celu ochrony dłoni przed ukąszeniami.
    2. Dwa dni po karmieniu krwią należy umieścić w klatce dwa plastikowe kubeczki zawierające wodę do hodowli larw, wyłożone paskiem papieru ściernego (Rysunek 1G) (lub papierem filtracyjnym (Rysunek 1H)), aby samice mogły złożyć jaja. Pasek papieru ściernego należy częściowo zanurzyć w wodzie, aby utrzymać go w stanie wilgotnym. Należy usunąć inne źródła wody, aby zapobiec składaniu jaj przez samice poza kubeczkiem do ovipozycji.
      UWAGA: W kubeczkach można stosować wodę z kranu, jednak woda do hodowli larw sprzyja ovipozycji51,52, a samice składają wtedy jaja w sposób bardziej synchroniczny.

5. Pobieranie i kondycjonowanie jaj

  1. Samice złożą jaja na papierze ściernym tuż nad lustrem wody; codziennie zbieraj i wymieniaj paski papieru ściernego, aż do momentu zaprzestania składania jaj. Należy pamiętać, że ovipozycja może trwać do jednego tygodnia.
  2. Wstępnie osusz paski papieru ściernego, delikatnie odciskając je ręcznikiem papierowym przez 30 s, uważając, aby nie usunąć jaj. Następnie zawiń paski w arkusz suchego ręcznika papierowego i umieść go w szczelnym plastikowym woreczku (Rysunek 1I). 
  3. Sprawdź stan jaj pod mikroskopem dissectingowym (Rysunek 3). Jeśli paski papieru ściernego są zbyt wilgotne, jaja mogą wykluć się przed zanurzeniem w wodzie (Rysunek 3B), natomiast w przypadku zbyt silnego osuszenia jaja mogą ulec zapadnięciu (Rysunek 3C).
  4. Jaja można inkubować w dowolnym momencie po trzech dniach od momentu zebrania; wykluj wszystkie jaja z każdej kolonii, zebrane we wszystkich dniach, w tym samym naczyniu z wodą, aby zapewnić, że następne pokolenie zostanie pobrane z dużej, losowej puli osobników.
  5. Do długotrwałego przechowywania umieść jaja w szczelnym pojemniku przy wysokiej (> 80%) wilgotności w temperaturze około 20 °C. W tych warunkach jaja pozbawione Wolbachia mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przy zachowaniu wysokiej wskaźnika wylęgu53,54.
  6. Ponieważ niektóre infekcje Wolbachia znacznie zmniejszają żywotność jaj wraz z upływem czasu49,5, wykluj jaja z linii zainfekowanych Wolbachia w ciągu jednego tygodnia od zebrania, aby zapobiec nadmiernej śmiertelności odpowiednich szczepów. Jeśli potrzebne są więcej jaj, po tygodniu ponownie podaj samicom pokarm krwi.
DzieńKrok
0Wylęganie jaj
1Przenoszenie larw do tacek i ich liczenie
7Przenieś larwy i poczwarki do klatek koloni
17Karmienie krwią dorosłych osobników żeńskich
21Rozpocząć pobieranie jaj
25Zakończ zbieranie jaj
28Wylęganie jaj

Tabela 1: Przegląd harmonogramu utrzymywania kolonii Ae. aegypti w temperaturze 26 °C. Termin karmienia samic krwią oraz wyklucia się jaj jest elastyczny, jednak należy unikać długiego czasu trwania tych etapów, szczególnie w przypadku komarów zainfekowanych Wolbachia, aby zminimalizować śmiertelność. Przestrzeganie tego harmonogramu minimalizuje selekcję przeciwko komarom o szybkim lub wolnym tempie rozwoju lub dojrzewania na wszystkich etapach życia, pod warunkiem optymalnego karmienia larw.

Typy i konfiguracje pojemników do hodowli owadów; przedstawiono różne tacki plastikowe, pudełko z siatki oraz opisane pojemniki do przechowywania w celu organizacji eksperymentów.
Rycina 1: Sprzęt używany do hodowli Ae. aegypti w laboratorium. (A) Plastikowe pojemniki używane do inkubacji jaj lub hodowli larw o objętościach 500, 750 i 50 ml (od lewej do prawej). (B) Tace używane do hodowli larw przy kontrolowanej gęstości, zazwyczaj 50 larw w 4 L wody. (C) 19,7 L i (D) klatki o pojemności 3 L używane do hodowli osobników dorosłych. Należy zachować zagęszczenie nieprzekraczające 25 osobników dorosłych na litr, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń. (E) kubek o pojemności 35 ml z wilgotną watą bawełnianą, służącą jako źródło wody dla osobników dorosłych. (F) kubek 35 ml z roztworem sacharozy dostarczanym za pomocą sznurka lub knotka dentystycznego jako źródła cukru. (G-H) kubki wypełnione wodą do hodowli larw i wyłożone podłożem do składania jaj w postaci papieru ściernego lub papieru filtracyjnego (G i H, odpowiednio). (I) Woreczek strunowy używany do przechowywania pasków papieru ściernego lub papieru filtracyjnego. Czarne kropki na papierze ściernym to jaja komarów. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat cyklu życiowego komara: stadia larwalne, poczwarki i postać dorosła; porównanie wielkości; badanie entomologiczne.
Rysunek 2: Widok boczny (A) i grzbietowy (B) poczwarek oraz osobnika dorosłego *Ae. aegypti* (C) wykazujące dymorfizm płciowy. Na każdym panelu samce znajdują się po lewej stronie, a samice po prawej. W warunkach optymalnego żywienia poczwarki samców i samic różnią się rozmiarem; samice są większe od samców (A) i mają stosunkowo kulisty głowotułów w porównaniu do samców, których boki są bardziej spłaszczone (B). Dorosłe samce są łatwo odróżnialne od samic we wszystkich warunkach hodowlanych, przede wszystkim ze względu na pierzaste czułki i długie palpy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wzorce rozsiewania nasion; diagram A-C; skala milimetrowa; badanie ekologiczne; analiza rozmieszczenia nasion.
Rycina 3. Czterodniowy Ae. aegypti jaja w różnych warunkach. (A) Nieuszkodzone jaja na paskach papieru ściernego utrzymywane w wysokiej (> 80%) wilgotności, ale bez widocznej obecności wody. Odsetek wyklucia powinien przekraczać 90% dla typu dzikiego Ae. aegypti przy prawidłowej konserwacji. (BJaja, które wyklują się przed zanurzeniem w wodzie (przedwczesne wyklucie), można rozpoznać po oddzielonej pokrywce jajowej i widocznej larwie. Świadczy to o zbyt wysokiej wilgotności paska papieru ściernego.CJaja, które zostały zbyt gwałtownie wysuszone, mogą ulec zapadnięciu, co jest wyraźnie widoczne w postaci ich wklęsłego wyglądu. Sztywność papieru ściernego również wskazuje na to, że jaja mogą być zbyt suche. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 4 przedstawia wpływ suboptimalnego odżywienia na rozwój larw Ae. aegypti. W przypadku zapewnienia w pojemnikach 0,25 mg pokarmu na larwę na dobę lub mniej, czas rozwoju wydłuża się zarówno u samców, jak i u samic, a proces ten jest mniej synchroniczny niż w pojemnikach, w których dostarczano 0,5 mg pokarmu. Brak odpowiedniej ilości pokarmu przez cały okres rozwoju larwalnego może negatywnie wpłynąć na harmonogram utrzymania hodowli. Osobniki r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem utrzymania zakażonych Wolbachia Ae. aegypti powinien zapewnić, że zdrowe komary o stałej jakości są produkowane do eksperymentów i wypuszczania na otwartym polu. W przeciwieństwie do innych protokołów, które priorytetowo traktują produkcję masowych ilości komarów (patrz odniesienie57), metody koncentrują się na maksymalizacji ich przydatności, zarówno w obrębie pokoleń poprzez wdrożenie złagodzonych warunków chowu, jak i między pokoleniam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Heng Lin Yeap, Chrisowi Patonowi, Petrinie Johnson i Clare Doig za ich wkład w rozwój naszych metod utrzymania kolonii, a trzem anonimowym recenzentom za ich sugestie, które pomogły ulepszyć rękopis. Nasze badania są wspierane przez grant programowy i stypendium dla AAH od National Health and Medical Research Council oraz grant tłumaczeniowy od Wellcome Trust. PAR jest laureatem stypendium Australijskiego Rządowego Programu Szkoleń Badawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dziki typ Aedes aegyptiZebrany z lokalizacji terenowych w Queensland w Australii, zobacz Yeap i inni39 aby uzyskać szczegółowe informacje
w Mel-infected Aedes aegyptiDostarczone przez Monash University. Zapoznaj się z Walker and others23 aby uzyskać informacje na temat szczepu
w Aedes aegyptiDostarczone przez Monash University. Zapoznaj się z Xi i innymi21 aby uzyskać informacje na temat szczepu
w zakażonego MelPop Aedes aegyptiDostarczone przez Monash University. Zapoznaj się z McMeniman i innymi22 aby uzyskać informacje na temat szczepu
Instant suszone drożdżeLowanStymuluje wylęganie się jaj. Znalezione w ogólnych sklepach spożywczych. Inne marki mogą być używane
5 L plastikowa wannaKwadrantQ110950Służy do wylęgu i hodowli larw. Można stosować inne produkty
Pokarm dla ryb (Tetramin Tropical Tablets)Tetra16152Dostarczany larwom jako źródło pożywienia. Adres internetowy: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Pojemniki plastikoweSłuży do hodowli larw. Każdy plastikowy pojemnik o pojemności powyżej 500 ml powinien być odpowiedni
Szklana pipetaSłuży do przenoszenia larw i poczwarek między pojemnikami. Adres internetowy: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Licznik klikającyRS Pro710-5212Służy do pomocy w liczeniu larw, poczwarek i jaj. Adres internetowy: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Tacki hodowlaneGratnellsSłuży do hodowli larw. Adres internetowy: http://www.gratnells.com
SiatkaSłuży do przenoszenia larw i poczwarek do pojemników ze słodką wodą. Mogą być używane inne marki. Adres internetowy: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
KlatkiBugDormDP1000Domy dla dorosłych komarów. Można stosować produkty alternatywne. Adres internetowy: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 ml plastikowy kubekHuhtamakiAA272225Służy do dostarczania wody lub sacharozy dorosłym komarom. Inne marki mogą być używane
35 ml plastikowa pokrywka do kubkaHuhtamakiGB030005Służy do dostarczania sacharozy dorosłym komarom. Można stosować inne marki
WataCutisoft71841-13Wilgotna wata służy jako źródło wody dla dorosłych. Inne marki mogą być używane
Biały cukierDostarczony jako źródło cukru dla dorosłych komarów. Znalezione w ogólnych sklepach spożywczych
LinaM Recht AkcesoriaC323C/WSłuży do dostarczania roztworu sacharozy osobom dorosłym. Mogą być używane inne marki. Adres internetowy: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastikowy kubek (duży)Używany jako pojemnik do składania jaj. Każdy plastikowy kubek, który mieści 100 ml wody, powinien być odpowiedni
Papier ściernyNorton Master PaintersCE015962Dostarczone jako podłoże do składania jaj. Można stosować alternatywne produkty, ale używamy tej marki, ponieważ jest stosunkowo bezwonna. Jaśniejsze kolory są używane dla kontrastu z jajkami. Adres internetowy: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Bibuła filtracyjnaWhatman1001-150Stosowana jako alternatywne podłoże do składania jaj. Inne marki mogą być używane
: Rękawiczki lateksoweSemperGuardZ560979Zapobiega ukąszeniom komarów na rękach podczas karmienia krwią. Mogą być używane inne marki. Adres internetowy: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/
nylonowa

Bibliografia

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. , 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37 (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36 (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25 (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16 (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24 (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26 (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48 (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29 (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1797(2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22 (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20 (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37 (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), e0135194(2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11 (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310 (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323 (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434(2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra237(2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792(2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892(2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846(2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563(2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11 (8), e0160196(2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8 (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36 (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80 (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3294(2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4 (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33 (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187 (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3 (9), e516(2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89 (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9 (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. , Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14 (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48 (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38 (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13 (1), e1006006(2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17 (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94 (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94 (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34 (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5 (4), e1015(2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57 (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40 (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4 (7), e748(2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10 (1), e0004320(2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579(2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19 (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78 (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118 (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21 (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13 (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48 (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67 (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. , (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95 (5), 1169-1173 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

zakażenie Wolbachiahodowla komarówutrzymanie laboratoryjneprotokół krzyżowania zewnętrznegokontrola temperaturyregulacja wilgotnościkarmienie larwprzenoszenie poczwarekzbieranie jaj
Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.