Izolacja i charakterystyka pierwotnych komórek śródmiąższowych zastawki szczura: nowy model do badania zwapnienia zastawki aortalnej

Summary

Ten protokół opisuje izolację, hodowlę i zwapnienie komórek śródmiąższowych zastawki pochodzących od szczurów, wysoce fizjologiczny model in vitro zwapnienia zastawki aortalnej (CAVD). Wykorzystanie tego szczurzego modelu ułatwia badania nad CAVD w badaniu mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw tego złożonego procesu patologicznego.

Abstract

Zwapnienie zastawki aortalnej (CAVD) charakteryzuje się postępującym pogrubieniem płatków zastawki aortalnej. Jest to stan często występujący u pacjentów w podeszłym wieku i ze schyłkową niewydolnością nerek (ESRD), którzy często cierpią na hiperfosfatemię i hiperkalcemię. Obecnie nie ma terapii lekowych, które mogłyby zatrzymać jej postęp. Mechanizmy leżące u podstaw tego patologicznego procesu pozostają niejasne. Płatek zastawki aortalnej składa się z cienkiej warstwy komórek śródbłonka zastawki (VEC) na zewnętrznych powierzchniach guzków aorty, z komórkami śródmiąższowymi zastawki (VIC) umieszczonymi między VEC. Zastosowanie modelu szczurzego umożliwia badanie in vitro zwapnienia ektopowego na podstawie in vivo fizjopatologicznych poziomów fosforanów (Pi) i wapnia (Ca) w surowicy pacjentów cierpiących na hiperfosfatemię i hiperkalcemię. Opisany protokół szczegółowo opisuje izolację czystej populacji szczurów VIC, na co wskazuje ekspresja markerów VIC: alfa-aktyna mięśni gładkich (α-SMA), wimentyna i tkankowy czynnik wzrostu beta (TGFβ) 1 i 2 oraz brak klastra różnicowania (CD) 31, markera VEC. Rozszerzając te VIC, można przeprowadzić badania biochemiczne, genetyczne i obrazowe w celu zbadania i rozwikłania kluczowych mediatorów leżących u podstaw CAVD.

Introduction

Zdrowa zastawka aortalna składa się z trzech listków, do których równomiernie rozdzielany jest rozkład naprężeń mechanicznych podczas otwierania i zamykania zastawki. Płatek zastawki ma zdefiniowaną strukturę trzech odrębnych warstw: włóknistej, gąbczastej i brzusznej, w której dominuje komórka śródmiąższowa zastawki (VIC). Te trzy warstwy są umieszczone pomiędzy dwoma łożyskami komórek śródbłonka zastawki (VEC)¹.

VIC odgrywają kluczową rolę w postępie zwapnienia zastawki aortalnej (CAVD), najczęstszej choroby zastawek serca w świecie zachodnim. CAVD jest opisywana jako stan postępujący, który jest aktywnie regulowany przez tkankę zastawkową i otaczające ją mikrośrodowisko. Zmiany komórkowe początkowo powodują zwłóknienie zwłóknienia, a ostatecznie rozległe zwapnienie płatków zastawki aortalnej. Prowadzi to do znacznego zwężenia zastawki aortalnej i ostatecznie do niedrożności odpływu lewej komory², pozostawiając chirurgiczną wymianę zastawki jako jedyne realne leczenie.

Patofizjologia CAVD jest złożona, ale ma podobne mechanizmy do fizjologicznej mineralizacji kości³. Chociaż wiele badań wykazało zdolność VIC do ulegania osteogennemu transróżnicowaniu i zwapnieniu^4,5, mechanizmy leżące u podstaw tego procesu nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione, co podkreśla kluczowe zapotrzebowanie na wykonalny i odpowiedni model CAVD in vitro.

Poprzednie prace wielu laboratoriów z powodzeniem wyizolowały VIC z modeli świńskich i bydlęcych oraz hodowały te komórki w warunkach zwapnienia^6,7,8. Ze względu na duży rozmiar zastawki aortalnej w tych modelach, izolacja komórek poprzez trawienie enzymatyczne była bardzo skuteczna w generowaniu czystych populacji komórek. Modele te mogą być jednak restrykcyjne ze względu na ograniczoną dostępność narzędzi molekularnych dla dużych gatunków zwierząt. W przeciwieństwie do tego, modele gryzoni pozostają korzystne ze względu na stosunkowo niższe koszty, potencjał manipulacji genetycznej i szeroki wachlarz narzędzi molekularnych, które są łatwo dostępne. Izolacja VIC z modeli małych zwierząt nie jest jednak powszechnie stosowana, co jest prawdopodobną konsekwencją trudności napotykanych podczas pracy z małymi próbkami tkanek.

Ten szczegółowy protokół opisuje kompleksową metodę bezpośredniej izolacji szczurzych VIC. Poprzez staranną sekcję zastawki, a następnie serię trawień enzymatycznych, VIC mogą być izolowane i stosowane w wielu różnych technikach eksperymentalnych, w tym w hodowli komórek, zwapnieniu i ekspresji genów. Ten niezwykle istotny model CAVD in vitro niewątpliwie w istotny sposób przyczyni się do poszerzenia naszej wiedzy na temat tego patologicznego procesu.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Użytkowników Zwierząt Instytutu Roslin, a zwierzęta były utrzymywane zgodnie z wytycznymi Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (UK) dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt. Do opisanego poniżej protokołu wykorzystano 5-tygodniowe samce szczurów Sprague Dawley.

1. Receptury odczynników

1. Przygotować pożywkę hodowlaną, używając zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco i mieszanki składników odżywczych F-12 (DMEM/F12). Dodaj 10% wysterylizowanej, inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% gentamycyny.
2. Przygotować pożywkę do zwapnienia, używając pożywki hodowlanej i 2,7 mM Ca/2,5 mM Pi.
   1. Przygotować 1 M chlorek wapnia (CaCl₂), odważając 555 mg CaCl₂ i rozpuszczając go w 5 ml wody destylowanej, aby uzyskać 5 ml 1 M CaCl₂. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby wysterylizować roztwór.
   2. Przygotować 1 M fosforan sodu, odważając 710 mg bezwodnego dwuzasadowego fosforanu sodu (Na₂HPO₄) i 600 mg bezwodnego jednozasadowego fosforanu sodu (_NaH2PO4), rozpuszczając każdy z nich oddzielnie w 5 ml wody destylowanej. Połącz 3 870 μl Na₂HPO₄ i 1 130 μl NaH₂PO₄ i przefiltruj przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu wysterylizowania roztworu.
3. Przygotuj bufor do płukania zawierający zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) i 1% gentamycyny.

2. Przygotowanie kaptura preparacyjnego

1. Wszystkie sekcje należy przeprowadzać w wentylowanym okapie, uprzednio zdezynfekowanym 70% etanolem, aby zapewnić sterylność próbek i odczynników.
2. Przed użyciem wysterylizuj narzędzia do preparowania poprzez autoklawowanie, a następnie zanurzenie końcówek narzędzi w zlewce zawierającej 70% etanolu.
3. Przygotować zlewki zawierające bufor do przemywania i namoczyć narzędzia do preparowania w buforze do przemywania przed wejściem w kontakt ze zwierzęciem lub tkankami. Bufor do płukania należy przez cały czas utrzymywać na lodzie.

3. Ekstrakcja pierwotnych szczurzych VICów

UWAGA: Do opisanego poniżej protokołu użyto 5-tygodniowych samców szczurów rasy Sprague Dawley.

1. Odstrzał szczurów (~ 100 g) przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.
2. Aby wyciąć serce każdego szczura, umieść zwierzę na wznak na szklanej desce sekcyjnej i zdezynfekuj skórę, spryskując ją 70% etanolem.
3. Wykonaj 4-centymetrowe nacięcie w linii środkowej szczura za pomocą nożyczek preparacyjnych, aby odsłonić jamę brzuszną i ostrożnie usuń klatkę piersiową i płuca, aby odsłonić serce.
4. Usuń serce za pomocą ostrych, zakrzywionych sprężynowo nożyczek i przechowuj wycięte serce w lodowatym buforze do mycia, aż wszystkie grube sekcje szczurów zostaną zakończone.
5. Aby przeprowadzić mikrosekcję każdego serca, przenieś je na szalkę Petriego pokrytą buforem do mycia. Przytnij mięsień sercowy za pomocą prostych nożyczek sprężynowych (ostrze 6 mm), aby pozostawić niewielki obszar otaczający aortę wstępującą i korzeń aorty.
6. Za pomocą tych samych sprężynowych nożyczek prostych (ostrze 6 mm) ostrożnie rozetnij aortę wstępującą w kierunku lewej komory i odsłoń płatki zastawki aortalnej.
7. Przenieś otwartą aortę na świeżą, sterylną szalkę Petriego wypełnioną HBSS. Wypreparuj płatki zastawki aortalnej, oznaczone unikalnym kształtem litery "U" u podstawy aorty, za pomocą pary mikronożyczek do kapsulotomii typu Vannas (ostrze 3 mm).
8. Przechowywać wszystkie ulotki w 1 ml lodowatego buforu do mycia na zimno, w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aż wszystkie rozbiory zostaną zakończone.
9. Po zebraniu wszystkich listków należy je odwirować w stężeniu 100 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu usunięcia buforu do płukania.
10. Wykonaj kolejne kroki w kapturze do hodowli komórkowych, aby zapewnić sterylizację. W celu usunięcia VEC należy roztrawić ulotki w 100 μl 425 U/ml kolagenazy II przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zakłócić trawienie, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
11. Wirować przy 100 x g przez 30 s w celu osadzenia listków i ostrożnie wyrzucić supernatant. Przemyć dwukrotnie buforem płuczącym o pojemności 500 μl i ponownie granulować komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 30 s.
12. Aby pobrać VIC z ulotek, należy je trawić za pomocą 100 μl kolagenazy II o stężeniu 425 μl/ml przez 2 godziny, a następnie uwolnić VICs, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
13. Rozcieńczyć kolagenazę II w 19 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 670 x g przez 5 minut w celu osadzenia VIC i pozostałych resztek ulotki zaworu. Odrzucić supernatant i odpowiednio przenieść ulotki i VIC na płytki/kolby hodowlane (tabela 1).
14. Hodować VIC przez 5-7 dni w pożywce, aż do osiągnięcia zbiegu w temperaturze 37 °C, w obecności 5% (dwutlenek węgla) CO_{2 ,} zmieniając pożywkę po 72 godzinach. Do późniejszego wykorzystania w eksperymentach in vitro, pasaż do 5 razy, gdy konfluencja osiągnie 100%.

4. Indukcja zwapnienia szczurzych VICs

UWAGA: Dla wszystkich eksperymentów, policz komórki za pomocą hemocytometru.

1. Wykonaj wszystkie pierwotne wysiewy komórek i pasażowanie w wysterylizowanych okapach, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Aby przygotować pierwotne VIC szczurów do eksperymentów zwapnienia in vitro, należy wysiać komórki o gęstości 150 000 komórek/dołek na płytkach 6-dołkowych. Utrzymywać w pożywce do ≥ 90% zbiegu (zwykle 72 godziny).
2. Poddać VIC działaniu zwapnienia w porównaniu z pożywką kontrolną i inkubować w temperaturze 37 °C, w obecności 5% CO₂ , przez dodatkowe 72 godziny.
3. W celu zbadania zwapniałych pierwotnych szczurzych VIC do dalszych analiz, należy usunąć pożywkę do zwapnienia/kontroli i przemyć monowarstwy buforem do przemywania w celu usunięcia niezwiązanych jonów Ca i Pi.

5. Charakterystyka VIC szczura

1. W celu barwienia immunologicznego w celu monitorowania markerów fenotypowych, takich jak wimentyna i α-SMA, należy zasiać szczurze VIC o gęstości 150 000 komórek/dołek w 6 dołkach zawierających szkiełka nakrywkowe (komórki będą rosły na powierzchni szkiełek nakrywkowych) i pozostawić do wzrostu do 50% zbieżności.
2. Odessać pożywkę hodowlaną i utrwalić monowarstwy komórek 4% paraformaldehydem (PFA) przez 10 minut, a następnie przemyć je 3 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), za każdym razem przez 5 minut.
   Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
3. Inkubować monowarstwę komórkową z buforem blokującym i przepuszczalnym (1x PBS, 5% normalnej surowicy tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe, 0,3% Triton X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Monowarstwy komórek inkubować mysią anty-wimentyną i króliczymi przeciwciałami anty-α-SMA rozcieńczonymi w buforze do rozcieńczania przeciwciał (1% albuminy surowicy bydlęcej + 0,3% Triton X-100 w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając na bujaku.
   UWAGA: Kontrole ujemne składały się z niesprzężonych mysich IgG i króliczych IgG, przy użyciu tych samych rozcieńczeń, co próbki testowe.
5. Następnego dnia zmyć przeciwciała pierwszorzędowe 3 razy PBS, za każdym razem przez 5 minut.
6. Inkubować monowarstwy komórek z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając na kołysce.
7. Umyj 3 razy PBS i delikatnie wytrzyj szkiełka nakrywkowe (które zawierają wirusy VIC szczurów) za pomocą kleszczy i umieść na szkiełku nakrywkowym zawierającym 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI). Pozostawić szkiełka do utwardzenia przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C przed wizualizacją za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
8. W przypadku analizy Western blot należy wysiać szczurze VIC o gęstości 150 000 komórek/dołek w 6 dołkach i pozostawić do wzrostu w pożywce hodowlanej, aż do 100% zlewania się.
9. Użyj 8 μg białka do przeprowadzenia Western blot w celu zmierzenia ekspresji CD31 i wykluczenia jakiegokolwiek zanieczyszczenia VEC.
   UWAGA: Zastosowano standardowy protokół Western blot, jak opisano wcześniej⁹.
10. W przypadku badań genów należy wyekstrahować kwas rybonukleinowy (RNA) za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z wytycznymi producenta.
11. Uzyskaj cDNA za pomocą odwrotnej transkrypcji w celu pomiaru ekspresji docelowych genów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-PCR; znanego również jako qPCR) z detekcją zielonego fluoroforu, używając Gapdh jako genu referencyjnego, jak opisano wcześniej¹⁰.
    1. Do analizy PCR należy użyć następującego programu: 1 cykl 94 °C przez 3 min, 30 cykli 94 °C przez 30 s, 63 °C przez 30 s, 72 °C przez 35 s i na koniec 1 cykl 72 °C przez 5 min.
    2. Do analizy qPCR należy użyć następującego programu: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut, 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 minutę i dodatkowy cykl w temperaturze 95 °C przez 1 minutę, 55 °C przez 30 s i 95 °C przez 30 s.
12. Uruchom elektroforezę żelową, aby przeanalizować produkty PCR przy użyciu 2% żelu agarozowego w buforze Tris/Boran/EDTA (TBE).

6. Badania zwapnienia VIC u szczurów

1. W przypadku badań nad Alizarin Red S i biochemicznym zwapnieniem należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wysiewu i zwapnienia opisanymi w punkcie 4.
2. Wybarwić monowarstwy komórek 5% roztworem czerwieni Alizaryn S, delikatnie kołysząc na shakerze, przez 20 minut. Następnie umyć 3 razy wodą destylowaną, za każdym razem przez 5 minut. Zdobądź zdjęcia każdej studni.
3. Aby określić ilościowo osadzanie Ca, użyj biochemicznego zestawu do oznaczania Ca. Wypłukiwać jony Ca²⁺ za pomocą 0,6 M kwasu solnego (HCl) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
4. Zebrać supernatant i zmierzyć stężenie Ca za pomocą zestawu do oznaczania Ca (patrz tabela materiałów) zgodnie z wytycznymi producenta.
5. Obliczyć stężenie wapnia jako ułamek całkowitego białka komórkowego. Denaturacja białek komórkowych z monowarstw komórek za pomocą 0,1 M wodorotlenku sodu (NaOH) + 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS). Określić całkowite stężenie białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem (DC) zgodnie z wytycznymi producenta.

Results

Celem tego protokołu było opisanie izolacji pierwotnych szczurzych VICów i hodowli ich do eksperymentów zwapnienia in vitro. Dzięki zastosowaniu opisanej powyżej metody, szczurze VIC mogą być z powodzeniem izolowane i rozszerzane w celu zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za CAVD.

Pierwotne VICs szczurów kolokalizują się z ustalonymi znacznikami VIC:

Fenotyp VIC izolowanych komórek został potwierdzony za pomocą immunofluorescencji poprzez sondowanie markerów VIC: wimentyny i α-SMA (odpowiednio czerwonego i zielonego, Rysunek 1A) i jest zgodny z poprzednimi raportami^11,12. Reprezentatywne kontrole ujemne przy użyciu niesprzężonych mysich i króliczych IgG przedstawiono na Rysunek 1B. Dodatkowo ekspresję regulatora wzrostu VIC TGFβ-1 i TGFβ-2 potwierdzono za pomocą analizy PCR (Figura 1C). W celu potwierdzenia, że izolowane pierwotne VIC szczurów były wolne od zanieczyszczenia śródbłonka, przeprowadzono analizę Western blot w celu sprawdzenia, czy VIC szczurów były ujemne dla markera komórek śródbłonka, CD31, przy użyciu VEC mitralnych psów jako kontroli pozytywnej (Figura 1D).

Ca i Pi wywołują zwapnienie VIC u szczurów:

Podwyższone ogólnoustrojowe stężenia Ca i/lub Pi zazwyczaj powodują zwapnienie VIC in vitro. Aby docenić potencjał zwapnienia izolowanych szczurzych VIC, komórki wystawiono na podwyższone poziomy Ca i Pi, które naśladują patologiczne stany hiperkalcemii i hiperfosfatemii u pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek. Leczenie VIC zwapnieniem indukowanym 2,7 mM Ca/2,5 mM Pi, określone przez barwienie czerwienią alizarynową S do osadzania Ca (Rysunek 2A) i kolorymetryczne oznaczanie poziomów Ca po wymywaniu HCl (81 razy; p < 0,05 za pomocą testu t-Studenta; Rysunek 2B).

Zmiany ekspresji genów związane ze zwapnieniem VIC:

Zwapnienie komórek naczyniowych in vitro wiąże się z odrębnym profilem molekularnym. W niniejszym badaniu leczenie VIC z 2,7 mM Ca/2,5 mM Pi wywołało znaczny wzrost ekspresji mRNA markerów osteogennych: Msh homeobox 2, Msx2 (2,04-krotna zmiana; p < 0,01; Rysunek 3A), fosfataza alkaliczna, Alpl (zmiana 1,49 raza; p < 0,001; Rysunek 3B), oraz fosfoetanoloamina/fosfocholina, Phospho1 (4,7-krotna zmiana; p < 0,01 przy użyciu jednokierunkowej analizy ANOVA; Rysunek 3C). Jednak ekspresja markera osteogennego, Runx2, i inhibitora zwapnienia, ektonukleotydu pirofafatazy, Enpp1, pozostała niezmieniona (Ryc. 3D-E).

Rysunek 1. Ekspresja markerów VIC. (A) Immunofluorescencja wykazująca podwójne barwienie i kolokalizację aktyny alfa-mięśni gładkich (α-SMA; zielona) i wimentyny w komórkach śródmiąższowych zastawki (VIC). (B) Reprezentatywny obraz kontroli ujemnych z wykorzystaniem IgG myszy i królika. Jądra są barwione na niebiesko przy użyciu 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI). Podziałka = 50 μm. (C) Obecność transformującego czynnika wzrostu beta 1 (TGFβ-1) i TGFβ-2 w VIC (Pasy 1-3), jak wykazano w analizie PCR. Pas 4 to kontrola wody. Użytym genem referencyjnym był Gapdh. (D) Analiza Western blot wykazująca obfitą ekspresję CD31 w komórkach śródbłonka zastawki mitralnej psów (VEC) w porównaniu z brakiem ekspresji w VIC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Zwapnienie in vitro wirusów VIC u szczurów. Osadzanie się Ca w VIC poddanych działaniu 2,7 mM Ca/2,5 mM Pi, zgodnie z ustaleniami: (A) Fotografia przedstawiająca barwienie czerwienią S alizaryny monowarstw komórkowych w studzience oraz (B) kolorymetryczne oznaczanie poziomów Ca po wymywaniu HCl. Test t-Studenta został przeprowadzony w celu przeanalizowania istotności między dwiema grupami danych. Wyniki przedstawiono jako średnią ± S.E.M. *p 0,5 < porównaniu z kontrolą; (n = 4).

Rysunek 3. Zmiany ekspresji genów związane ze zwapnieniem VIC. Krotna zmiana ekspresji mRNA markerów osteogennych (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2 i (E) Enpp1 w VIC traktowanych 2,7 mM Ca / 2,5 mM Pi przez 48 godzin. Ekspresja mRNA jest pokazana jako krotna zmiana w porównaniu z endogennym genem odniesienia Gadph. Przeprowadzono jednoczynnikową ANOVA przy użyciu ogólnego modelu liniowego obejmującego porównania parami w celu przeanalizowania istotności między wieloma grupami. Wyniki przedstawiono jako średnią ± S.E.M. **p < 0,01; p < 0,001 w porównaniu z kontrolą; (n = 6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Liczba ulotek zaworów	Płytka/kolba hodowlana
od 9 do 15	1 dołek w płytce 12-dołkowej
od 15 do 30	1 dołek w płytce 6-dołkowej
30+	Zobacz materiał T25

Tabela 1. Ogólne wytyczne dotyczące liczby listków wymaganych do pierwszego siewu.

Discussion

Ten szczegółowy protokół opisuje praktyczną metodę pozyskiwania pierwotnych wirusów VIC u szczurów, umożliwiając izolację tych komórek z zastawek serca szczura poprzez trawienie enzymatyczne. Nasza metoda dodatkowo wspiera i rozszerza zastosowanie wcześniej opisanego modelu in vitro szczura do badania zwapnienia zastawki aortalnej¹³. Izolacja VIC od zastawki aortalnej wprowadza możliwość zanieczyszczenia z sąsiednich VEC. Jednak nasze dane immunofluorescencyjne potwierdzają, że początkowy etap trawienia jest wystarczający do usunięcia VEC, co powoduje, że izolowane komórki są ujemne dla markera komórek śródbłonka, CD31. Ponadto barwienie α-SMA potwierdza aktywowany fenotyp VIC, który jest wymagany do zwapnienia¹².

Izolacje VIC były wcześniej zgłaszane w dużych modelach zwierzęcych ^6,7,8. Gatunki te są jednak ograniczone przez ograniczone narzędzia genetyczne i molekularne dostępne do dalszych badań, a także ich ograniczoną dostępność w laboratoriach na całym świecie. W przeciwieństwie do tego, takie narzędzia są dobrze ugruntowane w przypadku łatwo dostępnych gryzoni, a zatem zdolność do izolowania VIC pochodzących od szczurów umożliwia większą zdolność projektowania eksperymentalnego. Zastosowanie VIC od młodych szczurów oznacza również, że komórki są stosunkowo bardziej proliferacyjne niż u starszych szczurów, dlatego wymagają mniejszej liczby zwierząt do uzyskania większej liczby komórek. Chociaż myszy są łatwo dostępne, ale ze względu na to, że myszy mają znacznie mniejsze serca, izolacja pierwotnych mysich VIC byłaby bardziej czasochłonna i znacznie więcej zwierząt musiałoby wyizolować tę samą wydajność komórek, co model szczurzy.

Istotną zaletą tego opisanego podejścia jest to, że VIC mogą być czasowo izolowane od szczurów typu dzikiego i transgenicznego, a także od szczurzych modeli chorób sercowo-naczyniowych i uszkodzeń zastawek. Wykorzystanie modelu szczurzego wymagałoby większej liczby zwierząt do eksperymentów na dużą skalę, dlatego też, aby zmniejszyć wykorzystanie zwierząt, pierwotne szczurze VIC mogą zostać przekształcone w celu wytworzenia linii komórkowej po jej dokładnym scharakteryzowaniu.

Chociaż poważne implikacje kliniczne CAVD są powszechnie znane, mechanizmy przyczynowe leżące u ich podstaw nie zostały jeszcze określone. Ponadto obecnie nie są dostępne skuteczne terapie farmakologiczne, które mogą zapobiegać i potencjalnie leczyć zwapnienie zastawki aortalnej. Hodowla VIC w warunkach zwapnienia zapewnia zatem bardzo istotny model CAVD in vitro. Pokazujemy, że podwyższone poziomy Ca i Pi indukują zwapnienie in vitro izolowanych szczurzych VIC przy jednoczesnym wzroście ekspresji osteogennych markerów genowych Msx2, Alpl i Phospho1. Powszechnie wiadomo, że markery te są związane z patologicznym procesem zwapnienia naczyń 14,15,16. Nasze dane pokazują zatem, że hodowla VIC szczurów w pożywce wapniącej jest odpowiednim modelem do badania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro. Rzeczywiście, ostatnie badania z naszego laboratorium wykorzystały ten model, aby wykazać, że Ca sprzyja zwapnieniu zastawki aortalnej poprzez wzbogacenie Aneksyny VI pęcherzyków macierzy pochodzących z VIC¹⁷.

Pomimo korzyści płynących ze stosowania szczurzych VIC i ich skutecznej charakterystyki, nadal istnieją pewne ograniczenia. Po pierwsze, wielkość populacji VIC w zastawkach szczurów jest bardzo mała, a zatem potrzeba wielu zwierząt, aby wygenerować wystarczającą liczbę komórek do szeroko zakrojonych badań in vitro . Możliwe jest jednak przezwyciężenie tego ograniczenia poprzez podjęcie wstępnych badań na unieśmiertelnionych liniach komórek śródmiąższowych zastawek, jak niedawno donieśliśmy¹⁸, a następnie zastosowanie kultur pierwotnych w celu weryfikacji i rozszerzenia tych wyników.

Podsumowując, opisana metoda wyjaśnia pomyślną izolację, hodowlę i zwapnienie pierwotnych szczurzych VIC, które mogą być następnie oceniane za pomocą różnych analiz, w tym testów biochemicznych, a także analiz białek i RNA. Model ten oferuje niezawodny i wygodny system do badania CAVD in vitro i stanowi cenne narzędzie do badania mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za tę destrukcyjną chorobę.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nożyczki preparacyjne	World Precision Instruments	14393	Autoklaw przed użyciem.
Sprężyna prosta (ostrze 8 mm)	Autoklaw World Precision Instruments	15905	przed użyciem.
Nożyczki SuperFine Vannas (ostrze 5 mm, 8 cm)	Autoklaw World Precision Instruments	14003	przed użyciem.
Pęseta Dumont #5 (11 cm)	World Precision Instruments	500342	Autoklaw przed użyciem.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific	11320074
Płodowa surowica bydlęca	Thermo Fisher Scientific	10500064	Filtr przed dodaniem do pożywki.
Gentamycyna	Thermo Fisher Scientific 15710049
Absolutny etanol	Thermo Fisher Scientific	E/0650DF/17	Rozcieńczyć do 70% v/v w wodzie destylowanej.
Kwas solny (HCl)	Thermo Fisher Scientific	H1150PB17	Rozcieńczyć do 0,6 M wodą destylowaną.
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	UN1823	Rozcieńczyć do 0,1 M wodą destylowaną.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36931
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-mysie	Thermo Fisher Scientific	A11005	1/250 rozcieńczenie w buforze do rozcieńczania przeciwciał.
Alexa Fluor 488 przeciwciało przeciw królikowi osła	Thermo Fisher Scientific	A21206	/250 rozcieńczenie w buforze do rozcieńczania przeciwciał.
Indeks górny II zestaw	Thermo Fisher Scientific	18064014
dNTP	Thermo Fisher Scientific	18427013
Losowe startery	Thermo Fisher Scientific	P/N58875
Taq Zestaw polimerazy	Thermo Fisher Scientific	18038026
Tris/Boran/EDTA (TBE)	Thermo Fisher Scientific	AM9863	Rozcieńczyć do 1x z rozpyloną wodą przed użyciem.
Agaroza	Thermo Fisher Scientific	16500	2% w 1x Tris/Boran/EDTA(TBE).
Bufor do lizy (RIPA)	Termo Fisher Scientific	89900
T75	kolba Thermo Fisher Scientific	156472
T175	Thermo Fisher Scientific	159920
płytki qPCR	Thermo Fisher Scientific	AB0990
Rat Msx2 primer	Qiagen	QT01084090
Rat Alpl primer	Qiagen
Rat Enpp1 Primer	Qiagen	QT00181426
RNeasy minikit	Qiagen	74104
Płytki 6-dołkowe	Kolba Sigma	CLS3516
T25	Sigma	CLS430639
Fosforan jednozasadowy	Sigma	S5011
Fosforan dwuzasadowy	Sigma	S5136
Chlorek wapnia	Sigma	C1016
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma	5030	Rozcieńczyć do 0,1% 0,1M NaOH.
Paraformaldehyd	Sigma	P6148	Rozcieńczyć do 4% PBS.
Triton X100	Sigma	X100
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A3059
Czerwień alizarynowa S	Sigma	A5533	Uzupełnić do 2% wodą destylowaną i dostosować do pH 4,2.
TGFβ-1 para starterów: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA	Sigma		Zastosowane stężenie: 10 μ M
TGFβ-2 para starterów: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG	Sigma		Użyte stężenie: 10 μ M
Monoklonalna anty-β-aktyna− Przeciwciało peroksydazy wytwarzane w mysim	rozcieńczeniu Sigma	A3854	1/50000 w 5% BSA w soli fizjologicznej buforowanej trisem + 0,1% Tween (TBS/T).
Mysie przeciwciało anty-wimentynowe	Sigma	v6389	1/900 rozcieńczenie w bufor do rozcieńczania przeciwciał (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA), 0,3% Triton X-100).
Mysia IgG	Sigma	I5381	Rozcieńczona do tego samego stężenia podstawowego co mysie przeciwciało anty-wimentynowe przed rozcieńczeniem w buforze do rozcieńczania przeciwciał.
Rabbit IgG	GeneTex	GTX35035	rozcieńczony do tego samego stężenia podstawowego, co przeciwciało anty-&alfa--aktynowe przeciwko mięśniom gładkim królika przed rozcieńczeniem w buforze do rozcieńczania przeciwciał.
Przeciwciało anty-&alfa--mięśni gładkich królika	Abcam	ab5694	/200 rozcieńczenie w buforze do rozcieńczania przeciwciał.
Królik anty-CD31	Abcam	ab28364	rozcieńczenie 1/50 w 5% BSA inTBS/T.
Przeciwciało anty-królicze kozie sprzężone z HRP	Dako	P0448	1/3000 rozcieńczenie w 5% BSA w TBS/T.
Kolagenaza II	Worthington	41512862	Dostosować do 425 U/ml z wodą destylowaną, a następnie przefiltrować.
SYBR green mastermix	Primerdesign	PrecisionPLUS-MX-SY
Zestaw do oznaczania wapnia	Randox	CA590
DC	Bio-Rad	5000111
ECL	GE Healthcare	RPN2109
Hyperfilm ECL	Healthcare	28906837
Membrana nitrocelulozowa	GE Healthcare
drabinka PCR	Bioline	BIO-33057
Barwnik ładujący do elektroforezy żelowej	New England Biolabs	B7025S
Filtry strzykawkowe (0,22 μ m)	Merck Millipore	SLGP033RS
Coverslips	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3100
Hematocytometr	Marienfeld Superior	640030
Nazwa	Firma	>Numer katalogowy	Komentarze
Camera skonfigurowana do czerwonych obrazów Alizarin:
Camera	Nikon D800
Obiektyw	Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED
Kleszcze preparacyjne 10 cm, zakrzywione końce	Autoklaw World Precision Instruments	15915	przed użyciem.