Artykuł metodologiczny

Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56134

⸱

11 września 2017

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy użycie mikrodysekcji laserowej do uzyskania próbek różnych populacji komórek z różnych regionów mózgu do analizy genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na badanie zróżnicowanych skutków urazowego uszkodzenia mózgu w określonych obszarach mózgu szczura.

Streszczenie

Zdolność do izolowania określonych obszarów mózgu może być utrudniona w technikach dysocjacji tkanek, które nie zachowują swojego przestrzennego rozmieszczenia. Takie techniki mogą również potencjalnie zniekształcić analizę ekspresji genów, ponieważ sam proces może zmienić wzorce ekspresji w poszczególnych komórkach. Tutaj opisujemy metodę mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) w celu selektywnego zbierania określonych obszarów mózgu dotkniętych urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI) przy użyciu zmodyfikowanego protokołu barwienia Nissl (fiolet krezylowy) i wskazówek atlasu mózgu szczura. LCM zapewnia dostęp do regionów mózgu w ich naturalnych pozycjach oraz możliwość wykorzystania anatomicznych punktów orientacyjnych do identyfikacji każdego konkretnego regionu. W tym celu LCM był wcześniej używany do badania ekspresji genów specyficznych dla regionu mózgu w TBI. Protokół ten umożliwia badanie wywołanych przez TBI zmian w ekspresji genów i mikroRNA w różnych obszarach mózgu tego samego zwierzęcia. Zasady niniejszego protokołu mogą być zmieniane i stosowane do szerokiego zakresu badań oceniających ekspresję genomu w innych chorobach i/lub modelach zwierzęcych.

Wprowadzenie

Mózg ssaków jest niezwykle złożony i niejednorodny, z setkami do tysięcy typów komórek1. Rzeczywiście, badania na ludziach wykazały, że w regionach takich jak kora czołowa strukturalne i funkcjonalne różnice w istocie białej i szarej znajdują odzwierciedlenie w odrębnych i rozbieżnych profilach transkrypcyjnych2. Heterogeniczność mózgu była główną przeszkodą w interpretacji danych dotyczących ekspresji genów oraz w dziedzinie uszkodzeń mózgu. Ta niejednoznaczność w badaniach przedklinicznych doprowadziła następnie do setek nieudanych prób klinicznych leczenia urazów mózgu3.

Używamy metod mikrodysekcji laserowej (LCM) do badania dysregulacji genów wywołanej urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI) w mózgu szczura4, skupiając się na hipokampie, regionie mózgu, który jest niezbędny do uczenia się i pamięci5. Możliwość laserowego wychwytywania i analizowania ekspresji genów zarówno w umierających, jak i ocalałych neuronach daje nam lepsze zrozumienie roli stochastyczności w ekspresji genów w określaniu wyniku (przeżycia neuronów) po TBI6. Techniki LCM okazały się również przydatne do badania wpływu TBI na neurony hipokampa podczas porównywania młodych i starzejących się myszy7 lub rats8.

W ostatnich badaniach badaliśmy inne regiony mózgu szczura, na które TBI miało negatywny wpływ, skupiając się na obszarach u szczurów i u ludzkich pacjentów z TBI, które są związane z funkcjami wykonawczymi (np. kora czołowa9) i choroby współistniejące TBI; te choroby współistniejące obejmują depresję (np. jądro półleżące10) i zaburzenia rytmu dobowego (jądro nadskrzyżowaniowe11). W poprzednich badaniach Huusko i Pitkanen12 oraz Drexel et al.13 użył LCM do zbadania ekspresji genów we wzgórzu i podwzgórzu. Nasze badanie opiera się na tych wcześniejszych obserwacjach i obejmuje cztery inne regiony mózgu. Aby zbadać specyficzne dla regionu zmiany molekularne wywołane po TBI, konieczne było zdobycie wiedzy specjalistycznej w zakresie identyfikacji i uzyskiwania typów komórek w tych regionach za pomocą systemu LCM. Lasery UV i podczerwone (IR) pozwalają na precyzyjną mikrodysekcję pożądanych obszarów mózgu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób używamy tego systemu LCM, kierowanego współrzędnymi stereotaktycznymi w atlasie mózgu szczura14, do identyfikacji i laserowego przechwytywania czterech regionów mózgu szczura, na które w różny sposób wpływa eksperymentalna metoda uszkodzenia mózgu spowodowanego płynną fuzją4.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego, Galveston, Teksas, zgodnie z zaleceniami National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition, National Research Council).

1. Pobieranie tkanek, identyfikacja regionów i sekcje

  1. Badany dorosły samiec, szczury Sprague-Dawley, w wieku około sześciu tygodni i ważące 250 - 300 g, na eksperymentalne uszkodzenie płynem udarowym, jak opisano w Shimamura et al.4.
  2. Dwadzieścia cztery godziny po eksperymentalnym TBI humanitarnie poddaj zwierzęta eutanazji, umieszczając je w komorze o stężeniu izofluranu 4%, aż do głębokiego znieczulenia. Upewnij się, że śmierć nastąpi przez ścięcie, wytnij mózgi i natychmiast zamroź w sproszkowanym suchym lodzie. Zamrożone mózgi należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do momentu podzielenia na sekcje.
  3. Przed jakąkolwiek procedurą LCM, która obejmuje analizę transkrypcyjną, należy oczyścić wszystkie powierzchnie detergentem eliminującym RNazę, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i degradacji RNA.
    UWAGA: To czyszczenie obejmuje obszar używany do barwienia, kriostat, w którym tkanka jest cięta, oraz obszar wokół urządzenia LCM.
  4. Pobrać tkankę mózgową z magazynu i umieścić w kriostacie schłodzonym do temperatury -20 °C. Pozwolić mózgowi zrównoważyć się do temperatury komory kriostatu przez ~10 minut.
  5. Umieść mózg brzuszną stroną do góry na prześcieradle gazy na górze stolika kriostatu. Za pomocą czystej, wolnej od RNaz żyletki odetnij tylną część tuż obok móżdżku (można ją zachować lub wyrzucić) oraz część tuż przed skrzyżowaniem wzrokowym (och).
  6. Umieść niewielką ilość podłoża o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w dwóch oddzielnych krioformach. Umieść mózg (zawierający czołową korę asocjacyjną (FrA) i rdzeń jądra półleżącego (AcbC)) w krioformach przednią stroną do dołu. Dodać wystarczającą ilość pożywki OCT, aby pokryć tkankę.
    1. Powtórz ten krok z tkanką mózgową zawierającą hipokamp (Hp) i jądro nadskrzyżowaniowe (SCN).
    2. Pozostaw pożywkę OCT do całkowitego zamrożenia na ~ 20 minut w kriostacie.
  7. Gdy tkanka i podłoże OCT zostaną całkowicie zamrożone, wyciśnij niewielką ilość OCT na głowicę montażową i dociśnij zamrożone krioformy zawierające tkankę do głowicy montażowej. Pozwól OCT całkowicie zamarznąć, aby pleśń zawierająca tkankę była bezpiecznie przymocowana do głowy.
  8. Przymocuj mocowanie głowicy do uchwytu sekcyjnego i dokręć. Wyreguluj kąt cięcia w stosunku do ostrza kriostatu za pomocą dźwigni regulacyjnych, aby zapewnić równomierne cięcie sekcji.
  9. Ustaw grubość przekroju na 30 μm. Podczas cięcia bloku tkanki zawierającego FrA i AcbC, najpierw rozpocznij cięcie, aż kora mózgowa stanie się widoczna, a następnie rozpocznij zbieranie.
  10. Odnosząc się do Atlasu Mózgu Szczura12, przekrój i zbierz skrawki mózgu, delikatnie umieszczając szkiełka z membrany polietylenu naftalanowego (PEN) o temperaturze pokojowej na wierzchu pociętej tkanki dla FrA, aż do osiągnięcia wtórnej kory ruchowej (M2) na poziomie Bregma 5,16 mm.
    1. Wizualnie upewnij się, że szkiełko przylega, sprawdzając, czy tkanka i OCT są całkowicie stopione na szkiełku. Przechowywać wszystkie szkiełka z skrawkami tkanek w kriostacie do czasu barwienia.
  11. Kontynuuj sekcję, aż spoidło przednie (aca) stanie się widoczne i połączy się w jedno pełne spoidło pod widocznymi teraz komorami bocznymi (LV) na głębokości Bregma 1,80 mm.
  12. Zbieraj sekcje, aż LV pojawią się, aby połączyć się z aca na Bregma 0.84 mm.
  13. Po zakończeniu sekcji dla FrA i AcbC usuń zamontowany blok tkankowy i zastąp go blokiem zawierającym HP i SCN.
  14. Przekrój do momentu spłaszczenia och w Bregma -0,48 mm, gdy uwidoczni się trzecia komora (3 V).
  15. Zbieraj skrawki dla SCN od tego momentu aż do Bregma -0,72 mm, kiedy zaczyna się dekusacja nadoptyczna (sox).
    UWAGA: Może być konieczne zebranie większej liczby skrawków tkanek w całym och, ponieważ SCN jest łatwo przepuszczany.
  16. W przypadku pobierania HP należy ciąć do momentu, gdy rogi zakrętu zębatego warstwy komórek ziarnistych (GrDG) będą widocznie widoczne na głębokości Bregma -3,00 mm.
  17. Zbieraj skrawki, aż podpola CA hipokampa zostaną połączone w odcinkach koronalnych pod Bregma -4,78 mm. Ten szczegół pozwala na pełne pobranie hipokampa pod kraniotomią i miejscem urazu.
    UWAGA: Jak wykazano w poprzednich publikacjach z tego laboratorium, większość uszkodzonych komórek będzie widoczna w tym zakresie i jest to odpowiednie do analizy ekspresji genów lub mikroRNA.

2. Protokół barwienia

  1. Przed barwieniem umyj wszystkie naczynia i obszar barwienia w dygestoriach chemicznych z detergentem eliminującym RNazy. Preparat ten zmniejsza ryzyko degradacji RNA na skutek zanieczyszczenia.
  2. Przygotuj wszystkie odczynniki i roztwory barwiące w wodzie wolnej od nukleaz.
  3. Weź stojak ze szkiełkami przechowywanymi w kriostacie i umieść w dygestorium. Pozwól szkiełkom się rozgrzać przez 30 sekund. Umieść je w roztworach barwiących (przygotowanych z wodą wolną od nukleaz) w następujący sposób: 75% EtOH przez 1 min, woda wolna od nukleaz przez 1 min, 1% fiolet krezylowy przez 1 min, woda wolna od nukleaz przez 30 s, woda wolna od nukleaz przez 30 s, 95% EtOH przez 30 s, 100% EtOH przez 30 s, ksylen przez 3 min i ksylen przez 3 min.
  4. Pozostaw stojak do wyschnięcia na powietrzu nie dłużej niż 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Alternatywnie, umieść stojaki w eksykatorze próżniowym bez Rnazy w celu szybszego suszenia. Po wysuszeniu natychmiast przejdź do LCM.

3. Stereotaktyczny atlas sterowany laserowym mikrodyskrypcją z systemem LCM

  1. Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury LCM do analizy RNA, należy przetrzeć obszar pobierania i obszar wokół urządzenia detergentem eliminującym RNazy i 100% EtOH.
  2. Przestaw wyłącznik zasilania na jednostce generującej laser na podczerwień przed włączeniem podstawy mikroskopu i poczekaj, aż system zostanie zainicjowany przed uruchomieniem oprogramowania z pulpitu.
    UWAGA: Jeśli nie zostanie to zrobione w tej kolejności, oprogramowanie nie rozpozna mikroskopu.
  3. Po uruchomieniu oprogramowania i przejściu przez etapy inicjalizacji, naciśnij przycisk "Obecny etap" w "Panelu ustawień" oprogramowania. Stolik modułowy przesunie się do pozycji, w której można ładować i rozładowywać czapki i slajdy makr LCM.
  4. Umieść szkiełka membranowe PEN w uchwytach (do trzech na raz) matową krawędzią skierowaną w prawo.
    UWAGA: W przypadku umieszczenia w uchwycie w niewłaściwej orientacji oprogramowanie może nie być w stanie prawidłowo rozpoznać żądanego obszaru cięcia w podczerwieni lub UV.
  5. Kliknij pole wyboru "Mem" w "Obszarze obsługi nasadki i szkiełka" obok odpowiedniego slajdu (tj. A, B lub C). Ten krok oznacza, czy szkiełko jest szkiełkiem membranowym. Następnie kliknij żądany slajd, który chcesz najpierw przechwycić.
  6. Aby kamera wykonała kafelkowy obraz lokalizacji tkanki i orientacji w celu umieszczenia nasadki, wybierz "Obraz" na pasku narzędzi i wybierz "Uzyskaj przegląd"
    UWAGA: Jeśli użytkownik jest zaznajomiony z pobieraną tkanką, ten krok można pominąć, używając ręcznej kulki przewijania, aby ustawić "Środek regionu" do pobrania.
  7. Umieść kursor nad obszarem na obrazie sąsiadującym (lub położeniem względnym bez obrazu sąsiadującego), kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Umieść czapkę w środku regionu". Oprogramowanie automatycznie umieści czapkę w wybranej pozycji.
  8. Wybierz lokalizację.
    UWAGA: Aby upewnić się, że laser IR jest prawidłowo ustawiony i będzie wykrywał tylko obszary, w których oprogramowanie układa plamki, należy go zlokalizować przed kontynuowaniem.
    1. Przejdź do obszaru w nasadce, w którym nie ma tkanki. Kliknij "i" w okienku "Narzędzia do mikroanalizy" i wybierz zakładkę "IR Locate". Z panelu oddaj strzał testowy w podczerwieni, aby ocenić, gdzie strzela laser na podczerwień i jaki jest rozmiar plamki.
    2. Za pomocą kursora kliknij prawym przyciskiem myszy na środku punktu IR i wybierz "Zlokalizowany punkt IR"
      UWAGA: Rozmiar i intensywność wiązki podczerwieni można zmienić, ręcznie zmieniając "Moc, Średnicę lub Czas trwania" pod każdym oznaczeniem rozmiaru plamki lub przesuwając skalę u dołu okna dialogowego. Może być konieczne oddanie kilku strzałów próbnych, aby zapewnić odpowiednią wielkość plamki. Laser na podczerwień musi być ponownie zlokalizowany za każdym razem, gdy zmienia się położenie nasadki lub zamieniane są suwaki.
    3. W przypadku cięcia UV zlokalizuj laser UV, wybierając zakładkę "UV Locate" w oknie dialogowym.
      UWAGA: Ponieważ laser UV i laser IR poruszają się zgodnie, nie ma potrzeby ciągłego przesuwania lasera UV za każdym razem, gdy zmienia się położenie.
  9. Wybierz opcję "Rysowanie odręczne" w "Wybierz panel narzędzi". Za pomocą rysika do ekranu dotykowego narysuj obwód obszaru zainteresowania, uważając, aby nie stracić kontaktu między ekranem dotykowym a główką rysika. Upewnij się, że punkty początkowe i końcowe są ze sobą połączone.
    UWAGA: Plamki IR zostaną umieszczone automatycznie za pomocą oprogramowania, ale użytkownik może zdecydować się na ustawienie dodatkowych miejsc, aby upewnić się, że tkanka jest przyklejona do nasadki po wykonaniu cięcia UV.
  10. W przypadku pobierania FrA należy wykonać duży laserowy przechwyt tkanki korowej do momentu, gdy kora M2 pojawi się na Bregma 5.16 mm.
    UWAGA: Ten szczegół można zmienić w taki sposób, aby zbierane były tylko określone części FrA lub określone typy komórek.
  11. W przypadku zbierania AcbC uchwyć laserowo obszar znajdujący się w pobliżu aca.
    Rdzeń i powłoka AcbC pełnią różne funkcje i są fizjologicznie unikalne. Dlatego ważne jest, aby jak najdokładniej śledzić atlas mózgu. Zaleca się zbieranie z nie dalszej przeszłości bregma 0,84 mm, ponieważ te dwa podregiony stają się zbyt ściśle ze sobą związane.
  12. W celu zbierania Hp uchwyć laserowo podpola CA 1, 2 i 3 hipokampa, zaczynając od Bregma 3,00 mm i używając całkowicie uformowanego GrDG jako fizycznego punktu orientacyjnego do identyfikacji morfologicznej.
    UWAGA: Na potrzeby tego badania nie należy zbierać wartości powyżej -4,78 mm Bregma, które można wizualnie wyznaczyć jako punkt, w którym subpola Hp są stopione i skierowane brzusznie. Ten obszar został wybrany, ponieważ większość uszkodzonych neuronów można odkryć bezpośrednio pod miejscem uszkodzenia6.
  13. W przypadku zbierania SCN najpierw wizualnie zidentyfikuj gęsto upakowane jądra, które znajdują się grzbietowo do och, a następnie zbierz.
  14. Po zebraniu obszarów (wymienionych powyżej) przesuń LCM Macro Caps do "pozycji QC" i sprawdź, czy tkanka jest całkowicie przylegająca, wizualnie upewniając się, że tkanka przecięta promieniami UV jest przymocowana do membrany. Szybko umieść nakrętkę na cienkościennej probówce reakcyjnej o pojemności 0,5 ml wolnej od RNaz zawierającej 100 μl buforu do lizy komórek.
  15. Próbki należy krótko odwirować, aby zapewnić całkowitą lizę i przechowywać w temperaturze -80 °C. W tym momencie LCM może zostać wstrzymany, a próbki przechowywane do momentu wykorzystania do dalszej analizy genomowej6.

Wyniki

Schemat przedstawiony na Rysunku 1 ilustruje ogólny przebieg pracy w procesie LCM konkretnych obszarów mózgu z wykorzystaniem atlasu oraz potencjalne zastosowania w analizach następczych. Badanie to koncentrowało się na czterech obszarach mózgu istotnych dla patofizjologii TBI oraz rozwoju chorób współistniejących: FrA, AcbC, SCN i Hp. Ograniczeniem występującym podczas LCM konkretnych obszarów mózgu jest fakt, że lokalizacje anatomiczne są często niejasne z powodu braku wyraźnych granic, co widać na Rysunku 2 (A, D, G, J). Wykorzystanie atlasu mózgu do prowadzenia sekcjonowania i laserowego wycinania konkretnych obszarów zmniejsza prawdopodobieństwo zanieczyszczenia próbki regionami mózgu innymi niż docelowe. Przy zachowaniu staranności w śledzeniu punktów orientacyjnych tkanki, zarówno podczas sekcjonowania, jak i po barwieniu Nissla, technologia LCM może zapewnić wysoce spójny sposób pozyskiwania dyskretnych populacji komórek, jąder lub obszarów15. Długoterminowym celem tych badań jest zidentyfikowanie genów i mikroRNA, które potencjalnie mogą służyć jako zastępcze, nieinwazyjne biomarkery uszkodzeń specyficznych dla danego obszaru mózgu. Pierwszym krokiem w tym procesie opracowywania biomarkerów jest charakterystyka specyficznych dla tkanki zmian transkrypcyjnych po eksperymentalnym TBI. Dane te mogą następnie zostać skorelowane ze zmianami indukowanymi urazem w krążących biofluidach.

Przedstawione procedury zostały zoptymalizowane w celu zminimalizowania ryzyka degradacji RNA, aby umożliwić analizę RNA poprzez odwrotną transkrypcję całkowitego RNA uzyskanego metodą LCM przed ilościową reakcją PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Całkowite RNA (w tym małe i duże frakcje RNA) wyizolowano za pomocą metody kolumienkowej z tkanki pobranej za pomocą mikrodysekcji laserowej z poszczególnych obszarów mózgu. Aby ocenić integralność, jakość i ilość RNA po procedurach izolacji, próbki RNA poddano krótkiej denaturacji w 70 °C następnie poddano analizie za pomocą analizatora RNA. Pomiary jakościowe obejmowały analizę amplitud piku prążków rRNA 18S i 28S (Rycina 3), co może być reprezentatywne dla całkowitej degradacji, oraz przy użyciu "Wskaźnik integralności RNA (RNA Integrity Number)" (RIN). Przy zastosowaniu starannych technik wolnych od RNaz, RNA wyizolowane z próbek LCM zazwyczaj charakteryzuje się wartościami RIN w zakresie od 6 do 8. Niższa wartość RIN może wskazywać na niską jakość RNA i potencjalnie obniżyć dokładność analizy ekspresji genów oraz mikroRNA. Ilekroć RIN jest wyższy, rośnie pewność co do poprawności wyników uzyskanych z analizy RNA.

Analizę RT-qPCR przeprowadzono z wykorzystaniem zestawów starterów/sond dla poszczególnych genów i mikroRNA (Rysunek 4). Około 1 ng całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA i preamplifikacji przed wykonaniem qPCR zgodnie z protokołem producenta. Geny powiązane z urazem, oceniane w niniejszym badaniu, obejmowały BCL2 Associated X, Apoptosis Regulator (Bax), B-Cell CLL/Lymphoma 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related Cysteine Peptidase (Casp3), Brain Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) oraz CAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb). Wybrano miR-15b, ponieważ wykazano jego zmianę po eksperymentalnym TBI w pojedynczych obumierających neuronach. Posiada on również eksperymentalnie zwalidowane i bioinformatycznie przewidziane cele genowe o funkcjach pro-przeżywalnościowych (dane niepublikowane). Znormalizowane stosunki zmian krotności (fold-change) obliczono metodą ΔΔCt, porównując poziomy ekspresji genów i mikroRNA u zwierząt z TBI oraz w naiwnych grupach kontrolnych, przy normalizacji odpowiednio do genu endogennego (Gapdh) lub małego RNA (U6). Zmiana krotności powyżej 1 wskazuje na ogólną upregulację danego genu lub mikroRNA, a odwrotnie, zmiana krotności poniżej 1 wskazuje na downregulację. Analiza statystyczna wykazała istotne zmiany w ekspresji genów między grupą TBI a naiwną kontrolą (p ≤ 0,05), które były zależne od regionu mózgu. Nie stwierdzono istotnych zmian w ekspresji miR-15b między grupą TBI a naiwną kontrolą, ale zaobserwowano tendencje do wyższej i niższej ekspresji w sposób zależny od regionu mózgu. Dane te sugerują, że w celu oceny zmian w ekspresji mikroRNA niezbędna jest dalsza optymalizacja. Możliwe jest również, że wielkość próby była zbyt mała, aby uzyskać istotność statystyczną, częściowo ze względu na naturalną zmienność ekspresji. Przyszłe badania będą obejmować zwierzęta poddane operacjom pozorowanym (sham), aby upewnić się, że zmiany ekspresji genów i mikroRNA wynikają z TBI, a nie z przygotowania chirurgicznego.

figure-results-1
Rycina 1. Schemat procedury LCM z wykorzystaniem atlasu anatomicznego do późniejszych analiz genomicznych. (A-F) Procedury od przygotowania zwierząt po analizę qPCR: (A) Dorosłe samce szczurów linii Sprague Dawley (~6 tygodni życia, masa ciała 300 g) zostają poddane znieczuleniu, urazowi TBI metodą uderzenia cieczą (fluid percussion TBI), a następnie humanitarnie uśpione 24 h po urazie. (B) Seryjne przekroje (30 µm) świeżo zamrożonych mózgów są wykonywane w oparciu o współrzędne specyficznych obszarów mózgu (FrA, AcbC, Hp, SCN) z atlasu The Rat Brain autorstwa Paxinosa i Watsona. (C) Przekroje są utrwalane, barwione metodą Nissla (1% fioletu krezylowego), odwadniane i suszone na powietrzu. (D) LCM przeprowadzany jest w zidentyfikowanych obszarach mózgu przy użyciu systemu LCM. (E) Makro-kapturki LCM przenoszone są do probówek 0,5 mL wolnych od RNaz zawierających 100 μL buforu do lizy komórek i przechowywane w temperaturze -80 ºC do momentu izolacji RNA na potrzeby analiz genomicznych. RNA może następnie zostać poddane odwrotnej transkrypcji w celu analizy RT-qPCR genów lub mikroRNA, aby zbadać różnicową ekspresję celu molekularnego po TBI i/lub pomiędzy interesującymi obszarami mózgu (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2. LCM obszarów mózgu objętych TBI. Reprezentatywne obrazy przekrojów tkankowych pobranych z boku ipsilateralnego względem miejsca urazu przy użyciu funkcji laserów IR i UV w systemie LCM (A-I). Tkankę sekcjonowano w kriotomie (30 µm) i nanoszono na szkiełka z membraną PEN. Następnie przekroje utrwalono, zabarwiono metodą Nissla fioletem krezylowym (1%) i odwodniono, aby zidentyfikować konkretne obszary mózgu na podstawie punktów orientacyjnych opisanych w atlasie Paxinos and Watson's The Rat Brain Atlas. (A-C) Obszar przedczołowej kory asocjacyjnej (FrA) (D-F) Elementy warstw piramidowych CA1, CA2 i CA3 hipokampa (Hp) znajdujące się obok w pełni uformowanych rogów warstwy ziarnistej zakrętu zębatego (GrDG). (G-I) Obszar jądra półleżącego (AcbC) proksymalnie i rostralnie względem commissary przedniej (aca). (J-K) Jądro nadskrzyżowaniowe (SCN) rostralnie względem skrzyżowania wzrokowego (och). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3. Reprezentatywne skany jakości RNA. Reprezentatywne elektroferogramy i powiązane obrazy żelowe RNA wyizolowanego z tkanek pobranych metodą LCM (A-D). Elektroferogramy i powiązane obrazy żelowe wykazują nienaruszone RNA na podstawie obecności pików i prążków żelowych 18s i 28s rRNA. Takie RNA nadaje się do wszystkich dalszych zastosowań, w tym do analiz genomicznych i proteomicznych. (A) RNA z przedczołowej kory stowarzyszeniowej (FrA). RIN 6.1. (B) RNA z hipokampa (Hp). RIN 4.4. (C) RNA z rdzenia jądra półleżącego (AcbC). RIN 7.3. (D) RNA z jądra nadskrzyżowaniowego (SCN). RIN 7.6. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4. Analiza downstream ekspresji genów i mikroRNA w określonych obszarach mózgu za pomocą RT-qPCR. Przeprowadzono indywidualną analizę RT-qPCR dla wybranych genów (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) oraz wybranego mikroRNA (miR-15b) w obszarach mózgu wyizolowanych za pomocą mikrodysekcji laserowej po TBI (Hp i AcbC n= 5, FrA n= 4) i porównano je z nieuszkodzonymi zwierzętami naiwnymi (n= 4). Analizę genów związanych z patogenezą TBI przeprowadzono dla obszarów Hp, AcbC, FCx. Dane przedstawiono jako znormalizowane stosunki zmian krotności (fold change) w porównaniu do naiwnych kontrolnych obszarów mózgu (nieparametryczny test t z poprawką Welcha ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Różnicowa ekspresja miR-15b w różnych obszarach mózgu przedstawiona jest jako znormalizowane zmiany krotności w porównaniu do kontroli naiwnej (± SEM) (B). Dane z SCN (n=2) nie zostały uwzględnione. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyskusja

W badaniach molekularnych mózgu ssaków LCM stało się podstawową techniką. W artykule tym pokazano, że zastosowanie kombinacji laserów tnących IR i UV w systemie LCM może uchwycić zmiany genomowe w dowolnym regionie mózgu ssaków. Regiony te obejmują te, które można zidentyfikować za pomocą konwencjonalnych barwników kompatybilnych z LCM, takich jak fiolet krezylowy lub hematoksylina i eozyna. Szybkość procesu wychwytywania laserowego i zdolność do wykonywania LCM na grubszych odcinkach 30 μm na szkiełkach membranowych PEN pozwala nie tylko na uzyskanie wystarczającej ilości próbek komórek, ale także na wyizolowanie RNA z próbek LCM o odpowiedniej jakości dla wszystkich rodzajów dalszych analiz genomowych; analizy te obejmują mikromacierze16, tablice PCR17 i ilościowe PCR w czasie rzeczywistym18.

Nasze dane stanowią uzasadnienie dla badań, w których wykorzystuje się tkankę LCM. Odkryliśmy, że miR-15b jest regulowany w górę w hipokampie i korze mózgowej (ryc. 4), ale regulowany w dół w jądrze półleżącym i może być biologicznie istotny dla zrozumienia zróżnicowanych skutków TBI w mózgu. Poprzednie badanie sugerowało, że wzrost podatności neuronów korowych na uszkodzenia wynika z nadekspresji kilku miRNA, które negatywnie regulują geny sprzyjające przeżyciu, takie jak Bcl-219. Analiza skanowania docelowego pokazuje, że Bcl-2 jest również regulowany przez miR-15b; w związku z tym nasze dane sugerują mechanistyczne wyjaśnienie, dlaczego określone obszary mózgu (tj. FCx) mogą być selektywnie podatne na TBI. Ważne jest, aby pamiętać, że większość genów jest regulowana przez wiele miRNA, a skorelowanie zmian w dowolnym miRNA z określonym genem docelowym jest trudne. Co więcej, dane te wskazują, że pewne zmiany w ekspresji genów i mikroRNA mogą być wykorzystywane jako biomarkery uszkodzeń mózgu specyficznych dla regionu. Rzeczywiście, obecnie wykorzystujemy te dane w badaniach nad tym, jak nowe neuroprotekcyjne związki leków o właściwościach przeciwdepresyjnych mogą w różny sposób wpływać na ekspresję genów i mikroRNA w regionach mózgu związanych z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi. Jednym z ograniczeń naszego badania jest to, że podczas wielu etapów procesu przygotowania preparatów do LCM, integralność RNA może zostać naruszona. Protokół ten opisuje niezbędne kroki w celu ograniczenia ryzyka degradacji RNA. Kolejnym ograniczeniem jest stosunkowo mała liczebność próby wykorzystywanej do obliczeń statystycznych. W przyszłych badaniach zwiększenie wielkości próby powinno zmniejszyć wpływ różnic w ekspresji genów i miRNA wśród poszczególnych zwierząt.

Korzyści płynące z LCM są realizowane w translacyjnych badaniach genomicznych z wykorzystaniem zwierzęcych modeli chorób ludzkich i chorych tkanek 20,21,22,23. Bez możliwości uchwycenia określonych populacji komórek, profile transkrypcyjne różnych regionów mózgu byłyby niepoznawalną i nieczytelną mieszanką wielu typów komórek. Wykorzystanie metod LCM w badaniach nad urazami mózgu doprowadziło do obecnych wysiłków mających na celu określenie biomarkerów specyficznych dla regionu mózgu i zrozumienie, w jaki sposób korelują one z krążącymi biomarkerami TBI.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Elizabeth Sumner za pomoc w edycji tego rękopisu. Finansowanie tego projektu zostało częściowo zapewnione przez The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research i RO1NS052532 HLH.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System mikrodysekcji Arcturus Laser CaptureApplied Biosystems (Life Technologies)
Bioanalizator Agilent 2100Agilent TechnologiesG2939AA
Agilent 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Szkiełka szklane membranowe Arcturus PEN Applied Biosystems (Life Technologies)LCM0522
Capsure Czapki LCMBiosystemy stosowane (Life Technologies)LCM0211/LCM0214
Octan fioletu krezylowegoSigma-AldrichC5042-10G
Ksylen (klasa histologiczna)Fisher ScientificX3P-1GAL
Etanol 200 proof (klasa histologiczna)UTMB Apteka
RNAqueous Micro- KitLife Technologies (Ambion)AM1931
Taqman Gene Expression Primer/ProbesApplied Biosystems (Life Technologies)4331182
Taqman MicroRNA Expression Primer/ProbesApplied Biosystems (Life Technologies)A25576
Lightcycler 96 SystemRoche

Bibliografia

  1. Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
  2. Mills, J. D., et al. Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe. PLoS One. 8 (10), e78480(2013).
  3. Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future. J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).
  4. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).
  5. Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
  6. Rojo, D. R., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS.One. 6 (8), e23111(2011).
  7. Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).
  8. Shearer, J., et al. Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury. Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).
  9. Caeyenberghs, K., et al. Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients. Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).
  10. Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy. Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).
  11. Karatsoreos, I. N. Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health. Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).
  12. Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., Hörtnagl, H., Pitkänen, A., Sperk, G. Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury. Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).
  13. Huusko, N., Pitkanen, A. Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI. Neuroscience. 267, 30-45 (2014).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
  15. Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).
  16. Hellmich, H. L., et al. Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury. PLoS.One. 8 (1), e53230(2013).
  17. Boone, D. R., et al. Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury. PLoS.One. 10 (5), e0127287(2015).
  18. Boone, D. R., et al. Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock. PLoS.One. 7 (10), e46204(2012).
  19. Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury. Brain Res. 1533, 122-130 (2013).
  20. Hellmich, H. L., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
  21. Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease. Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).
  22. Elstner, M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
  23. Wang, S., et al. Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors. BMC.Genomics. 11, 163(2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urazy czaszkowo m zgoweprowadzenie wed ug atlasu m zgubarwienie fioletem krezyluanaliza RNAci cie w kriotomaciepobieranie tkanekekspresja gen wanaliza mikroRNA

Powiązane artykuły