Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

Podsumowanie

Analizy ekspresji promotorów są kluczowe dla lepszego zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennej ekspresji docelowych genów. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół identyfikacji, izolacji i klonowania promotora roślin. Ponadto opisujemy charakterystykę promotora specyficznego dla guzków w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej.

Streszczenie

Sekwencje poprzedzające sekwencje kodujące geny są określane jako sekwencje promotorowe. Badanie wzorców ekspresji promotorów jest bardzo ważne dla zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennych wzorców ekspresji genów docelowych. Z drugiej strony kluczowe znaczenie ma również ustanowienie narzędzi oceny promotorów i technik transformacji genetycznej, które są szybkie, wydajne i powtarzalne. W tym badaniu zbadaliśmy czasoprzestrzenny wzorzec ekspresji promotora powstania guzków specyficznego dla symbiozy ryzobialnej (NIN) Phaseolus vulgaris w transgenicznych korzeniach owłosionych. Korzystając z baz danych genomu roślinnego i narzędzi analitycznych, zidentyfikowaliśmy, wyizolowaliśmy i sklonowaliśmy promotor NIN P. vulgaris w fuzji transkrypcyjnej z chimeryczną reporterową β-glukuronidazą (GUS) wzmocnioną GUS::GFP. Ponadto protokół ten opisuje szybki i wszechstronny system transformacji genetycznej u P. vulgaris przy użyciu owłosionych korzeni wywołanych przez Agrobacterium rhizogenes. System ten generuje ≥2 cm owłosione korzenie w ciągu 10 do 12 dni po transformacji. Następnie oceniliśmy czasoprzestrzenną ekspresję promotora NIN w owłosionych korzeniach zaszczepionych Rhizobium w okresowych odstępach czasu po inokulacji. Z uzyskanych przez nas wyników zobrazowanych przez działalność GUS wynika, że promotor NIN był aktywny w procesie guzowania. Podsumowując, niniejszy protokół pokazuje, jak zidentyfikować, wyizolować, sklonować i scharakteryzować promotor roślin w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej. Co więcej, protokół ten jest łatwy w użyciu w niewyspecjalizowanych laboratoriach.

Wprowadzenie

Promotorzy są ważnymi narzędziami biologii molekularnej, które odgrywają kluczową rolę w zrozumieniu regulacji ekspresji interesujących genów. Promotory to sekwencje DNA znajdujące się przed kodonem inicjującym translację sekwencji genów i przenoszą centralną informację regulacyjną genów; Dlatego ich prawidłowa adnotacja i charakterystyka są niezbędne do zrozumienia funkcji genów. W zależności od wzorców ekspresji, promotory roślinne są klasyfikowane jako konstytutywne, specyficzne dla tkanki lub specyficzne dla etapu rozwoju i indukowalne¹. Postępy w technologiach transkryptomicznych, ulepszenia w modelowaniu komputerowym i dostępność coraz większej liczby sekwencji genomu dla różnych gatunków roślin ułatwiły przewidywanie sekwencji promotorowych na dużą skalę².

Z drugiej strony, kluczowe jest również ustanowienie narzędzi oceny promotorów i technik transformacji genetycznej, które są szybkie, wydajne i powtarzalne. W przeciwieństwie do innych roślin modelowych, funkcjonalna charakterystyka genów rośliny strączkowej fasoli zwyczajnej (P. vulgaris) jest utrudniona głównie ze względu na oporny charakter Phaseolus sp. dla stabilnej transformacji genetycznej. Systemy transformacji przejściowej służą jako alternatywa dla szybkich badań nad charakterystyką funkcjonalną genów³. W badaniach nad symbiozą roślin strączkowych interakcja między rośliną żywicielską rośliny strączkowej a bakterią ryzobialną jest jednym z najłatwiejszych do opanowania systemów modelowych do analizy funkcjonalnej genów specyficznych dla guzków i badań promotorów. Do tej pory scharakteryzowano kilka promotorów roślin strączkowych związanych z tymi symbiozami, a mianowicie: Medicago truncatula PT4⁴, SWEET11⁵, Lotus japonicus Cyclops, UBQ⁶, VAG1⁷, Glycine max PT5⁸, Exo70J⁹, P. vulgaris RbohB^10,11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, TOR¹⁵, itd. Elementy cis bezpośrednio wpływają na regulację genów. Czynnik transkrypcyjny ENBP1A wiąże się z regionem regulatorowym Cis (-692 pz) wczesnej noduliny VfENOD12, co ułatwia ekspresję genu reporterowego w zawiązkach guzków Vicia faba¹⁶. Zastąpienie regionów regulatorowych Cis (od -161 do -48 pz) specyficznego dla guzków promotora leghemoglobiny GLB3 heterologicznymi skróconymi promotorami δ-p35S i δ-pNOS spowodowało utratę swoistości guzków i zmniejszoną aktywność promotora¹⁷.

Poprzednie raporty pokazują, że czynnik transkrypcyjny NIN jest niezbędny do zainicjowania infekcji ryzobialnej w komórkach rzęsatych korzenia i jest również niezbędny do organogenezy guzków u L. japonicus¹⁸. W niniejszym badaniu opisano protokół identyfikacji, izolacji, klonowania i charakterystyki specyficznego dla guzków promotora w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej. Aby to osiągnąć, wybraliśmy specyficzny dla symbiozy ryzobialnej promotor NIN P. vulgaris i sklonowaliśmy go w fuzji transkrypcyjnej do chimerycznego reportera wzmocnionego GUS::GFP. Co więcej, protokół ten opisuje szybki i wszechstronny system transformacji genetycznej u P. vulgaris przy użyciu owłosionych korzeni wywołanych przez A. rhizogenes. System ten generuje owłosione korzenie w mniej niż 2 tygodnie po transformacji. Na koniec oceniliśmy czasoprzestrzenną ekspresję promotora NIN w brodawkach korzeniowych skolonizowanych przez rhizobia za pomocą barwienia GUS.

Opisana tutaj procedura może być przydatna nie tylko do badania nodulacji i mikoryzacji¹¹ roślin strączkowych, ale także do badania wzorców ekspresji promotorów w korzeniach¹⁹. Co więcej, protokół ten jest łatwy w użyciu w niewyspecjalizowanych laboratoriach.

Protokół

1. Identyfikacja, izolacja i klonowanie promotora NIN P. vulgaris

1. Zidentyfikuj sekwencję promotora dla genu będącego przedmiotem zainteresowania. Dostępnych jest kilka baz danych genomu i narzędzi do analizy roślin, takich jak Phytozome, Ensembl Plants, NCBI itp. Promotor roślin strączkowych P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) został użyty w tym badaniu²⁰.
2. Zaprojektuj oligonukleotydy do klonowania enzymów Gateway lub tradycyjnych enzymów restrykcyjnych w zależności od użytego systemu wektorów (Rysunek 1A).
   UWAGA: Standardowe (25-35 pz), odsolone podkłady działają dobrze. Wskazane są odwrotne sekwencje oligo, które znajdują się między promotorem a genem.
3. Amplifikować region promotora PvNIN (lub region promotora genu będącego przedmiotem zainteresowania) ze świeżo wyizolowanego genomowego DNA P. vulgaris przy użyciu zestawu oligonów specyficznego dla promotora. Użyj polimerazy o wysokiej wierności w następujących warunkach PCR: 95 °C przez 5 minut; 30 cykli (95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min); i 72 °C przez 5 min.
4. Uruchomić amplifikowany fragment na 1% żelu agarozowym pod napięciem 60 V na tacce żelowej o wymiarach 7 x 10 cm, a następnie wymyć odpowiedni amplikon (700 pz, Rysunek 1B) i sklonować do wektora pENTR/D-TOPO zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Przekształć 2 μl reakcji w kompetentne komórki Escherichia coli, korzystając z instrukcji producenta i płytkując 150 μl mieszaniny transformacyjnej na bracie lizogennym (LB) uzupełnionym 50 mg/l kanamycyną (Kan50). Wyhodować posiane komórki w temperaturze 37 °C przez noc.
6. Wybierz 3-6 kolonii i hoduj je przez noc w pożywce LB zawierającej Kan50. Wyizolować plazmidowe DNA przy użyciu wybranej metody i przeanalizować plazmid metodą PCR przy użyciu specyficznych dla wektora oligonukleotydów M13. Do PCR użyj 100 ng plazmidu, 0.3 pm oligonukleotydów, 10X buforu PCR, polimerazy 0.5 U Taq DNA i 10 mM dNTP.
7. Stosować następujące warunki amplifikacji PCR: 95 °C przez 3 min; 30 cykli (95 °C przez 30 s, 58 °C przez 30 s, 72 °C przez 75 s) i 72 °C przez 7 min. Wizualizuj produkty PCR na 1% żelu agarozowym. Upewnij się, że poprawne insercje mają pasmo 1,024 pz, a wektory bez wstawień będą miały pasmo 324 pz (Rysunek 1C).
8. Przeprowadź reakcję LR między wektorem wejściowym (pENTR/D-TOPO-PvNIN) a wektorem docelowym pBGWFS7.0²¹ przy użyciu dostępnej w handlu mieszanki enzymów zgodnie z instrukcjami producenta.
9. Przekształć 2 μl reakcji LR w kompetentne komórki E. coli przy użyciu standardowych technik opisanych w instrukcjach producenta i rozlać 150 μl mieszaniny transformacyjnej na LB uzupełnionej 100 mg/l spektynomycyny (Spe100). Wyhodować posiane komórki w temperaturze 37 °C przez noc.
10. Zbierz około 5 kolonii i hoduj je przez noc w pożywce LB zawierającej Spe100. Wyizolować DNA plazmidu za pomocą wybranej metody i przeanalizować plazmid metodą PCR przy użyciu oligonukleotydów specyficznych dla promotora.
11. Użyj warunków PCR z kroku 1.3. Wizualizuj produkty PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację. Amplikony wynoszą 700 pz.
12. Zsekwencjonuj dodatni plazmid pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (Rysunek 1D) z oligonukleotydami specyficznymi dla promotora, aby zweryfikować autentyczność insertu.
13. Przekształć plazmidy w szczep A. rhizogenes K599 (jednak można użyć dowolnych innych szczepów A. rhizogenes). Dodaj 2 μl preparatu plazmidowego do 50 μl elektrokompetentnych ogniw i elektroporuj w kuwecie 1 mm z następującymi ustawieniami: 1,8 kV, 25 μF i 200 Ω.
14. Odzyskaj komórki w ~ 500 μL pożywki SOC i wstrząsaj w temperaturze 28 °C przez 2 godziny. Płytka na LB-Spe100 i rosnąć w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
15. Wykonaj badania przesiewowe kolonii, jak wspomniano w kroku 1.7 i użyj warunków PCR, jak w kroku 1.3. Wytwarzaj zapasy glicerolu z dodatnich klonów i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
16. Jako kontrolę ujemną należy użyć kultury A. rhizogenes zawierającej pusty wektor pBGWFS7.0.

2. A. Rhizogenes przekształcił owłosione korzenie fasoli zwyczajnej

1. Wysterylizuj nasiona fasoli (P. vulgaris cv. Negro Jamapa) (około 20) w 50 ml 96% etanolu przez 1 minutę i wyrzuć etanol; następnie dodaj 50 ml 20% wybielacza (podchlorynu sodu) przez 10 minut, stale mieszając w okapie z przepływem laminarnym. Usuń wybielacz i umyj go w nadmiarze sterylnej wody 3 razy.
   UWAGA: Inne odmiany P. vulgaris mogą być używane do indukcji owłosionych korzeni
.
2. Wysterylizowane nasiona należy kiełkować na sterylnych bibułach filtracyjnych zwilżonych roztworem Broughton & Dilworth (B&D)²² (Tabela 1) przez 2 dni w ciemności w temperaturze 28 °C.
3. Dzień przed przemianą przygotuj następujące elementy:
   1. Usunąć 150 μl kultury A. rhizogenes zawierającej wektor binarny (przygotowany w krokach 1.13 i 1.14) na stałym LB Spe100 i rosnąć w temperaturze 28 °C przez noc.
   2. Napełnij probówkę o pojemności 15 ml roztworem B&D i zastąp nakrętkę dwuwarstwową folią aluminiową. Złóż to w szklanej probówce o średnicy 22 cm zawierającej 10 ml roztworu B&D (Rysunek 2C) i autoklawuj to.
4. W dniu przemiany należy zgromadzić następujące sterylne materiały w okapie z przepływem laminarnym: kiełkujące nasiona z kroku 2.2, płytkę hodowlaną z kroku 2.3.1, probówki z kroku 2.3.2, sterylną wodę podwójnie destylowaną (10 ml), pipety i końcówki do pipet, sterylne kleszki i strzykawki o pojemności 3 ml.
5. Za pomocą wygiętej końcówki o pojemności 200 μl zeskrobać komórki A. rhizogenes z płytki do probówki mikrowirówkowej i ponownie zawiesić w 1 ml podwójnie sterylnej wody. Podobnie, należy oddzielnie przygotować komórki kontrolne wektorów.
   1. Delikatnie wymieszaj komórki, aby ponownie zawiesić. Nie wirować.
6. Wykonaj otwór o średnicy 3 mm w folii aluminiowej probówek z kroku 2.3.2 za pomocą sterylnej końcówki pipety.
7. Zbierz komórki (promotor lub kontrola wektora) z kroku 2.5 za pomocą strzykawki i lekko nakłuj hipokotyle kiełkujących nasion końcówką igły (Rysunek 2G).
   UWAGA: Upewnij się, że igła wnika (4-6 razy) w tkankę naczyniową i wstrzyknij małe (~ 5 μL) krople komórek na ranie w różnych miejscach wokół hipokotylu.
8. Ostrożnie włożyć korzenie wstrzykniętych sadzonek do 3-milimetrowego otworu w 15 ml probówce zawierającej roztwór B&D. Włóż cały zestaw do szklanych probówek o pojemności 22 ml i uszczelnij je, aby utrzymać wilgotność.
9. Inkubować probówki w komorze wzrostowej utrzymywanej w temperaturze 28 °C przy świetle 16 godzin: 8 godzin ciemnego fotoperiodu.
   Uwagi: 3-4 dni po inkubacji rośliny dorastają do krawędzi szklanych probówek o pojemności 22 ml. Na tym etapie zdejmij nasadki i uszczelnij obręcz parafilmem wokół trzpienia, jak pokazano na Rysunek 2I.
10. Obserwuj modzel w miejscach zranień po 5-7 dniach i znajdź ~ 2 cm owłosione korzenie do 10-12 dni po transformacji.
    UWAGA: Ważne jest, aby stale utrzymywać roztwór B&D zarówno w plastikowych, jak i szklanych tubach.
11. Po 2 tygodniach usuń pierwotny korzeń, przycinając łodygę 2 cm poniżej owłosionych korzeni i przeszczep pierwotne korzenie do doniczek zawierających sterylny wermikulit. Utrzymuj rośliny w komorze wzrostowej (16 h światła: 8 h ciemności w temperaturze 28 °C) i nawadniaj roztworem B&D.

3. Analiza promotora: Ekspresja promotora NIN w guzkach ryzobialnych fasoli zwyczajnej

1. W celu indukcji guzków korzeniowych zaszczepić Rhizobium tropici lub Rhizobium etli (które są kompatybilne z fasolą zwyczajną) w 100 ml pożywki PY (0,5 g peptonu, 0,3 g ekstraktu drożdżowego) uzupełnionej 700 mM CaCl₂ i 20 mg ^mL-1 kwasu nalidyksowego. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny z wytrząsaniem przy 300 obr./min.
   Uwaga: W przypadku transgenicznego Rhizobium można zastosować wszelkie specyficzne antybiotyki.
2. Granulować komórki w wirówce przez 3 minuty w temperaturze pokojowej 2 800 x g i ponownie zawiesić w 10 ml 10 mM_MgSO4. Dostosować OD komórek do 0,6 przy OD₆₀₀ przez rozcieńczenie 10 mM_MgSO4.
3. Zaszczepić 1-2 ml kultury (przygotowanej z kroku 3.2) na roślinę (zarówno promotor, jak i kontrolę wektora), aby wywołać wzrost guzków na owłosionych korzeniach. Nawadniaj rośliny roztworem B&D z ograniczoną ilością azotu (2 mM KNO₃), aby pobudzić nodulację.
4. W zależności od potrzeby eksperymentalnej zbierz owłosione korzenie w różnych punktach czasowych. Pobrać próbki do badania nici infekcji między 3-5 dniami po inokulacji (dpi).
   Uwaga: Guzki pierwotne i młode guzki można badać odpowiednio w rozdzielczości 6-9 dpi i 10-12 dni. Wreszcie, dojrzałe i funkcjonalne guzki można badać w rozdzielczości 14-21 dpi, a guzki starcze w > 28 dpi.
5. Przetwórz korzeń/guzki pod kątem aktywności genów reporterowych (GUS lub GFP). Analizuj aktywność GUS zgodnie z protokołem opisanym przez Jefferson²³. Obserwuj GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wzbudzić fluorescencję GFP za pomocą niebieskiego lasera argonowo-jonowego (488 nm) i zebrać wyemitowaną fluorescencję od 510 do 540 nm.

Wyniki

Celem tego badania była ocena czasoprzestrzennego wzorca ekspresji specyficznego dla guzków P. vulgaris NIN. Aby to zrobić, wybrano region o długości 700 pz przed kodonem inicjującym translację genu NIN i zaprojektowano zestaw oligonukleotydów, jak pokazano na Rysunek 1A. Używając polimerazy o wysokiej wierności, fragment promotora NIN został amplifikowany, wyizolowany ( Rysunek 1B) i sklonowany do docelowego wektora binarnego pBGW...

Dyskusja

Podczas analizy funkcjonalnej genów, badanie wzorców ekspresji genów odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu przestrzennej i czasowej regulacji genów in vivo. Dobrze znaną metodą badania wzorców ekspresji genów jest klonowanie regionu promotora genu będącego przedmiotem zainteresowania, przed genami reporterowymi, takimi jak geny markerów fluorescencyjnych (GFP, RFP itp.) lub β-glukuronidaza. W tym artykule wybraliśmy region promotorowy genu specyficznego dla symbiozy guzków korzeniowych (RNS), NIN, w celu ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Startery do testu qRT-PCR
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
strong>Nazwa	Company<	strong>Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI
pENTR/D-TOPO Zestaw do klonowania	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Biologia systemów roślinnych	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platynowa polimeraza DNA Taq	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelem PureLink	ThermoFisher Scientific	K210012
Platynowa polimeraza DNA Pfx	Invitrogen
Certyfikowana biologia molekularna Agaroza	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Trypton	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Ekstrakt z drożdży	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Agar bakteriologiczny	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Siarczan kanamycyny	Sigma-Aldrich	60615-25G
Siarczan spektynomycyny	Sigma-Aldrich	PHR1441
Alkohol etylowy	Sigma-Aldrich	E7023
Pepton bakteriologiczny	Sigma-Aldrich	P0556
Chlorek	wapniaSigma-Aldrich	C1016
Kwas nalidyksowy	Sigma-Aldrich	N8878
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M7506
Żelowy roztwór ładujący	Sigma-Aldrich	G7654
Nazwa	>Company	Numer katalogowy	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Wirówka	Sigma	Sigma 1-14K
Jednostka dokumentacji żelu	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Komora wzrostu roślin	MRC	PGI-550RH
Kabina z horyzontalnym laminarnym przepływem powietrza	Lumistell	LH-120
Mikroskop fluorescencyjny	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Ostrze skalpela	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Wirówka stożkowa Probówki	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL szklane probówki	Thomas scientific	45048-16150