Analizy ekspresji promotorów są kluczowe dla lepszego zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennej ekspresji docelowych genów. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół identyfikacji, izolacji i klonowania promotora roślin. Ponadto opisujemy charakterystykę promotora specyficznego dla guzków w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sekwencje poprzedzające sekwencje kodujące geny są określane jako sekwencje promotorowe. Badanie wzorców ekspresji promotorów jest bardzo ważne dla zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennych wzorców ekspresji genów docelowych. Z drugiej strony kluczowe znaczenie ma również ustanowienie narzędzi oceny promotorów i technik transformacji genetycznej, które są szybkie, wydajne i powtarzalne. W tym badaniu zbadaliśmy czasoprzestrzenny wzorzec ekspresji promotora powstania guzków specyficznego dla symbiozy ryzobialnej (NIN) Phaseolus vulgaris w transgenicznych korzeniach owłosionych. Korzystając z baz danych genomu roślinnego i narzędzi analitycznych, zidentyfikowaliśmy, wyizolowaliśmy i sklonowaliśmy promotor NIN P. vulgaris w fuzji transkrypcyjnej z chimeryczną reporterową β-glukuronidazą (GUS) wzmocnioną GUS::GFP. Ponadto protokół ten opisuje szybki i wszechstronny system transformacji genetycznej u P. vulgaris przy użyciu owłosionych korzeni wywołanych przez Agrobacterium rhizogenes. System ten generuje ≥2 cm owłosione korzenie w ciągu 10 do 12 dni po transformacji. Następnie oceniliśmy czasoprzestrzenną ekspresję promotora NIN w owłosionych korzeniach zaszczepionych Rhizobium w okresowych odstępach czasu po inokulacji. Z uzyskanych przez nas wyników zobrazowanych przez działalność GUS wynika, że promotor NIN był aktywny w procesie guzowania. Podsumowując, niniejszy protokół pokazuje, jak zidentyfikować, wyizolować, sklonować i scharakteryzować promotor roślin w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej. Co więcej, protokół ten jest łatwy w użyciu w niewyspecjalizowanych laboratoriach.
Wprowadzenie
Promotorzy są ważnymi narzędziami biologii molekularnej, które odgrywają kluczową rolę w zrozumieniu regulacji ekspresji interesujących genów. Promotory to sekwencje DNA znajdujące się przed kodonem inicjującym translację sekwencji genów i przenoszą centralną informację regulacyjną genów; Dlatego ich prawidłowa adnotacja i charakterystyka są niezbędne do zrozumienia funkcji genów. W zależności od wzorców ekspresji, promotory roślinne są klasyfikowane jako konstytutywne, specyficzne dla tkanki lub specyficzne dla etapu rozwoju i indukowalne1. Postępy w technologiach transkryptomicznych, ulepszenia w modelowaniu komputerowym i dostępność coraz wi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Identyfikacja, izolacja i klonowanie promotora NIN P. vulgaris
- Zidentyfikuj sekwencję promotora dla genu będącego przedmiotem zainteresowania. Dostępnych jest kilka baz danych genomu i narzędzi do analizy roślin, takich jak Phytozome, Ensembl Plants, NCBI itp. Promotor roślin strączkowych P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) został użyty w tym badaniu20.
- Zaprojektuj oligonukleotydy do klonowania enzymów Gateway lub tradycyjnych enzymów restrykcyjnych w zależności od użytego systemu wektorów (Rysunek 1A).
UWAGA: Standardowe (25-35 pz), odsolone podkłady ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Celem niniejszego badania była ocena spatiotemporalnego wzorca ekspresji specyficznego dla brodawek białka NIN u P. vulgaris. W tym celu wybrano region o długości 700 bp położony powyżej kodonu startowego translacji genu NIN i zaprojektowano zestaw oligosów, jak przedstawiono na Rysunku 1A. Przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności fragment promotora NIN został namnożony, wyizolowany (Rysunek 1B) i sklonowany .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podczas analizy funkcjonalnej genów, badanie wzorców ekspresji genów odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu przestrzennej i czasowej regulacji genów in vivo. Dobrze znaną metodą badania wzorców ekspresji genów jest klonowanie regionu promotora genu będącego przedmiotem zainteresowania, przed genami reporterowymi, takimi jak geny markerów fluorescencyjnych (GFP, RFP itp.) lub β-glukuronidaza. W tym artykule wybraliśmy region promotorowy genu specyficznego dla symbiozy guzków korzeniowych (RNS), NIN, w celu .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (grant no. IN219916 do M.L, a IA205117 do M.K. A) oraz Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (stypendium CONACYT nr 240614 dla M.L.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Startery do testu qRT-PCR | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| strong>Nazwa | Company< | strong>Numer katalogowy | Komentarze |
| ODCZYNNIKI | |||
| pENTR/D-TOPO Zestaw do klonowania | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Biologia systemów roślinnych | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platynowa polimeraza DNA Taq | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelem PureLink | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platynowa polimeraza DNA Pfx | Invitrogen | ||
| Certyfikowana biologia molekularna Agaroza | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Trypton | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Ekstrakt z drożdży | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Agar bakteriologiczny | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Siarczan kanamycyny | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Siarczan spektynomycyny | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Alkohol etylowy | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Pepton bakteriologiczny | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Chlorek | wapniaSigma-Aldrich | C1016 | |
| Kwas nalidyksowy | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Siarczan magnezu | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Żelowy roztwór ładujący | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Nazwa | >Company | Numer katalogowy | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Wirówka | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Jednostka dokumentacji żelu | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Komora wzrostu roślin | MRC | PGI-550RH | |
| Kabina z horyzontalnym laminarnym przepływem powietrza | Lumistell | LH-120 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Ostrze skalpela | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Wirówka stożkowa Probówki | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL szklane probówki | Thomas scientific | 45048-16150 |
Bibliografia
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
