Ten manuskrypt opisuje, jak rozróżniać różne nicienie za pomocą sygnatur dyfrakcyjnych dalekiego pola. Porównujemy lokomocję 139 dzikich i 108 "rolkowych" C. elegans, uśredniając częstotliwości związane z czasową sygnaturą dyfrakcyjną Fraunhofera w jednym miejscu za pomocą lasera o fali ciągłej.
Artykuł metodologiczny
Analiza dyfrakcyjna oparta na Fourierze żywych Caenorhabditis elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten manuskrypt opisuje, jak klasyfikować nicienie za pomocą sygnatury dyfrakcyjnej czasowego dalekiego pola. Pojedynczy C. elegans jest zawieszony w słupie wody wewnątrz kuwety optycznej. Laser HeNe o długości fali ciągłej o długości fali 632 nm jest kierowany przez kuwetę za pomocą lusterek na przedniej powierzchni. Znaczna odległość co najmniej 20-30 cm przebyta po przejściu światła przez kuwetę zapewnia użyteczny wzór dyfrakcyjny dalekiego pola (Fraunhofer). Wzór dyfrakcyjny zmienia się w czasie rzeczywistym, gdy nicienie pływają w wiązce laserowej. Fotodioda jest umieszczona poza środkiem we wzorze dyfrakcyjnym. Sygnał napięciowy z fotodiody jest obserwowany w czasie rzeczywistym i rejestrowany za pomocą oscyloskopu cyfrowego. Proces ten powtarza się dla 139 dzikich i 108 "walcowych" C. elegans. Robaki typu dzikiego wykazują szybki wzorzec oscylacji w roztworze. Robaki "rolkowe" mają mutację w kluczowym elemencie naskórka, który zakłóca płynną lokomocję. Interwały czasu, które nie są wolne od nasycenia i bezczynności, są odrzucane. Praktyczne jest podzielenie każdej średniej przez jej maksimum w celu porównania względnych intensywności. Sygnał dla każdego robaka jest przekształcany w Fouriera, tak aby wyłaniał się wzorzec częstotliwości dla każdego robaka. Sygnał dla każdego typu robaka jest uśredniony. Uśrednione widma Fouriera dla typu dzikiego i "rolkowego" C. elegans są wyraźnie różne i ujawniają, że dynamiczne kształty robaków dwóch różnych szczepów robaków można rozróżnić za pomocą analizy Fouriera. Widma Fouriera każdego szczepu robaka pasują do przybliżonego modelu wykorzystującego dwa różne binarne kształty robaków, które odpowiadają momentom lokomotorycznym. Obwiednia uśrednionego rozkładu częstotliwości dla rzeczywistych i modelowanych robaków potwierdza, że model jest zgodny z danymi. Metoda ta może służyć jako punkt odniesienia dla analizy Fouriera dla wielu mikroskopijnych gatunków, ponieważ każdy mikroorganizm będzie miał swoje unikalne widmo Fouriera.
Wprowadzenie
Ta metoda porównuje eksperymentalne i modelowane widma częstotliwości lokomocji C. elegans przy użyciu dwóch szczepów o bardzo różnych wzorcach lokomotorycznych. Wyniki pokazują, że spektrum częstotliwości zależy od zmian czasowych, gdy nicienie pływają w słupie wody, więc do analizy nie są potrzebne wyraźne obrazy mikroskopowe. Metoda ta pozwala na ilościową analizę w czasie rzeczywistym i dostarcza informacji uzupełniających do obrazów/filmów uzyskanych za pomocą tradycyjnych mikroskopów. Dyfrakcja Fraunhofera, zwana również dyfrakcją dalekiego pola, stanowi podstawę do uzyskiwania danych dyfrakcji na żywo1,2. Natężenie światła w dowolnym pojedynczym punkcie wzoru dyfrakcyjnego jest wynikiem nałożenia światła z każdego punktu w obrysie nicienia3. W rezultacie natężenie światła zebrane w czasie niesie ze sobą informację o lokomocji nicienia. Analiza zależnego od czasu sygnału dyfrakcyjnego może zidentyfikować charakterystyczny ruch odpowiedniego mutanta, ponieważ analiza wszystkich częstotliwości związanych z lokomocją, uzupełnia tradycyjną analizę wideo. W tym przypadku charakterystyczne różnice między lokomocją, jaką uprawia się "walcowo" a dzikim typem C. elegans, potwierdza się poprzez porównanie widm częstotliwości dwóch różnych szczepów nicieni.
Niektóre poprzednie cechy zostały potwierdzone za pomocą analizy częstotliwości sygnałów dyfrakcyjnych, takich jak częstotliwości pływania2,4. Co ważniejsze, metoda ta może być stosowana jako metoda uzupełniająca tradycyjną mikroskopię do obserwacji lokomocji w czasie rzeczywistym na ekranie komputera podczas zbierania danych. Spektrum częstotliwości robaków z wyraźnymi wzorcami lokomotorycznymi można określić ilościowo, biorąc pod uwagę sygnał transformowany przez Fouriera sygnału dyfrakcyjnego.
Multidyscyplinarny charakter dyfrakcji opartej na Fourierze w tej pracy obejmuje dziedziny biologii i fizyki. Dyfrakcja przez niedostateczne próbkowanie jest od dawna stosowana do badania struktur krystalicznych w biologii5 i innych dziedzinach. Jednak w tym eksperymencie nadpróbkowanie6,7 tworzy wzór dyfrakcji dalekiego pola, tak że organizm jest wyśrodkowany w wiązce laserowej. Nadpróbkowanie jest zwykle używane do obrazowania bez soczewki8 w połączeniu z algorytmem odzyskiwania fazy, który rekonstruuje obraz oryginalnego obiektu. Odzyskiwanie faz jest trudne do osiągnięcia, gdy obecne są rozpraszacze, jak ma to miejsce w przypadku nicieni. Sygnatura dyfrakcji czasowej jest wystarczająca do oceny kluczowych częstotliwości ruchu robaka. Ta metoda jest mniej obciążająca obliczeniowo i zapewnia optyczny sposób ilościowego określania lokomocji. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do analizy mutacji lub warunków środowiskowych, które zmieniają zachowanie.
Protokół
1. Wzrost i utrzymanie C. elegans
- Przygotuj potrawy z kultur nicieni.
- Napełnij szalki Petriego roztworem agaru i pozostaw je do zestalenia, a następnie wysiewaj je kulturą E. coli szczepu OP50 9,10.
- Przygotuj początkową populację dorosłych nicieni na każdej tablicy, przenosząc kilka dorosłych robaków na świeże szalki Petriego wypełnione agarem z plastrem E. coli. Utrzymywać kultury nicieni w temperaturze 20 °C w inkubatorze.
UWAGA: Szczepy nicieni można uzyskać w Centrum Genomu Caenorhabditis elegans. W tym badaniu wykorzystano szczep typu dzikiego, N2, i szczep OH7547 (otls199[cat-2::GFP + rgel-1(F25B3.3)::d sRed + rol-6(su1006)]), który wykazuje fenotyp rolkowy. - Rozmnażaj robaki dla przyszłych kultur.
- Wyjąć szalkę Petriego zawierającą C. elegans i nieużywaną szalkę Petriego z inkubatora o kontrolowanej temperaturze. Umieść je na stoliku mikroskopu preparacyjnego.
- Zapal palnik Bunsena i wysterylizuj platynowy nicień, umieszczając metal w płomieniu, aż zaświeci się na czerwono. Pozwól kilofowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Nie odkładaj kilofa ani nie pozwól, aby miał on kontakt z zanieczyszczeniami.
- Delikatnie dotknij końcówką kilofa krawędzi kręgu bakterii. Substancja ta jest lepka i ułatwi zbieranie pojedynczych dorosłych nicieni.
- Przenieść do 4 grawitacyjnych nicieni na pożywkę Petriego wypełnioną agarem z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) i inkubować w temperaturze 20 °C. Robaki złożą jaja, które dojrzeją w ciągu czterech dni.
- Pozostałe nicienie należy umieścić z powrotem w inkubatorze po przeniesieniu czterech dorosłych nicieni.
2. Układ optyczny (Rysunek 1)
- Zamocuj laser helowo-neonowy w pobliżu lewego tylnego rogu stołu optycznego i podłącz go do źródła zasilania.
UWAGA: Wiązka lasera musi spełniać wymagania dotyczące nadpróbkowania. C. elegans mają około 1 mm długości, dlatego wiązka laserowa powinna mieć średnicę większą niż 2 mm, gdy pada na nicienie, ale nie większą niż 5 mm, aby wzór dyfrakcyjny nie był trudny do zlokalizowania. - Umieść filtr o neutralnej gęstości między laserem helowo-neonowym a próbką w taki sposób, aby wiązka lasera przechodziła przez filtr przed dotarciem do próbki.
- Korzystając z dwóch aluminiowych lusterek kierowniczych na przedniej powierzchni, zbuduj peryskop, zabezpieczając pierwsze lusterko za filtrem o neutralnej gęstości. Zamocuj drugie lustro około 10 cm poniżej pierwszego lustra, aby dać miejsce na sterowanie wiązką laserową i włożenie kuwety między lustra. Ustaw wiązkę lasera i kuwetę tak, aby wiązka lasera przechodziła pionowo przez kuwetę.
UWAGA: Odległość od organizmu dyfrakcyjnego do fotodiody musi być znacznie większa niż sam organizm, aby uzyskać dyfrakcję w polu dalekim. W tym eksperymencie odległość od kuwety do fotodiody wynosi 20 cm. - Zamocuj fotodiodę bezpośrednio naprzeciwko drugiego lustra, tak aby jej czujnik był skierowany w stronę lustra.
UWAGA: Kuweta zawierająca nicienie zostanie umieszczona między dwoma lustrami za pomocą zacisków chemicznych. Patrz punkty 4 i 5. - Umieść kuwetę wypełnioną wodą na stojaku. Dostosuj wysokość podstawy. Dostosuj wysokości i kąty lustra 1 i lustra 2 tak, aby wiązka laserowa przechodziła przez kuwetę skierowaną w pobliżu, ale nie bezpośrednio na fotodiodę.
- Użyj poziomicy, aby upewnić się, że stojaki tworzą równą powierzchnię dla kuwety. W razie potrzeby wyreguluj lusterka dalej.
- Podłącz fotodiodę do oscyloskopu cyfrowego za pomocą USB dostarczonego z oscyloskopem cyfrowym. Podłącz oscyloskop cyfrowy do komputera, który będzie używany do nagrywania i zapisywania danych.
3. Ustawienia oscyloskopu
- Korzystając z oprogramowania oscyloskopu w komputerze, ustaw częstotliwość próbkowania na co najmniej 8 Hz, aby wystarczająco rozwiązać cykl młócenia robaka.
UWAGA: Częstotliwość próbkowania powinna być ponad dwukrotnie większa niż oczekiwana częstotliwość młócenia gatunku, aby spełnione było twierdzenie Nyquista11.
4. Przygotowanie robaka i kuwety do zbierania danych
- Przenieś cztery dorosłe nicienie na świeżą płytkę Petriego wypełnioną agarem NGM10 za pomocą cienkiego, spłaszczonego szpikulca z drutu platynowego (patrz sekcja 1.3).
- Wyjmij jedną jednorazową plastikową kuwetę z opakowania, uważając, aby dotykać kuwety tylko jej prążkowanymi bokami.
- Za pomocą mikropipety odpipetuj wodę destylowaną do kuwety, aż kuweta zostanie wypełniona w około 80% wodą destylowaną.
UWAGA: Ważne jest, aby podczas pracy z nicieniami używać wyłącznie wody destylowanej lub zjonizowanych, takich jak M910 lub sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), ponieważ woda z kranu zawiera związki zabijające mikroorganizmy. - Umieścić szalkę Petriego zawierającą C. elegans, która ma być użyta, pod lunetą preparacyjną.
- Używając platynowego kilofa, wyjmij jeden dojrzały C. elegans z szalki Petriego i zanurz go w kuwecie, przesuwając kilkor, jeśli to konieczne, aby usunąć nicienie.
- Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w kuwecie, napełnij kuwetę wodą, aż lekko wybrzuszy się nad górną częścią kuwety. Napełnij całkowicie nasadkę kuwety wodą, a następnie szybko załóż nasadkę na kuwetę.
- Użyj szmatki do czyszczenia optycznego, aby usunąć kropelki wody, które mogły się rozlać, i papieru do czyszczenia optycznego, aby wyczyścić wszelkie małe pozostałe kropelki.
5. Akwizycja danych w czasie rzeczywistym o zmianach intensywności wzoru dyfrakcyjnego
- Włącz laser helowo-neonowy i dostosuj ustawienie częstotliwości/koloru tak, aby wytwarzał czerwoną wiązkę. Włącz czujnik.
ostrożność: Użyj wiązki o niskiej energii przy długości fali 632 nm, ponieważ C. elegans unika światła o wysokiej częstotliwości (niebieskiego)12. - Zlokalizuj robaka w kuwecie. Trzymając kuwetę po jej prążkowanych bokach, delikatnie przechylaj kuwetę, aż nicienie znajdą się mniej więcej w środku części kuwety.
UWAGA: Potrząsanie lub przechylanie kuwety powoduje gwałtowne zderzenie robaka ze ściankami kuwety. Może to uszkodzić nicienie.- Umieść kuwetę na stojaku w układzie optycznym, centrując robaka w wiązce lasera odbitej od lustra 1 do lustra 2. Pamiętaj, aby wyeliminować rozproszone światło.
- Wyśrodkuj robaka w wiązce laserowej.
- Umieść fotodiodę we wzorze dyfrakcyjnym tak, aby położenie fotodiody i centralne maksimum wzoru dyfrakcyjnego nie pokrywały się.
- Dostosuj filtr o neutralnej gęstości, aby zapobiec nasyceniu fotodiody. Obracanie koła filtrów o neutralnej gęstości reguluje natężenie światła.
- Obróć filtr o neutralnej gęstości tak, aby napięcie wyjściowe z fotodiody wzrosło.
UWAGA: Napięcie wyjściowe jest obserwowane za pomocą oprogramowania fotodiody cyfrowej. Fotodioda jest nasycona, jeśli napięcie się nie zmienia. W takim przypadku obracaj filtr o neutralnej gęstości, aż napięcie spadnie bez spłaszczania się przy minimalnym odczycie. Upewnij się, że voltage sygnał nie spłaszcza się przy szczytowych odczytach, wskazując na nasycenie fotodiody. Zmniejsz natężenie światła, obracając koło filtrów o neutralnej gęstości, jeśli zaobserwowane jest nasycenie.
- Obróć filtr o neutralnej gęstości tak, aby napięcie wyjściowe z fotodiody wzrosło.
- Gdy poruszający się wzór dyfrakcyjny jest widoczny, zbierz dane za pomocą fotodiody, klikając przycisk start w oprogramowaniu sterującym oscyloskopem, jednocześnie monitorując ruch robaka. Kontynuuj wykonywanie pomiarów, aż robak wyjdzie z wiązki laserowej, a wzór dyfrakcyjny zniknie, co zwykle trwa około 20 sekund.
- Zatrzymaj proces zbierania danych, klikając przycisk zatrzymania w oprogramowaniu oscyloskopu. Zapisz dane każdej wersji próbnej w formacie .csv lub .txt.
- Powtarzaj kroki 5.2 - 5.3, aż zostanie zebranych co najmniej 50 zestawów danych dla każdego fenotypu. Na próbę należy użyć od ośmiu do dziesięciu zwierząt.
- Jeśli kuweta jest porysowana, wyrzuć ją i robaka, a następnie powtórz krok 4. Jeśli robak zostanie uszkodzony podczas przenoszenia, wyrzuć go i opłucz kuwetę wodą destylowaną przed powtórzeniem kroku 4 przy użyciu tej samej kuwety.
- Powtórz krok 5 używając szczepu OH7547 "Roller", uważając, aby oznaczyć dane wskazujące szczep robaka.
6. Spektrum danych Fouriera
- Zaimportuj uzyskane dane do programu do analizy danych, który jest w stanie wykonać dyskretne transformaty Fouriera3.
- Wykonaj transformacje Fouriera na każdym zestawie danych, korzystając z opcji szybkiej transformaty Fouriera (FFT) oprogramowania.
- Uśrednić częstotliwości z wyników FFT dla każdej amplitudy dla robaków typu dzikiego N2.
- Powtórz krok 6.3 przy użyciu FFT z robaków "rolkowych" OH7547.
7. Modelowanie widma Fouriera
- Zaprogramuj binarny model lokomocji nicieni (patrz program zawarty w materiałach dodatkowych).
UWAGA: Ten model jest przybliżonym przybliżeniem, które na pierwszy rzut oka pokazuje wyraźne cechy ruchu robaków. Model można udoskonalić, porównując wyniki z rzeczywistymi robakami. Kształty robaków są przybliżeniami przy użyciu obrazów mikroskopowych13.- Twórz sekwencyjne klatki modelu binarnego przechodzącego przez co najmniej dwa cykle robaka (Rysunek 2a). Zobacz filmy w materiałach dodatkowych; Film o robaku C (CWorm.avi) i film o robaku W (WWorm.avi).
- Twórz sekwencyjne wzory dyfrakcyjne. Zobacz filmy w materiałach dodatkowych. Film z dyfrakcją robaka C (CWormDiff.avi) i film z robakiem W (WWormDiff.avi).
- Transformacja Fouriera polega na przekształceniu każdej binarnej klatki obrazu robaka. Im większa dopełnienie ramki wokół robaka, tym lepsza będzie rozdzielczość obrazu dyfrakcyjnego.
UWAGA: Wartość bezwzględna każdej ramki przekształconej Fouriera jest proporcjonalna do odpowiadającego jej wzoru dyfrakcyjnego (Rysunek 2b). - Dostosuj kontrast wzoru dyfrakcyjnego, odwzorowując intensywność wzoru dyfrakcyjnego na skalę logarytmiczną.
UWAGA: Kamery i oczy mają tendencję do działania w skali nieliniowej. Skala logarytmiczna może symulować, w jaki sposób wzór dyfrakcyjny jest zwykle postrzegany przez ludzkie oko.
- Transformacja Fouriera polega na przekształceniu każdej binarnej klatki obrazu robaka. Im większa dopełnienie ramki wokół robaka, tym lepsza będzie rozdzielczość obrazu dyfrakcyjnego.
- Wyodrębnij modelowany sygnał dyfrakcyjny.
- Wybierz położenie poza środkiem, które odpowiada położeniu fotodiody we wzorze dyfrakcyjnym.
- Dodaj sąsiednie elementy matrycy otaczające położenie fotodiody, aby zasymulować rozmiar fotodiody. Rozmiar fotodiody wynosi zazwyczaj 0,1% modelowanego wzoru dyfrakcyjnego.
- Zapisać i wykreślić sekwencję wielkości sygnałów dyfrakcyjnych. Sprawdź, czy sygnał jest fizycznie uzasadniony (tzn. w przypadku okresowego młócenia sygnał z fotodiody również powinien być okresowy).
- Fourier przekształca sygnał dyfrakcyjny uzyskany w 7.3 i porównuje wyniki z danymi doświadczalnymi.
- Powtórz dla różnych szczepów robaków i porównaj.
Wyniki
Układ optyczny przedstawiony na Rysunku 1 umożliwia badanie mikroorganizmów bez ograniczenia do jednej płaszczyzny ogniskowania. Sygnał miotania z fotodiody może być obserwowany w czasie rzeczywistym na ekranie komputera w miarę gromadzenia danych. Nietypowe wzorce będą widoczne natychmiast, bez konieczności szczegółowej analizy wideo.
Przykłady zamodelowanego sekwencyjnego ruchu nicienia oraz odpowiadające im wzory dyfrakcyjne przedstawiono na Rysunku 2. Zamodelowane wzory dyfrakcyjne jakościowo przypominają wzory eksperymentalne1 i stanowią wstępną wskazówkę, że symulacje skutecznie modelują nicienia.
Przykładowa czasowa sygnatura dyfrakcyjna dwóch badanych tutaj typów C. elegans została przedstawiona na Rysunku 3. Jakościowo widać, że każdy nic웜 miota się z różną częstotliwością i amplitudą. Niektóre z tych różnic można określić ilościowo poprzez dopasowanie krzywych, tak jak zrobiono to w poprzedniej publikacji1. Dyskretna transformata Fouriera ujawnia jednak więcej szczegółów dotyczących zawartych częstotliwości:
, (1)
gdzie Fk to cyfrowa transformata Fouriera (FT), a fn to zależny od czasu surowy sygnał dyfrakcyjny ze zmienną czasu dyskretną n i zmienną częstotliwości dyskretną k. N to całkowita liczba punktów danych. Średnia cyfrowa transformata Fouriera pozwala na identyfikację nicienia na podstawie amplitudy jego widma częstotliwości dyfrakcyjnej (Rysunek 4). W widmie typu dzikiego dominują niższe częstotliwości niż w widmie ruchu tocznego.
Model przybliżający typ dziki w porównaniu z mutantem roller C. elegans wykazuje, że typ dziki ma tendencję do miotania się w ruchu falistym (w kształcie litery W lub S) (Rycina 2a), podczas gdy mutant roller wykazuje preferencję do jednej strony, co przypomina oscylację w kształcie litery C (Rycina 5). Pozwala to częściowo wyjaśnić różnice w widmach. Mutant roller najczęściej tworzy kształt litery C po jednej stronie, podczas gdy oscylację w kształcie W można uznać za dwa przeciwstawne ruchy w kształcie litery C. Z tego powodu ruch W jest bardziej złożony, wykazując więcej wtórnych niskich częstotliwości niż ruch C. Wynik ten potwierdzono w modelu obliczeniowym. Kształt W wykazuje znacznie wyższą gęstość częstotliwości niż kształt C (Rycina 6). Potwierdzają to wyniki FFT na Rycynie 4, gdzie częstotliwości mutanta roller są bardziej skupione, choć nie całkowicie dyskretne. Statystyki mutanta roller są skośne, ponieważ może on tymczasowo powrócić do lokomocji typowej dla typu dzikiego.
Wygładzone widma mocy C. elegans typu „roller” wykazują szeroki pik przy ~1,5 Hz, podczas gdy pływający C. elegans typu dzikiego wykazuje widmo multimodalne (w tym piki przy ~1,0 Hz i 1,75 Hz). Fotodioda (PD) ma ograniczony rozmiar obejmujący kilka elementów macierzy. Poszczególne elementy macierzy lub punkty na wzorcu dyfrakcyjnym różnią się intensywnością, ponieważ interferencja konstruktywna i destrukcyjna ulega zmianom; niemniej jednak częstotliwości, z którymi zmienia się intensywność, są takie same dla wszystkich elementów macierzy, co widać na Rysunku 7. Biorąc pod uwagę pochodną czasową z równania 1, można zauważyć, że fluktuacje częstotliwości nie zależą od macierzy fazowej, lecz jedynie od fluktuacji pierwotnego obiektu:
, (2)
Ponieważ PD rozprzestrzenia się na kilka elementów macierzy, położenia pików uśredniają się do spójnego profilu częstotliwości. Można spodziewać się pewnych wariacji, które mogą dostarczyć wskazówek co do orientacji dżdżownicy. Rozkład częstotliwości będzie zmieniać się wraz ze zmianą chodu dżdżownicy. Obecny model jest modelem prostym, który pozwala jedynie na ocenę położenia pików, a nie ich względnych wysokości. Różne wzorce lokomocyjne będą uśredniać się do różnych położeń pików.
Rysunek 1. Układ doświadczalny. Wiązka lasera o niskiej mocy przechodzi przez filtr neutralnoprzepuszczalny, jest odbijana przez lustro M1 w dół przez kuwetę zawierającą nicienia na lustro M2, a następnie biegnie w kierunku fotodiody. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2. Kolejne kształty nicieni i odpowiadające im wzory dyfrakcyjne. (a) Wybrane sekwencyjne obrazy binarne modelowanych nicieni o kształcie litery W oraz (b) odpowiadające im sekwencyjne dyfraktogramy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 3. Sygnatury dyfrakcyjne próbek eksperymentalnych. Sygnatury dyfrakcyjne zebrane dla (a) „wałek” OH7547 i (b) N2 typ dziki C. elegans wykorzystanie pojedynczej fotodiody w obrazie dyfrakcyjnym. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4. Eksperymentalne uśrednione widma mocy serii dyfrakcji Fraunhofera dla typu Roller i typu dzikiego. Widma przedstawiają częstotliwości obecne w uśrednionej transformacie Fouriera szeregów czasowych zarejestrowanych za pomocą fotodiody. Do wygładzania zastosowano filtr Gaussa o odchyleniu standardowym 0,075 Hz, uciętym przy 3 odchyleniach standardowych. Należy zwrócić uwagę na szeroki szczyt widmowy przy ~1,5 Hz w wygładzonym widmie typu roller, w porównaniu z multimodalnym wygładzonym widmem typu dzikiego (obejmującym szczyty przy ~1,0 i 1,75 Hz). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5. Ilustracja powstawania dyfrakcji. Wzory dyfrakcyjne można modelować, traktując każdy segment linii jako nieskończenie małą linię prostą (po lewej). Nałożenie tych linii na siebie (po prawej) obrazuje konstrukcję wzorów dyfrakcji w polu dalekim generowanych przez nicienia o kształcie litery C. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6. Symulowane widma mocy serii dyfrakcyjnych Fraunhofera dla szczepu Roller i typu dzikiego. (a) kształt litery C i (b) kształt W dla nicieni, z fotodiodą wycentrowaną na elementach macierzy 200 (pionowo) i 175 (poziomo). Kształt W wykazuje wyższą gęstość częstotliwości ze względu na bardziej złożoną lokomocję. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7. Symulowane widma mocy serii dyfrakcji Fraunhofera dla typu Roller i typu dzikiego w różnych położeniach fotodiod. (a) w kształcie litery W i (b) Robak w kształcie litery C dla pojedynczych elementów macierzy w różnych położeniach, symulujący różne lokalizacje fotodiody. Wysokości piku różnią się w zależności od położenia; jednak lokalizacje piku pozostają takie same dla określonych kształtów. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Dyskusja
Uwzględnienie odcinków danych z brakiem aktywności spowoduje zniekształcenie wyników, ponieważ sztuczne niższe częstotliwości zostaną uśrednione w wynikach. Nasycenie fotodiody można rozpoznać po płaskich pikach lub "odciętych" pikach w surowych danych. Podzielenie każdego zestawu surowych danych przez szczytowe intensywności pomoże w uwzględnieniu wahań intensywności lasera.
Częstotliwości szczytowe są wskaźnikiem ogólnej częstotliwości młócenia; Jednak skomplikowany ruch powoduje zakłócenia przy częstotliwościach dudnień we wzorze dyfrakcyjnym i należy go dokładnie zbadać.
Metodę tę można wykorzystać do zbadania lokomocji innych nicieni. Środowisko można zmienić na inne medium. Długości fal również mogą ulec zmianie. Praca w widzialnym zakresie widma elektromagnetycznego jest najłatwiejsza i najbezpieczniejsza.
Bardziej wyrafinowany model będzie w przyszłości symulować widma dyfrakcyjne w bardziej realistyczny sposób. Przyszły model może zawierać robaka, który może zmieniać orientację, co nie wpłynęłoby na lokalizacje częstotliwości, ale na względne wysokości szczytów. Bardziej realistyczny model pozwoliłby na probabilistyczny rozkład częstotliwości młócenia, co poszerzyłoby szczyty, tak jak w danych eksperymentalnych. Rozpiętość częstotliwości odpowiadałaby za zmiany w częstotliwościach młócenia.
Obecny kształt ślimaka jest surowy, szczególnie w okolicy głowy i ogona, które powinny być bardziej zwężające się niż w obecnym modelu. Interesujące może być przeprowadzenie szczegółowej analizy szeregów czasowych sygnału, ponieważ może to dostarczyć wskazówek na temat złożoności lokomocji u różnych mutantów.
Warto zastanowić się nad praktycznością rozszerzenia tej techniki na charakteryzowanie wielu nicieni jednocześnie. Metodę tę należy rozumieć jako metodę uzupełniającą istniejące metody z wykorzystaniem tradycyjnych mikroskopów. Ta metoda ma tę zaletę, że nie wymaga mikroskopu podczas pozyskiwania danych, dzięki czemu robak może wydostać się poza płaszczyznę ogniskową. Uśrednione widma częstotliwości pokazują wyraźne różnice w ruchu robaków i mogą być określone ilościowo za pomocą przeważających pików częstotliwości, co jest nowatorską metodą ilościowego określania lokomocji robaków. Analiza danych dotyczących sygnatur dyfrakcyjnych jest w dalszym rozwoju i miejmy nadzieję, że doprowadzi do zautomatyzowanego procesu identyfikacji wielu mutantów i osobników.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Juanowi Vasquezowi za jego wkład obliczeniowy w ten projekt. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund oraz nagrodę NSF nr 1058385.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przestrajalny laser helowo-neonowy | Elektrooptyka badawcza | 30602 | Można wybrać cztery długości fal od 543 nm do 633 nm. |
| 2 Aluminiowe lusterka z przednią powierzchnią | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| Fotodioda: SI Ampliified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
| Kwarcowe kuwety | Starna Cells | 21 / G / 5 | Można również użyć plastikowych ogniw |
| MatLab (Oprogramowanie) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Użyj polecenia fft, aby symulować dyfrakcję |
| Excel | Microsoft | 14.7.1 | Służy do analizy danych Rysunek 4 |
| Caenorhabditis elegans Roller | >University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Szczep: OH7547 Genotyp: otIs199. | https://cbs.umn.edu/cgc/home |
| Caenorhabditis elegans Typ dziki | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Szczep: N2 Genotyp: C. elegans izolat dziki | https://cbs.umn.edu/cgc/home |
Bibliografia
- Magnes, J., et al. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- James, J. F. A Student's Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
- Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- Thibault, P., Rankenburg, I. C. Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory. Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).
- Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method. Phys. Rev. B. 67, 174104(2003).
- Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography. Optik - International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).
- Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Dasalukunte, D., Öwall, V., Rusek, F., Anderson, J. B. Faster than Nyquist Signaling. Algorithms to Silicon. , Springer International Publishing. Switzerland. (2014).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), e198(2008).
- Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids. Phys. Fluids. 25, 081902(2013).
Przedruki i uprawnienia
