Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56169

⸱

9 kwietnia 2018

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Streszczenie

Enterokrwotoczny E. coli (EHEC) O157:H7, który jest patogenem przenoszonym przez żywność, powodującym biegunkę, krwotoczne zapalenie jelita grubego (HS) i zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS), kolonizuje przewód pokarmowy ludzi. Aby zbadać szczegółowy mechanizm kolonizacji EHEC in vivo, niezbędne jest posiadanie modeli zwierzęcych do monitorowania i ilościowego określania kolonizacji EHEC. Demonstrujemy tutaj model kolonizacji myszy-EHEC poprzez przekształcenie plazmidu wyrażającego bioluminescencyjną do EHEC w celu monitorowania i ilościowego określenia kolonizacji EHEC u żywych gospodarzy. Zwierzęta zaszczepione znakowanym bioluminescencyjnie EHEC wykazują intensywne sygnały bioluminescencyjne u myszy poprzez wykrywanie za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo. Po 1 i 2 dniach od zakażenia u zakażonych zwierząt nadal można wykryć sygnały bioluminescencyjne, co sugeruje, że EHEC kolonizuje gospodarzy przez co najmniej 2 dni. Pokazujemy również, że te bioluminescencyjne EHEC lokalizują się w jelicie myszy, szczególnie w jelicie ślepym i okrężnicy, na podstawie obrazów ex vivo. Ten model kolonizacji EHEC za pomocą myszy może służyć jako narzędzie do pogłębiania obecnej wiedzy na temat mechanizmu kolonizacji EHEC.

Wprowadzenie

EHEC O157:H7 to patogen, który powoduje biegunkę1, HS2, HUS3, a nawet ostrą niewydolność nerek4 poprzez skażoną wodę lub żywność. EHEC jest chorobotwórczym enterobacterium i kolonizuje przewód pokarmowy człowieka1. Kiedy EHEC po raz pierwszy przylega do nabłonka jelitowego gospodarza, wstrzykuje czynniki kolonizacyjne do komórek gospodarza przez system wydzielania typu III (T3SS), który działa jak strzykawka molekularna, indukując zmianę przyczepiania i zacierania (A / E), a następnie w celu wymuszenia adhezji (kolonizacji) 5. Geny te biorące udział w tworzeniu zmian A/E są kodowane przez locus of enterocyte effacement (LEE) pathogenicity island5.

Bioluminescencja to chemiczna reakcja wytwarzająca światło, w której lucyferazy katalizują swój substrat lucyferynę, aby wytworzyć światło widzialne6. Ten proces enzymatyczny często wymaga obecności tlenu lub adenozynotrifosforanu (ATP)6. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) umożliwia naukowcom wizualizację i kwantyzację interakcji gospodarz-patogen u żywych zwierząt7. BLI może scharakteryzować cykl infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt, śledząc bioluminescencyjne bakterie, gdy migrują do różnych tkanek i atakują je7; Świadczy to o dynamicznym postępie infekcji. Co więcej, obciążenie bakteryjne u zwierząt jest związane z sygnałem bioluminescencyjnym8; Jest to zatem wygodny wskaźnik do oszacowania stanów patologicznych zwierząt doświadczalnych w prosty i bezpośredni sposób.

Plazmid użyty tutaj zawierał operon lucyferazy, luxCDABE, który pochodzi z bakterii Photorhabdus luminescens, która koduje swój własny substrat lucyferazy7,9. Przekształcając ten plazmid wyrażający lucyferazy w bakterie, procesy kolonizacji i infekcji można monitorować, obserwując te bioluminescencyjne bakterie u żywych zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, BLI i bakterie znakowane bioluminescencją pozwalają naukowcom monitorować liczbę i lokalizację bakterii, żywotność bakterii przy antybiotykach/terapii oraz ekspresję genów bakteryjnych w infekcji/kolonizacji6,7. Opisano liczne bakterie chorobotwórcze, które wykazują ekspresję operonu luxCDABE w celu zbadania ich cyklu infekcji i/lub ekspresji genów w zakażeniu. Bakterie te, w tym uropatogenne E. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropatogenne E. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, oraz Vibrio cholerae20, zostały udokumentowane.

Kilka eksperymentalnych modeli zostało opracowanych w celu ułatwienia badania kolonizacji EHEC in vitro i in vivo21,22,23. Brakuje jednak odpowiednich modeli zwierzęcych do badania kolonizacji EHEC in vivo, a co za tym idzie niedostatek szczegółów. Aby ułatwić badanie mechanizmu kolonizacji EHEC in vivo, cenne jest budowanie modeli zwierzęcych w celu obserwacji i ilościowego określenia kolonizacji EHEC u żywych zwierząt w sposób nieinwazyjny.

Ten manuskrypt opisuje model kolonizacji myszy-EHEC, który wykorzystuje system ekspresji bioluminescencyjnej do monitorowania kolonizacji EHEC w czasie u żywych gospodarzy. Myszy są inokulowane dożołądkowo znakowanym bioluminescencyjnie EHEC, a sygnał bioluminescencyjny jest wykrywany u myszy za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo13. Myszy zakażone EHEC znakowanym bioluminescencyjnie wykazywały znaczące sygnały bioluminescencyjne w jelicie po 2 dniach od zakażenia, co sugerowało, że bakterie te skolonizowały jelito gospodarza po 2 dniach po zakażeniu. Dane obrazowe ex vivo wykazały, że kolonizacja ta występuje specyficznie w jelicie ślepym i okrężnicy myszy. Korzystając z tego mysiego modelu EHEC, bioluminescencyjna kolonizacja EHEC może zostać wykryta w żywym gospodarzu za pomocą systemu obrazowania in vivo, w celu zbadania szczegółowych mechanizmów kolonizacji bakterii jelitowych, co może przyczynić się do dalszego zrozumienia zmian fizjologicznych i patologicznych wywołanych przez EHEC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: EHEC O157:H7 jest patogenem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) zgodnie z instrukcją bezpieczeństwa biologicznego (https://www.cdc.gov/) Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC). W związku z tym wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem EHEC muszą być wykonywane w obiekcie BSL-2. Podczas wykonywania eksperymentu noś fartuchy laboratoryjne i rękawice. Praca w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Zdezynfekować stanowisko doświadczalne przed i po procedurze doświadczalnej 70% etanolem. Wszystkie narzędzia lub sprzęt, które mają kontakt (lub mogą mieć kontakt) z EHEC, należy zdezynfekować 70% etanolem lub wybielaczem. Zanieczyszczone (lub potencjalnie skażone) odpady należy starannie uszczelnić i sterylizować w autoklawie. W razie potrzeby załóż maskę, okulary ochronne, podwójne rękawiczki lub kombinezon. 6-tygodniowe samice myszy C57BL/6 zostały zakupione i utrzymywane w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Narodowego Uniwersytetu Cheng Kung (NCKU). Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania NCKU (numer zatwierdzenia 104-039).

1. Generacja bakterii EHEC znakowanych biolucyferazą

  1. Zmieszać 50 ng kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), po 1 μL z 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 2 μL 2,5 mM dezankleotydów (dNTP), 2 μL 10x buforu, 0,2 μL polimerazy DNA i sterylnej podwójnie destylowanej wody (ddH2O) do końcowej objętości 20 μL w celu amplifikacji kasety anty-kanamycyny, nptII gene24. Szablon DNA pochodzi z pBSL18024, który jest zakupiony od National BioResource Project (NBRP). Warunki PCR są wymienione w Tabeli 1, a sekwencja startera jest dostępna w Tabeli 2.
  2. Zwiąż produkty PCR z komercyjnym wektorem klonowania zgodnie z protokołem zestawu (patrz Tabela materiałów).
  3. Wyciąć fragment genu nptII z wektora klonującego przez NsiI i SmaI i sklonować do pBBR1MCS4, który jest trawiony przez NsiI i ScaI z pAKlux29 w celu wytworzenia plazmidu odpornego na kanamycynę, pWF27813.
  4. Wyciąć operon luxCDABE z plazmidu eksprymującego lucyferazy9, pAKlux2, przez SpeI-HF i ScaI i sklonować do SpeI-HF i SmaI strawionego pWF278 w celu wytworzenia plazmidu opornego na kanamycynę i eksplagującego lucyferazy, pWF27913.
    UWAGA: Do ekstrakcji plazmidów i oczyszczania wyciętych fragmentów należy użyć odpowiednio komercyjnej ekstrakcji plazmidu i zestawu do ekstrakcji żelu. Do trawienia enzymatycznego zmieszać 100 ng DNA, 1 μl 10x buforu, 1 μl każdego wybranego enzymu restrykcyjnego i sterylnego ddH2O do całkowitej objętości 10 μl i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2,5 - 3 godziny.
  5. Przekształć plazmid pWF279 w kompetentne komórki E. coli O157:H7 EDL933 za pomocą elektroporacji napięciem 2,500 V przez 4 ms.
  6. Inkubować przekształcone komórki bakteryjne w 1 ml pożywki Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  7. Bakterie należy umieścić na płytce agarowej LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C przez 16 - 18 godzin.
  8. Następnego dnia należy sprawdzić sygnał bioluminescencyjny płytki za pomocą urządzenia do obrazowania in vivo. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i hodować ją w 3 ml LB uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C przez 16 - 18 godzin.
  9. Przygotować podstawową pożywkę bakteryjną, rozcieńczając 100% glicerolu w sterylnym ddH2O, aby uzyskać 30% roztwór glicerolu.
  10. Zamrażać oporne na kanamycynę bakterie E. coli O157:H7 EDL933 zawierające plazmid lucyferazy jako zapas bakteryjny w kriowiale z zakrętką w stosunku 1:1 kultury bakterii i 30% roztworu glicerolu w temperaturze -80 °C. Końcowe stężenie glicerolu wynosi 15%.

2. Bioluminescencyjne bakterie EHEC Preparat do doustnego szczepienia

UWAGA: Schemat blokowy osi czasu procedur eksperymentalnych dla przygotowania EHEC i zgłębnika doustnego myszy jest przedstawiony w Rysunek 1, aby pomóc w przygotowaniu eksperymentalnym.

  1. Smuga bakterii E. coli O157:H7 EDL933 zawierających plazmid lucyferazy na płytce agarowej LB z 50 μg/ml kanamycyny z bulionu -80 °C. Hoduj bakterie przez 16 - 18 godzin w temperaturze 37 °C.
  2. Pobrać pojedynczą kolonię z płytki na noc i hodować w 3 ml pożywki LB z 50 μg/ml kanamycyny przez 16 - 18 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 220 obr./min.
  3. Subhodowlę bakterii (rozcieńczenie 1:100) do kanamycyny (50 μg/ml) zawierającej bulion LB przez 2,5 - 3 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 200 obr./min. (Na przykład dodaj 2 ml bakterii hodowanych przez noc do 200 ml pożywki LB z dodatkiem kanamycyny (50 μg / ml).
  4. Inkubować bakterie przez 2,5 - 3 godziny i mierzyć wartość gęstości optycznej przy 600 nm (OD600), aż wartość będzie mieścić się w przedziale od 0,9 do 1. Liczba komórek bakteryjnych ma gęstość około 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml.
  5. Odwirować ponownie wyhodowane bakterie w temperaturze 8 000 x g przez 30 minut, w temperaturze 4 °C.
  6. Odrzucić sklarat osadu bez mieszania osadu bakteryjnego i przemyć go 100 ml 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej przez delikatne mieszanie.
  7. Powtórz kroki 2.5 i 2.6 jeden raz.
  8. Po przepłukaniu odwirować kulturę bakteryjną o stężeniu 8 000 x g przez 30 minut, 4 °C i delikatnie odrzucić supernatant.
  9. Skondensować granulat 100-krotnie z 0,9% sterylną solą fizjologiczną. Na przykład, jeśli odwiruje się 200 ml bakterii, dodaj 2 ml zwykłej soli fizjologicznej, aby zawiesić osad.
  10. Potwierdź bakterię CFU (powinna wynosić około 109 CFU/100 μL po kondensacji w soli fizjologicznej) poprzez posiew skoncentrowanych bakterii przez 10-krotne seryjne rozcieńczenie25.

3. Zgłębnik ustny myszy z EHEC

  1. Traktuj 6-tygodniowe samice myszy C57BL/6 wodą ze streptomycyną (5 g/l) przez 24 godziny.
  2. Po 24 godzinach przestaw się na zwykłą wodę pitną na kolejne 24 godziny przed zgłębkiem. Po leczeniu zwykłą wodą przez 24 godziny, myszy są gotowe do doustnego podania EHEC.
  3. Napełnić strzykawkę 100 μl bakterii EHEC, pociągając za tłok. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Usunąć pęcherzyki, zatrzaskując strzykawkę palcami.
  4. Delikatnie podnieś zwierzę i ostrożnie umieść je na górze klatki.
  5. Ostrożnie chwyć mysz za ogon, a zwierzę chwyci górną część klatki i spróbuje się odsunąć.
  6. Delikatnie przytrzymuj mysz, chwytając luźną skórę szyi i grzbietu zwierzęcia kciukiem i palcem wskazującym, aby zapobiec poruszaniu się głowy myszy.
  7. Przytrzymaj mysz w pozycji pionowej, aby włożyć igłębkę i upewnij się, że głowa myszy jest unieruchomiona i pionowa.
  8. Włóż igłębkę do ust myszy wzdłuż podniebienia i przesuń się w dół do przełyku i w kierunku żołądka.
  9. Gdy wprowadzona igła osiągnie połowę lub dwie trzecie długości myszy, wstrzyknij 100 μl bakterii EHEC, które zawierają około 10-9 komórek CFU.

4. Wizualizacja

  1. Po zgłębniku ustnym wykryj sygnały bioluminescencyjne przez 1 i 2 dni.
  2. Przed zbadaniem sygnałów bioluminescencyjnych zwierząt należy je znieczulić, umieszczając je w komorze z 2,5% izofluranem z 1,5 l/min tlenu.
  3. Odczekaj 2 - 5 minut, aż wszystkie myszy stracą przytomność i przestaną się poruszać. Zwierzęta są gotowe do wykrywania bioluminescencji in vivo.
  4. Wykrywanie i obrazowanie sygnałów bioluminescencyjnych zwierząt za pomocą systemu obrazowania in vivo. Patrz rozdział 5 "Akwizycja danych" w celu uzyskania informacji na temat obsługi oprogramowania. Podczas procesu obrazowania wszystkie zwierzęta są stale zasilane 2,5% izofluranem z 1,5 l/min tlenu.
    1. Kliknij file>live i ręcznie ustaw ostrość na myszy.
    2. Wybierz czas naświetlania i intensywność lasera.
    3. Kliknij przycisk acquire>capture.
  5. W przypadku obrazowania ex vivo należy poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i usunąć całe jelito zakażonych myszy. Umieścić jelita na 9-centymetrowej szalce Petriego i wykonać zdjęcie za pomocą systemu obrazowania in vivo. Ustawienie jest takie samo jak w przypadku obrazowania in vivo, z wyjątkiem tego, że pole widzenia jest ustawione jako A/B. Szczegółowe informacje można znaleźć w rozdziale 5 "Gromadzenie danych".
    UWAGA: Metoda zwichnięcia szyjki macicy: Unieruchomić myszy na górze klatki, chwytając ogon jedną ręką, tak aby zwierzęta chwyciły klatkę. Umieść marker lub kciuk i pierwszy palec drugiej ręki na karku u podstawy czaszki. Szybko pchnij do przodu ręką lub przedmiotem, przytrzymując głowę i pociągnij do tyłu, trzymając rękę trzymającą ogon.
    Sprawdź dokładnie, aby potwierdzić zatrzymanie oddechu i brak bicia serca.

5. Akwizycja danych

UWAGA: Oprogramowanie używane do pozyskiwania danych jest wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Aby uzyskać dostęp do obrazu, otwórz Panel sterowania akwizycją oprogramowania (Rysunek 2).
  2. Wybierz "Luminescencyjny", "Zdjęcie" i "Nakładka".
  3. Ustaw Czas ekspozycji na "Auto". Ustaw Binning na "Średni".
  4. Ustaw ƒ/stop jako 1 dla luminescencyjnego i 8 dla zdjęcia. ƒ/stop kontroluje ilość światła odbieranego przez detektor CCD.
  5. Ustaw pole widzenia na podstawie pola obrazów, które są interesujące do uzyskania. Opcja "D" może zmieścić pięć 6-tygodniowych myszy i zobrazować je wszystkie na raz. "C" może obrazować trzy 6-tygodniowe myszy na jednym polu.
  6. Gdy myszy/próbki będą gotowe do obrazowania, kliknij "Pobierz", aby uzyskać obraz.
  7. Otwórz dane obrazu, który został pobrany.
  8. Otwórz panel Paleta narzędzi (Rysunek 3).
  9. Wybierz Narzędzia ROI. Zalecamy Okrąg (skrajny po lewej), aby objąć zakres obszaru bioluminescencyjnego na obrazach (Rysunek 4).
  10. Kliknij "Zmierz ROI" (ikona ołówka), aby zmierzyć intensywność bioluminescencji powierzchni (Rysunek 3). Pojawi się panel Pomiary zwrotu z inwestycji i wartości kwantyfikacji (Rysunek 5).
  11. Użyj opcji Konfiguruj pomiar w lewym rogu panelu Pomiary ROI, aby wybrać potrzebne wartości/informacje (Rysunek 6), w przeciwnym razie kliknij "Eksportuj", aby wyeksportować tę tabelę danych i zapisać jako plik .csv (Rysunek 5).
  12. Użyj wartości z kolumny "Strumień całkowity (p/s)" jako kwantyfikację intensywności bioluminescencji w pliku .csv.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podano bioluminescencyjnie znakowane EHEC (~ 109 komórki bakteryjne) do 6-tygodniowych samic myszy szczepu C57BL/6 poprzez zgłębnik dożożołądkowy. W ciągu 1 h po doustnym zaszczepieniu myszy EHEC, u zwierząt badano sygnał bioluminescencyjny za pomocą in vivo układ obrazowania przedstawiony na Rysunek 7Wyniki wykazały silny sygnał bioluminescencyjny u myszy, którym podano drogą zgłębnika EHEC znakowane bioluminescencyjnie. Sygnały analizowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Doniesiono, że EHEC przekształcony plazmidem lucyferazy został wykorzystany do zbadania jego lokalizacji u gospodarzy lub ekspresji genów in vivo 8,11,12. Zademonstrowany tutaj model mysi wykrył również czas i lokalizację kolonizacji EHEC u mysiego gospodarza8. Niemniej jednak udostępniamy szczegółowy protokół, w jaki sposób podawać szczepionkę EHEC myszom dożołądkowo i jak starannie przygotować ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Chi-Chung Chen z Departamentu Badań Medycznych, Centrum Medycznego Chi Mei (Tainan, Tajwan) za pomoc w zakażeniu myszy oraz wsparcie ze strony centrum zwierząt laboratoryjnych Narodowego Uniwersytetu Cheng Kung. Prace te są wspierane przez granty Ministra Nauki i Technologii (MOST) (MOST 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006 -011 i 106-2321-B-006 -005) dla CC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubator z wytrząsarkąYIH DERLM-570Rinkubacja bakterii 
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnymFIRSTEKS300inkubacja bakterii 
pBSL180źródło genu nptII
pAKlux2źródło operonu luxCDABE
T& Zestaw do klonowaniaYeast BiotechFYC001-20Pdo klonowania TA 
Nsi INEBR0127Szastosowanie do klonowania plazmidów 
Sca INEBR0122Szastosowanie do klonowania plazmidów 
Spe HFNEBR0133Ssłuży do klonowania plazmidów 
Sma I Zastosowanie NEBR0141Sdo klonowania plazmidów 
Ligaza T4NEBM0202Szastosowanie do klonowania plazmidu 
Ex TaqTaKaRaRR001Azastosowanie do amplifikacji PCR
10X Ex Taq BufferTaKaRaRR001Azastosowanie do amplifikacji
PCR Mieszanina dNTP TaKaRaRR001Azastosowanie do amplifikacji PCR
Maszyna PCRzastosowana Biosystem Termocykler 2720   do amplifikacji PCR
GlicerolSIGMAG5516-1Lstosować do roztworu do przechowywania bakterii
NaClSigma31434-5KG-Rsubstancja chemiczna do wytwarzania podłoża LB, 10 g/L
TryptonCONDA pronadisaCat 1612.00substancja chemiczna do produkcji podłoża LB, 10 g/L
Ekstrakt drożdżowy w proszkuAffymetrix23547-1 KGsubstancja chemiczna do produkcji podłoża LB, 5 g/L
AgarCONDA pronadisa Cat1802.00substancja chemiczna do produkcji kanamycyny agarowej LB
 Antybiotyki SigmaK4000-5G, stosowane do selecitonu
streptomycyny Antybiotyki SigmaS6501-100G, eliminują mikrobiotę u myszy
EDL933 kompetentna komórkaDomowametoda znajduje się w dokumencie uzupełniającym 
ElektroporatorMicroPulserdo elektroporacji
Kuwety do elektroporacjiGene Pulser/MicroPulser1652086do elektroporacji
Wirówka szybkoobrotowaBeckman CoulterAvanti, J-26S XPzastosowanie do odwirowywania bakterii 
Rotor o stałym kącie nachyleniaBeckman CoulterJA25.5służy do odwirowania bakterii 
Rotor o stałym kącieBeckman CoulterJLA10.5służy do odwirowywania bakterii 
butelki wirówkoweBeckman CoulterREF357003zastosowanie do odwirowywania bakterii 
butelki wirówkoweThermo Fisher scientific3141-0500zastosowanie do odwirowania bakterii 
Biofotometr Eppendorf Plus eppendorfAG 22331 hamburgdo pomiaru wartości OD600 myszy bakteryjnych
C57BL/6 Laboratorium Centrum Zwierząt NCKU
fartuch laboratoryjny, rękawicedo ochrony personelu 
izofluran Panion & BF Biotech Inc.G-8669do znieczulenia myszy, strzykawka 1ml klasy farmaceutycznej
 stosować do podawania w jamie ustnej myszy Igła
do karmienia wielokrotnego użytku 22 G z końcówką kulkowąφ 0,9 mm X L 50 mmZastosowanie do podawania w jamie ustnej myszy
chirurgiczne  Nożyczki zastosowanie do eksperymentu na myszach
System obrazowania Xenogen IVIS 200Wykorzystanie widmaPerkin Elmerdo przechwytywania obrazów bioluminescencyjnych 
Oprogramowanie Living ImageSoftware Perkin Elmerw wersji 4.1służy do ilościowego określania danych obrazu
nachylenia IVIS

Bibliografia

  1. Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
  2. Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
  3. Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
  4. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  5. Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).
  6. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
  7. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  8. Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
  9. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
  10. Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
  11. Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
  12. Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
  13. Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).
  14. Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
  15. Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
  16. Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  17. Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
  18. Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
  19. Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
  20. Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
  21. Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).
  22. Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).
  23. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
  24. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  25. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  26. Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
  27. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  28. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
  29. Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
  30. Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
  31. Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
  32. Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
  33. Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  34. Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
  35. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  36. Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enterohemorrhagiczna Escherichia coliobrazowanie bioluminescencyjneobrazowanie in vivomodel kolonizacji myszytechnika zgłębnika doustnegokwantyfikacja luminescencjikolonizacja kątnicykolonizacja okrężnicyobrazowanie ex vivodetekcja nieinwazyjna
Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.